JP5605597B2 - Ｄ（−）−乳酸生成のための耐熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの遺伝子操作 - Google Patents
Ｄ（−）−乳酸生成のための耐熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの遺伝子操作 Download PDFInfo
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Description
本発明は、Ｄ（−）−乳酸生成のための耐熱性Bacillus coagulansの遺伝子操作に関する。
本出願は２０１０年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／４１６００２号の利益を主張するものであり、すべての図、表、および拡散配列を含むその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国エネルギー省助成金番号ＤＥ−ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９の下において、政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
石油は主要な燃料源としての役割だけでなく、プラスチック工業で使用される様々なポリマーを生産するための原料としての役割も果たしている。石油埋蔵量は有限であること、および石油の使用が環境に悪影響を及ぼすことから、再生可能な代替燃料源、および石油の代替となる化学物質に関心が移っている（非特許文献２３参照）。炭水化物の発酵により様々な短鎖ヒドロキシ酸や他の化学物質が生成されることが示されている。この化学物質を重合することで、物理的特性および化学的特性の異なるプラスチック類を生産することができる。このような発酵産物の中でも、乳酸は、ＣＯ２ニュートラルであるため環境への影響が最も少なく、かつ再生可能な生分解性プラスチック類を製造するための出発物質となり得る主要な化学物質として注目を集めている。糖類の乳酸発酵の起源は先史時代まで遡り、純粋細菌培養を利用した乳酸の商業生産は１８９５年には既に始まっていた（非特許文献３参照）。乳酸は主に食品および薬品工業で使用されている。しかし、乳酸由来のポリマーの生産コストが石油化学製品由来のポリマーの生産コストと同程度になれば、乳酸由来のバイオポリマーの生産における乳酸の使用量は、食品および薬品工業における乳酸の使用量を上回ることが予想される（非特許文献８，１４，１８参照）。
乳酸を縮合するとラクチドとなり、精製・重合すると熱可塑性物質であるポリラクチド（ＰＬＡ）となる（非特許文献１８，２２参照）。Ｄ（−）−乳酸およびＬ（＋）−乳酸を慎重に混合することで、様々な物理的特性および熱化学的特性を有するポリマーを生成することができる。乳酸は石油から合成できるが、この合成物は２つの異性体の混合物であり、ＰＬＡの生成には適さない。ＰＬＡの生成に必要とされる光学的に純粋な乳酸は、微生物発酵によってのみ生成される（非特許文献１４参照）。Lactobacillus、Lactococcusなどの様々な乳酸菌は、グルコースやスクロースなどの発酵性糖類から高収率かつ高力価のＬ（＋）−乳酸を生成する（非特許文献６，１４参照）。これら乳酸菌は複雑な栄養要求性を有し、その増殖温度範囲は３０℃〜３５℃である。主要発酵産物としてＤ（−）−乳酸を生成する微生物については既に説明がなされており、現在、この微生物は産業で利用されている（非特許文献２５，３４，３６参照）（非特許文献１２参照）。微生物生体触媒を利用した乳酸発酵は、現在、３０℃〜３７℃の温度範囲で行われているが、増殖温度および発酵温度を５０℃〜５５℃の範囲まで上昇させることで、大規模な工業発酵における汚染を最小限に抑えることが期待されている（非特許文献１参照）。乳酸生成コストを抑えるために、また、乳酸生成の原料として食品炭水化物を使用しないようにするために、発酵性糖類および微生物生体触媒の代替物が開発されている。リグノセルロース・バイオマスは、魅力的な糖類源である。ここでいう糖類には、グルコース、キシロースなどが含まれる。産業で利用される乳酸菌のキシロース発酵特性を改善する試みがなされたものの、これら乳酸菌は、ペントース類を効率的に乳酸発酵する能力に欠ける（非特許文献２５，３１参照）。
Bacillus coagulansは、ｐＨ５．０、５０℃〜５５℃の温度で増殖し、ヘキソース類およびペントース類を発酵する有胞子性乳酸菌である（非特許文献１０，２７参照）。この乳酸菌は、グルコースおよびキシロースから流加発酵により１８０ｇ／Ｌもの濃度のＬ（＋）−乳酸を生成することが示されており、また、セルロースから光学的に純粋な乳酸へ同時糖化発酵を行う菌の優れた候補でもある（非特許文献２６参照）。B. coagulansは一般的に遺伝子操作を行うことが困難であるので、（特に、外因性核酸配列を含まない遺伝子操作微生物を利用した）純粋な乳酸を生成する方法が必要となる。本発明の一側面によれば、この遺伝子操作を行うことが困難な細菌を操作する一般的な方法が提供される。本開示の方法および増殖に基づく選択を利用して、B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂの発酵産物を、Ｌ（＋）−乳酸からＤ（−）−乳酸に変換させた。この遺伝子操作生体触媒は、５０℃の温度で４８時間以内に約９０ｇ／ＬのＤ（−）−乳酸を生成した。
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３０℃から５５℃の間の温度範囲でＤ（−）−乳酸を生成する能力を有する遺伝子組換え微生物を提供する。
本発明の様々な実施形態において、この微生物は不活化染色体乳酸脱水素酵素（ldh）遺伝子および／または不活化染色体アセト乳酸合成酵素（alsS）遺伝子を有してもよい。本開示の方法において利用される微生物の例としては、Bacillus coagulansなどのBacillus spp.が挙げられる。本開示に従って生産される微生物は、少なくとも６０ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ）の培地でＤ（−）−乳酸を生成する。本開示の遺伝子組換え微生物の生産方法および利用方法を提供する。
本発明の一側面によれば、Ｄ（−）−乳酸を生成する能力を有する遺伝子組換え微生物が提供される。本発明の様々な実施形態において、この微生物は、不活化染色体乳酸脱水素酵素（ldh）遺伝子、不活化染色体ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）遺伝子、不活化ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、不活化α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、および／または不活化アセト乳酸合成酵素（alsS）染色体遺伝子を有してもよい。また、この微生物は、Bacillus coagulansなどのBacillus spp.である。本開示に従って生産された微生物は、少なくとも６０ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ）の培地でＤ（−）−乳酸を生成する。本発明の一側面によれば、不活化染色体乳酸脱水素酵素（ldh）遺伝子、不活化染色体ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）遺伝子、および不活化染色体アセト乳酸合成酵素（alsS）遺伝子を有する微生物が提供される。本発明の他の側面によれば、不活化染色体乳酸脱水素酵素（ldh）遺伝子および不活化染色体アセト乳酸合成酵素（alsS）遺伝子を有する微生物が提供される。本発明のさらに他の側面によれば、不活化酵素活性の様々な組み合わせを有する微生物が提供される（下記考察参照）。
「遺伝子」という用語は、プロモーターおよびオペレーターなどの特定の制御機能を有する領域、ならびに構造遺伝子を含む。「遺伝子」という用語は、上流制御配列および下流制御配列だけでなく、遺伝子のオープン・リーディング・フレームも含む。上流制御領域は、遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流制御領域は、ターミネーター配列領域とも呼ばれる。ldhおよびalsSは、
（１）ldh、pflA、pflB、alsD、およびalsS遺伝子のうちの少なくとも1つのプロモーターやオペレーターなどの転写制御に関わる、染色体ＤＮＡにおけるヌクレオチド配列を欠失させること
（２）乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つが活性タンパク質として発現しないようにフレームシフトを導入すること、あるいは
（３）乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする構造遺伝子の全部またはその一部を欠失させること
により不活化してもよい。本発明の好ましい実施形態において、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする遺伝子の全部が欠失した微生物が提供される。B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂにおける乳酸脱水素酵素遺伝子およびアセト乳酸合成酵素遺伝子、ならびにα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例示的な配列を、それぞれSEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2に示す。B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂにおけるピルビン酸ギ酸リアーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素のコード配列をSEQ ID NO: 3に示す。
（１）ldh、pflA、pflB、alsD、およびalsS遺伝子のうちの少なくとも1つのプロモーターやオペレーターなどの転写制御に関わる、染色体ＤＮＡにおけるヌクレオチド配列を欠失させること
（２）乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つが活性タンパク質として発現しないようにフレームシフトを導入すること、あるいは
（３）乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする構造遺伝子の全部またはその一部を欠失させること
により不活化してもよい。本発明の好ましい実施形態において、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする遺伝子の全部が欠失した微生物が提供される。B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂにおける乳酸脱水素酵素遺伝子およびアセト乳酸合成酵素遺伝子、ならびにα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例示的な配列を、それぞれSEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2に示す。B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂにおけるピルビン酸ギ酸リアーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素のコード配列をSEQ ID NO: 3に示す。
「構造遺伝子の一部」、構造遺伝子の全部または「その一部」という語句は、その構造遺伝子部分における単一ヌクレオチド欠失を指してもよい。この欠失は、好ましくは、構造遺伝子における５個から１０個のヌクレオチドの欠失であり、より好ましくは、１０個から５０個のヌクレオチドの欠失、さらに好ましくは５０個から１００個のヌクレオチドの欠失である。本発明の一側面においては、構造遺伝子の全部が欠失していてもよい。本発明の他の側面によれば、欠失乳酸脱水素酵素（ldh）、欠失ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、欠失ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、欠失α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、および欠失アセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも1つが提供される。上述の酵素をコードする各遺伝子のオープン・リーディング・フレームを配列一覧に示す。以下に説明するように、pflA、pflB、alsS、およびalsDのあらゆる組み合わせとldhとを欠失させることができる。
