JP5624981B2 - 自己集合性多細胞体、および前記多細胞体を用いて３次元の生物構造体を作製する方法 - Google Patents

Description

助成金の記述
本発明は部分的に、全米科学財団の助成金番号第ＮＳＦ−０５２６８５４の下で、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明に対してある特定の権利を有する。

本発明は、再生医療およびティッシュエンジニアリングの分野、より詳細には、所望の構造体を有する人工組織／臓器の作製に関する。

ティッシュエンジニアリングは、血管を含む移植可能な臓器の慢性的な不足に伴う臓器置換および組織置換への要請の高まりに起因する問題に対して、有望な解決策を提供する。米国では例えば、数千人が、臓器移植の全米待機リストに掲載されている。病変動脈もしくは静脈に代わる置換用血管、または置換用腹部臓器の不足のため、多くは死亡する可能性が高い。移植用の血管および臓器の供給不足の問題を軽減し、最終的には解消する目的で、ティッシュエンジニアリングによって、移植可能な血管、代用血管、臓器、または代用臓器を研究室において高精度、大規模、かつ比較的短期間で構築して増殖させる試みが行われている。

人工組織を構築するためのさまざまな方法が試みられ、かつ開発されており、限定的な成果を挙げている。しかし、３次元の血管新生化臓器を組み立てることは、未だ達成されていない。

先行技術の解決策は有望であるものの、多くの課題がある。足場の選択、免疫原性、分解速度、分解産物の毒性、宿主の炎症反応、足場の分解による線維組織の形成、および周囲組織との機械的不整合は、人工組織コンストラクトの長期的挙動に影響を及ぼすと共に、そのコンストラクトの主要な生物学的機能を直接妨げる場合がある。例えば、心筋組織には、隣接し合う細胞を密接に相互連結させるギャップ結合を介して同期拍動を確保するために、高い細胞密度が必要になる。心臓のティッシュエンジニアリングの際に足場を用いることは、細胞間結合の低下、ならびに、細胞外マトリックス（ＥＣＭ、例えばコラーゲンおよびエラスチン）の不適切な沈積および配列と関連しており、足場の生分解と心筋コンストラクトの力発生能力とに影響を及ぼす。脈管のティッシュエンジニアリングでは、ＥＣＭ関連因子も特に重要である。主にこの理由から、足場を用いてエンジニアリング技術で作製した小径代用血管であって、成人の動脈血管再生の際の本物の血管に匹敵する機械的強度を有する小径代用血管の有望性は、ティッシュエンジニアリングの「聖杯」といわれる場合が多いが、未だ実現されていない。足場を使用すると、インビトロで弾性線維を作製するのが困難になることが多いのに加えて、さらなる問題が生じる。ゲル固有の脆弱性は、ティッシュエンジニアリングで作製した脈管の最終強度の妨げとなる場合がある。これに加えて、残存ポリマー断片の存在が、脈管壁の正常組織構造を壊し、さらには、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の表現型に影響を及ぼすことさえもある。したがって、ティッシュエンジニアリングで作製した脈管移植片の先駆的な臨床的応用において、低圧応用をターゲットとするか、または、まったく足場を用いない方法（シートベースティッシュエンジニアリングという）に依存していたのは驚くことではない。

臓器印刷、特に米国特許出願第１０／５９０，４４６号に記載されている技法は、３次元組織を作製するものとして有望である。臓器印刷は一般に、コンピューターを利用したディスペンサーベースの３次元ティッシュエンジニアリング技術で、機能的な臓器モジュールを構築することと、最終的に臓器全体を層状に構築することとを目的とした技術である。米国特許出願第１０／５９０，４４６号に記載されている技術では、個々の多細胞集合体を印刷して、ゲルまたはその他の支持マトリックスにする。印刷後に上記の個々の集合体を融合させることによって、最終的な機能的組織が得られる。

本発明の１つの態様は、細長い多細胞体である。この多細胞体は、複数の生体細胞と組織培地とを含む。その生体細胞は、互いに凝集し合っている。上記の多細胞体の長さは少なくとも約１０００マイクロメートルであり、長さ方向に沿って切断した断面の平均面積は約７，８５０平方マイクロメートル〜約３６０，０００平方マイクロメートルの範囲である。

本発明の別の態様は、細長い人工多細胞体である。この多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この多細胞体の長さは少なくとも約１０００マイクロメートルであり、長さ方向に沿って切断した断面の平均面積は約７，８５０平方マイクロメートル〜約３６０，０００平方マイクロメートルの範囲である。

別の実施形態は、神経が発達していない非軟骨性の細長い多細胞体である。この多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この多細胞体の長さは少なくとも約１０００マイクロメートルであり、長さ方向に沿って切断した断面の平均面積は約７，８５０平方マイクロメートル〜約３６０，０００平方マイクロメートルの範囲である。

本発明のさらなる態様は、管腔のない細長い多細胞体である。この多細胞体は、複数の生体細胞と組織培地とを含む。その生体細胞は、互いに凝集し合っている。この多細胞体のアスペクト比は少なくとも約２である。

本発明の１つの態様では、所望の３次元形状の複数の細胞または細胞集合体で作られた多細胞体であって、粘弾性粘稠性を有する多細胞体が説明されている。この多細胞体は、複数の細胞または細胞集合体を含み、その細胞または細胞集合体は凝集し合って、操作および取り扱いがしやすいように粘弾性粘稠性、所望の細胞密度、および十分な完全性を有する、所定の形状のコンストラクトを形成する。

本発明のさらに別の態様は、複数の生体細胞を含む細長い多細胞体を作製する方法である。複数の生体細胞を含む細胞ペーストを細長い形状に成形する。成形したこの細胞ペーストを制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、細長い多細胞体を形成させる。

本発明による、複数の生体細胞を含む多細胞体を作製する別の方法は、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを３次元形状に保つ器具内で、前記細胞ペーストを成形することを含む。平面上で細胞体が自立するほど十分な凝集力を有する細胞体を作製するのに十分な時間にわたって、成形した前記細胞ペーストを前記３次元形状に保ったまま、前記細胞ペーストを制御環境中でインキュベートする。

複数の生体細胞を含む細長い多細胞体を作製する方法も提供する。この方法は、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを細長い形状に成形することと、この成形した細胞ペーストを制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、細長い多細胞体を形成させることを含む。本発明のこの態様では、所定の形状で複数の細胞または細胞集合体を含む細長い多細胞体であって、粘弾性粘稠性を有する多細胞体を作製する方法について説明されている。１つの実施形態では、多細胞体を作製する方法は、１）事前に選択した複数の細胞または細胞集合体を含むと共に、所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストを用意する工程と、２）前記細胞ペーストを操作して所望の形状にする工程と、３）成熟を通じて多細胞体を形成させる工程とを含む。

本発明のさらに別の態様では、所望の３次元の生物学的コンストラクトを構築する目的で、上記の多細胞体と併せて用いるフィラー体について説明されている。このフィラー体は、所定の形状をしたある物質を含み、その物質は、細胞が内殖、移動、および接着するのを妨げ、組織培地に対する透過性を持つ（すなわち、栄養分に対する透過性を持つ）こともできる。フィラー体は、アガロース、寒天、および／またはその他のヒドロゲルのような物質で作られていてもよい。生物学的コンストラクトの構築中に、所定のパターンに従ってフィラー体を用いて、多細胞体がない領域を画定する。

本発明の別の態様では、フィラー体を形成する方法が説明されている。一般にこの方法は、事前に選択した、ゲル様状態の好適な材料を調製（例えば操作）して所望の形状にするものである。本発明の方法の１つの実施形態によれば、この製作法は、１）当該材料の粘度を低下させて液体様物質にする工程と、２）その液体様物質を所定の形状に成形する工程と、３）この物質の粘度を向上させて、所望のゲル様フィラーマトリックスユニットの粘度にする工程とをさらに含んでもよい。

本発明のさらに別の実施形態は、神経が発達していない複数の細長い多細胞体を含む３次元構造体である。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。これらの多細胞体は、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触すると共に、多細胞体が互いに凝集し合っていないパターンで配列されている。

本発明のさらなる態様は、ある３次元構造体である。この構造体は、複数の細長い人工多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。これらの多細胞体は、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触すると共に、多細胞体が互いに凝集し合っていないパターンで配列されている。

別の実施形態では、３次元構造体は、複数の細長い多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞と、組織培地とを含む。これらの多細胞体は、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触すると共に、多細胞体が互いに凝集し合っていないパターンで配列されている。

さらに別の実施形態では、３次元構造体は、神経が発達していない複数の多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。これらの多細胞体は、長さが少なくとも約１０００マイクロメートルの接触区域沿いで、多細胞体のうちの少なくとも１つが別の多細胞体と接触するパターンで配列されている。

本発明の別の態様では、３次元構造体は、複数の人工多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。これらの多細胞体は、長さが少なくとも約１０００マイクロメートルの接触区域沿いで、多細胞体のうちの少なくとも１つが別の多細胞体と接触するパターンで配列されている。

本発明のさらに別の実施形態では、３次元構造体は複数の多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞と、組織培地とを含む。これらの多細胞体は、長さが少なくとも約１０００マイクロメートルの接触区域沿いで、多細胞体のうちの少なくとも１つが別の多細胞体と接触するパターンで配列されている。

３次元構造体の別の実施形態は、複数の多細胞体を含む。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この構造体は、複数の離散したフィラー体も含む。各フィラー体は、細胞が多細胞体からフィラー体に移動および内殖するのを妨げると共に、多細胞体中の細胞がフィラー体に接着するのを妨げる生体適合性物質を含む。これらの多細胞体とフィラー体は、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体または少なくとも１つのフィラー体と接触するパターンで配列されている。

本発明の別のさらなる態様は、複数の多細胞体を含む３次元構造体である。各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この構造体は、複数のフィラー体も含む。各フィラー体は、細胞が多細胞体からフィラー体に移動および内殖するのを妨げると共に、多細胞体中の細胞がフィラー体に接着するのを妨げる生体適合性物質を含む。これらの多細胞体とフィラー体は、多細胞体によって占められておらず、かつフィラー体によって占められていない複数の空間を３次元構造体中に形成するように配置されている。

本発明のさらに別の態様は、３次元人工生物組織を作製する方法である。この方法は、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触するようなパターンに従って、複数の細長い多細胞体を配列することを含む。各多細胞体は複数の生体細胞を含む。上記の多細胞体の少なくとも１つを少なくとも１つの他の多細胞体と融合させてもよい。

３次元人工生物組織を作製する方法の別の実施形態では、各多細胞体が（ｉ）別の多細胞体、または（ｉｉ）フィラー体の少なくとも１つと接触するようなパターンに従って、複数の多細胞体と複数のフィラー体を配列する。各多細胞体は複数の生体細胞を含む。各フィラー体は生体適合性物質を含み、この生体適合性物質は、細胞が多細胞体からその生体適合性物質に移動および内殖するのを妨げると共に、多細胞体中の細胞がフィラー体に接着するのを妨げる。上記の多細胞体の少なくとも１つを少なくとも１つの他の多細胞体と融合させてもよい。

３次元人工生物組織を作製する方法のさらに別の実施形態では、その方法は、複数の多細胞体を配列して、事前に選択した受容環境中で所定のパターンにするものである。このエンジニアリング法の１つの実施形態によれば、事前に選択したフィラー体と併せて多細胞体を用いてもよい。より詳細には、１つの実施形態では、この方法は、１）所定のパターンに従って、複数のフィラー体と所定どおりに組み合わせて複数の多細胞体を配列し、積み重ねた形または層状のコンストラクトを形成する工程であって、前記多細胞体とフィラー体が接触している工程と、２）成熟のために、事前に選択した制御環境に前記層状コンストラクトを沈積させ、それによって前記多細胞体が互いに融合し合って、融合コンストラクトをもたらすようにする工程と、３）前記融合コンストラクトからフィラー体を取り除いて、所望の生物学的コンストラクトを作製する工程とを含む。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１つのフィラー体と、互いに凝集し合っている複数の生体細胞とを含む３次元構造体である。この生体細胞は、上記の少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む管状構造体を形成する。上記のフィラー体はコンプライアントな生体適合性物質を含み、この生体適合性物質は、細胞がその物質に移動および内殖するのを妨げると共に、細胞がその物質に接着するのを妨げる。

本発明のさらに別の態様は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む多細胞体を作製するためのモールドである。このモールドは生体適合性基材を有し、この生体適合性基材は、細胞がその基材に移動および内殖するのを妨げると共に、細胞がその基材に接着するのを妨げる。この基材は、凝集力が比較的小さい複数の細胞を含む組成物を受容して、凝集力が増大して多細胞体が形成される成熟期の間、前記組成物を所望の形状に保つように成形されている。多細胞体の上記の所望の形状の長さは、少なくとも約１０００マイクロメートルであり、この形状は、多細胞体中のすべての細胞が、その多細胞体の外側から約２５０マイクロメートル以下に存在するように形作られている。

本発明の別の実施形態は、複数の多細胞体を作製するのに適したモールドを作製するためのツールであり、上記の各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。このツールは、最上部と底部とを有する本体を備える。この本体の底部からは、複数のフィンが伸びている。生体適合性のゲル基材内に溝が形成されるように、上記のフィンのそれぞれの幅は約１００マイクロメートル〜約８００マイクロメートルの範囲であり、上記のゲル基材は、上記の溝中に配置された生体細胞を細長い多細胞体に形成するように形作られている。上記のフィンは長手方向軸を有し、これらのフィンの少なくとも１つは、別のフィンの長手方向軸から横方向に隔置されている。

本発明の多細胞体の１つの実施形態の斜視図である。 表面によって支えられている本発明の多細胞体の拡大斜視図である。 表面上で互いに並列して隣接している関係にある複数の本発明の多細胞体の末端の拡大斜視図である。 人工組織の１つの実施形態を作製するのに適したパターンで配列された複数の多細胞体と複数のフィラー体とを含む３次元コンストラクトの１つの実施形態の斜視図である。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図２に示されている多細胞体を作製する方法の１つの実施形態を示している。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図２に示されている多細胞体を作製する方法の１つの実施形態を示している。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図２に示されている多細胞体を作製する方法の１つの実施形態を示している。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図２に示されている多細胞体を作製する方法の１つの実施形態を示している。 図３Ａ〜図３Ｄに示されている方法で用いるのに適しているモールドの１つの実施形態の斜視図である。 前記モールドの上面図である。 図４Ｂの線４Ｃ――４Ｃで前記モールドを切断した場合の断面図である。 図４Ｃに示されているようなモールドの一部の拡大断面図である。 図４Ａ〜図４Ｄに示されているモールドを作製するのに用いることができるツールの１つの実施形態の斜視図である。 図５Ａに示されているツールの側面図である。 図５Ｂに示されているようなツールの一部の拡大側面図である。 図４Ａ〜図４Ｄに示されているモールドを作製する目的で、図５Ａ〜図５Ｃに示されているツールを使用する方法の１つの実施形態を示している。 図４Ａ〜図４Ｄに示されているモールドを作製する目的で、図５Ａ〜図５Ｃに示されているツールを使用する方法の１つの実施形態を示している。 図４Ａ〜図４Ｄに示されているモールドを作製する目的で、図５Ａ〜図５Ｃに示されているツールを使用する方法の１つの実施形態を示している。 複数の多細胞体と複数のフィラー体とから作られた３次元コンストラクトの種々の実施形態の概略斜視図である。 複数の多細胞体と複数のフィラー体とから作られた３次元コンストラクトの種々の実施形態の概略斜視図である。 複数の多細胞体と複数のフィラー体とから作られた３次元コンストラクトの種々の実施形態の概略斜視図である。 複数の多細胞体と複数のフィラー体とから作られた３次元コンストラクトの種々の実施形態の概略斜視図である。 複数の多細胞体と複数のフィラー体とから作られた３次元コンストラクトの種々の実施形態の概略斜視図である。 複数の多細胞体とフィラー体とから３次元コンストラクトを作製するための種々の方法の概略図である。 複数の多細胞体とフィラー体とから３次元コンストラクトを作製するための種々の方法の概略図である。 本明細書に記載されている方法に従って、エンジニアリング技術によって作製した２つの管状構造体の写真であり、これらの構造体の外径はそれぞれ１２００マイクロメートルと９００マイクロメートルである。 本明細書に記載されている方法に従って、エンジニアリング技術によって作製した別の管状構造体の写真である。 本明細書に記載されている方法に従って、エンジニアリング技術によって作製した管状構造体であって、その管状構造体の管腔内にあるフィラー体と組み合わされている構造体の１つの実施形態の概略斜視図である。 球状の多細胞体が融合して、枝分かれした管状構造体が形成される様子を示している写真群である。 第１の組の多細胞体群が、その第１の組の多細胞体の組成とは異なる細胞型組成を有する第２の組の多細胞体と融合する様子を示している写真群である。 ゼラチンとフィブリンを含む人工管状構造体を示している写真群である。

すべての図面にわたり、対応する参照符号は対応する部分を示している。

本明細書で言及されているすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

人工組織を作製するための新たな構造体と方法を提供する。本発明の技術は、成熟を通じて所望の人工組織になり得る３次元コンストラクトを組み立てるのに使用できるビルディングブロックとして、新規な多細胞体を使用することを含む。各多細胞体は、その細胞体を単一の物体として取り扱う（例えば持ち上げて動かす）ことができるほど十分に互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。これらの多細胞体の凝集力は、その生体細胞が、隣接する多細胞体の生体細胞と凝集可能になるほど十分な期間にわたって、その多細胞体が（例えば、作業表面上で、または複数の多細胞体を含む組立体の形で）自立できるほど十分であるのが好適である。自立した多細胞体の形状で、複数の生体細胞を持ち上げて動かすことができると、多種多様な３次元コンストラクトを組み立てるための柔軟性が得られる。例えば、上記の多細胞体は、１つ以上のフィラー体（例えば、細胞が多細胞体からフィラー体に移動および内殖するのを妨げると共に、細胞がフィラー体に接着するのを妨げる生体適合性物質を含むフィラー体）と併せて用いて、成熟を通じて管状人工組織になり得るコンストラクトを組み立てることができる。また、上記の多細胞体およびフィラー体を用いて、成熟を通じて他の形状を有する人工組織になるコンストラクトを組み立てることもできる。さらに、上記の多細胞体は自立しているので、上記の多細胞体を支持体のゲルまたは足場に包埋する必要がない。むしろ、「大気中での印刷」ができることによって、多細胞体が互いに直接接触し合うような形で、多細胞体を配列しやすくなる。多細胞体間の接触度が向上すると、成熟中に、多細胞体の効率的かつ確実な融合を促すことができる。加えて、フィラー体は、成熟した人工組織の外側および内側（例えば管状構造体の管腔）から簡単に取り外すことができる。

上記に加えて、本発明のいくつかの方法では、上記の人工組織用のビルディングブロックとして、細長い多細胞体を用いる。細長い多細胞体はすでに、その多細胞体の長手方向軸沿いで、かなりの長さにわたって互いに凝集し合っているので、多細胞体の融合の確実性が向上しており、この融合を、より短時間で実現させることができる。さらに、細長い多細胞体を、並列して隣接している関係で配列して、かなりの長さを有する接触区域沿いで、多細胞体間を接触させることができる。これにより、隣接し合っている多細胞体を互いに、迅速かつ確実に融合させやすくすることができる。

本発明の材料とプロセスを用いて、３次元人工生物組織を作製する方法の概要を示してきたが、以下では、そのプロセスと材料について、さらに詳細に説明していく。
多細胞体

多細胞体（本明細書では、中間体細胞ユニットともいう）の１つの実施形態（概して１という符号が付されている）が図１に示されている。この多細胞体１は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。多細胞体１は、所望の３次元（３−Ｄ）形状で凝集し合っている複数の細胞を含み、これらの細胞は、ティッシュエンジニアリングまたは臓器工学のようなバイオエンジニアリングプロセスの際に操作および取り扱いがしやすいように、粘弾性粘稠性と十分な完全性を有する。十分な完全性とは、多細胞体が、後に行われる作業の間、その物理的形状（剛性ではなく、粘弾性粘稠性を有する形状）を保持できると共に、その細胞の生命力を維持できることを意味する。

多細胞体１は、事前に選択したいずれかの１つ以上の細胞型から構成されていてもよい。一般に、細胞型の選択は、所望の３次元生物組織に応じて変わることになる。例えば、血管タイプの３次元構造体をエンジニアリング技術で作製する目的で多細胞体を用いる場合には、その多細胞体を形成させるのに用いる細胞は有益なことに、脈管組織中に通常存在する１つまたは複数の細胞型（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞など）を含むことができる。多細胞体を用いて、異なる種類の３次元組織（例えば、腸、肝臓、腎臓など）をエンジニアリング技術で作製する場合には、他の細胞型を用いて多細胞体を形成させてもよい。当業者であれば、エンジニアリング技術で作製する３次元組織の種類に基づき、多細胞体に適した１つまたは複数の細胞型を選択できるであろう。好適な細胞型の非限定例としては、収縮性細胞すなわち筋細胞（例えば、筋芽細胞および心筋細胞を含む横紋筋細胞、ならびに平滑筋細胞）、神経細胞、線維芽細胞、結合組織細胞（骨と軟骨を構成する細胞型、骨形成細胞と軟骨細胞に分化できる細胞、およびリンパ組織を構成する細胞型を含む）、実質細胞、上皮細胞（窩腔および脈管または経路の内張りを形成する内皮細胞、外分泌および内分泌上皮細胞、上皮吸収細胞、角化上皮細胞、ならびに細胞外マトリックス分泌細胞を含む）、肝実質細胞、および未分化細胞（胚細胞、幹細胞、およびその他の前駆細胞など）などが挙げられる。例えば、多細胞体１を形成させる目的で用いる細胞は、生きているヒトまたは動物の被検体から得ることも、初代細胞株として培養することもできる。

多細胞体１は、ホモ細胞型であってもヘテロ細胞型であってもよい。ホモ細胞型多細胞体では、複数の生体細胞は、単一の細胞型の複数の生体細胞を含む。ホモ細胞型多細胞体の生体細胞のほぼすべては、単一の細胞型の細胞であり、低レベルの純度に対してある程度の許容性があり、そのホモ細胞型多細胞体を含むコンストラクトの成熟にごくわずかな影響しか及ぼさない異なる細胞型の細胞を比較的少数含む。

対照的に、ヘテロ細胞型多細胞体は、２種以上の細胞型の細胞を有意数含む。例えば、多細胞体は、第１の型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞（など）を含むことができ、この第２の細胞型は、第１の細胞型とは異なるものである。多細胞体を用いて脈管組織を作製する場合には、例えば、第１の型の細胞は内皮細胞であることができると共に、第２の型の細胞は平滑筋細胞であることができ、第１の型の細胞は内皮細胞であることができると共に、第２の型の細胞は線維芽細胞であることができ、または、第１の型の細胞は平滑筋細胞であることができると共に、第２の型の細胞は線維芽細胞であることができる。また、ヘテロ細胞型多細胞体は、第１の細胞型の複数の細胞と、第２の細胞型の複数の細胞と、第３の細胞型の複数の細胞とを含むこともでき、この第１、第２、および第３の細胞型のそれぞれは、第１、第２、および第３の細胞型のうちの他の型とは異なるものである。例えば、人工血管を作製するのに適した多細胞体は、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞を含むことができる。ヘテロ細胞型細胞体中の生体細胞は、未ソーティングのままであってもよく、または、人工組織用の特定の内部構造体を形成させるための融合プロセス中に、「ソーティング」（例えば自己集合）することもできる。細胞のセルフソーティングは、差次接着仮説（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）（ＤＡＨ）の予測と整合する。ＤＡＨは、構成細胞間の接着性と凝集性相互作用によって生じる組織表面張力および界面張力の観点で、細胞集団の液体様挙動を説明するものである。一般に、細胞は、細胞の接着力の差異に基づきソーティングすることができる。例えば、ヘテロ細胞型多細胞体の中心部にソーティングされる細胞型は一般に、その多細胞体の外側にソーティングされる細胞よりも接着力が強い（すなわち、表面張力が大きい）。

さらに、ヘテロ細胞型多細胞体が、正常な発達過程にある隣接組織である組織から採った細胞からなる場合には、ソーティングの際に、それらの細胞は、生理学的な立体配座を回復させる場合がある。したがって、ヘテロ細胞型多細胞体は、構成細胞の接着特性と凝集特性、および細胞が存在する環境に基づき、ある種の事前に構築された内部構造体を含んでもよい。この内部構造体を用いて、さらに複雑な生物構造体を構築することができる。例えば、単純な収縮管を構築する目的で、筋細胞からなるホモ細胞型多細胞体を用いることができる一方で、血管様構造体を構築する目的で、少なくとも２つの細胞型を用いることができる。例えば、人工血管を構築するのに用いるヘテロ細胞型多細胞体は好適には、（ｉ）内皮細胞および平滑筋細胞、（ｉｉ）平滑筋細胞および線維芽細胞、（ｉｉｉ）内皮細胞および線維芽細胞、または（ｉｖ）内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞を含むことができる。体内にランダムに分散しているこれらの多種多様な細胞型からなる多細胞体を用いて、３次元の生物構造体を構築することによって、構造体形成の際に、内皮細胞が管の内部構造体（すなわち管腔）を裏打ちし、平滑筋細胞が、内皮細胞を取り囲む層を形成し、線維芽細胞が、平滑筋層を取り囲む外層を形成するように、種々の細胞型をソーティングすることができる。この最適な構造は、多細胞体の組成（例えば、多種多様な細胞型同士の比率）を変えることによって、かつ、多細胞体のサイズによって実現させることができる。別の例として、ヘテロ細胞型多細胞体は、第１の細胞型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の細胞と、第３の型の複数の細胞とを含むことができる。このような多細胞体を用いて脈管組織を作製する場合には、例えば、第１の細胞型の細胞は好適には内皮細胞であることができ、第２の細胞型の細胞は好適には平滑筋細胞であることができ、第３の細胞型の細胞は好適には線維芽細胞であることができる。このようなヘテロ細胞型多細胞体でも、細胞のセルフソーティングが起きる場合がある。したがって、これらの多細胞体を用いて、３次元の生物構造体、例えば管状構造体を構築する場合には、構造体の形成の際に、内皮細胞が管の内部構造（すなわち管腔）を裏打ちし、平滑筋細胞が、内皮細胞を実質的に取り囲む層を形成し、線維芽細胞が管状構造体の外層を形成し、この外層が上記の内皮細胞の層と平滑筋細胞の層の両方を実質的に取り囲むように、上記の細胞型をソーティングしてよい。

場合によっては、多細胞体１は、複数の細胞に加えて、１種以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、または１種以上のＥＣＭ成分の１種以上の誘導体を含むのが好適である。例えば、多細胞体１は、各種ＥＣＭタンパク（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン）を含んでよい。下にさらに詳細に論じられているように、多細胞体を形成させるのに用いる細胞ペーストに、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を加えることができる。上記の細胞ペーストに加えるＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物の供給源から精製することも、当該技術分野において既知の組み換え法によって作製することもできる。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を多細胞体中の細胞によって自然に分泌させることも、多細胞体を作製する目的で用いる細胞を、当該技術分野において既知のいずれかの好適な方法によって遺伝子操作して、１種以上のＥＣＭ成分もしくはＥＣＭ成分の誘導体、および／または、１種以上の細胞接着分子もしくは細胞−基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびカドヘリン）の発現レベルを変えることもできる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞体中の細胞の凝集を促すことがある。例えば、好適には、多細胞体を形成する目的で用いる細胞ペーストに、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを加えることができる。続いて、トロンビンを加えることによって、上記のフィブリノゲンをフィブリンに転換させることができる。

上述のように、多細胞体１は場合によっては、組織培地を含むのが好適である。この組織培地は、生理学的な適合性のあるいずれの培地でもあることができ、通常は、当該技術分野において周知のように、含まれる細胞型（単数または複数）に従って選択することになる。この組織培地は例えば、糖およびアミノ酸のような基本栄養素、増殖因子、抗生物質（コンタミを最小限に抑えるためのもの）などを含んでもよい。

多細胞体１中の細胞の凝集力は、多細胞体１が３次元形状を保てると同時に、平面上で自立できるほど十分に強力であるのが好適である。図１Ｂでは例えば、多細胞体１は、平面１３上で自立している。多少の変形が（例えば、多細胞体１が表面１３と接触する場所で）見られるものの、好適にはその多細胞体の幅の少なくとも半分であり、より好適には幅と同等である高さを保つのに十分な凝集力をこの多細胞体は有する。同様に図１Ｂに示されているように、例えば、多細胞体１は、その多細胞体と表面１３との接触によって多細胞体の底部に形成された平らな外面１５によって支えられている。多細胞体１の全重量が表面１３によって支えられている場合、多細胞体のわずかな変形が原因で、接触面１５の面積Ａ１は、初期接触面積よりも大きいことがある。しかし、接触表面１５の面積Ａ１は、支持表面１３上の多細胞体１の２次元投影図の面積Ａ２よりも小さいのが好適である（図１Ｂ参照）。これは、多細胞体１の一部（例えば、図１Ｂに示されているような各側部）が、作業面１３上の多細胞体１によって支えられることを意味する。同様に、平面１３上に、２個以上の多細胞体１を互いに、並列して隣接している関係で配置する場合（図１Ｃ）、それらの多細胞体の自立能力は、それらの多細胞体が保っている３次元形状と合わさって、それらの多細胞体の側部の下と作業面上に空間１７を形成することができる。

また、多細胞体１とフィラー体が互いに積み重なるコンストラクトの形で多細胞体１を組み立てる場合に、多細胞体１が、同等のサイズかつ形状の少なくとも１つの多細胞体またはフィラー体の重量を支えられるほど、多細胞体１中の細胞の凝集力が十分に強力であるのが好適である（図２参照。さらなる詳細は後述されている）。また、多細胞体１を器具（例えばキャピラリーマイクロピペット）によって持ち上げられるほど、多細胞体１中の細胞の凝集力が十分に強力であるのが好適である（図３Ｄ参照。さらなる詳細は後述されている）。