本発明の一側面においては、外因性遺伝子の全部またはその一部を導入することなく、微生物の染色体の遺伝子を突然変異させることができる。本発明の他の側面によれば、１つまたは複数の点突然変異を生じさせること、あるいは組換えられている内因性遺伝子のオープン・リーディング・フレームに１つまたは複数の終止コドンを導入することによって、突然変異を起こした内因性遺伝子が提供される。本発明のさらに他の側面においては、内因性遺伝子のオープン・リーディング・フレームを染色体ＤＮＡから欠失させることができる。
本発明の一側面においては、所望の表現型の突然変異遺伝子を有する菌株を選択するために、外因性ヌクレオチド配列を導入して標的遺伝子を不活化してもよい。微生物ゲノムに導入された外因性ヌクレオチド配列は、その後、残すことなく完全に除去することができる。
本発明の一実施形態においては、高い力価、収率、および容積生産性でＤ（−）−乳酸生成を生成する能力により生体触媒を選択する。本発明の一実施形態によれば、１モルの炭素源（例えばグルコース）を消費するごとに少なくとも０．５モルのＤ（−）−乳酸を生産可能な生体触媒が提供される。このような生体触媒を、増殖に基づく選択を利用して任意に選択してもよい。
「力価」という用語は、発酵ブロスにおける特定の化合物のモル濃度を意味する。したがって、Ｄ（−）−乳酸を生成するための発酵プロセスにおいて、１００ｍＭの力価であれば、測定時の発酵ブロス１リットルにつき１００ｍＭの乳酸が含まれていることになる。
「収率」という用語は、発酵プロセスにおいて消費された原料１モル当たり生成される特定の化合物のモル数を指す。したがって、グルコースを原料としたＤ（−）−乳酸を生成するための発酵プロセスにおいて、収率という用語は、消費されたグルコース1モル当たり生成されるＤ（−）−乳酸のモル数を指す。
「容積生産性」という用語は、単位体積および単位時間当たり生成される特定の化合物の量をグラム数で表したものである。したがって、０．９ｇＬ−１ｈ−１のＤ（−）−乳酸の容積生産性値であれば、１時間の増殖で、発酵ブロス１リットルにつき０．９ｇのＤ（−）−乳酸が蓄積したことになる。本開示の遺伝子組換え微生物が有する容積生産性の範囲は、例えば４ｇＬ−１ｈ−１までとすることができる。例えば、ＱＺ１９は３ｇＬ−１ｈ−１よりも高い容積生産性を有することができる。
本開示において使用する「力価」、「収率」、および「容積生産性」という用語には、「基準化された力価」、「基準化された収率」、および「基準化された容積生産性」も含まれる。基準化された力価、基準化された収率、および基準化された容積生産性を決定する際には、増殖培地のｐＨを維持するために発酵槽に添加された中和試薬の体積も考慮される。
「（ｗ／ｖ）」という用語は、１リットル当たりの物質の量（グラム数）（ｇ／Ｌ）を指す。
本明細書で使用する「遺伝子操作」または「遺伝子組換え」という用語は、微生物のゲノムＤＮＡを操作することによりその微生物中の１つまたは複数の酵素の発現を調節することを指す。「遺伝子組換え微生物」、「遺伝子組換え菌株」（ＧＭＢＳ）、および「生体触媒」という用語は、本開示においては区別せずに使用してもよい。本発明の一実施形態においては、Bacillus coagulans株、Bacillus licheniformis株、Bacillus subtilis株、Bacillus amyloliquifaciens株、 Bacillus megaterium株、Bacillus macerans株などの様々なBacillus spp.、Paenibacillus spp.、またはGeobacillus stearothermophilus株などのGeobacillus spp.に対して遺伝子組換えを行うことができる。他のBacillus株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などのカルチャー・コレクションから得ることができる。また、本明細書に記載の遺伝子組換えを行うことにより、そのBacillus株はＤ（−）−乳酸を生成することができるようになる。本発明の一実施形態では、特に、B. coagulans株ＳＵＹ２７−１３およびＳＵＹ２７−１３のうちの少なくとも一方の中で発見された点突然変異を含むB. coagulans株を特許請求の範囲から除外してもよい。
したがって、本発明の一側面によれば、遺伝子組換え菌株によって炭素化合物から商業的に重要な量の乳酸を生成する方法が提供される。本明細書に記載されているように、Ｄ（−）−乳酸の生成に適した微生物は、１段階または２段階の方法で培養することができる。この方法のいずれのステップにおいても、約３０℃から約６５℃の間の温度範囲で遺伝子組換え微生物を培養してもよい。本発明の様々な実施形態においては、約３０℃、３７℃、または５５℃の温度で微生物を培養することが期待される。本発明の他の実施形態においては、約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、または約４５℃から５０℃の間の温度範囲で微生物を培養することが期待される。
「突然変異」、または「不活化」は、オープン・リーディング・フレームならびに上流制御領域および下流制御領域を含む遺伝子に対して実施された遺伝子組換えのことを指す。遺伝子に突然変異が起こると、その遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の転写がダウン・レギュレーションまたは完全阻害される。遺伝子の突然変異は、その遺伝子（ＯＲＦ）のコード領域全体、またはコードヌクレオチド配列（ＯＲＦの）の一部を欠失させること、コード領域にフレームシフト突然変異を導入すること、ミスセンス突然変異を導入すること、すなわち遺伝子がコードするタンパク質の活性を阻害する配列を挿入すること、終止コドンを導入すること、あるいは、上述の遺伝子突然変異のあらゆる組み合わせにより実現される。
本明細書で使用する「外因性」という用語は、細胞外由来の分子または活性を宿主微生物に導入することを指す。微生物細胞に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立したプラスミドとして存在するか、または宿主染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。本発明の一実施形態に係る生体触媒においては、タンパク質をコードする外因性核酸が発見されない。他の実施形態においては、外因性遺伝子を含む生体触媒を考慮する。外因性遺伝子（核酸配列）が存在する場合、プロモーターやターミネーター配列などの微生物独自の制御配列に発現可能な形態で導入してもよい。あるいは、外因性核酸分子は、宿主染色体ＤＮＡに組み込んでもよく、また宿主制御配列の制御化にあってもよい。
「内因性」という用語は、宿主細胞内に自然に（生まれつき）存在する分子および活性を指す。生合成活性に関連して使用する場合、「外因性」という用語は、宿主指標生物に導入された活性を指す。その起源は、例えば、宿主微生物への導入後にその活性を発現する同種または異種のコード核酸とすることができる。タンパク質をコードする核酸が同種の微生物から得られた場合、それを同種ＤＮＡと呼ぶ。核酸が異種の微生物から得られた場合、それを異種ＤＮＡと呼ぶ。ＤＮＡが宿主細胞に導入された場合、同種ＤＮＡであろうと異種ＤＮＡであろうとＤＮＡの種類に関係なく、導入されたＤＮＡ由来のＤＮＡおよび活性は外因性のものとする。したがって、コード核酸の外因性発現においては、同種または異種、あるいは同種および異種のコード核酸を利用することができる。
本発明の一側面によれば、優れた力価、高い収率、および高い容積生産性でＤ（−）−乳酸を生成するＧＭＢＳが提供される。様々な糖類を利用してＤ（−）−乳酸を生産する生産方法において、本開示の微生物を利用することができる。本発明の一実施形態において、遺伝子組換えには、微生物が生まれつき有するゲノム内の遺伝子を操作することのみが含まれる。本実施形態においては、抗生物質耐性遺伝子、またはある酵素タンパク質をコードする他のあらゆる外因性ヌクレオチド配列を有するプラスミドなどの外因性遺伝物質が、Ｄ（−）−乳酸生成菌株内に存在しない。
本発明においては、特定の遺伝子組換え技術と、増殖に基づく選択プロセスとを組み合わせて、高い収率、力価、および容積生産性でＤ（−）−乳酸を生成する菌株を得る。続いて、本開示の方法で生産された遺伝子組換え菌株を、低ｐＨなどの様々な条件下で数世代にわたって増殖させ、親株よりもＤ（−）−乳酸の生成量が多いクローン、および親株と比較して細胞収率の高いクローンのうちの少なくとも一方を選択してもよい。この点に関して、例示的な図を図７に示す。菌株を増殖させて、最も好ましい表現型を有するクローンを選択するプロセスを、増殖に基づく選択と呼ぶ。
図７は、Ｄ（−）−乳酸生成菌株を生産するための例示的な概略図である。一般的に、標的菌株／細菌細胞に対して遺伝子組換えを行うことで、ピルビン酸分岐点における競争反応であるＬ−乳酸脱水素酵素活性およびアセト乳酸合成酵素活性を不活化する。そして、ｐＨ４．５から５．５の間の酸素制限条件下で細胞を培養する。親株と比較して細胞収率の高い細胞および／または乳酸生産量の多い細胞を選択し、さらに成長させる。その後、選択した細胞をｐＨ６．５から７．５の間の酸素制限下／嫌気性条件下で培養する。選択した細胞と比較して細胞収率の高い細胞および／または乳酸生産量の多い細胞を選択し、さらに成長させ、あるいは、Ｄ（−）−乳酸の生成に利用した。本発明の好ましい側面において、Ｄ（−）−乳酸の生成に利用される細胞は、（好ましくは４８時間以内に）培地１リットル当たり少なくとも６０ｇの乳酸を生成する。
増殖に基づく選択を行っている間、遺伝子組換え菌株を新しい培地に一定期間繰り返し植菌することで、細胞増殖が速く、様々な炭素源を急速に消費し、複数の糖類を同時に利用する能力を有し、炭素源に含まれる有害化学物質に対して耐性があり、所望の有機酸の生産収率および生産性が高く、他の有機酸の生産量が少ないクローンを得る。増殖に基づく選択を行っている間、上述の望ましい表現型を有するクローンを選択するように注意する。この選択プロセスにより、とても高い増殖率を示すが所望の有機酸の収率が高くないクローンが得られたとしても、それは望ましいものではない。本開示の方法を実施する際、遺伝子組換え菌株の培養を好気的条件下で開始し、培養系（例えば発酵槽）内において酸素制限条件下でその菌株を連続継代することにより、菌株を選択する。酸素制限条件下で増殖できる遺伝子組換え微生物を選択して、微好気的条件または嫌気性条件に達するまで継代を続ける。それから、ｐＨを上げて微生物を嫌気的に培養し、この培養条件におけるＤ（−）−乳酸の生産量を基に微生物を選択する。この方法のいずれのステップにおいても、遺伝子組換え微生物を約３０℃から約６５℃の間の温度範囲で培養する。本発明の様々な実施形態においては、微生物を３０℃、３７℃、または５５℃の温度で培養することが期待される。本発明の他の実施形態においては、微生物を約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、または約４５℃から約５０℃の間の温度範囲で培養することが期待される。
遺伝子操作はいくつかの異なる段階に分けて実施することができ、この段階の間に、増殖に基づく選択を行う。遺伝子操作には、内因性ＤＮＡ配列を操作すること、または特定のＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡから完全に除去することが含まれる。遺伝子操作は、微生物のゲノムＤＮＡ配列に外因性ＤＮＡ配列を挿入することを含んでもよい。本発明の一実施形態においては、微生物のゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ配列を除去することによって、外因性ＤＮＡを導入せずに遺伝子操作を実施することができる。特定のタンパク質生成物をコードする遺伝子の発現を抑えるのに必要な遺伝子操作では、外因性ＤＮＡ配列を微生物のゲノムに挿入して、所望の遺伝子組換えクローンを選択する必要がある。例えば、外因性抗生物質マーカー遺伝子を利用して、内因性遺伝子を挿入的に不活化し、所望の遺伝子型を有するクローンを選択することができる。本発明の一実施形態において、導入された外因性ＤＮＡ配列は、遺伝子操作プロセスの最後に、微生物がゲノムＤＮＡ内に外因性ＤＮＡをほとんど有しないように、または有しないように、特に外因性ＤＮＡ遺伝子の全部（またはその一部）を有しないように、微生物のゲノムＤＮＡから最終的に除去される。本発明の好ましい実施形態の目的を達成するのに必要な様々な遺伝子操作技術は、当該技術分野において周知であり、また、高温度で不安定性を示すプラスミドを利用することを含む（例えば、本願の実施例に記載の物質および方法を参照）。引用科学出版物および引用特許文献はいずれも、本発明に有用な遺伝子操作技術を実施するために必要なあらゆる詳細情報を提供することを目的として、その全体が参照として組み込まれる。