さらに、多細胞体１は好適には、神経が発達していない（すなわち、実質的に神経がない）ものであることも、非軟骨性であることも、神経が発達しておらず、かつ非軟骨性であることもできる。このような多細胞体は、ヒトの手を加えなくても発生する生物構造体とは異なるので、「人工」多細胞体と称することができる。換言すると、上記の多細胞体は合成のものであり、すなわち、自然発生しないものである。

多細胞体１は、本発明の範囲内のさまざまなサイズと形状を有することができる。例えば、図１に示されている多細胞体１は管腔のない細胞体であり、これは、多細胞体を貫通する開放路がないことを意味する。例えば、多細胞体１には、その細胞体内に空間、空洞などが実質的にないのが好適である。これは、図１に示されている多細胞体１と、先行技術による人工血管およびその他の先行技術による管状人工組織との相違点の１つである。

図１Ａ〜図１Ｂに示されている多細胞体１は、酸素および／または栄養分が多細胞体の中心部分に拡散できないことが原因で生じる細胞壊死を制限するように形作られている。例えば、好適には、多細胞体１中のすべての生体細胞が、その多細胞体の外面から約２５０マイクロメートル以下にくるように、より好適には、多細胞体１中のすべての生体細胞が、その多細胞体の外面から約２００マイクロメートル以下にくるように、多細胞体１を形作るのが好適である。多細胞体１の中心部分の細胞が、多細胞体１の外面に近接しているので、その多細胞体の外面にある空間から、その多細胞体の中心部に向かって酸素および／または栄養分を拡散させることによって、その多細胞体中の細胞に酸素および／または栄養分を供給することができる。この多細胞体の１つ以上の部分（例えば中心部）の細胞の壊死が見られる場合もあるが、壊死は限定的である。

図１の多細胞体１は、その高さＨ１および幅Ｗ１よりも有意に長い長さＬ１を有する細長い細胞体である。この多細胞体１の長さＬ１は、好適には少なくとも約１０００マイクロメートル（例えば、約１０００マイクロメートル〜約３０センチメートルの範囲）であり、より好適には少なくとも約１センチメートル（例えば、約１センチメートル〜約３０センチメートルの範囲）であり、さらに好適には、少なくとも約５センチメートル（例えば、約５センチメートル〜約３０センチメートルの範囲）である。上記の多細胞体の長さＬ１には理論的上限はない。したがって、十分な量の生体細胞を得る問題、または、長い多細胞体を取り扱う問題などのように、長い多細胞体の作製に関連する実施上の問題を克服したいと考える限りは、本発明の範囲内で、長さが３０センチメートル（または、３０センチメートルとは異なる任意の長さ）を超える多細胞体を作製することも可能であると認められる。

図１に示されている細長い多細胞体１の高さＨ１および幅Ｗ１は、その長さＬ１よりも有意に短いのが好適である。例えば、長さＬ１は、幅Ｗ１の少なくとも２倍であると共に、高さＨ１の少なくとも２倍であるのが好適であり、これは、細胞体１のアスペクト比（すなわち、長さと直交する最長寸法に対する長さの比）が少なくとも約２、より好適には少なくとも約１０、さらに好適には少なくとも２０であることを意味する。上記の多細胞体１の寸法の説明から、アスペクト比も、本発明の範囲内で、２０よりも大幅に大きくできることが認められ、例えば、アスペクト比は２０００であることができる。

図１に示されている多細胞体１は、幅Ｗ１が比較的狭く、高さＨ１が比較的短い。例えば、多細胞体１の長さＬに沿って切断した断面の平均面積は、好適には約７，８５０平方マイクロメートル〜約３６０，０００平方マイクロメートルの範囲であり、より好適には約３１，４００平方マイクロメートル〜約２５０，０００平方マイクロメートルの範囲であり、さらに好適には約３１，４００平方マイクロメートル〜約９０，０００平方マイクロメートルの範囲である。別の例では、図１に示されている多細胞体１（実質的に円筒形であり、円形の断面を有する）の長さ方向沿いの平均直径は、好適には約１００マイクロメートル〜約６００マイクロメートルの範囲（約７，８５０平方マイクロメートル〜約２８２，６００平方マイクロメートルの範囲の平均断面積に対応する）であり、より好適には約２００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲（約３１，４００平方マイクロメートル〜約１９６，２５０平方マイクロメートルの範囲の平均断面積に対応する）であり、さらに好適には約２００マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲（約３１，４００平方マイクロメートル〜約７０，６５０平方マイクロメートルの範囲の平均断面積に対応する）である。

図１に示されている多細胞体１は実質的に円筒形であり、実質的に円形の断面を有するが、異なるサイズと形状を有する多細胞体も本発明の範囲内である。例えば、多細胞体は、本発明の範囲内で、断面が正方形、長方形、三角形、またはその他の非円形である細長い形状（例えば筒形状）であることができる。同様に、多細胞体は、本発明の範囲内で、概ね球状の形状、細長くない円筒形状、または立方体形状を有することができる。
多細胞体の作製方法

本発明の範囲内で、上記の特徴を有する多細胞体を作製するためのさまざまな方法が存在する。例えば、複数の生体細胞を含むか、または所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストから多細胞体を製作することができる。この細胞ペーストを所望の形状に成形し、成熟（例えばインキュベート）を通じて細胞体を形成させることができる。別の例では、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを細長い形状に成形することによって、細長い多細胞体を作製する。この細胞ペーストを制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、細長い多細胞体を形成させる。さらに別の例では、細胞ペーストを３次元形状に保つ器具の中で、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを成形することによって多細胞体を作製する。上記のように、平面上で自立するほど十分な凝集力を有する細胞体が作製されるほど十分な時間にわたり、上記の細胞ペーストを３次元形状に保ちながら、制御環境中でインキュベートする。

細胞ペーストは好適には、（Ａ）細胞または細胞集合体（本明細書では「事前に選択した」細胞または細胞集合体ともいう）（この細胞または細胞集合体は、単一の細胞型であっても複数の細胞型であってもよい）と細胞培地（本明細書では「事前に選択した」培地ともいう）を（例えば所定の比率で）混合して、細胞懸濁液（本明細書では細胞混合物ともいう）を得て、（Ｂ）この細胞混合物を圧縮して、所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストを作製することによって用意することができる。上記の圧縮作業は、当該細胞ペーストに必要な所望の細胞濃度（密度）、粘度、および稠度を実現させるように、細胞培養から得た特定の細胞懸濁液を濃縮することによるなど、多くの方法によって行ってもよい。例えば、モールド内で成形できるペレット中細胞濃度を実現させるために、細胞培養から得た比較的希薄な細胞懸濁液を所定の時間、遠心分離してもよい。タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮または圧縮する別の好適な方法である。また、必要とされる押し出し特性を付与する目的で、化合物を細胞懸濁液と組み合わせてもよい。本発明で用いてよい好適な化合物のいくつかの例としては、コラーゲン、ヒドロゲル、マトリゲル、ナノ繊維、自己集合性ナノ繊維、ゼラチン、フィブリノゲンなどが挙げられる。

したがって、これらの方法で用いる細胞ペーストは、複数の生体細胞を組織培地と混合し、これらの生体細胞を（例えば遠心分離によって）圧縮することによって作製するのが好適である。１種以上のＥＣＭ成分、または１種以上のＥＣＭ成分の１種以上の誘導体を細胞ペースト中に含める場合（さらなる詳細は後述されている）には、細胞ペーストは好適には、１種以上のＥＣＭ成分または１種以上のＥＣＭ成分の誘導体を含有する生理学的に許容可能な１種以上のバッファー中に再懸濁させることができ、その結果得られた細胞懸濁液を再度遠心分離して、細胞ペーストを形成させる。

さらなる処理のために望ましい、上記の細胞ペーストの細胞密度は、細胞型によって変わる場合がある。細胞間相互作用が細胞ペーストの特性を決定し、細胞密度と細胞間相互作用との関係は、細胞型によって異なることになる。細胞ペーストを成形する前に、細胞間相互作用を高める目的で細胞に前処理を施してもよい。例えば、細胞ペーストを成形する前に、細胞間相互作用を高める目的で、遠心後に遠心チューブ内で細胞をインキュベートしてもよい。

さまざまな方法を用いて、本発明による細胞ペーストを成形してよい。例えば、（例えば濃縮／圧縮後に）細胞ペーストを操作するか、手作業で成型するか、またはプレス加工して、所望の形状を実現させてよい。例えば、マイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）のような予め形成済みの器具であって、その器具の内面と同じ形になるように細胞ペーストを成形する器具の中に細胞ペーストを取り込んで（例えば吸引して）もよい。このマイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）の断面形状は、円形、正方形、長方形、三角形、またはその他の非円形の断面形状であることができる。また、プラスチックモールド、金属モールド、またはゲルモールドのような予め形成済みのモールドに細胞ペーストを沈積させることによって、細胞ペーストを成形してもよい。さらには、遠心鋳造または連続鋳造を用いて細胞ペーストを成形してもよい。

上記の方法の１つの例では、成形作業は、成形器具内に細胞ペーストを保持して、その成形器具内で細胞が部分的に互いに凝集し合えるようにすることを含む。例えば、図３Ａに示されているように、成形器具５１（例えばキャピラリーピペット）の中に細胞ペースト５５を吸引して、成熟期間（本明細書ではインキュベート期間ともいう）にわたって、その成形器具内に保持し（図３Ｂ）、細胞が少なくとも部分的に互いに凝集し合えるようにすることができる。第１の成形器具５１内で細胞を十分に凝集させることができる場合には、１回の成熟工程（例えば１回のインキュベート工程）のみを有するプロセスで、多細胞体１を作製することができる。例えば、この方法は、１つの成形器具５１内で細胞ペースト５５を成形することと、成形した細胞ペーストを１つの制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、多細胞体１を形成させることを含むのが好適である。この方法の場合、成形器具５１（例えばキャピラリーピペット）は好適には、下にさらに詳細に説明されているように、多細胞体を３次元コンストラクト中に自動的に配置する目的で使用できるバイオプリンターの印刷ヘッドまたは類似の装置の一部であることができる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体、例えばゼラチンおよび／またはフィブリノゲンは、多細胞体の総体的な凝集力を促進できるので、このような成分を細胞ペースト中に含めると、１回の成熟工程での多細胞体の作製が容易になる場合がある。しかし、細胞の生存能に影響が及ぶ前に、酸素および／または栄養分に触れる機会を細胞にせいぜい限定的にしか与えないキャピラリーピペットのような成形器具内に細胞を保持できる時間には制限がある。

所望の凝集力を実現させるほど十分に長い成熟期間にわたって、成形器具５１内に細胞を保持できない場合には、部分的に凝集した細胞ペースト５５をその成形器具（例えばキャピラリーピペット）から、栄養分および／または酸素を細胞に供給させる第２の成形器具３０１（例えばモールド）に移すと同時に、追加的な成熟期間にわたって、細胞をその第２の成形器具内に保持するのが好適である。栄養分および酸素を細胞に供給させる好適な成形器具３０１の１つの例は、図４Ａ〜図４Ｄに示されている。この成形器具は、複数の多細胞体（例えば、実質的に同一の多細胞体）を作製するためのモールド３０１である。モールド３０１は生体適合性基材３０３を含み、この基材は、細胞が基材３０３に移動および内殖するのを妨げると共に、細胞が基材３０３に接着するのを妨げる物質で作られている。モールド３０１は、細胞がモールドに増殖もしくは移動、または接着しないようにするいずれの物質で作られていてもよい。例えば、基材３０３は好適には、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステレンス鋼、ヒアルロン酸、アガロース、アガロース、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、またはゲル材（例えばアガロースゲルもしくはその他のヒドロゲル）、および類似の物質で作ることができる。

基材３０３は、比較的凝集力の小さい複数の細胞を含む組成物（例えば第１の成形器具５１から得られるもの）を受容するように、かつ、細胞の凝集力が向上して、上記の多細胞体１の特徴のいずれも有する多細胞体のように、成熟期間前の組成物よりも凝集力が大きい多細胞体が形成される成熟期間の間、上記の組成物を所望の３次元形状に保つように成形されている。また、モールド３０１は、（例えば、組織培地をモールド３０１の上に分注することによって）組織培地を細胞ペースト５５に供給できるように形作られているのが好適である。例えば、図４Ａ〜図４Ｄに示されているように、基材３０３には、複数の細長い溝３０５が形成されている。図４Ｄに示されているように、各溝の深さＤ２は、約５００マイクロメートル〜約１０００マイクロメートルの範囲であるのが好適である。実質的に円形の断面形状を有する細長い円筒形の多細胞体が形成されるように、図示されている実施形態の各溝３０５の底部は、弓状（例えば半円）の断面形状を有するのが好適である。溝３０５の幅Ｗ５は、モールド３０１内で作製される多細胞体の幅よりもわずかに広いのが好適である。例えば、溝３０５の幅Ｗ５は、約３００マイクロメートル〜約１０００マイクロメートルの範囲であるのが好適である。溝３０５の間の空間は重要ではないが、概して、モールド３０１内で作製できる多細胞体の数を増やす目的で、溝同士が比較的近くなるように溝が隔置されているのが望ましい。図示されている実施形態では例えば、溝３０５の間の基材３０３の各ストライプの幅Ｗ４は、約２ｍｍである。

本発明の範囲内で好適なモールドを作製するためのさまざまな方法が存在する。例えば、図５Ａ〜図５Ｃは、上記の多細胞体を作製するのに適したモールドを作製するのに用いることができるツール（概して２０１という符号が付されている）の１つの実施形態を示している。一般に、ツール２０１の一部は、部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成熟期間にわたって保持するモールド３０１の一部のネガ型となるように形作られている。例えば、ツール２０１は、本体２０３と、本体２０３から伸びている複数の突起２０５とを備えるのが好適である。各突起２０５のサイズと形状は、細胞ペースト５５をある形状に保つことになるモールド基材中に凹部すなわち受容区域を形成して、突起２０５によってモールド内に形成されたその凹部／受容区域内の細胞が、成形済みの細胞ペーストの外側から約３００マイクロメートル以下の位置にくるようにするのが好適である。

図５Ａ〜図５Ｃに示されている特定のツール２０１は、図４Ａ〜図４Ｂに示されているモールド３０１を作製するように形作られている。突起２０５は、本体２０３の底部２０７から伸びている複数のフィンとして形作られている。フィン２０５のそれぞれは、モールド３０１の溝３０５の１つのネガ型である。フィン２０５は長手方向軸２０９を有し（図５Ａ）、上記の細長い多細胞体１を作製するのに用いることができるモールドを作製するように形作られている。フィン２０５の少なくとも１つは、別のフィンの長手方向軸２０９から横方向に隔置されている。これは、ツール２０１と、ゲル電気泳動を行うためのゲル内にウェルを形成する目的で用いる従来のコームとの相違点の１つである。図示されている実施形態では、すべてのフィン２０５は実質的に互いに対して平行であり、各フィンは、他のフィンから、その長手方向軸２０９の横方向に隔置されている。フィン２０５は、すべてが実質的に互いに同一であるのが好適である。図５Ｃを参照すると、各フィン２０５は、本体２０３から約１．５ｍｍの距離Ｄ１だけ伸びているのが好適である。フィン２０５の遠位末端は、モールド３０１の溝３０５の底部の形状に対応する弓状（例えば半円）の断面形状を有する。各フィンの幅Ｗ３は約３００マイクロメートル〜約１０００マイクロメートルであるのが好適である。フィンを分離している距離Ｗ２は、約２ｍｍであるのが好適である。突起を細胞培養皿の底部よりも上に保つように、ツール２０１の縁２１１が細胞培養皿の周縁上に位置するように形作られているのが好適である。ツール２０１は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼などのように、モールドが簡単に離れるさまざまな物質で作製することができる。

モールド３０１を作製するためには、図６Ａに示されているように、凝固するかまたはゲルとして固まるように作製できる液体２２３で細胞培養皿２２１を満たすのが好適である。例えば、この液体はアガロース溶液２２３であることができる。ツール２０１を細胞培養皿２２１の上に配置して（図６Ｂ）、縁２１１が細胞培養皿の周縁２２５の上にくると共に、突起２０５（例えばフィン）が、ツール２０１の底部２０７から液体２２３まで及ぶようにする。液体２２３を固化させて、突起２０５（例えばフィン）の遠位末端を取り囲む固体基材またはゲル基材を形成させる。続いて、ツール２０１を細胞培養皿から持ち上げて、新たに作製されたモールド３０１からツール２０１を引き離す（図６Ｃ）。

したがって、第２の成形器具を用いる場合には、部分的に凝集した細胞ペースト５５を第１の成形器具５１（例えばキャピラリーピペット）から第２の成形器具（例えば、図４Ａ〜図４Ｄに示されているモールド３０１）に移すのが好適である。部分的に凝集した細胞ペースト５５は、図３Ｃに示されているように、第１の成形器具５１（例えばキャピラリーピペット）によってモールド３０１の溝３０５に移すことができる。すなわち、この方法は、部分的に凝集した細胞ペースト５５を第２の成形器具３０１に移すことと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形器具内に保持して、多細胞体１を形成させることとを含む。モールド３０１を、その中に保持されている細胞ペースト５５と共に制御環境中でインキュベートし、細胞ペースト中の細胞が互いにさらに凝集し合うようにして、多細胞体１を形成させる成熟期間の後には、図３Ｄに示されているように、得られた多細胞体１を器具５１’、例えばキャピラリーピペットで持ち上げられるほど、上記の細胞の凝集力は十分に強力になることになる。このキャピラリーピペット５１’（モールド３０１の溝３０５から持ち上げた成熟した多細胞体１を含んでいる）は好適には、下にさらに詳細に説明されているように、多細胞体を３次元コンストラクト中に自動的に配置する目的で使用できるバイオプリンターまたは類似の装置の印刷ヘッドの一部であることができる。

したがって、多細胞体１を作製する方法の１つの例では、成形作業は、細胞ペースト５５を第１の成形器具５１内に保持して、第１の成形器具内で細胞が部分的に互いに凝集し合えるようにすることと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形器具３０１に移すことと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形器具内に保持して、多細胞体１を形成させることとを含む。しかし、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを細胞ペーストに加えるようないくつかの実施形態では、細胞が、第１の成形器具５１内で多細胞体を形成させるほど十分に凝集する場合もあり、細胞ペースト５５を第２の成形器具３０１に移して、その細胞ペーストを第２の成形器具内に保持する工程は、不要であることもある。

第１の成形器具５１としては好適には、キャピラリーピペットを挙げることができ、第２の成形器具としては、上記のモールド３０１のように、細胞を第２の成形器具に保ったまま、栄養分と酸素を細胞に供給できる器具を挙げることができる。

多細胞体の断面形状とサイズは実質的に、その多細胞体を作製する目的で用いる第１の成形器具と任意で第２の成形器具との断面形状とサイズに対応することになり、当業者であれば、上述の断面形状、断面積、直径、および長さを有する多細胞体を作製するのに適した好適な断面形状、断面積、直径、および長さを有する好適な成形器具を選択できるであろう。

上述のように、多種多様な細胞型を用いて、本発明の多細胞体を作製してよい。したがって、例えば上で列挙したすべての細胞型を含め、１つ以上の型の細胞または細胞集合体（ヒトおよび動物の体細胞）を出発材料として用いて、細胞ペーストを作製してよい。例えば、平滑筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞、間葉幹細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞、シュヴァン細胞、肝実質細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞のような細胞を用いてよい。対象受容者に由来する（例えば生検によって採取した）細胞、または１種以上の樹立細胞株に由来する細胞のサンプルを培養して、多細胞体を製作するのに十分な量の細胞を作製することができる。対象受容者に由来する細胞から作製した多細胞体は、宿主の炎症反応、または、受容者による、移植臓器もしくは移植組織に対するその他の急性もしくは慢性拒絶反応を回避するのに有益である。

上述のように、多細胞体はホモ細胞型であることも、ヘテロ細胞型であることもできる。ホモ細胞型多細胞体を作製するためには、細胞ペーストはホモ細胞型、すなわち、単一の細胞型の複数の生体細胞を含むのが好適である。ホモ細胞型多細胞体を作製するのに用いる細胞ペースト中の生体細胞のほぼすべては、単一の細胞型の細胞であることになり、低レベルの純度に対してある程度の許容性があり、当該細胞ペーストから作製したホモ細胞型多細胞体を含むコンストラクトの成熟にごくわずかな影響しか及ぼさない異なる細胞型の細胞を比較的少数含む。例えば、ホモ細胞型多細胞体を作製するための細胞ペーストは、第１の型の細胞を含むのが好適であり、細胞ペースト中の細胞の少なくとも約９０パーセントは、その第１の細胞型の細胞である。

一方、ヘテロ細胞型多細胞体を作製するためには、細胞ペーストは、２つ以上の細胞型の細胞を有意数含むのが好適である（すなわち、細胞ペーストはヘテロ細胞型となる）。例えば、この細胞ペーストは、第１の型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞を含むことができ、この第２の細胞型は、第１の細胞型とは異なるものである。別の例では、細胞ペーストは、第１の細胞型の複数の生体細胞と、第２の細胞型の複数の生体細胞と、第３の細胞型の複数の生体細胞を含むことができる。したがって、この細胞ペーストを用いて、ヘテロ細胞型多細胞体を作製してから、そのヘテロ細胞型多細胞体を用いて脈管組織を作製する場合には、細胞ペースト中の複数の生体細胞は好適には、（ｉ）内皮細胞および平滑筋細胞、（ｉｉ）平滑筋細胞および線維芽細胞、（ｉｉｉ）内皮細胞および線維芽細胞、または（ｉｖ）内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞を含むことができる。上でさらに詳細に論じたように、ヘテロ細胞型細胞ペーストを用いて多細胞体を作製する場合、細胞の接着強度の相違に基づき、成熟および凝集プロセス中に生体細胞を「ソーティング」してよく、生体細胞は、それらの生理学的な立体配座を回復させる場合がある。

好適には、複数の生体細胞に加えて、１種以上のＥＣＭ成分または１種以上のＥＣＭ成分の１種以上の誘導体（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン）を細胞ペーストに含めて、上記のように、これらの物質を多細胞体に組み込むことができる。細胞ペーストに加えるＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物の供給源から精製することも、当該技術分野において既知の組み換え法によって作製することもできる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を細胞ペーストに加えると、多細胞体中の細胞の凝集が促進される場合がある。例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを細胞ペーストに加えることができる。より詳細には、１０〜３０％のゼラチン溶液と１０〜８０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン溶液を複数の生体細胞と混合して、ゼラチンとフィブリノゲンを含む細胞懸濁液を形成させることができる。続いて、この細胞懸濁液を（例えば遠心分離によって）圧縮して、細胞ペーストを形成させることができる。次いで、このプロセスによって形成した細胞ペーストを成形し、制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、多細胞体を形成させることができる。（例えば印刷プロセス中に）トロンビンを加えることによって、上記のフィブリノゲンをフィブリンに転換させることができる。例えばゼラチンおよびフィブリノゲンのようなＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を細胞ペーストに含める場合には、成形工程は、細胞ペーストを１つの成形器具内に保持して、多細胞体を形成させることを含むのが好適であり、インキュベート工程は、この成形した細胞ペーストを１つの制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、多細胞体を形成させることを含むのが好適である。

本発明は、複数の細胞または細胞集合体を含む多細胞体であって、所望の３Ｄ形状に形成された多細胞体を作製する方法も提供する。本発明の作製法は一般に、１）事前に選択した複数の細胞または細胞集合体を含む細胞ペースト（例えば、所望の細胞密度と粘度を有するもの）を用意する工程と、２）この細胞ペーストを（例えば所望の形状に）成形する工程と、３）成熟を通じて前記多細胞体を形成させる工程とを含む。

上記の形成工程は、多細胞体（例えば細胞ユニット）を確実に凝集させる目的で、１つまたは複数の工程を通じて行ってもよい。特定のプロセスでは、初期成熟時に、細胞ペーストを部分的に安定化させるか、または部分的に硬化させて、さらなる作業が行えるほど十分な完全性を有する多細胞体を形成させてもよい。

１つの実施形態によれば、上記の形成工程は、２つのサブ工程、すなわち、Ａ）初期成熟のための第１の期間（例えば所定の期間）にわたって、細胞ペーストをマイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）のような成形器具内に保持するサブ工程と、Ｂ）さらなる成熟のための第２の期間（例えば所定の期間）にわたって、上記の成形した細胞ペーストをモールドのような保持器具に沈積させるサブ工程であって、細胞がそのモールドに増殖もしくは移動、または接着しないようにできる物質から前記保持器具が作られているサブ工程とを含んでもよい。上記の初期成熟は、上記のさらなる成熟プロセスでの作業中に細胞ペーストが無傷の状態を保つのに十分な安定性を細胞ペーストにもたらすことになる。

さまざまな方法を用いて、上記のさらなる成熟プロセスを促すことができる。１つの実施形態では、凝集を助長するための期間（細胞型によって決まる場合がある）にわたって、細胞ペーストを約３７℃でインキュベートしてよい。この代わりに、またはこれに加えて、接着を助長する因子および／またはイオンを含む細胞培地の存在下で、細胞ペーストを保持してもよい。

例えば、円筒形状の細胞ペーストの円筒形を壊すことなくマイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）から押し出すことができるほど細胞が接着するまで、その細胞ペーストをマイクロピペット内でインキュベートした後（すなわち初期成熟プロセスの後）、さらなる成熟プロセスで、細胞ペーストをさらにインキュベートして、培地と共に培養してよく、このプロセスによって、所望の形状を保つように促す。
フィラー体

本発明は、所望の３次元人工生物組織を形成する目的で、上記の多細胞体と併せて用いることができるフィラー体も提供する。具体的には、本発明は、生物学的コンストラクトを構築するためのビルディングユニットとして、多細胞体と併せて用いるフィラー体（本明細書では「フィラーマトリックスユニット」ともいう）も提供し、このフィラー体を用いて、多細胞体が欠けている所望の３Ｄバイオコンストラクトの領域を画定する。本発明のフィラー体は、細胞がそのフィラー体に増殖もしくは移動、または接着しないようにできる物質で作られた所定の形状を有するフィラー体であるのが好適である。本発明のフィラー体の材料は、栄養培地（本明細書では、組織培地または細胞培地ともいう）に対する透過性があるのが好適である。例えば、本発明のフィラー体の材料は、アガロース、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、および寒天、もしくはその他のヒドロゲルからなる群から選択された生体適合性ゲル物質、または、ゲル以外の可とう性生体適合性物質であるのが好適である。本発明のフィラー体は好適には、種々の材料または種々の濃度の同じ材料から形成させることができる。例えば、管腔を形成するフィラー体を４％のアガロースで作製できる一方で、所望の３次元人工生物組織を構築するのに用いる残りのフィラー体を２％のアガロースで作製することができる。本発明のフィラー体は、対応する多細胞体（円筒形状を有するのが好ましい）の形状またはサイズに従っていれば、いずれの形状またはサイズを呈してもよい。

いくつかの実施形態では、フィラー体は、そのフィラー体と共に所望の３次元人工生物組織を構築するのに用いられる多細胞体の形状とサイズと実質的に同一の形状とサイズを有する。したがって、例えば、本発明のフィラー体は好適には、多細胞体１との関連で上に記した形状のうちのいずれかを有することができる。例えば、フィラー体と多細胞体の双方とも、（図２に示されているように、）実質的に円筒形であると共に、直径が実質的に同一である実質的に円形の断面を有してもよい。

多細胞体が互いに融合したときに、所望の３次元人工生物組織が形成されるようなパターンに従って、フィラー体と多細胞体を配列できるならば、フィラー体と多細胞体は異なるサイズおよび／または形状を有することができる。例えば、（図２に示されているように、）本発明のフィラー体は実質的に円筒形であることができ、本発明の多細胞体は実質的に球状であることができる。さらに、本発明のフィラー体と多細胞体は双方とも、細長いと共に、実質的に円筒形であるが、長さが異なっていてもよい。当業者であれば、さまざまなサイズおよび形状のフィラー体と多細胞体を組み合わせて、所望の３次元人工生物組織を形成できる方法が数多く存在することを認識するであろう。

好適なゲル様物質を所定の形状に成形することによって、フィラー体を作製するのが好適である。１つの実施形態によれば、この方法は、１）フィラー材料（すなわち、事前に選択したフィラー材料）の粘度を減少（低下）させて液体様物質にする工程と、２）その液体様物質を（例えば、事前に選択した形状に）成形する工程と、３）その物質の粘度を増大（上昇）させ、凝固させてフィラー体（例えば、事前に選択した形状を有するフィラー体）にする工程とをさらに含んでもよい。

フィラー材料の直接または間接加熱、加圧、またはフィラー材料の濃度の変更を含め、多くの既知の方法を用いて、フィラー材料の粘度を減少させてよい。さらに、上記の成形工程でも、フィラー材料をプレキャストモールドに沈積させる方法、または、ピペットによって、もしくはピストンの下方向への移動によって、フィラー材料を所望の形状のチャンバーに注入する方法のような多くの方法を用いてもよい。さらに、フィラー材料を直接または間接的に冷却する方法、溶媒を除去もしくは蒸発させるか、溶媒を除去もしくは蒸発可能にする方法、フィラー剤を硬化させる化学作用を可能にする方法、構成成分の濃度を変える方法、または、化学作用もしくはその他の作用によってポリマー物質の架橋を可能にする方法を含め、多くの既知の方法を用いて、フィラー材料の粘度を増大させて、その形状を強固なものにしてもよい。

例えば、１つの実施形態によれば、アガロース溶液（元々粉末状態であるアガロースをバッファーおよび水と混合したもの）を加熱してその粘度を低下させ、所望の寸法を有するキャピラリーピペット（すなわちマイクロピペット）の中に（または、ピストンの下方向への移動によって所望の形状のチャンバーの中に）取り込んで（例えば吸引して）もよい。フィラー体の所望の断面形状に応じて、さまざまな断面形状を有するキャピラリーピペットを用いることができる。例えば、長さに沿って切断した断面が実質的に円形であるキャピラリーピペットを用いて、実質的に円筒形であると共に、実質的に円形の断面形状を有するフィラー体を作製することができる。あるいは、長さに沿って切断した断面が実質的に正方形であるキャピラリーピペットを用いて、実質的に筒形であると共に、正方形の断面形状を有するフィラー体を作製することができる。当業者であれば、同様の方式で、上記のような多細胞体を作製する際に用いられるようなキャピラリーピペットを用いて、多種多様な断面形状を有するフィラー体を作製できることを認識するであろう。