本発明の一実施形態において、発酵経路で機能することが周知であるタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子は、上述のように１つまたは複数の遺伝子操作または遺伝子操作技術により不活化される。不活化してもよい遺伝子および酵素には、乳酸脱水素酵素（ldh）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）が含まれる。
これにより、以下の非限定的な実施形態が提供される。
（１）
ａ）乳酸脱水素酵素ならびに任意にアセト乳酸合成酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも１つ
ｂ）乳酸脱水素酵素およびアセト乳酸合成酵素
ｃ）乳酸脱水素酵素、アセト乳酸合成酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼ、または
ｄ）乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素のあらゆる組み合わせ
の酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
ａ）乳酸脱水素酵素ならびに任意にアセト乳酸合成酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも１つ
ｂ）乳酸脱水素酵素およびアセト乳酸合成酵素
ｃ）乳酸脱水素酵素、アセト乳酸合成酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼ、または
ｄ）乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素のあらゆる組み合わせ
の酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
（２）
前記（１）に記載の細菌細胞であって、さらに
所望の酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
前記（１）に記載の細菌細胞であって、さらに
所望の酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
（３）
前記（１）または（２）に記載の細菌細胞であって、さらに
外因性遺伝子を導入する遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
前記（１）または（２）に記載の細菌細胞であって、さらに
外因性遺伝子を導入する遺伝子組換えを行った
細菌細胞。
（４）
前記（１）または（２）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは、
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に突然変異を生じさせること、または
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の一部または全部を欠失させることを含む
細菌細胞。
前記（１）または（２）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは、
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に突然変異を生じさせること、または
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の一部または全部を欠失させることを含む
細菌細胞。
（５）
前記（４）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子の突然変異は
前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームに１つまたは複数の点突然変異を導入すること、または１つ若しくは複数の終止コドンを導入することを含む
細菌細胞。
前記（４）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子の突然変異は
前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームに１つまたは複数の点突然変異を導入すること、または１つ若しくは複数の終止コドンを導入することを含む
細菌細胞。
（６）
前記（１）〜（３）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つのコード配列／オープン・リーディング・フレームに点突然変異を導入すること、または前記コード配列／オープン・リーディング・フレームを欠失させること、または乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つのコード領域／オープン・リーディング・フレームに外因性配列を挿入することを含む
細菌細胞。
前記（１）〜（３）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つのコード配列／オープン・リーディング・フレームに点突然変異を導入すること、または前記コード配列／オープン・リーディング・フレームを欠失させること、または乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素（pflA）、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ（alsD）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つのコード領域／オープン・リーディング・フレームに外因性配列を挿入することを含む
細菌細胞。
（７）
前記（１）、（２），（４），（５）、または（６）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
外因性遺伝子の全部またはその一部を含まない
細菌細胞。
前記（１）、（２），（４），（５）、または（６）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
外因性遺伝子の全部またはその一部を含まない
細菌細胞。
（８）
前記（１）、（２）、（４）、（５）、または（６）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
前記細菌細胞が有するＬ−乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性は、温度感受性プラスミドを任意に利用した相同組換えによって不活化される
細菌細胞。
前記（１）、（２）、（４）、（５）、または（６）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
前記細菌細胞が有するＬ−乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性は、温度感受性プラスミドを任意に利用した相同組換えによって不活化される
細菌細胞。
（９）
前記（８）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは
アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチドの全部または一部を欠失させることを含む
細菌細胞。
前記（８）に記載の細菌細胞であって
前記遺伝子組換えは
アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチドの全部または一部を欠失させることを含む
細菌細胞。
（１０）
前記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
前記細菌はBacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquifaciens、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、またはBacillus thiaminolyticusなどのBacillus spp.であり
Bacillus coagulans Ｓｕｙ２７−１３は、特許請求の範囲から任意に除外してもよい
細菌細胞。
前記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって
前記細菌はBacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquifaciens、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、またはBacillus thiaminolyticusなどのBacillus spp.であり
Bacillus coagulans Ｓｕｙ２７−１３は、特許請求の範囲から任意に除外してもよい
細菌細胞。
（１１）
前記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細菌細胞であって
ＱＺ１５またはＱＺ１９である
細菌細胞。
前記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細菌細胞であって
ＱＺ１５またはＱＺ１９である
細菌細胞。
（１２）
Ｄ（−）−乳酸を生成する方法であって
Ｄ（−）−乳酸の生成を可能にする条件下で、炭素源を含む培地において前記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細菌細胞を培養する
Ｄ（−）−乳酸を生成する方法。
Ｄ（−）−乳酸を生成する方法であって
Ｄ（−）−乳酸の生成を可能にする条件下で、炭素源を含む培地において前記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細菌細胞を培養する
Ｄ（−）−乳酸を生成する方法。
（１３）
前記（１２）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、さらに
Ｄ（−）−乳酸を単離または精製する
Ｄ（−）−乳酸生産方法。
前記（１２）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、さらに
Ｄ（−）−乳酸を単離または精製する
Ｄ（−）−乳酸生産方法。
（１４）
前記（１３）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記細菌細胞は嫌気性条件下で培養される
Ｄ（−）−乳酸生産方法。
前記（１３）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記細菌細胞は嫌気性条件下で培養される
Ｄ（−）−乳酸生産方法。
（１５）
前記（１２）〜（１４）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記培地は２％から２０％（ｗ／ｖ）の間の濃度の炭素源を含む
Ｄ（−）−乳酸生成方法。
前記（１２）〜（１４）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記培地は２％から２０％（ｗ／ｖ）の間の濃度の炭素源を含む
Ｄ（−）−乳酸生成方法。
（１６）
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞を生産する方法であって、
ａ） 前記細菌細胞における乳酸脱水素酵素活性およびアセト乳酸合成酵素活性を不活化し
ｂ） ｐＨを３．０から６．０の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記細菌細胞を好気性条件下および酸素制限条件下の少なくとも一方で培養し、
ｃ） 親株と比較して細胞収率および／またはＤ（−）−乳酸生成量が増加した細菌細胞を選択し、
ｄ） ｐＨを６．５から８．０の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記選択された細菌細胞を嫌気性条件下で培養し、
ｅ） 親株、すなわちステップｄ）で選択された細菌細胞と比較して細胞収率および／またはＤ（−）−乳酸生成量のうちの少なくとも一方が増加した細菌細胞を選択する
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞を生産する方法であって、
ａ） 前記細菌細胞における乳酸脱水素酵素活性およびアセト乳酸合成酵素活性を不活化し
ｂ） ｐＨを３．０から６．０の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記細菌細胞を好気性条件下および酸素制限条件下の少なくとも一方で培養し、
ｃ） 親株と比較して細胞収率および／またはＤ（−）−乳酸生成量が増加した細菌細胞を選択し、
ｄ） ｐＨを６．５から８．０の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記選択された細菌細胞を嫌気性条件下で培養し、
ｅ） 親株、すなわちステップｄ）で選択された細菌細胞と比較して細胞収率および／またはＤ（−）−乳酸生成量のうちの少なくとも一方が増加した細菌細胞を選択する
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（１７）
前記（１６）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
ステップｂ）は、約４．５若しくは５．５、または約５．０のｐＨで実施される
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
ステップｂ）は、約４．５若しくは５．５、または約５．０のｐＨで実施される
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（１８）
前記（１６）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
ステップｄ）は、約６．５若しくは７．５、または約７．０のｐＨで実施される
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞生産方法。
前記（１６）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
ステップｄ）は、約６．５若しくは７．５、または約７．０のｐＨで実施される
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞生産方法。
（１９）
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地において、ステップｄ）およびステップｅ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地において、ステップｄ）およびステップｅ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２０）
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地において、ステップｂ）およびステップｃ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地において、ステップｂ）およびステップｃ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２１）
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地においてステップｂ）〜ステップｅ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）〜（１８）に記載のＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
炭素源の量を増やした培地においてステップｂ）〜ステップｅ）を繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２２）
前記（１２）〜（２１）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記炭素源は
グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、セルロース、グリセロール、またはその組み合わせである
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１２）〜（２１）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記炭素源は
グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、セルロース、グリセロール、またはその組み合わせである
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２３）
前記（１２）〜（１５）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記発酵は、嫌気性条件下においてｐＨを
約６．５から７．５、または
約７．０
に維持して行われる
Ｄ（−）−乳酸生成方法。
前記（１２）〜（１５）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記発酵は、嫌気性条件下においてｐＨを
約６．５から７．５、または
約７．０
に維持して行われる
Ｄ（−）−乳酸生成方法。
（２４）
前記（１２）〜（２２）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、
発酵開始から４８時間以内に
発酵培地１リットルにつき少なくとも６０ｇの乳酸を生成し、
発酵培地１リットルにつき少なくとも８０ｇの乳酸を生成し、または
発酵培地１リットルにつき少なくとも９０ｇの乳酸を生成する
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１２）〜（２２）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、
発酵開始から４８時間以内に
発酵培地１リットルにつき少なくとも６０ｇの乳酸を生成し、
発酵培地１リットルにつき少なくとも８０ｇの乳酸を生成し、または
発酵培地１リットルにつき少なくとも９０ｇの乳酸を生成する
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２５）
前記（１２）〜（２４）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞を培養するために使用する培地のｐＨは、酸または塩基を自動添加することにより維持される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１２）〜（２４）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞を培養するために使用する培地のｐＨは、酸または塩基を自動添加することにより維持される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２６）
前記（１６）〜（２３）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、最初に好気性条件下で培養され、微好気的条件または嫌気性条件に達するまで、培養系内に存在する酸素の量を低減させた条件下で連続継代される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）〜（２３）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、最初に好気性条件下で培養され、微好気的条件または嫌気性条件に達するまで、培養系内に存在する酸素の量を低減させた条件下で連続継代される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２７）
前記（１６）〜（２３）、または（２６）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquifaciens、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、またはBacillus thiaminolyticusなどのBacillus spp.であり、
Bacillus coagulans Ｓｕｙ２７−１３は任意に除外される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１６）〜（２３）、または（２６）に記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquifaciens、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、またはBacillus thiaminolyticusなどのBacillus spp.であり、
Bacillus coagulans Ｓｕｙ２７−１３は任意に除外される
Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２８）
前記（１）〜（１０）および（１２）〜（２７）のいずれか１つに記載の細菌細胞、Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、
ldh＋pflB、ldh＋pflA、ldh＋pflA＋pflB、ldh＋alsS、ldh＋alsD、ldh＋alsS＋alsD、ldh＋pflB＋alsS、ldh＋pflB＋alsD、ldh＋pflA＋alsS、ldh＋pflA＋alsD、ldh＋pflA＋pflB＋alsS、ldh＋pflA＋pflB＋alsD、ldh＋pflA＋alsD＋alsS、ldh＋pflB＋alsD＋alsS、およびldh＋pflA＋pflB＋alsD＋alsSの遺伝子の組み合わせのうちいずれか１つが不活化された、または
乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、および乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素の酵素活性の組み合わせのうちいずれか１つが不活化された
細菌細胞、Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１）〜（１０）および（１２）〜（２７）のいずれか１つに記載の細菌細胞、Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
前記細菌細胞は、
ldh＋pflB、ldh＋pflA、ldh＋pflA＋pflB、ldh＋alsS、ldh＋alsD、ldh＋alsS＋alsD、ldh＋pflB＋alsS、ldh＋pflB＋alsD、ldh＋pflA＋alsS、ldh＋pflA＋alsD、ldh＋pflA＋pflB＋alsS、ldh＋pflA＋pflB＋alsD、ldh＋pflA＋alsD＋alsS、ldh＋pflB＋alsD＋alsS、およびldh＋pflA＋pflB＋alsD＋alsSの遺伝子の組み合わせのうちいずれか１つが不活化された、または
乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋アセト乳酸合成酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素、および乳酸脱水素酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素＋ピルビン酸ギ酸リアーゼ＋α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ＋アセト乳酸合成酵素の酵素活性の組み合わせのうちいずれか１つが不活化された
細菌細胞、Ｄ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
（２９）
前記（１）〜（１１）または（２８）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって、
約３０℃から約６５℃の間、約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、若しくは約４５℃から約５０℃の間の温度範囲、または、約３０℃、約３７℃、若しくは約５５℃の温度でＤ（−）−乳酸を生成する
細菌細胞。
前記（１）〜（１１）または（２８）のいずれか１つに記載の細菌細胞であって、
約３０℃から約６５℃の間、約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、若しくは約４５℃から約５０℃の間の温度範囲、または、約３０℃、約３７℃、若しくは約５５℃の温度でＤ（−）−乳酸を生成する
細菌細胞。
（３０）
前記（１２）〜（２８）のいずれか１つに記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
約３０℃から約６５℃の間、約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、若しくは約４５℃から約５０℃の間の温度範囲、または、約３０℃、約３７℃、若しくは約５５℃の温度で前記細菌細胞を培養すること
を含むＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