例えばピペットの外側に強制空気を供給するか、または、冷液の入った容器の中にピペットを入れることによって、ピペット（またはチェンバー）内のアガロース溶液を室温まで冷却して、アガロース溶液が凝固して、所望の形状を有するアガロースゲル、すなわちフィラー体になることができるようにしてもよい。得られたフィラー体は、特定のバイオコンストラクトの構築中に、ピペットまたはチェンバーから押し出してもよい。

バイオプリンターまたは類似の装置は、多細胞体とフィラー体との配列体を含む３次元コンストラクトを組み立てるので、フィラー体は好適には、バイオプリンターまたは類似の装置によって作製することができる。例えば、キャピラリーピペットは、バイオプリンターの印刷ヘッドの一部であることができる。３次元コンストラクトにフィラー体が必要な場合には、ゲルとして固まることができる液体の供給源に、キャピラリーピペットを移動させることができる。例えば、液体状態に保つ目的で加熱されているアガロース溶液の供給源に、キャピラリーピペットを移動させることができる。上記の液体をキャピラリーピペットの中に吸引し、その液体を成形してフィラー体の形状にすることができる。続いて、アガロースのゲル化を促進する目的で、キャピラリーピペットを（例えば冷水浴中に浸すことによって）冷やすことができる。
３次元コンストラクト

本発明の方法に従って上記の多細胞体とフィラー体を用いて、３次元人工生物組織を作製することができる。簡潔に言うと、各多細胞体が（ｉ）別の多細胞体、または（ｉｉ）フィラー体のうちの少なくとも１つと接触するようなパターンに従って、複数の多細胞体と複数のフィラー体を配列する。続いて、その多細胞体を少なくとも１つの他の多細胞体と融合させて、３次元人工生物組織を形成させる。次いで、融合した多細胞体からフィラー体を引き離して、人工組織を得ることができる。

本発明の３次元構造体の１つの実施形態（概して１０１という符号が付されている）は、図２に示されている。この構造体１０１は、複数の細長い多細胞体１を含み、その各多細胞体は、上記の細長い多細胞体１と同一であるのが好適である。例えば、細長い多細胞体１のそれぞれは、自立する多細胞組織体であって、大気中で印刷することができる多細胞組織体を作製するための上記の方法に従って作製したものであるのが好適である。各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触するパターンで、多細胞体１が配列されている。図１Ｃを参照するとよく分かるように、かなりの長さを有する接触区域沿いで、多細胞体１の少なくとも１つが別の多細胞体と接触する。図１Ｃには、２つの多細胞体１が表面１３の上で並列して隣接している関係で示されており、図２に示されているパターンでは配列されていないが、２つの多細胞体１の間の接触区域は、多細胞体が互いに並列して隣接している関係にあるパターンで多細胞体が配列されている図１Ｃに示されている接触区域と実質的に同様であり得ることを理解されたい。例えば、図２の配列では、かなりの長さを有する接触区域全体にわたって、各多細胞体１が少なくとも１つ（例えば２つ）の他の多細胞体と接触する。並列関係にある隣接し合う細長い多細胞体の間の接触区域の長さは、好適には少なくとも約１０００マイクロメートル、より好適には少なくとも約１センチメートル、より好適には少なくとも約５センチメートル、さらに好適には約５センチメートル〜約３０センチメートルの範囲である。別の例では、この接触区域の長さは、好適には約１０００マイクロメートル〜約３０センチメートルの範囲、より好適には約１センチメートル〜約３０センチメートルの範囲である。接触区域の長さは、多細胞体１の長さに相当することができる。多細胞体１の長さには理論的上限がないので、十分な量の細胞ペーストを得る必要性のように、長い多細胞体の作製に関連する実施上の問題を克服したいと考える限りは、上記の接触区域の長さは、本発明の範囲内で、３０センチメートル（または３０センチメートル以外のいずれかの任意の長さ）を超えることができる。図２では、多細胞体１は互いに接触し合っているが、この成熟の初期段階では、多細胞体は互いに凝集し合ってはいない。

本発明の構造体は、１つ以上のフィラー体５も含み、その各フィラー体は、上記のフィラー体と同一であるのが好適である。例えば、図２の構造体は複数の離散したフィラー体５を含む。多細胞体と共に、各フィラー体が少なくとも１つの多細胞体または別のフィラー体と接触するようなパターンで、フィラー体５が配列されている。図２における多細胞体１とフィラー体５は、構造体１０１の中に複数の空間１７を形成するように配列されており、これらの空間は、多細胞体１によって占められておらず、かつフィラー体５によっても占められていない。空間１７には、組織培地が含まれているのが好適であり、この培地は、多細胞体１およびフィラー体５の最上部の上から流し込むことによって、構造体１０１に加えることができる。したがって、空間１７は、（例えば成熟中に、）栄養分および／または酸素を多細胞体１中の細胞に供給しやすくすることができる。

図２に示されている構造体の多細胞体１は、ホモ細胞型細胞体であることも、ヘテロ細胞型細胞体であることも、これらの組み合わせであることもできる。特に、多細胞体１は好適には、上記のいずれの細胞型および細胞型の組み合わせも含むことができる。図示されているように、多細胞体１は、その中に含まれる細胞型が実質的に同一であるのが好適である。しかし、本発明の範囲内で、１つ以上の多細胞体が、その構造体中の他の多細胞体と異なる細胞型の細胞を含むことも可能である。例えば、１つ以上の各多細胞体１中の大半の細胞は好適には、第１の細胞型（例えば、内皮細胞または平滑筋細胞）の細胞であることができ、構造体１０１の１つ以上の他の各多細胞体中の大半の細胞は、上記の第１の細胞型とは異なる第２の細胞型（例えば、平滑筋細胞または線維芽細胞）の細胞であることができる。多細胞体１は、形状が実質的に均一であるのが好適である。フィラー体も、形状が実質的に均一であるのが好適である。さらに、図２に示されているように、多細胞体１は、フィラー体５の形状と実質的に同一な形状を有する。

多細胞体１の少なくともいくつか（例えばすべての多細胞体）は、管様構造体３１を形成するように配列されている。少なくとも１つのフィラー体５’が、管様構造体３１の内側にあると共に、管様構造体３１を形成する多細胞体１に実質的に囲まれている。例えば、図２の多細胞体１は、フィラー体５のうちの１つを取り囲む管様構造体３１を形成するように、六角形の配置で配列されている。図２の六角形の配置の各多細胞体１は、少なくとも２つの隣接する細長い多細胞体と、並列して隣接している関係にある。この配列では、管様構造体３１の内側にある１つ以上のフィラー体５’は、管腔を形成するフィラー体である。この管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’がこのように称されるのは、細胞が多細胞体１から、管様構造体３１を貫通している細長い空間（この空間は、下記の方法に従って構造体を成熟させた後、管腔になる）に移動および内殖するのを防ぐからである。管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’は、成熟中には、そのフィラー体自体の中には管腔を発生させない。一般に、管様構造体の内側にフィラー体があるか否かを問わず、成熟を通じて、複数の生体細胞を含む管状人工組織を作製することができる多細胞体のいずれの配列体も、管様構造体とみなすことができる。この成熟段階では、隣接し合う多細胞体が互いに凝集し合っていないので、管様構造体を形成する２つの隣接し合う多細胞体の間の空間に、物体を押し込むことができることから、管様構造体が管状構造体とは異なるものであり得ることは、上記の内容から明らかである。

３次元構造体の別の実施形態（概して２０１という符号が付されている）は、図７に示されている。指定のない限り、この構造体は、図２に示されていると共に上記されている構造体と実質的に同一であることができる。図７の構造体２０１は、複数の多細胞体を含み、その各多細胞体は、上記の多細胞体１と同一であることができる。しかし、この構造体２０１では、構造体２０１を形成するパターンで配列されている２つの異なる組の多細胞体１’、１’’が存在する。第１の組の多細胞体１’中の大半の細胞（例えば少なくとも約９０パーセントの細胞）は、第１の細胞型の細胞であり、第２の組の多細胞体１’’中の大半の細胞（例えば少なくとも約９０パーセントの細胞）は、上記の第１の細胞型とは異なる第２の細胞型の細胞である。例えば、第１の組の多細胞体１’中の大半の細胞は好適には内皮細胞であることができ、第２の組の多細胞体１’’中の大半の細胞は好適には平滑筋細胞であることができる。別の例として、第１の組の多細胞体１’中の大半の細胞は好適には内皮細胞であることができ、第２の組の多細胞体１’’中の大半の細胞は線維芽細胞であることができる。さらに別の例として、第１の組の多細胞体１’中の大半の細胞は好適には平滑筋細胞であることができ、第２の組の多細胞体１’’中の大半の細胞は線維芽細胞であることができる。他の細胞型を用いることも可能である。第１の組の多細胞体１’は、管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’を取り囲む六角形の配置（上記の六角形の配置と同様の配置）で配列されている。第２の組の多細胞体１’’は、第１の組の多細胞体１’と、管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’とを取り囲む、上記よりも大きい六角形の配置で配列されている。多細胞体１’と１’’が合わさって、２つの異なる型の細胞を含む管様構造体２３１を形成する。第１の組の多細胞体１’は、管様構造体２３１の内層を形成するように配列されており、第２の組の多細胞体１’’は、管様構造体２３１の外層を形成するように配列されている。したがって、第１の細胞型の細胞（例えば内皮細胞）は、管様構造体２３１の内側部分の方に集中しており、第２の細胞型の細胞（例えば平滑筋細胞）は、管様構造体２３１の外側部分の方に集中していて、第１の組の多細胞体１’における内皮細胞の数の非内皮細胞の数に対する比率が、第２の組の多細胞体１’’における内皮細胞の数の非内皮細胞の数に対する比率よりも大きくなるように、または、第２の組の多細胞体１’’における平滑筋細胞の数の平滑筋細胞でない細胞の数に対する比率が、第１の組の多細胞体１’における平滑筋細胞の数の平滑筋細胞でない細胞の数に対する比率よりも大きくなるようになっている。この配列体は、第１の型の細胞からなる内層と、第２の型の細胞からなる外層とを有する管状人工組織の作製を容易にすることができる。例えば、構造体２０１を用いて、内皮細胞からなる内層と、平滑筋細胞からなる外層とを有する人工血管を作製することができる。別の例では、複数の内皮細胞と複数の平滑筋細胞とをそれぞれ含む第１の組の多細胞体１’が、管様構造体２３１の内層を形成するように配列されており、線維芽細胞を含む第２の組の多細胞体１’’が、管様構造体２３１の外層を形成するように配列されている。したがって、内皮細胞は、管様構造体２３１の内側部分の方に集中しており、平滑筋細胞は、管様構造体２３１の中央部分の方に集中しており、線維芽細胞は、管様構造体２３１の外側部分の方に集中していて、第２の組の多細胞体１’’における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率が、第１の組の多細胞体１’における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率よりも大きくなるようになっている。別の例では、内皮細胞をそれぞれ含む第１の組の多細胞体１’が、管様構造体２３１の内層を形成するように配置されており、複数の平滑筋細胞と複数の線維芽細胞とをそれぞれ含む第２の組の多細胞体１’’が、管様構造体２３１の外層を形成するように配列されている。したがって、内皮細胞は、管様構造体２３１の内側部分の方に集中しており、平滑筋細胞は、管様構造体２３１の中央部分の方に集中しており、線維芽細胞は、管様構造体２３１の外側部分の方に集中していて、第１の組の多細胞体１’における内皮細胞の数の非内皮細胞の数に対する比率が、第２の多細胞体１’’における内皮細胞の数の非内皮細胞の数に対する火散るよりも大きくなるようになっている。

図７Ａは、本発明の別の例の３次元構造体２５１を示している。この構造体２５１は、第３の組の多細胞体１’’’も含む点以外は、図７に示されている構造体と実質的に同じである。第３の組の多細胞体１’’’中の大半の細胞は、第１の組の多細胞体１’と第２の組の多細胞体１’’の細胞型の大半を構成する各細胞型とは異なる細胞型の細胞である。第３の組の多細胞体１’’’は、第２の組の多細胞体１’’を取り囲むと共に多細胞体１’’と隣接する概ね六角形の配置で配列されているのが好適である。したがって、第３の組の多細胞体１’’’は、第２の組の多細胞体１’’と、第１の組の多細胞体１’とを取り囲むのが好適である。多細胞体１’、１’’、および１’’’が合わさって、３つの多細胞体層によって形成される管様構造体２６１を形成するのが好適である。管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’が、管様構造体２６１を軸方向で貫通している。構造体２５１を用いて、人工血管を形成する場合には、第１の組の多細胞体１’中の大半の細胞は内皮細胞であるのが好適であり、第２の組の多細胞体１’’中の大半の細胞は平滑筋細胞であるのが好適であり、第３の組の多細胞体１’’’中の大半の細胞は線維芽細胞であるのが好適であり、第３の組の多細胞体１’’’における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率が、第１の組の多細胞体１’または第２の組の多細胞体１’’における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率よりも大きくなるようになっている。しかし、多細胞体１’、１’’、１’’’の大半の細胞型は、本発明の範囲内で、他の細胞型であることもできる。

本発明の別の実施形態の３次元構造体３０１が図８に示されている。指定のない限り、この構造体３０１は、上記されていると共に図２に示されている構造体１０１と実質的に同一である。この実施形態では、図２に示されている構造体１０１で用いられている細長い円筒形多細胞体１のそれぞれが、実質的に球状の一連の多細胞体１１と置き換えられている。球状の多細胞体１１は、自立する多細胞体を作製するための上記の方法に従って作製するのが好適である。当然ながら、球状の多細胞体１１は、上記の多細胞体１の細長い特徴のいずれも有していないので、球状の多細胞体１１の形状は、上記の多細胞体１とは異なる。球状の多細胞体１１は、管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’を取り囲む管様構造体３３１を形成するように配列するのが好適である。球状の多細胞体の融合を容易にする目的で、一連（例えば一列）の多細胞体はそれぞれ、隣接する一連の多細胞体からオフセットさせて、球状の各多細胞体の中心が、隣接する一連の多細胞体中の隣接し合っている球状の多細胞体の中心間の距離の約２分の１の点と軸方向で揃うようにすることができる。これによって、隣接し合っている球状の多細胞体１１の接触面積が増大するので、融合を容易にすることができる。図８では、管腔を形成する１つ以上のフィラー体５’を取り囲む多細胞体１１の層は１つのみであるが、図７または図７Ａにおける多細胞体１’、１’’、および１’’’を球状の多細胞体１１と置き換えることもできる。球状の多細胞体では、細胞型、それぞれ異なる多細胞体における細胞型の組み合わせ、多細胞体中の細胞型の組み合わせに関して、細長い多細胞体と同じ選択肢が得られる。