前記（１２）〜（２８）のいずれか１つに記載のＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、
約３０℃から約６５℃の間、約３７℃から約６５℃の間、約３７℃から約５５℃の間、約４５℃から約６０℃の間、若しくは約４５℃から約５０℃の間の温度範囲、または、約３０℃、約３７℃、若しくは約５５℃の温度で前記細菌細胞を培養すること
を含むＤ（−）−乳酸生成方法またはＤ（−）−乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。
アメリカ合衆国６１６０４イリノイ州ピオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５にあるアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Service Culture Collection）に微生物を寄託した（表５）。本寄託物は、本特許出願の係属中、３７ＣＦＲ１．１４および３５ＵＳＣ１２２の下で特許商標庁長官により資格を有すると決定された者は、本寄託物を利用できるよう保証されるという条件下で寄託されている。本願の写し、またはその所産が提出されている国における外国特許法の定めるところにより、本寄託物を利用することができる。しかし、本寄託物を利用できたとしても、行政措置により付与された特許権に関し、特例として本発明の実施権が与えられるわけではないことが理解されよう。
さらに、本寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約（Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms）の条項に従って保存され、一般に利用可能となる。すなわち、本寄託物は、寄託試料の最近の分譲請求から少なくとも５年間、またいずれの場合でも、寄託日から少なくとも３０年間、または、培養物を開示している発行可能性のある特許の権利行使可能期間、生存可能かつ汚染されていない状態を保つために必要なあらゆる配慮をもって保存される。寄託者は、寄託物の分譲請求を受けた際に寄託物の状態により寄託機関が試料を分譲できない場合、寄託物を交換する義務があることを認めている。本寄託物の一般の利用可能性に関するすべての制限は、本寄託物を開示する特許が付与された際に、取消不能に取り除かれる。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。これら発明は、本発明の範囲を限定するものではない。いくつかの異なる実施形態において、工業微生物学分野の経験者であれば、本発明の精神を逸脱することなく、本発明を実施することができるであろう。
本明細書において参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願、および刊行物は、本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、すべての図および表を含むその全体が参照として組み込まれる。
以下は、本発明を実施するための手順を示す実施例である。これら実施例は、本発明を限定するものと解釈してはならない。特に断りのない限り、百分率はすべて重量百分率であり、溶媒混合比はすべて体積比である。
＜実施例１：Ｄ（−）−乳酸生成耐熱性Bacillus coagulansの構造＞
［材料および方法］
（菌株およびプラスミド）
B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂについては非特許文献２７に既に記載されている。本研究で使用する様々なプラスミドを構築する際に、Escherichia coli株Ｔｏｐ１０（インビトロジェン社）およびBacillus subtilis株ＨＢ１０００（非特許文献１１参照）を宿主として利用した。プラスミドｐＧＫ１２は、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、いくつかのグラム陽性菌およびE. coli内において複製を行う（非特許文献１７，２１参照）。このプラスミドは広宿主域を有するが、複製を行うための温度は必然的に４２℃以下に限られる。温度感受性を有するプラスミドｐＧＫ１２が５０℃の温度で複製を行うことにより、５０℃〜５５℃の温度範囲で増殖できるB. coagulansの染色体ＤＮＡ成分を選択する機会が与えられる。プラスミドｐＧＫ１２およびその誘導体を、B. subtilis株ＨＢ１０００内に３７℃の温度で維持した。B. coagulansに形質転換する際に、この形質転換体を選択し、３７℃の温度で維持する。B. coagulans変異株、および変異株の構築の際に利用したプラスミドの一覧を表１に示す。
［材料および方法］
（菌株およびプラスミド）
B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂについては非特許文献２７に既に記載されている。本研究で使用する様々なプラスミドを構築する際に、Escherichia coli株Ｔｏｐ１０（インビトロジェン社）およびBacillus subtilis株ＨＢ１０００（非特許文献１１参照）を宿主として利用した。プラスミドｐＧＫ１２は、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、いくつかのグラム陽性菌およびE. coli内において複製を行う（非特許文献１７，２１参照）。このプラスミドは広宿主域を有するが、複製を行うための温度は必然的に４２℃以下に限られる。温度感受性を有するプラスミドｐＧＫ１２が５０℃の温度で複製を行うことにより、５０℃〜５５℃の温度範囲で増殖できるB. coagulansの染色体ＤＮＡ成分を選択する機会が与えられる。プラスミドｐＧＫ１２およびその誘導体を、B. subtilis株ＨＢ１０００内に３７℃の温度で維持した。B. coagulansに形質転換する際に、この形質転換体を選択し、３７℃の温度で維持する。B. coagulans変異株、および変異株の構築の際に利用したプラスミドの一覧を表１に示す。
（培地および増殖条件）
富栄養培地としてＬＢ培地（非特許文献１９参照）を使用し、必要に応じてｐＨを５．０または７．０に維持して細菌を培養した。グルコースを個別に滅菌して、所望の濃度で培地に添加し、その後、植菌した。必要に応じてクロラムフェニコール、エリスロマイシン、およびアンピシリンをそれぞれ７．５ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／ＬずつＬＢ培地に添加した。既に非特許文献３０に記載されているように、グルコース添加（２％、ｗ／ｖ）ＬＢ寒天培地に２．５ｍｌの炭酸カルシウム寒天（１．５％の寒天を添加した水に懸濁した固体の炭酸カルシウム（１％ｗ／ｖ））を重ね合わせることで、炭酸カルシウム培地を調製した。
富栄養培地としてＬＢ培地（非特許文献１９参照）を使用し、必要に応じてｐＨを５．０または７．０に維持して細菌を培養した。グルコースを個別に滅菌して、所望の濃度で培地に添加し、その後、植菌した。必要に応じてクロラムフェニコール、エリスロマイシン、およびアンピシリンをそれぞれ７．５ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／ＬずつＬＢ培地に添加した。既に非特許文献３０に記載されているように、グルコース添加（２％、ｗ／ｖ）ＬＢ寒天培地に２．５ｍｌの炭酸カルシウム寒天（１．５％の寒天を添加した水に懸濁した固体の炭酸カルシウム（１％ｗ／ｖ））を重ね合わせることで、炭酸カルシウム培地を調製した。
振とう機内において、２００ｒｐｍの攪拌速度で好気性培養物を増殖させた。小さな特注の発酵槽（非特許文献２参照）、または２．５Ｌの発酵槽（New Brunswick Scientific Bioflo 110）内で発酵を行った。２Ｎまたは６ＮのＫＯＨを自動添加することにより、培養ｐＨを設定値に維持した。別に指定しない限り、発酵の初期に、固体の炭酸カルシウム（フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社（ペンシルベニア州ピッツバーグ））を必要に応じて２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加した。これら培養物の接種菌を、５０℃の温度で一晩、同じ培地において好気的に増殖させた。１％（ｗ／ｖ）の接種菌を用いて、発酵を開始した。発酵産物を決定するため、および残糖濃度を求めるために、定期的に試料を取り出した。
（B. coagulansの欠失変異株の構築）
既に非特許文献１３に記載された、標的遺伝子の両端を含むプラスミドＤＮＡを適切なＤＮＡ配列相同性を利用して単一の組換え事象により染色体の標的部位に組み込む方法を基に、B. coagulansの欠失変異株を単離した。適切な抗生物質耐性を有するこのような組換え体は、細胞質から完全なプラスミドが細胞質から取り除かれる制限温度において複製条件付きプラスミドを利用することで容易に特定することができる。続いて、導入されたプラスミドＤＮＡおよび適切な染色体ＤＮＡの異なる部位において単一の相同組換えが起こることにより、このプラスミドＤＮＡおよび関連する抗生物質耐性遺伝子が染色体から除去される。これにより、標的遺伝子を欠失させることができる。ldh遺伝子を欠失させたB. coagulansを構築する際、B. coagulans内で複製できないプラスミド・ベクターを最初に用いた。しかし、このようなプラスミドを利用しても、導入されたプラスミドＤＮＡの染色体への挿入は検出されなかった。これは、B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂのプラスミド形質転換頻度が、取り込まれたプラスミドの染色体への潜在的な組換え頻度よりも低い（非特許文献２９参照）ことによるものと考えられる。この形質転換頻度が低いという問題を解決するために、ＤＮＡをB. coagulansへ移動させる主要な媒体としてプラスミドｐＧＫ１２を利用して欠失変異株を構築した。プラスミドｐＧＫ１２は、B. coagulans内において、３７℃の温度では安定であるが、５０℃の温度では安定でない。３７℃の温度において、母集団（１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の各細胞内にプラスミドが存在することにより、プラスミドＤＮＡの細菌への形質転換頻度が低いという問題の解決に役立つ。プラスミドＤＮＡを有する細胞の母集団が大きいことにより、プラスミドＤＮＡと染色体との相同領域間における稀な組換え事象を選択することができる。（抗生物質耐性遺伝子とともに）染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡを有する細胞の母集団における稀な組換えは、５０℃〜５５℃の温度範囲で増殖した後、そのプラスミドＤＮＡが細胞から取り除かれることで容易に特定することができる。
既に非特許文献１３に記載された、標的遺伝子の両端を含むプラスミドＤＮＡを適切なＤＮＡ配列相同性を利用して単一の組換え事象により染色体の標的部位に組み込む方法を基に、B. coagulansの欠失変異株を単離した。適切な抗生物質耐性を有するこのような組換え体は、細胞質から完全なプラスミドが細胞質から取り除かれる制限温度において複製条件付きプラスミドを利用することで容易に特定することができる。続いて、導入されたプラスミドＤＮＡおよび適切な染色体ＤＮＡの異なる部位において単一の相同組換えが起こることにより、このプラスミドＤＮＡおよび関連する抗生物質耐性遺伝子が染色体から除去される。これにより、標的遺伝子を欠失させることができる。ldh遺伝子を欠失させたB. coagulansを構築する際、B. coagulans内で複製できないプラスミド・ベクターを最初に用いた。しかし、このようなプラスミドを利用しても、導入されたプラスミドＤＮＡの染色体への挿入は検出されなかった。これは、B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂのプラスミド形質転換頻度が、取り込まれたプラスミドの染色体への潜在的な組換え頻度よりも低い（非特許文献２９参照）ことによるものと考えられる。この形質転換頻度が低いという問題を解決するために、ＤＮＡをB. coagulansへ移動させる主要な媒体としてプラスミドｐＧＫ１２を利用して欠失変異株を構築した。プラスミドｐＧＫ１２は、B. coagulans内において、３７℃の温度では安定であるが、５０℃の温度では安定でない。３７℃の温度において、母集団（１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の各細胞内にプラスミドが存在することにより、プラスミドＤＮＡの細菌への形質転換頻度が低いという問題の解決に役立つ。プラスミドＤＮＡを有する細胞の母集団が大きいことにより、プラスミドＤＮＡと染色体との相同領域間における稀な組換え事象を選択することができる。（抗生物質耐性遺伝子とともに）染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡを有する細胞の母集団における稀な組換えは、５０℃〜５５℃の温度範囲で増殖した後、そのプラスミドＤＮＡが細胞から取り除かれることで容易に特定することができる。