本発明の、図示されていない別の実施形態の３次元構造体では、その構造体は、上記されていると共に図２に示されている構造体１０１と実質的に同一である。この実施形態では、図２に示されている構造体１０１で用いられている細長い円筒形の各フィラー体が、実質的に球状の一連のフィラー体と置き換えられている。この球状のフィラー体は、自立するフィラー体を作製するための上記の方法に従って作製するのが好適である。当然ながら、この球状のフィラー体は、上記のフィラー体の細長い特徴のいずれも有していないので、この球状のフィラー体の形状は、上記のフィラー体とは異なる。これらの球状のフィラー体を積み重ねやすくする目的で、一連（例えば一列）のフィラー体はそれぞれ、隣接する一連のフィラー体からオフセットさせて、球状の各フィラー体の中心が、隣接する一連のフィラー体中の隣接し合っている球状のフィラー体の中心間の距離の約２分の１の点と軸方向で揃うようにすることができる。これによって、隣接し合っている球状のフィラー体の接触面積が増大するので、積み重ねやすくすることができる。このような球状のフィラー体では、材料（例えばアガロースなど）に関して、細長いフィラー体と同じ選択肢が得られる。

本発明の、図示されていない別の実施形態の３次元構造体では、その構造体は、図８に示されているような細長いフィラー体の少なくともいくつかの代わりに、上記のような球状のフィラー体も含む点以外は、図８に示されている構造体と実質的に同一である。

図９は、別の実施形態の３次元構造体（概して４０１という符号が付されている）の一部を示している。この構造体は、上記の多細胞体１と実質的に同一であることができる細長い多細胞体１と、複数のフィラー体５との配列体であるのが好適である。図９では、多細胞体１とフィラー体５の内側の配列を示す目的で、いくつかの多細胞体１とフィラー体５が取り除かれている。この構造体４０１では、１つ以上のフィラー体５が、管腔を形成するフィラー体５’となるように配列されている。図示されているように、管腔を形成するフィラー体５’は、細胞が多細胞体から第１の細長い空間４１１と第２の細長い空間４１３に内殖するのを防ぐように配列されている。管腔を形成するフィラー体５’は、多細胞体１に実質的に囲まれている。例えば、多細胞体１は、第１の細長い空間４１１を取り囲む第１の管様構造体４３１’と、第２の細長い空間４１３を取り囲む第２の管様構造体４３１’’とを形成するように配列するのが好適である。管様構造体４３１’、４３１’’の全体は示されていないが、これらの管様構造体は、指定のない限り、図２の管様構造体３１と同様のものである。

一方の管様構造体４３１’’は、もう一方の管様構造体４３１’よりも直径が長い。直径が短い方の管様構造体４３１’を形成する細長い多細胞体１の少なくともいくつかは、管様構造体４３１’と４３１’’との交差部４４１で、直径が長い方の管様構造体を形成する細長い多細胞体１の少なくともといくつかと接触する。さらに、第１の細長い空間の末端を第２の細長い空間に連結するように、管腔を形成する少なくとも１つのフィラー体５’が多細胞体１のギャップ４５１を貫通していて、管腔を形成するフィラー体５’によって管様構造体４３１’と４３１’’に形成される管腔が互いに連結し合うようになっているのが好適である。したがって、この構造体を成熟させることによって、人工血管のような枝分かれした管状人工組織を作製することができる。図９に示されている例では、単一の枝が作られているが、上記の技法を拡張して、直径が多種多様である枝を有する構造体を含め、さらに高次の分岐構造体を作製することができる。また、図９の細長い多細胞体１は、図１０の構造体５０１によって示されているように、球状の多細胞体１１と置き換えることができる。さらに、細長い多細胞体１（図９）または球状の多細胞体（図１０）によって形成される管様構造体４３１’、４３１’’は好適には、図７および図７Ａに示されているものと同様の形で、１つ以上の追加的な組の多細胞体を含むように修正することができる。細胞型、それぞれ異なる多細胞体における細胞型の組み合わせ、多細胞体中の細胞型の組み合わせに関して、上記されているものと同じ選択肢が、図９および１０に示されている構造体４０１、５０１にも適用される。

図１Ｃは、本発明の別の３次元構造体６０１を示している。この構造体６０１は必ずしもフィラー体を含んでいるわけではない。その代わりに、一連の細長い多細胞体が、シート様構造体を形成するように、並列して隣接している関係で配列されている。図１Ｃに示されているシート構造体６０１には多細胞体１が２つしかないが、これらの多細胞体と並べて、いずれかの数の追加の多細胞体を配置して、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体と接触して、シート構造体６０１の幅を増大させるようにすることができる。
３次元構造体を作製する方法

細長い多細胞体１と球状の多細胞体１１を含め、多細胞体を（場合によってはフィラー体５と併せて）用いて、本発明の範囲内で、上記の３次元の生物学的コンストラクトを作製する方法には、多種多様なものがある。例えば、１つの方法は一般に、細長い各多細胞体１が少なくとも１つの他の多細胞体と接触するようなパターンに従って、複数の細長い多細胞体１を配列してから、少なくとも１つ（例えばすべて）の多細胞体１を少なくとも１つの他の多細胞体１に融合させて、所望の３次元人工生物組織を作製することを含む。多細胞体の配列体中にフィラー体を含める必要はない（例えば、図１Ｃを参照されたい）。しかし、複数の多細胞体（上記の細長い多細胞体１と球状の多細胞体１１など）と、１つ以上のフィラー体５を配列して、各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体またはフィラー体と接触するようにしてから、それらの多細胞体を融合させて、所望の３次元人工生物組織を形成させることも可能である。

多くの方法を用いて、所定のパターンで多細胞体を配列して、所望の３次元構造体を作製してもよい。例えば、多細胞体は、互いにまたはフィラー体と接触するように手作業で配置することも、ピペット、ノズル、もしくは針から押し出すことによって適切な位置に沈積させることも、自動化マシンによって接触させて配置することもできる。図１１に示されているように、例えば、１つ以上の器具（好適には、上記の第１の成形器具５１、上記のように、多細胞体をモールド３０１から取り出すキャピラリーピペット５１’、および／または、異なる器具を含むことができる）を用いて、多細胞体を持ち上げる（例えば、上記のモールド３０１から取り出す）。この器具によって、３次元コンストラクト（例えば図１Ｃ、図２、図７、図７Ａ、または図８〜図１０に示されているようなもの）が組み立てられている組み立て区域（例えばガラス表面）に多細胞体を移すと共に、すでに組み立て区域に移されており、かつ組み立てているコンストラクト中に配置されているいずれかの他の多細胞体といずれかのフィラー体とに対して、多細胞体を適切な位置に分注するか、もしくは他の方法で配置する。

多細胞体を所定の位置に配置した後、上記のプロセスを繰り返して、コンストラクトに別の多細胞体またはフィラー体を（例えば、すでにコンストラクト中に配置されている多細胞体と並べて配置することによって、）追加するのが好適である。組み立てているコンストラクトが、１つ以上のフィラー体を含む場合には、別の器具（図示されていないが、成形器具５１またはキャピラリーピペット５１’と同様のものであってよい）を用いてフィラー体５を持ち上げ（または上記のようにフィラー体を作製し）、そのフィラー体を組み立て区域に移し、フィラー体を必要とするいずれかの時点で、そのフィラー体を所定の位置で、組み立てているコンストラクト中に分注するか、または別の方法で配置するのが好適である。多細胞体を組み立て区域に移すのに用いる器具５１、５１’は、多細胞体とフィラー体を所望のパターンで配置する目的で使用できるバイオプリンターの印刷ヘッドまたはその他の自動化装置によって運ばれるのが好適である。例えば、１つの好適なバイオプリンターは、米国特許出願公開第２００４０２５３３６５号に開示されており、この特許は参照により本明細書によって組み込まれる。ティッシュエンジニアリングの技術分野に精通した者であれば、多細胞体（およびフィラー体を用いる場合にはフィラー体）を配列して好適なコンストラクトにする目的で用いることができる他の好適なバイオプリンターと類似の装置を熟知しているであろう。フィラー体を組み立て区域に移すのに用いる器具は、バイオプリンターの別のヘッドの一部であるのが好適である。バイオプリンターは、複数のヘッドを有することができ、および／または、多細胞体とフィラー体を移すための各種の器具５１、５１’を１つ以上のバイオプリンターヘッドに順次的に搭載することができる。バイオプリンターまたは類似の装置を用いて、本発明のコンストラクトを自動的に組み立てるのが望ましいこともあるが、本明細書に記載されている方法は、本発明の範囲内で、手作業で（例えば１つ以上のキャピラリーピペットを用いて）実施することもできる。

図１１に示されているように、多細胞体１は、１つ以上のフィラー体５の上に配置する（例えば積み重ねる）のが好適である。多細胞体１は、他の多細胞体および／またはフィラー体５に隣接させて配置するのが好適である。したがって、多細胞体１は、いずれのフィラー体５の中にも押し込んだり、または埋め込んだりしない。多細胞体をゲルまたは液体に分散させないので、これは「大気中での印刷」と称することができる。図１２に示されている方法は、図１１に示されている細長い多細胞体１の代わりに、球状の多細胞体１１を用いる点以外は、図１１に示されている方法と実質的に同様のものである。図１１は、図２に示されているコンストラクトを、図１２は、図８に示されているコンストラクトを作製するプロセスを示しているが、本発明の範囲内で、実質的に同じ方法で、図１Ｃ、図７、図７Ａ、図８、および図９に示されていると共に上記されているようなコンストラクト（および他の多くのコンストラクト）を作製できることが分かる。

コンストラクトを組み立て終えたら、コンストラクトの最上部の上から組織培地を注入するのが好適である。この組織培地は、多細胞体とフィラー体との間の空間１７に入って、多細胞体中の細胞を支えることができる。３次元コンストラクト中の多細胞体を互いに融合させて、人工生物組織を作製する。「融合させる」、「融合した」、または「融合」とは、接触している多細胞体の細胞が、細胞表面タンパク同士の相互作用を通じて直接的に、または、それらの細胞とＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体との相互作用を通じて間接的に、互いに接着し合うようになることを意味する。融合後、コンストラクト中に含まれていたすべてのフィラー体を人工組織から引き離す。管様構造体を含むコンストラクトの場合には、例えば、その管の外側にあるすべてのフィラー体を（例えば、管様コンストラクトから形成された管状構造体から剥がすことによって、）取り除くことができる。管腔を形成するフィラー体で、管状構造体の内側にあるフィラー体５’はいずれも、管状構造体の開口端から引き抜くのが好適である。管腔を形成するフィラー体５’は好適には、管腔からフィラー体を引き抜きやすくするために、所望に応じて、可とう性物質で作製することができ、これは、（例えば、人工組織が、枝分かれした管状構造体である場合に）有益であることがある。別の選択肢は、融合後に（例えば温度変化、光、またはその他の刺激によって）溶解させることができる材料から、フィラー体５と、管腔を形成するフィラー体５’を作製することである。

本発明はさらに、本発明の多細胞体を用いて、所定の３Ｄパターンに従って、事前に選択した受容環境中に複数の多細胞体をさらに配列して、細胞ユニットが融合して所望のバイオコンストラクトになるようにすることによって、組織、血管、または臓器のように３Ｄ形状を有する生物学的コンストラクトをエンジニアリング技術で作製する別の方法を提供する。融合する２つ以上の多細胞体は、形状とサイズが同一のものであっても、異なるものであってもよいと共に、同じ細胞型を含んでも、異なる細胞型を含んでもよい。数多くの方法で、上記の多細胞体をバイオコンストラクトエンジニアリングに適用してよい。例えば、所望の構造体の上半分と下半分を含む形状の異なる２つの多細胞体を作製してよいと共に、これらの多細胞体を接触させ融合させてもよい。あるいは、複数の多細胞体を組み立て、フィラー体と組み合わせて所望の形状に融合させてもよい。１つの実施形態によれば、多細胞体をフィラー体と共に用いる場合、上記のエンジニアリング法は、Ａ）複数の多細胞体を所定のパターンに従って、複数のフィラー体と所定の通りに組み合わせて配列して、層状コンストラクトを形成させる工程（これにより、多細胞体とフィラー体は接触している）と、Ｂ）成熟のために、事前に選択した制御環境中に前記層状コンストラクトを沈積させる工程（これにより、多細胞体が互いに融合しあって、融合したコンストラクトが得られる）と、Ｃ）この融合したコンストラクトからフィラー体を取り除いて、所望の生物学的コンストラクトを作製する工程とを含んでもよい。

さらに、２つ以上の細胞型を含むバイオコンストラクトが作製されるように、各多細胞体１、１１は、２つ以上の細胞型から構成されていてもよい。これらの細胞型は、当該構造体の表面に対する親和性、または細胞間相互作用のようなその他の力に基づいて区別されるものと予想することができる。例えば、平滑筋細胞と内皮細胞との混合物から円筒形の成型多細胞体を作製して、移植可能な血管のような管状構造体を作製してよい。続いて、これらの多細胞体を適切な位置（例えば図２に示されているような位置）に配置し、融合させて管状コンストラクトにする。コンストラクトの管腔を通じてコンストラクトを灌流すると、内皮細胞は、管状コンストラクトの中央の内面に移動する一方で、平滑筋細胞は、コンストラクトの外側を占めるものと予想することができる。別の例として、多細胞体１が、内皮細胞と線維芽細胞との混合物を含む場合には、コンストラクトの管腔を通じてコンストラクトを灌流すると、内皮細胞は、管状コンストラクトの中央の内面に移動する一方で、線維芽細胞はコンストラクトの外側を占めるものと予想することができる。別の例として、多細胞体１が、平滑筋細胞と線維芽細胞との混合物を含む場合には、平滑筋細胞は、管状コンストラクトの中央の内面に移動する一方で、線維芽細胞は外側を占めるものと予想することができる。さらなる例として、多細胞体１が、内皮細胞と平滑筋細胞と線維芽細胞との混合物を含む場合には、コンストラクトの管腔を通じてコンストラクトを灌流すると、内皮細胞は、コンストラクトの内層にソーティングされるものと予想することができ、線維芽細胞は、コンストラクトの外層にソーティングされるものと予想することができ、平滑筋細胞は、内側の内皮層と外側の線維芽細胞層とに挟まれた中間層にソーティングされるものと予想することができる。
３次元の人工管状構造体

本発明はさらに、本発明の方法に従ってエンジニアリング技術で作製した管状細胞コンストラクトの例を提供する。図１３および図１４は、本明細書に記載されているプロセスによって構築した実際の管状バイオコンストラクトを示している。図１３は、成熟させてフィラー体を取り除いた後の２つの異なる管状バイオコンストラクトの側部を示している。図１４は、すべてのフィラー体を取り除いた後の管状コンストラクトの末端を示している。

このようなコンストラクトの１つの実施形態は、図１５に概略が示されており、概して８０１という符号が付されている。３次元管状構造体８０１は、少なくとも１つのフィラー体５’と、互いに凝集し合っている複数の生体細胞とを含み、これらの生体細胞が、少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む管状構造体８０１を形成している。フィラー体５’はコンプライアントな生体適合性物質を含み、この生体適合性物質は、細胞がその物質に移動および内殖するのを妨げると共に、細胞がその物質に接着するのを妨げるものである。また、この生体適合性物質は、栄養分に対する透過性があってもよい。