（ldh遺伝子欠失変異株の単離）
ldh欠失誘導体を構築するために、２組のプライマー（プライマー９（ＢｓａＡＩ）、１０（ＥｃｏＲＩ）、１１（ＥｃｏＲＩ）、１２（ＳｔｕＩ））を利用して、B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂから得たゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ldh遺伝子の５’末端および３’末端を個別に増幅した。ＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマーの一覧を表２に示す。これらプライマーは、５’末端に固有のエンドヌクレアーゼ認識配列を有する。この２つの増幅断片をＥｃｏＲＩにより切断し、結合した。結合生成物を鋳型として用い（プライマー９および１２）、ldh遺伝子の「ＡＴＧ」のうちの「Ａ」から数えて４３１番目の塩基対から始まるldh遺伝子中央の１００塩基対領域を欠く、プロモーターを有しないldh遺伝子断片を生成した。この断片をＢｓａＡＩおよびＳｔｕＩで切断し、同様に切断されたプラスミドｐＧＫ１２（プラスミドｐＱＺ４４）に結合した。プラスミドへの挿入は、シークエンシングにより確認した。プラスミドｐＱＺ４４をB. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂに形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを３７℃の温度にて選択した。形質転換体の１つを５０℃の温度で培養し、Ｌ−ＬＤＨ要求性（約１％）であるエリスロマイシン耐性誘導体を選択した（株ＱＺ３）。株ＱＺ３の染色体のldh遺伝子にプラスミドＤＮＡが存在することは、適切なプライマーを用いてゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、増幅生成物の配列を決定するにより確認した。エリスロマイシン無添加培地での継代培養中、株ＱＺ３のldh要求性は不安定であることが発見され、ldh非要求性復帰突然変異株が容易に単離された。株ＱＺ３をエリスロマイシン無添加の新しい培地に、５５℃の温度において、連続的に毎日、１０日間植菌した（１％ｗ／ｖの接種濃度）。最終培養物を希釈し、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。５０℃の温度にて一晩増殖させた後、レプリカ平板法にてコロニーをＬＢ寒天培地、ＬＢ寒天＋エリスロマイシン培地、および炭酸カルシウム培地（グルコースおよび炭酸カルシウム添加ＬＢ寒天培地（非特許文献３０参照））に植菌した。ＬＢ寒天培地で増殖したが、ＬＢ寒天＋エリスロマイシン培地では増殖せず、炭酸カルシウム培地が透明化した範囲を基に乳酸を生成しなかったコロニーを採取し、このコロニーを液体培養することにより乳酸の生成を試験した。２回目の組換えにより、ldh遺伝子内の１００塩基対が欠失しているためにＬ−ＬＤＨ活性を欠くエリスロマイシン感受性誘導体が生産されることが期待された。本実験において、ldh遺伝子欠失の頻度は、５０００個のエリスロマイシン感受性コロニーのうち１個であった。これらldh遺伝子欠失変異株の１つである株ＱＺ４を選択してさらに研究を行った。
ldh欠失誘導体を構築するために、２組のプライマー（プライマー９（ＢｓａＡＩ）、１０（ＥｃｏＲＩ）、１１（ＥｃｏＲＩ）、１２（ＳｔｕＩ））を利用して、B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂから得たゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ldh遺伝子の５’末端および３’末端を個別に増幅した。ＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマーの一覧を表２に示す。これらプライマーは、５’末端に固有のエンドヌクレアーゼ認識配列を有する。この２つの増幅断片をＥｃｏＲＩにより切断し、結合した。結合生成物を鋳型として用い（プライマー９および１２）、ldh遺伝子の「ＡＴＧ」のうちの「Ａ」から数えて４３１番目の塩基対から始まるldh遺伝子中央の１００塩基対領域を欠く、プロモーターを有しないldh遺伝子断片を生成した。この断片をＢｓａＡＩおよびＳｔｕＩで切断し、同様に切断されたプラスミドｐＧＫ１２（プラスミドｐＱＺ４４）に結合した。プラスミドへの挿入は、シークエンシングにより確認した。プラスミドｐＱＺ４４をB. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂに形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを３７℃の温度にて選択した。形質転換体の１つを５０℃の温度で培養し、Ｌ−ＬＤＨ要求性（約１％）であるエリスロマイシン耐性誘導体を選択した（株ＱＺ３）。株ＱＺ３の染色体のldh遺伝子にプラスミドＤＮＡが存在することは、適切なプライマーを用いてゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、増幅生成物の配列を決定するにより確認した。エリスロマイシン無添加培地での継代培養中、株ＱＺ３のldh要求性は不安定であることが発見され、ldh非要求性復帰突然変異株が容易に単離された。株ＱＺ３をエリスロマイシン無添加の新しい培地に、５５℃の温度において、連続的に毎日、１０日間植菌した（１％ｗ／ｖの接種濃度）。最終培養物を希釈し、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。５０℃の温度にて一晩増殖させた後、レプリカ平板法にてコロニーをＬＢ寒天培地、ＬＢ寒天＋エリスロマイシン培地、および炭酸カルシウム培地（グルコースおよび炭酸カルシウム添加ＬＢ寒天培地（非特許文献３０参照））に植菌した。ＬＢ寒天培地で増殖したが、ＬＢ寒天＋エリスロマイシン培地では増殖せず、炭酸カルシウム培地が透明化した範囲を基に乳酸を生成しなかったコロニーを採取し、このコロニーを液体培養することにより乳酸の生成を試験した。２回目の組換えにより、ldh遺伝子内の１００塩基対が欠失しているためにＬ−ＬＤＨ活性を欠くエリスロマイシン感受性誘導体が生産されることが期待された。本実験において、ldh遺伝子欠失の頻度は、５０００個のエリスロマイシン感受性コロニーのうち１個であった。これらldh遺伝子欠失変異株の１つである株ＱＺ４を選択してさらに研究を行った。
同様の方法により、クロラムフェニコール耐性遺伝子を選択マーカーとして利用しても、ldh遺伝子欠失変異株を単離することはできなかった。プラスミドの骨格に関係なく、クロラムフェニコール耐性遺伝子は、プラスミドのB. coagulans染色体ＤＮＡとは無関係の染色体における固有の位置にプラスミドＤＮＡを挿入することを目的として存在していることが発見された（SuおよびRhee、未発表データ）。これら結果は、クロラムフェニコール耐性遺伝子がこのB. coagulans株における変異株の構築に適していないことを示している。
（als遺伝子欠失変異株の構築）
アセト乳酸合成酵素活性を欠く株ＱＺ４の変異誘導体は、B. coagulansのldh変異株が生成する発酵産物であるアセトインおよび2,3-ブタンジオールを生成しないものと考えられている（非特許文献３０参照）。この二重変異株（ldh遺伝子欠失変異株およびals遺伝子欠失変異株）を構築するための最初のステップとして、alsD（α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ）配列およびalsS（アセト乳酸合成酵素）配列を、プライマー１７および２１を用いて、株Ｐ４−１０２ＢのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ断片をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで処理し、HincII切断プラスミド・ベクターｐＵＣ１９に結合することにより、プラスミドｐＱＺ４５を構築した。このalsSD ＤＮＡがプラスミドｐＱＺ４５へ挿入されたことを、適切なプライマーを用いたシークエンシングにより検証した。プライマー１８および２２を用いて、alsSDコード領域のみを含む（プロモーターを含まない）プラスミドｐＱＺ４５から得た２３８０塩基対のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡは、プラスミドｐＵＣ１９のHincII部位に移植し、プラスミドｐＱＺ４５−１を生成した。alsSの５９６塩基対領域を、AfeIおよびHincIIにより切断した後、プラスミドｐＱＺ４５−１から除去し、エリスロマイシン耐性遺伝子カセットをその位置に挿入した。この新しいプラスミドｐＱＺ５４は、鋳型（プライマー１８および２２）としての役割を果たし、alsSにおいて５９６塩基対の欠失がありalsSD遺伝子を有する断片、およびエリスロマイシン耐性をコードする遺伝子を増幅させた。このＰＣＲ生成物をポリヌクレオチド・キナーゼでリン酸化し、BsaAIおよびAfeIで切断されたプラスミドｐＧＫ１２に結合した。こうして得られたプラスミドｐＱＺ６４をエレクトロポレーションによりB. coagulans株ＱＺ４（ldh遺伝子欠失株）に形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを３７℃の温度にて選択した。ldh遺伝子欠失株を構築するための上述の手順を用いて、alsS遺伝子が欠失した突然変異を株ＱＺ４に導入した。この方法により、好気性条件および嫌気性条件において増殖率が異なるいくつかのalsS変異株が生産された。最も高い増殖率を示した変異株（株ＱＺ５）を選択し、さらに研究を行った。
アセト乳酸合成酵素活性を欠く株ＱＺ４の変異誘導体は、B. coagulansのldh変異株が生成する発酵産物であるアセトインおよび2,3-ブタンジオールを生成しないものと考えられている（非特許文献３０参照）。この二重変異株（ldh遺伝子欠失変異株およびals遺伝子欠失変異株）を構築するための最初のステップとして、alsD（α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ）配列およびalsS（アセト乳酸合成酵素）配列を、プライマー１７および２１を用いて、株Ｐ４−１０２ＢのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ断片をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで処理し、HincII切断プラスミド・ベクターｐＵＣ１９に結合することにより、プラスミドｐＱＺ４５を構築した。このalsSD ＤＮＡがプラスミドｐＱＺ４５へ挿入されたことを、適切なプライマーを用いたシークエンシングにより検証した。プライマー１８および２２を用いて、alsSDコード領域のみを含む（プロモーターを含まない）プラスミドｐＱＺ４５から得た２３８０塩基対のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡは、プラスミドｐＵＣ１９のHincII部位に移植し、プラスミドｐＱＺ４５−１を生成した。alsSの５９６塩基対領域を、AfeIおよびHincIIにより切断した後、プラスミドｐＱＺ４５−１から除去し、エリスロマイシン耐性遺伝子カセットをその位置に挿入した。この新しいプラスミドｐＱＺ５４は、鋳型（プライマー１８および２２）としての役割を果たし、alsSにおいて５９６塩基対の欠失がありalsSD遺伝子を有する断片、およびエリスロマイシン耐性をコードする遺伝子を増幅させた。このＰＣＲ生成物をポリヌクレオチド・キナーゼでリン酸化し、BsaAIおよびAfeIで切断されたプラスミドｐＧＫ１２に結合した。こうして得られたプラスミドｐＱＺ６４をエレクトロポレーションによりB. coagulans株ＱＺ４（ldh遺伝子欠失株）に形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを３７℃の温度にて選択した。ldh遺伝子欠失株を構築するための上述の手順を用いて、alsS遺伝子が欠失した突然変異を株ＱＺ４に導入した。この方法により、好気性条件および嫌気性条件において増殖率が異なるいくつかのalsS変異株が生産された。最も高い増殖率を示した変異株（株ＱＺ５）を選択し、さらに研究を行った。
（E. coli、B. subtilis、およびB. coagulansの形質転換）