上記の３次元管状構造体の長さは、好適には少なくとも約１０００マイクロメートルであり、より好適には少なくとも約５センチメートル（例えば約５センチメートル〜約３０センチメートルの範囲）である。いくつかのケースでは、３次元管状構造体の長さは、約３０センチメートル未満であるのが好適である。多細胞体と同様に、３次元管状構造体の長さには理論的上限がないので、長い管状構造体の作製に関連する実施上の問題（例えば、十分な量の細胞を得る問題、当該構造体を作成するのに必要となる場合のある長い多細胞体を取り扱う問題など）を克服したいと考える限りは、本発明の範囲内で、長さが３０センチメートル（または、３０センチメートルとは異なる任意の長さ）を超える３次元管状構造体を作製することも可能であると認められる。

個々の多細胞体のように、上記の３次元管状構造体は、単一の細胞型からなることも、複数の細胞型を含むこともできる。上記の３次元管状構造体は、上記のさまざまな細胞型のいずれかを用いて作製することができる。したがって、例えば、管状構造体は、実質的にホモ細胞型であることができる（すなわち、管状構造体中のほぼすべての生体細胞は、単一の細胞型の細胞であり、低レベルの純度に対してある程度の許容性があり、その管状コンストラクトの成熟にごくわずかな影響しか及ぼさない異なる細胞型の細胞を比較的少数含む）。より具体的には、上記の管状構造体の細胞は好適には、本質的に単一の細胞型の細胞からなることができる。あるいは、上記の管状構造体の細胞は好適には、第１の細胞型の生体細胞を含むことができ、少なくとも約９０パーセントの細胞が、上記の第１の細胞型の細胞である。

上記の管状構造体は、２つ以上の異なる細胞型を含むヘテロ細胞型であることもできる。管状構造体が脈管管状構造体である場合には、その管状構造体は、通常脈管組織に存在する細胞型（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞など）を含むのが有益である。１つの例では、管状構造体の細胞は、第１の細胞型の複数の生体細胞と、第２の細胞型の複数の生体細胞を含み、この第２の細胞型は上記の第１の細胞型とは異なる。別の例では、上記の管状構造体の細胞は、第１の細胞型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞と、第３の細胞型の複数の生体細胞とを含む。したがって、脈管管状構造体では、細胞は好適には、（ｉ）内皮細胞および平滑筋細胞、（ｉｉ）平滑筋細胞および線維芽細胞、（ｉｉｉ）内皮細胞および線維芽細胞、または（ｉｖ）内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞を含むことができる。さらに、脈管管状構造体では、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞は有益なことに、天然の組織に存在する細胞型の層を模する層を形成することができる。したがって、１つの例では、内皮細胞と平滑筋細胞とを含む脈管管状構造体においては、内皮細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む内層を形成するのが有益であり、平滑筋細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体と、内皮細胞によって形成された内層とを実質的に取り囲む層を形成するのが有益である。別の例では、内皮細胞と線維芽細胞とを含む脈管管状構造体においては、内皮細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む内層を形成するのが有益であり、線維芽細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体と、内皮細胞によって形成された内層とを実質的に取り囲む層を形成するのが有益である。別の例として、平滑筋細胞と線維芽細胞とを含む脈管管状構造体においては、平滑筋細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む内層を形成するのが有益であり、線維芽細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体と、平滑筋細胞によって形成された内層とを実質的に取り囲む層を形成するのが有益である。別の例では、内皮細胞と平滑筋細胞と線維芽細胞とを含む脈管管状構造体においては、内皮細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体を実質的に取り囲む内層を形成するのが好適であり、平滑筋細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体と、内皮細胞によって形成された内層とを実質的に取り囲む第２の層を形成するのが好適であり、線維芽細胞は、前記少なくとも１つのフィラー体と、内皮細胞によって形成された内層と、平滑筋細胞によって形成された第２の層とを実質的に取り囲む第３の層を形成するのが好適である。

また、枝分かれした３次元管状構造体も本発明の範囲内である。このような構造体の１つの例では、複数の生体細胞が、管腔を形成するフィラー体である１つ以上のフィラー体を実質的に取り囲む枝分かれした管状構造体を形成する。この管腔を形成するフィラー体は、上記の生体細胞が第１および第２の細長い空間に内殖するのを防ぐ目的で配列されており、このケースでは、第１の細長い空間の末端が、第２の細長い空間の側部と隣接している。

前記少なくとも１つのフィラー体のコンプライアントな生体適合性物質は、アガロース、寒天、ヒアルロン酸、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される。前記少なくとも１つのフィラー体は、そのフィラー体を管状構造体から引き抜くことによって、管状構造体から引き離すことができるのが好適である。

実施例１：ブタ平滑筋細胞を用いた多細胞体の調製およびティッシュエンジニアリング
Ｉ．ブタ平滑筋細胞 過去の研究で用いた条件と同じ条件で、ブタ平滑筋細胞（ＳＭＣ）を増殖させた。その培地組成物は、１０％ブタ血清、１０％ウシ血清、プロリン５０ｍｇ／Ｌ、アラニン２０ｍｇ／Ｌ、グリシン５０ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１２μｇ／Ｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）１２μｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４３．０μｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳバッファー０．０１Ｍ、ならびに、ペニシリンおよびストレプトマイシン１．０×１０^５ユニット／Ｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）であった。ゼラチン（ブタの皮膚由来のゼラチン）をコーティングした１０ｃｍのペトリ皿で上記の細胞を増殖させ、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートした。そのＳＭＣを継代７代目まで継代培養してから、多細胞体（例えば細胞ユニット）の調製用に用いた。２４個の細胞ユニットと４本の管（外径（ＯＤ）：１．５ｍｍ、内径（ＩＤ）：０．５ｍｍ、長さ（Ｌ）：５ｃｍ）を調製するには、１８枚のコンフルエントなペトリ（例えば細胞培養）皿が必要であった。
ＩＩ．アガロースモールド

（ｉ）２％アガロース溶液の調製 ２ｇのＵｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ（ＬＭＰ）Ａｇａｒｏｓｅを１００ｍｌの超純水／バッファー溶液（１：１、ｖ／ｖ）に溶解させた。このバッファー溶液は、ＰＢＳ、すなわちダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（１×）、またはＨＢＳＳ、すなわちハンクス平衡塩類溶液（１×）であることができる。温水（８０℃超）の入ったビーカーに上記のアガロース溶液を入れ、アガロースが完全に溶解するまでホットプレート上に保った。温度が約３６℃超であれば、このアガロース溶液は液体のままである。３６℃未満では相転移が起こり、粘度が上昇し、最終的にはアガロースがゲルを形成する。

（ｉｉ）アガロースモールドの調製 ペトリ皿（直径１０ｃｍ）に適合するＴｅｆｌｏｎプリント（すなわちＴｅｆｌｏｎツール）を用いて、アガロースモールドを形成した（図５Ａ〜図５Ｃ）。このアセンブリー（Ｔｅｆｌｏｎプリント＋ペトリ皿）を水平に保ち、余熱しておいたアガロース約４０ｍｌをＴｅｆｌｏｎプリントの孔を通じてペトリ皿に入れた。すべての気泡を取り除いた後、このアセンブリーを４℃にて少なくとも１時間置いた。アガロースが完全にゲル化した後、Ｔｅｆｌｏｎプリントを取り除いたところ、アガロース中に溝が現れた（図４Ｄの溝３０５を参照されたい）。このモールドに１０ｍｌの培地を加えた。
ＩＩＩ．多細胞体の調製

コンフルエントなペトリ皿から培地を取り除き、１０ｍｌのＨＢＳＳ＋２ｍＭのＣａＣｌ_２で細胞を洗浄した。０．１％トリプシン１．５ｍｌを均一に播き、表面から細胞を剥がした。このペトリ皿に、５ｍｌの培地＋２ｍＭのＣａＣｌ_２を加えた。この細胞懸濁液を９００ｇにて５分間遠心分離した。培地（すなわち上清）を取り除いた後、細胞ペレットを２００μｌの培地＋２ｍＭのＣａＣｌ_２に再懸濁させ、数回、吸い上げたり押し出したりして（すなわち、激しくピペッティングして）、細胞クラスターを分解させて、単一の細胞懸濁液を得た。１５ｍｌの遠心チューブ内に置いた２ｍｌのエッペンドルフチューブに、この溶液を移した。１３００ｇにて２分間遠心分離することによって、高密度細胞ペーストを形成させた。培地（すなわち上清）を取り除いて、１ｍｌのエッペンドルフピペッターに取り付けられている１ｍｌのチップの中に挿入したキャピラリーチューブ（ＯＤ１ｍｍ、ＩＤ０．５または０．３ｍｍ）に細胞ペーストを吸引によって移した。細胞ペーストの入ったキャピラリーチューブを培地＋２ｍＭのＣａＣｌ_２中で１５分間、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートした。成形した細胞ペーストをキャピラリーチューブからプランジャーによって、培地で満たしたアガロースモールドの溝の中に押し出した（図３Ｃ）。このモールドをインキュベーター内に一晩置いた。翌日、成熟した多細胞体を手作業でキャピラリーチューブの中に吸引し（すなわち吸い込み）（図３Ｄ）、次に使用するまで培地中に置いた。
ＩＶ．ティッシュエンジニアリング

２％アガロースの予熱溶液１０ｍｌを直径１０ｃｍのペトリ皿に沈積させ、均一に広げて、均一な層を形成させた。アガロースゲルを冷蔵庫内で４℃にて調製した。キャピラリーチューブにアガロース溶液を充填し、（冷気を吹き込むことによって、または冷たいＰＢＳ溶液を用いて）急冷し、フィラー体を形成させた。管腔を形成するフィラー体の場合には、アガロース濃度は４％で、他のすべてのフィラー体では、アガロース濃度は２％であった。双眼顕微鏡下で、ピストンまたはワイヤを用いてフィラー体をキャピラリーチューブから押し出し、５ｃｍのアガロース棒（すなわちフィラー体）をペトリ皿内部のアガロース層の上に真っ直ぐ置いた。第２のフィラー体を第１のフィラー体に並列させ、９個のフィラー体を沈積して１段目の層が形成されるまで、同様の作業を繰り返した。図１１に示されているように、２段目の層を構成する６個のフィラー体を沈積させた。２つの多細胞体を第４および第５の位置に沈積させて、１段目の層の管を形成させた。５個のフィラー体を沈積させると共に、２つの多細胞体を第３および第５の位置に沈積させることによって、３段目の層を形成させた。４段目の層は、４個のフィラー体と、第３および第４の位置の２個の多細胞体から構成させた。５段目の層は、５個のフィラー体から構成させた（図２）。沈積プロセス全体を通じて、少量の培地（加える時点で１０μｌ）をコンストラクトの側部に加えて、材料（アガロースと多細胞体）の脱水を回避した。０．５〜１ｍｌの液体アガロース（３７℃＜Ｔ＜４０℃）をコンストラクトの周囲および上に注ぎ、コンストラクトの完全性を保った。ゲル化後、コンストラクトが完全に沈むまで培地を加えた。このコンストラクトをインキュベーター内に入れた。４８時間後、多細胞体が互いに融合した。アガロースを管状構造体の外面から剥がすと共に、管状構造体の管腔を満たしているフィラー体を管状構造体から引き抜くことによって、アガロースを取り除いた。続いて、さらに成熟させるために、この管をバイオリアクターに移した。この成熟プロセス用には、いずれの市販のバイオリアクターも用いることができる。
実施例２：多細胞体の調製およびティッシュエンジニアリングのための代替的な手順
Ｉ．さまざまな型の細胞用の増殖条件

１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍＬおよびゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ）、ならびにジェネティシン４００μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、Ｎ−カドヘリンでトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を増殖させた。ゲンタマイシンに加えて、すべての抗生物質をインビトロジェンから購入した。

ヒト臍静脈平滑筋細胞（ＨＵＳＭＣ）とヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した（ＨＵＳＭＣはＣＲＬ−２４８１、ＨＳＦはＣＲＬ−２５２２）。１０％ＦＢＳ、抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍＬおよびゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ）、内皮細胞増殖助剤（ＥＣＧＳ）２０μｇ／ｍＬ、ならびにピルビン酸ナトリウム（ＮａＰｙ）０．１Ｍを添加したＤＭＥＭとハムＦ１２（比率３：１）中で、ＨＵＳＭＣを増殖させた。２０％ＦＢＳ、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍＬおよびゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ）、グルタミン２ｍＭ、ＮａＰｙ０．１Ｍを添加したＤＭＥＭとハムＦ１２（比率３：１）中で、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）を増殖させた。

１０％ＦＢＳ、１０％ブタ血清、Ｌ−アスコルビン酸、硫酸銅、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グリシン、およびペニシリンＧを添加した低グルコースＤＭＥＭ中で、新鮮分離したブタ大動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）を増殖させた。

０．５％ゼラチン（ブタ皮ゼラチン）をコーティングした皿で、すべての細胞株（ＣＨＯを除く）を培養し、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気中にて３７℃で維持した。
ＩＩ．多細胞体の調製

細胞培養液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．１％トリプシンで１０分間処理し、得られた細胞懸濁液を１，５００ＲＰＭにて５分間、遠心分離した。４ｍｌの細胞型特異的培地中に細胞を再懸濁させ、接着の回復のために、１０ｍｌの組織培養用フラスコ内で３７℃にて５％のＣＯ_２と共に、旋回シェーカーで１時間インキュベートしてから、１，５００ＲＰＭにて５分間、遠心分離した。続いて、その細胞を２００μｌの培地中に再懸濁させ、激しくピペッティングし、３，５００ＲＰＭにて２分間、再度遠心分離した。内径が３００μｍまたは５００μｍのキャピラリーチューブに、得られた細胞ペレット（細胞ペースト）を移し、３７℃にて５％のＣＯ_２と共に１５分間インキュベートした。

実質的に球状の多細胞体の調製には、ＨＳＦまたはＣＨＯ細胞を用い、部分的に凝集している細胞ペーストを機械的に押し出し、均等に切断して断片化し、一晩、旋回シェーカーで３７℃、５％のＣＯ_２にてそれらの断片が集まるようにした。キャピラリーチューブの直径に応じて、この手順によって、所定のサイズと細胞数の均一なスフェロイドが得られた。

細長い多細胞体の調製には、ＰＡＳＭＣ、ＨＵＳＭＣ、またはＨＳＦを用い、特異的に調製した非接着性のＴｅｆｌｏｎまたはアガロースモールドの中に、バイオプリンターを用いて、部分的に凝集している細胞ペーストを機械的に押し出した。前記モールドにて３７℃、５％のＣＯ_２で一晩成熟させたところ、実施例１に記載されているように、３次元人工組織を作製する目的で、フィラー体と共に沈積させるのに十分な程度に、多細胞体が凝集した。
ＩＩＩ．フィラー体の調製