E. coliについては、既に記載されている標準的な技術に基づいて形質転換を行った。Bacillus subtilis株ＨＢ１０００については、Boylanらによる手順（非特許文献４参照）に従って、いくつか変更を加えながら形質転換を行った。ＬＢ培地にて一晩培養した増殖静止期の細胞を、１２５ｍｌの三角フラスコ内で新たに調整した１０ｍｌのＭＣ（modified competence）培地（非特許文献２９参照）に植菌し（１０％ｗ／ｖ）、３７℃の温度で３時間振とうさせながら培養した。ＭＣ培地には、 １００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、３ｍＭの硫酸マグネシウム、２％のグルコース、２２μｇ／ｍｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．１％のカゼイン加水分解物、および０．２％のグルタミン酸カリウムが含まれる。ＯＤ６００ｎｍがおよそ０．６に達したとき、０．６ｍｌの培養物を１３×１００ｍｍの試験管に移植し、ＤＮＡを細胞に添加した。このＤＮＡを含む培養物を、３７℃の温度で２．５時間、遠心分離機にて培養した。細胞を室温にて遠心分離により回収し、０．１ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。プレートは３７℃の温度で培養し、翌日、形質転換体を選択した。
E. coliについては、既に記載されている標準的な技術に基づいて形質転換を行った。Bacillus subtilis株ＨＢ１０００については、Boylanらによる手順（非特許文献４参照）に従って、いくつか変更を加えながら形質転換を行った。ＬＢ培地にて一晩培養した増殖静止期の細胞を、１２５ｍｌの三角フラスコ内で新たに調整した１０ｍｌのＭＣ（modified competence）培地（非特許文献２９参照）に植菌し（１０％ｗ／ｖ）、３７℃の温度で３時間振とうさせながら培養した。ＭＣ培地には、 １００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、３ｍＭの硫酸マグネシウム、２％のグルコース、２２μｇ／ｍｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．１％のカゼイン加水分解物、および０．２％のグルタミン酸カリウムが含まれる。ＯＤ６００ｎｍがおよそ０．６に達したとき、０．６ｍｌの培養物を１３×１００ｍｍの試験管に移植し、ＤＮＡを細胞に添加した。このＤＮＡを含む培養物を、３７℃の温度で２．５時間、遠心分離機にて培養した。細胞を室温にて遠心分離により回収し、０．１ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。プレートは３７℃の温度で培養し、翌日、形質転換体を選択した。
野生型B. coagulans Ｐ４−１０２Ｂを形質転換させるために、１２５ｍｌのフラスコに入れた１０ｍｌのＬＢ培地において５０℃の温度で増殖した細胞（ＯＤ４２０ｎｍ、０．３）を、１リットルのフラスコに入れた１００ｍｌのＬＢ培地に植菌した（１０％ｗ／ｖ）。ＯＤ４２０ｎｍが約０．３〜０．５に達するまで、約３〜４時間振とうしながら（２００ＲＰＭ）、５０℃の温度にて細胞を培養した。細胞を遠心分離により回収し（４℃、４３００ｘｇ、１０分）、３０、２５、１５ｍｌの十分に冷えたＳＧ培地（スクロース、０．５Ｍ、グリセロール、１０％）で３回洗浄した。このようにして得られたエレクトロコンピテント細胞をすぐに利用した。７５μｌの細胞懸濁液を０．１μｇのプラスミドＤＮＡと混合し、冷却したエレクトロポレーション・キュベットに移した（１ｍｍギャップ）。エレクトロポレーション条件（Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーター）は、１．７５ｋＶ、５ｍｓの矩形波に設定した。エレクトロポレーション後、細胞を予め温められた（３７℃または５０℃）２ｍｌのＲＧ培地（０．５Ｍのスクロース、５５．６ｍＭのグルコース、および２０ｍＭの塩化マグネシウムを添加したＭＬＢ培地）に植菌した。この細胞を１３×１００ｍｍのスクリュー・キャップ・チューブに植菌し、チューブ・ローテーターにて３時間、５０℃の温度で培養し、その後、選択抗生物質培地にプレーティングした。温度感受性プラスミドを形質転換させるため、再生温度を３７℃とし、培養物を一晩培養した。変異株ＱＺ４を形質転換させるため、ＤＮＡ濃度を１μｇプラスミドＤＮＡまで増加させ、エレクトロポレーション条件を１．５ｋＶ、２５μＦ、６００Ω、１０ｍｓの時定数に変更した。
（所望の表現型を有する自然突然変異株の増殖に基づく選択）
微生物培養を行うと必ず一定数の自然突然変異が発生するので、特定の変異株の増殖を選択的に促進すると考えられる増殖条件を与えることで、所望の表現型を有する変異株をその母集団から容易に単離することができる。ldh遺伝子欠失およびalsS遺伝子欠失変異株であるＱＺ５は、培養ｐＨ５．０において嫌気性増殖不全である。したがって、新しい発酵経路（例えば、Ｄ−乳酸生成）を開始することで嫌気性増殖の割合を増加させると考えられる突然変異体は、他の母集団に対して増殖優位性を有することが予想される。嫌気性増殖の割合をさらに増加させるためには、複数の突然変異が必要である（例えば、新しい発酵経路を開始するため、酵素濃度を増加させることでその発酵経路への代謝フラックスを増加させるため）。単一の細胞内で所望の数の突然変異が起こり、その結果、特定可能な表現型を示すまで連続して培養物を植菌することにより、増殖率および生成物のうちの少なくとも一方の生成量を徐々に増加させる有利な突然変異を蓄積させることができる。株ＱＺ５は嫌気性増殖不全であるため、空気を気相としてｐＨを制御した小さな発酵槽内で培養を開始した（５００ｍｌの容器に２５０ｍｌの発酵培養物）。培養物が増殖し始めると、厳しい酸素制限により、増殖および細胞収率が制限されるであろう。さらに細胞密度が増加するかどうかは、培地に存在する糖類を発酵する細胞の能力に左右されるであろう。嫌気的に増殖できる株ＱＺ５の変異誘導体を単離するために、ｐＨを制御した小さな発酵槽を使用して、所望の条件下で連続的に発酵培養物を継代培養した。植菌条件は、異なる時間および異なる接種量となるように調整した。２％の接種濃度で培養物を増殖させ、糖濃度の増加に適応している間、平均して２日ごと、または３日ごとに植菌を実施した。
微生物培養を行うと必ず一定数の自然突然変異が発生するので、特定の変異株の増殖を選択的に促進すると考えられる増殖条件を与えることで、所望の表現型を有する変異株をその母集団から容易に単離することができる。ldh遺伝子欠失およびalsS遺伝子欠失変異株であるＱＺ５は、培養ｐＨ５．０において嫌気性増殖不全である。したがって、新しい発酵経路（例えば、Ｄ−乳酸生成）を開始することで嫌気性増殖の割合を増加させると考えられる突然変異体は、他の母集団に対して増殖優位性を有することが予想される。嫌気性増殖の割合をさらに増加させるためには、複数の突然変異が必要である（例えば、新しい発酵経路を開始するため、酵素濃度を増加させることでその発酵経路への代謝フラックスを増加させるため）。単一の細胞内で所望の数の突然変異が起こり、その結果、特定可能な表現型を示すまで連続して培養物を植菌することにより、増殖率および生成物のうちの少なくとも一方の生成量を徐々に増加させる有利な突然変異を蓄積させることができる。株ＱＺ５は嫌気性増殖不全であるため、空気を気相としてｐＨを制御した小さな発酵槽内で培養を開始した（５００ｍｌの容器に２５０ｍｌの発酵培養物）。培養物が増殖し始めると、厳しい酸素制限により、増殖および細胞収率が制限されるであろう。さらに細胞密度が増加するかどうかは、培地に存在する糖類を発酵する細胞の能力に左右されるであろう。嫌気的に増殖できる株ＱＺ５の変異誘導体を単離するために、ｐＨを制御した小さな発酵槽を使用して、所望の条件下で連続的に発酵培養物を継代培養した。植菌条件は、異なる時間および異なる接種量となるように調整した。２％の接種濃度で培養物を増殖させ、糖濃度の増加に適応している間、平均して２日ごと、または３日ごとに植菌を実施した。
（ｍＲＮＡレベルの決定）
B. coagulansのｍＲＮＡレベルを求めるために、異なる条件下で増殖した細胞を遠心分離（１６０００×ｇ、３０秒、室温）により回収した。既に非特許文献３０に記載されているフェノール酸抽出法を用いて、ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度から求めた（NanoVue、GE社）。選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いて、Superscript III逆転写酵素（インビトロジェン社）によりｃＤＮＡコピーを作製した。遺伝子特異的プライマー、およびＰＣＲリアクション・ミックス（PCR reaction mix）を含むサイバーグリーン（SYBR-green）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、ＰＣＲによりｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）濃度を求めた。異なる濃度のｃＤＮＡを用いたＰＣＲごとのＣｔ（threshold cycle）値を求め、同時に流した標準ＤＮＡ鋳型と比較した（非特許文献１６参照）。この結果から、試料中に存在する遺伝子特異的ｍＲＮＡの濃度比を算出した。報告する結果は、少なくとも３回行った実験から得られた平均値である。ldhプライマーはプライマー２３および２４、pflプライマーはプライマー２５および２６、pdhA（E1α）プライマーはプライマー２７および２８、d-ldhプライマーはプライマー２９および３０、alsプライマーはプライマー３１および３２、内部制御に用いたpolAプライマーはプライマー３３および３４である。
B. coagulansのｍＲＮＡレベルを求めるために、異なる条件下で増殖した細胞を遠心分離（１６０００×ｇ、３０秒、室温）により回収した。既に非特許文献３０に記載されているフェノール酸抽出法を用いて、ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度から求めた（NanoVue、GE社）。選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いて、Superscript III逆転写酵素（インビトロジェン社）によりｃＤＮＡコピーを作製した。遺伝子特異的プライマー、およびＰＣＲリアクション・ミックス（PCR reaction mix）を含むサイバーグリーン（SYBR-green）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、ＰＣＲによりｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）濃度を求めた。異なる濃度のｃＤＮＡを用いたＰＣＲごとのＣｔ（threshold cycle）値を求め、同時に流した標準ＤＮＡ鋳型と比較した（非特許文献１６参照）。この結果から、試料中に存在する遺伝子特異的ｍＲＮＡの濃度比を算出した。報告する結果は、少なくとも３回行った実験から得られた平均値である。ldhプライマーはプライマー２３および２４、pflプライマーはプライマー２５および２６、pdhA（E1α）プライマーはプライマー２７および２８、d-ldhプライマーはプライマー２９および３０、alsプライマーはプライマー３１および３２、内部制御に用いたpolAプライマーはプライマー３３および３４である。
（酵素分析）
ＰＤＨ活性レベルおよびＬＤＨ活性レベルを求めるために、指数増殖中期〜後期に達するまで細胞をＬＢ培地にて培養した。細胞を遠心分離（１００００×ｇ、１０分、室温）により採取し、１０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）にて一度洗浄し、５．０ｍｌの同じリン酸緩衝液で再懸濁した。フレンチ・プレッシャー・セル（French pressure cell）（２００００ＰＳＩ）で処理することにより、細胞を破砕した。このステップ後の操作は、すべて４℃の温度にて行った。細胞抽出物を１２０００×ｇで３０分間遠心分離することで細胞残屑を取り除き、上清を１０００００×ｇ（ベックマン（Beckman））で１時間、再び遠心分離することで大きな粒子および膜小胞を取り除いた。この上清を用いて酵素測定を行った。ＰＤＨ活性測定は、既に非特許文献３３に記載されているように、３４０ｎｍ（ε＝６２２０Μ?１ｃｍ?１）でのＮＡＤ＋のピルビン酸依存還元を基にして行った。各１ｍｌの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、チアミンピロリン酸（０．４ｍＭ）、ＣｏＡ（０．１３ｍＭ）、塩化マグネシウム六水和物（２ｍＭ）、ジチオスレイトール（２．６ｍＭ）、ＮＡＤ＋（０．７５ｍＭ）、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸（５ｍＭ）を添加することにより、反応を開始した。既に非特許文献３５に記載されているように、ピルビン酸の存在下でＮＡＤＨの酸化を基にＬＤＨ活性を測定した。各１ｍｌの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＮＡＤＨ（０．１ｍＭ）、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸（２５ｍＭ）を添加することにより、反応を開始した。ウシ血清アルブミンを標準としてブラッドフォード法によりタンパク質濃度を求めた（非特許文献５参照）。