アガロース棒を調製する目的で、液体アガロース（温度＞４０℃）をキャピラリーチューブ（ＩＤが３００または５００μｍ）に充填した。管腔を形成するフィラー体の調整では、アガロース濃度は４％に、他のすべてのフィラー体の調整では、アガロース濃度は２％にした。充填したキャピラリーチューブを冷たいＰＢＳ（４℃）に浸漬させた。アガロースはキャピラリーチューブに接着しないので、ゼラチン上では、バイオプリンターによって、別の印刷ヘッドを用いて、連続的な棒を簡単に押し出すことができた。
ＩＶ．免疫組織化学

組織を一晩、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。脱水後、パラフィン浸透およびパラフィン包埋のために、組織を処理した。全体的な性状を得るために、５μｍの切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。免疫組織化学を得るために、抗切断カスパーゼ−３抗体（マウスおよびヒト切断カスパーゼ−３と反応するウサギ抗切断カスパーゼ−３ポリクローナル抗体の１：５０希釈物）、抗平滑筋アクチン抗体（マウス抗ヒト平滑筋アクチン（１Ａ４）の１：４００希釈物という抗体と共に、切片をインキュベートした。２次抗体（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋、抗マウス抗体または抗ウサギ抗体とコンジュゲートしたホースラディシュペルオキシダーゼ標識ポリマー）をＤＡＢ（３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）を用いて視覚化した。切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色し、顕微鏡（ＩＸ７０）検査のためにカバースリップで覆った。
Ｖ．実質的に球状の多細胞体を用いたティッシュエンジニアリング

実質的に球状の多細胞体を組み立てて、所定のトポロジーのカスタマイズ型管状構造体にするために、ビルディングブロックとしてフィラー体（例えばアガロース棒）を用いることに基づき、足場を用いないアプローチを設計した。アガロース棒と、実質的に球状かつ実質的に均一な多細胞体とを層状に沈積させたところ、管の直径、肉厚、および分岐パターンを正確に制御することができた（図１０）。

このアプローチを用いて、図８に示されているパターンに従って、まず、真っ直ぐな管を手作業で構築した。ＨＳＦからなる実質的に球状の多細胞体を用いて、最小の管を組み立てた。その管の直径は９００μｍで、肉厚は３００μｍであった（図１６Ａ）。組み立てたところ、その実質的な多細胞体が５〜７日のうちに互いに融合し合って、最終的な管状コンストラクトが得られた。この融合プロセスについてさらに詳しく観察するために、緑色または赤色の膜色素で染色したＣＨＯ細胞を用いて、実質的に球状の多細胞体を作製してから、図８に示されているスキームに従って、この多細胞体を組み立てた。緑色のスフェロイドと赤色のスフェロイドが交互に融合していることが、図１６Ｂに示されており、はっきりした融合境界が、ほとんど混ざり合うことなく現れており、過去の発見が裏付けられた。

本発明は、管の直径および肉厚の柔軟性に加えて、その独自の特長として、枝分かれした大血管構造体を構築する方法を提供する。この目的では、確実に管腔を正確に連結させるために、血管樹の種々の枝を同時に組み立てた。図１０のパターンに従って、ＨＳＦからなる直径３００μｍの実質的に球状の多細胞体を用いて、直径の異なる枝を有する、枝分かれした管状構造体（図１６Ｃ）を構築した。これらの枝の直径は、１．２ｍｍ（実線の矢印）と０．９ｍｍ（点線の矢印）であった（図１６Ｃ）。これらの実質的に球状の多細胞体は、５〜７日のうちに互いに融合し合って、融合済みの枝分かれした管状構造体（図１６Ｄ）が形成された。
ＶＩ．細長い多細胞体を用いて、１層および２層状の脈管性管を作製するためのティッシュエンジニアリング

スピード、精度、および再現性を向上させると共に、それによって、上記の方法を潜在的な臨床応用に適合させる目的で、上記（図２）と同じ概念的アプローチを保ちながら、特異的に構築した３次元配列装置（すなわちバイオプリンター）をフィラー体（例えばアガロース棒）と細長い多細胞体との沈積用に適合させた。

コンピューターを利用したラピッドプロトタイピングバイオプリンティング技術によって、上記（図２）と同じテンプレートに従って、フィラー体（例えばアガロース棒）と細長い多細胞体（例えば多細胞性シリンダー）を制御下で同時に沈積可能にした。垂直に移動する２つの印刷ヘッド（一方は、アガロース棒の調製および押し出し用、もう一方は、多細胞性シリンダーの沈積用）が搭載されているバイオプリンターを用いて、沈積作業を行った。アガロース棒の充填、ゲル化、および押し出しは、全自動サイクル中で行った。まず、充填を行うために、印刷ヘッドに取り付けられているキャピラリーピペット−カートリッジを、加温液体アガロースの入ったバイアルの中に移動させた。次に、アガロースを速やかにゲル化させるために、充填したカートリッジを、ＰＢＳの入った冷したバイアルに浸漬させた。最後に、得られたアガロース棒をペトリ皿に押し出した。浸漬スキーム（多細胞性シリンダーの配列作業ともいう）の際に、上記の多細胞性シリンダーの１つをアガロースモールドからキャピラリーピペットに吸い入れた。続いて、このキャピラリーピペットを第２の印刷ヘッドに充填し、アガロース棒と同様に、多細胞性シリンダーを押し出した。図２に示されているデザインに従って、ＨＵＳＭＣからなる単純な真っ直ぐの管を印刷した。コンピューターを利用して２つの印刷ヘッドを移動および調整して、事前にプログラムしたパターンの再現性を確保した。組み立て後、ＨＵＳＭＣからなる多細胞体が２〜４日のうちに融合して、最終的な管状構造体になり、支持アガロース棒を取り除いた。２つの別個の直径（それぞれ外径が１２００マイクロメートルと９００マイクロメートル）を有する融合済みの管が図１３に示されている。

次に、大血管系中の脈管と似ている２層状の脈管性管であって、培地と外膜を有する脈管性管を構築した。この管では、図１７に示されているパターンに従って、ＨＵＳＭＣシリンダーとＨＳＦシリンダーの両方をビルディングブロックとして用いた。この方法の汎用性を示すために、代わりに、生体内に相当する物がないパターンで、ＨＵＳＭＣとＨＳＦからなる多細胞性シリンダーを沈積させることによって、エンジニアリング技術で管を作製した（図１７Ｅ）。ＨＵＳＭＣをヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）（図１７Ｂ、図１７Ｆ）と、平滑筋アクチン（図１７Ｃ、図１７Ｇ）で染色したところ、融合の３日後に、人工コンストラクトにおけるＳＭＣと線維芽細胞の層または領域の間に明確な境界が現れた。カスパーゼ３で染色したところ、管状構造体の壁の中に、アポトーシスを起こした細胞が数個、現れた（図１７Ｄ、図１７Ｈ）。図１７Ａ〜図１７Ｄに示されている、より複雑な２層状の構造体では、融合に必要な時間が長くなった。

これらの１層または２層状の管は、外径が約０．９ｍｍ〜約２．５ｍｍの範囲であった。

本発明のティッシュエンジニアリング法は、人工コンストラクトを細胞のみから構築し、可能な限り高い細胞密度を実現させる。本物の脈管は、隣接するＳＭＣが重なり合った状態で、比較的細胞密度の高い層をもたらすので、上記の点は重要である。本発明の方法では、多細胞性の３次元スフェロイドまたはシリンダーをビルディングブロックとして用いる。細胞間相互作用による組織の凝集は、液体系を用いた類推によって既に定量化されており、これまで観察された細胞型の中でも、ＳＭＣは非常に自己凝集性が高いものの１つであることが報告されている。多細胞性の組み立て体と液体との類推によって、本発明で用いられている発生的形態形成プロセスの一部に対する理解が深まった。本発明での研究で説明されている多細胞性スフェロイドおよびシリンダーの集合または融合は、時間の尺度において、運動性細胞と接着細胞とからなる組織が、高粘性の非圧縮性液体によく似ているという物理的理解（ティッシュエンジニアリングにおいて過去に用いられてきた概念）と整合している。
実施例３：多細胞体および３次元の融合管状構造体の調製の際に、ゼラチンおよび／またはフィブリンを利用すること

ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）をカスケード・バイオロジクスから購入した（Ｃ−００７−５Ｃ）。平滑筋増殖助剤（ＳＭＧＳ）を添加した培地２３１中で、ＨＡＳＭＣを増殖させた。コーティングを施していない細胞培養皿でＨＡＳＭＣを増殖させ、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気中にて３７℃で維持した。

上の実施例１および２に示されているように、ＨＡＳＭＣをトリプシン処理し、組織培地中に再懸濁させ、遠心分離した。遠心分離後、組織培地（すなわち上清）を取り除き、細胞（１枚のコンフルエントなペトリ皿）をまず、フィブリノゲン溶液（０．９％のＮａＣｌ中に５０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ中に再懸濁させてから、ゼラチン溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２０％）を７０μｌ加えた。この細胞懸濁液を再度遠心分離し、上清を取り除き、細胞ペーストをキャピラリーチューブの中に吸引できるようになるまで、細胞ペレットの入った遠心チューブを３７℃（ゼラチンが液体の状態を保つ温度）の水浴中に置いた。続いて、この細胞ペーストをキャピラリーチューブの中に吸引させ、氷冷したＰＢＳ溶液中に１５分間置いた。この工程中、ゼラチンはゲル化し、第２の成形工程または第２のインキュベート工程の必要性なしに、多細胞体を、即座に印刷できるほど十分に凝集させた。上の実施例１に示されているように、多細胞体をフィラー体と共に、受容表面上に沈積させて、所望の３次元の生物学的構造体（例えば管状構造体）を形成させた。各層を沈積させた後、トロンビン溶液（５０Ｕ／ｍｌ）を加え、フィブリノゲンをフィブリンに転換させた。続いて、上の実施例１に示されているように、多細胞体の成熟と相互融合のために、この３次元構造体をインキュベーター内に置いた。

図１８は、上記の方法を用いて作製したいくつかの管状構造体であって、沈積から１２日後の構造体を示している。図１８Ａは、上記の方法を用いて作製した管状構造体であって、アガロースフィラー体を取り除く前の構造体を示しており、図１８Ｂ〜図１８Ｇは、アガロースを取り除いた後の構造体を示している。図１８Ｃと図１８Ｄは、上記の方法を用いて作製した管状構造体であって、多細胞体間の融合の程度を示す目的で、長手方向に切断して開いた構造体を示している。図１８Ｅ〜図１８Ｇは、上記の方法を用いて作製した管状構造体の横断図である。

本発明の具体的な実施形態と関連させながら、本発明について説明してきたが、本発明の方法論は、さらなる修正が可能であることが分かるであろう。本特許出願は、一般に、本発明の原理に従っていると共に、本発明と関連する技術分野内の既知または慣例的な実施態様内に入るような本開示からの逸脱形態、および本明細書でこれまで示してきた本質的な特長に適用できるような本開示からの逸脱形態、および添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱形態を含む本発明のあらゆる変形形態、用途、または適合形態を網羅するように意図されている。

Claims (14)

1. 複数の多細胞体（各多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む）と、複数の離散したフィラー体（各フィラー体は、細胞が前記多細胞体から前記フィラー体に移動および内殖するのを妨げると共に、前記多細胞体中の細胞が前記フィラー体に接着するのを妨げる生体適合性物質を含む）とを含む３次元構造体であって、
   各多細胞体が少なくとも１つの他の多細胞体または少なくとも１つのフィラー体と接触するパターンで、前記多細胞体とフィラー体が配列されている３次元構造体。
2. 前記多細胞体のそれぞれの長手方向軸に沿って切断した断面の平均面積が、７，８５０平方マイクロメートル〜３６０，０００平方マイクロメートルの範囲である、請求項１に記載の３次元構造体。
3. 前記多細胞体のそれぞれの長さが３０センチメートル未満である、請求項１または２に記載の３次元構造体。
4. 各多細胞体が単一の細胞型の細胞からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の３次元構造体。
5. 前記多細胞体の１つ以上が、第１の細胞型の複数の生体細胞と、第２の細胞型の複数の生体細胞と、第３の型の複数の生体細胞とを含み、前記第１、第２、および第３の細胞型のそれぞれが、前記第１、第２、および第３の細胞型のうちの他の型と異なる、請求項１〜３のいずれかに記載の３次元構造体。
6. 前記細胞が内皮細胞、平滑筋細胞、または線維芽細胞である、請求項４または５に記載の３次元構造体。
7. 前記多細胞体の形状が均一であると共に、前記フィラー体の形状が均一である、請求項１〜６のいずれかに記載の３次元構造体。
8. 各多細胞体は、該多細胞体の幅の少なくとも2倍で且つ該多細胞体の高さの少なくとも2倍の長さを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の３次元構造体。
9. 前記多細胞体の少なくともいくつかが、シートを形成するように配置されている、請求項１〜８のいずれかに記載の３次元構造体。
10. 前記多細胞体が円筒形であると共に、円形の断面を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の３次元構造体。
11. 前記多細胞体の上に、その多細胞体と同一である別の多細胞体があるときに、その各多細胞体が前記別の多細胞体の重量を支えられるほど、各多細胞体中の細胞の凝集力が十分に強力である、請求項１〜１０のいずれかに記載の３次元構造体。
12. 前記複数の多細胞体の少なくともいくつかが、管様構造体を形成するように配列されており、その管様構造体の内側に、前記フィラー体の少なくとも１つが存在する、請求項１〜１１のいずれかに記載の３次元構造体。
13. 前記多細胞体が、第１および第２の組の多細胞体を含み、前記第１の組の各多細胞体が内皮細胞を含み、前記第２の組の各多細胞体が平滑筋細胞を含み、
    前記第１の組の多細胞体が、前記少なくとも１つのフィラー体を取り囲む内層を形成するように配列されており、前記第２の組の多細胞体が、前記少なくとも１つのフィラー体と、前記第１の組の多細胞体によって形成された内層とを取り囲む第２の層を形成するように配列されており、
    前記多細胞体が第３の組の多細胞体をさらに含み、前記第３の組の各多細胞体が線維芽細胞を含み、前記第３の組の多細胞体が、前記少なくとも１つのフィラー体と、
    前記第１の組の多細胞体によって形成された前記内層と、前記第２の組の多細胞体によって形成された前記第２の層とを取り囲む層を形成するように配列されており、前記第３の組における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率が、前記第１の組または前記第２の組における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率よりも大きい、請求項１２に記載の３次元構造体。
14. 前記多細胞体が第１の組の多細胞体を含み、前記第１の組の各多細胞体が、複数の内皮細胞と複数の平滑筋細胞とを含み、前記第１の組の多細胞体が、前記少なくとも１つのフィラー体を取り囲む内層を形成するように配列されており、前記多細胞体が第２の組の多細胞体を含み、前記第２の組の各多細胞体が線維芽細胞を含み、前記第２の組の多細胞体が、前記少なくとも１つのフィラー体と、前記第１の組の多細胞体によって形成された内層とを取り囲む層を形成するように配列されており、前記第２の組における線維芽細胞の数の非線維芽細胞の数に対する比率が、前記第１の組における線維芽細胞の数の非線維芽細胞に対する比率よりも大きい、請求項１２に記載の３次元構造体。

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