ＰＤＨ活性レベルおよびＬＤＨ活性レベルを求めるために、指数増殖中期〜後期に達するまで細胞をＬＢ培地にて培養した。細胞を遠心分離（１００００×ｇ、１０分、室温）により採取し、１０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）にて一度洗浄し、５．０ｍｌの同じリン酸緩衝液で再懸濁した。フレンチ・プレッシャー・セル（French pressure cell）（２００００ＰＳＩ）で処理することにより、細胞を破砕した。このステップ後の操作は、すべて４℃の温度にて行った。細胞抽出物を１２０００×ｇで３０分間遠心分離することで細胞残屑を取り除き、上清を１０００００×ｇ（ベックマン（Beckman））で１時間、再び遠心分離することで大きな粒子および膜小胞を取り除いた。この上清を用いて酵素測定を行った。ＰＤＨ活性測定は、既に非特許文献３３に記載されているように、３４０ｎｍ（ε＝６２２０Μ?１ｃｍ?１）でのＮＡＤ＋のピルビン酸依存還元を基にして行った。各１ｍｌの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、チアミンピロリン酸（０．４ｍＭ）、ＣｏＡ（０．１３ｍＭ）、塩化マグネシウム六水和物（２ｍＭ）、ジチオスレイトール（２．６ｍＭ）、ＮＡＤ＋（０．７５ｍＭ）、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸（５ｍＭ）を添加することにより、反応を開始した。既に非特許文献３５に記載されているように、ピルビン酸の存在下でＮＡＤＨの酸化を基にＬＤＨ活性を測定した。各１ｍｌの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＮＡＤＨ（０．１ｍＭ）、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸（２５ｍＭ）を添加することにより、反応を開始した。ウシ血清アルブミンを標準としてブラッドフォード法によりタンパク質濃度を求めた（非特許文献５参照）。
（分析方法）
既に非特許文献３２に記載されているように、Aminex HPX-87Hイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより、グルコースおよび発酵産物を測定した。２ｍＭの硫酸銅（II）を溶離液としてChirex 3126（D）ペニシラミン・カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）（Phenomenex）を用いたＨＰＬＣにより、Ｄ（−）−乳酸およびＬ（＋）−乳酸の光学異性体を測定した。Ｄ（−）−乳酸はまた、Ｄ−乳酸脱水素酵素（シグマ・ケミカル社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）を用いた酵素に基づく方法により分析した。
既に非特許文献３２に記載されているように、Aminex HPX-87Hイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより、グルコースおよび発酵産物を測定した。２ｍＭの硫酸銅（II）を溶離液としてChirex 3126（D）ペニシラミン・カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）（Phenomenex）を用いたＨＰＬＣにより、Ｄ（−）−乳酸およびＬ（＋）−乳酸の光学異性体を測定した。Ｄ（−）−乳酸はまた、Ｄ−乳酸脱水素酵素（シグマ・ケミカル社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）を用いた酵素に基づく方法により分析した。
（材料）
生化学材料は、シグマ・ケミカル社（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）から入手し、有機化学材料および無機化学材料はフィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から入手した。分子生物学試薬および分子生物学用品はニューイングランド・バイオラボ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州イプスウィッチ）、インビトロジェン社、またはバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社から入手した。
生化学材料は、シグマ・ケミカル社（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）から入手し、有機化学材料および無機化学材料はフィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から入手した。分子生物学試薬および分子生物学用品はニューイングランド・バイオラボ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州イプスウィッチ）、インビトロジェン社、またはバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社から入手した。
［結果および考察］
B. coagulansなどの有胞子性乳酸菌は、炭素源（グルコース、キシロース、セロビオースなど）に関係なく、主要発酵産物としてＬ（＋）−乳酸を生成する（非特許文献１０，２７，２８参照）。その証拠に、ピルビン酸分岐点でタンパク質をコードする複数の遺伝子間において、増殖ｐＨまたは増殖期に関係なく、ldh遺伝子をコードするｍＲＮＡのレベルが最も高かった。（表３）（非特許文献３０参照）。Ｄ（−）−乳酸脱水素酵素（ldhA）をコードする遺伝子がB. coagulans内において特定され、この遺伝子をEscherichia coli内に移植することで活性型の遺伝子として発現した。しかし、B. coagulansの発酵ブロスにおけるＤ（−）−乳酸のレベルは生成された全乳酸の５％を超えることはなく、実際には、発酵ブロスのほとんどにおいて、検出可能なＤ（−）−乳酸が不足していた（非特許文献２７参照）。細胞内のldhA ｍＲＮＡレベルは、ldh ｍＲＮＡレベルの０．５％未満であった（表３）。
B. coagulansなどの有胞子性乳酸菌は、炭素源（グルコース、キシロース、セロビオースなど）に関係なく、主要発酵産物としてＬ（＋）−乳酸を生成する（非特許文献１０，２７，２８参照）。その証拠に、ピルビン酸分岐点でタンパク質をコードする複数の遺伝子間において、増殖ｐＨまたは増殖期に関係なく、ldh遺伝子をコードするｍＲＮＡのレベルが最も高かった。（表３）（非特許文献３０参照）。Ｄ（−）−乳酸脱水素酵素（ldhA）をコードする遺伝子がB. coagulans内において特定され、この遺伝子をEscherichia coli内に移植することで活性型の遺伝子として発現した。しかし、B. coagulansの発酵ブロスにおけるＤ（−）−乳酸のレベルは生成された全乳酸の５％を超えることはなく、実際には、発酵ブロスのほとんどにおいて、検出可能なＤ（−）−乳酸が不足していた（非特許文献２７参照）。細胞内のldhA ｍＲＮＡレベルは、ldh ｍＲＮＡレベルの０．５％未満であった（表３）。
糖発酵、特にピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の存在を示すキシロースなどのペントース類の発酵において、B. coagulansは少量の酢酸、エタノール、およびギ酸も生成していた（非特許文献２７参照）。2,3-ブタンジオール経路においてこれら酵素をコードする遺伝子はB. coagulansが有する配列決定されたゲノムに存在するが、増殖ｐＨに関係なく、野生型B. coagulansの発酵ブロスにおいて2,3-ブタンジオールは検出されなかった。これは、野生型B. coagulansにおけるalsSDオペロンの発現が弱いこと（表３）、またはピルビン酸のプールを枯渇させるほど乳酸へのフラックスが高いことによると考えられる。Ｄ（−）−乳酸を主要発酵産物として生成するB. coagulans誘導体を構築するためには、Ｌ−ＬＤＨ（ldh）に触媒されるＬ（＋）−乳酸への主要発酵経路を除去し、Ｄ−ＬＤＨをコードするldhAの発現レベルを増加させる必要がある。
（ldh遺伝子欠失変異株の構築）
既に非特許文献３０に記載されているＬ−ＬＤＨ活性を欠くB. coagulans変異株は、発酵産物として酢酸、エタノール、ギ酸、および2,3-ブタンジオールを生成したが、Ｄ（−）−乳酸は生成しなかった。このldh変異株Ｓｕｙ２７−１３は単一の塩基置換が生じたldh遺伝子を有し、嫌気性増殖、特にｐＨ５．０での増殖の間に復帰突然変異が生じる。株Ｓｕｙ２７−１３においてldh突然変異の復帰率が高いという問題を解決するために、ldh遺伝子を欠失させた。
既に非特許文献３０に記載されているＬ−ＬＤＨ活性を欠くB. coagulans変異株は、発酵産物として酢酸、エタノール、ギ酸、および2,3-ブタンジオールを生成したが、Ｄ（−）−乳酸は生成しなかった。このldh変異株Ｓｕｙ２７−１３は単一の塩基置換が生じたldh遺伝子を有し、嫌気性増殖、特にｐＨ５．０での増殖の間に復帰突然変異が生じる。株Ｓｕｙ２７−１３においてldh突然変異の復帰率が高いという問題を解決するために、ldh遺伝子を欠失させた。
細菌において遺伝子を欠失させるいくつかの方法が利用でき、これら方法の多くは、標的遺伝子に対応する短いＤＮＡ配列の側に抗生物質耐性遺伝子などの正の選択遺伝子を有する適切な直鎖状ＤＮＡを利用する（非特許文献７，２０，２４参照）。しかし、直鎖状ＤＮＡを利用してldh遺伝子欠失変異株を構築する試みは、B. coagulansにおいては失敗に終わっている。これは、B. coagulansの形質転換効率が低いことに加え、取り込まれたＤＮＡを組換えて選択可能な形質転換体を生産する必要があることが原因と考えられる。このような欠点を克服するために、遺伝子欠失に有効であることが証明されている代替方法を用いた（非特許文献１３参照）。適切な標的ldh遺伝子配列およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有する温度感受性プラスミドを構築した（プラスミドｐＱＺ４４）。B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂをエレクトロポレーションにより形質転換させた後、プラスミドｐＱＺ４４含有形質転換体を、このプラスミドを安定に維持できる３７℃の温度で選択した。このプラスミド含有誘導体を継代培養することで、ldh遺伝子の単一組換えにより、母集団のごく一部においてプラスミドが染色体へ移動することが期待される。このプラスミドは５０℃の温度では複製不能なため、５０℃の温度でこの誘導体を増殖させるとプラスミドが細胞から取り除かれる。５０℃の温度で現れるエリスロマイシン耐性コロニーにおいては、染色体ldh遺伝子にこのプラスミドＤＮＡが組み込まれていることが予想される。これら誘導体をさらに培養することでＤＮＡが再編成され、これにより、標的遺伝子ldhを欠失させることができる。このようなldh変異株の１つであるＱＺ４は、エリスロマイシン耐性が喪失していることおよび、発酵産物としての乳酸が欠乏していることにより特定された（表３および４）。ldh変異株における以前の報告（非特許文献３０参照）と一致して、株ＱＺ４の嫌気性増殖の割合は、ｐＨ５．０のグルコース添加富栄養培地においてもとても少なかった。
（ldh遺伝子欠失変異株ＱＺ４の特性）
図１は、ｐＨ５．０（図１（Ａ））およびｐＨ７．０（図１（Ｂ））におけるB. coagulans株ＱＺ４（ldh遺伝子欠失株）の発酵プロファイルを示す。ここでは、ｐＨを制御した小さな発酵槽において、ＬＢ＋グルコース培地を用いて発酵を行った。初期グルコース濃度は、ｐＨ５．０で３０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０で５０ｇ／Ｌとした。ldh変異株ＱＺ４は、ｐＨ７．０で培養すると主要な発酵産物としてエタノールを生成し、ｐＨ５．０で増殖・発酵を行った場合は、主要産物として2,3-ブタンジオールを生成した（表４、図１）。ＰＦＬおよびＰＤＨの両方がｐＨ７．０でのエタノール生成過程におけるアセチル−ＣｏＡの生成に関与し、ＰＤＨが関与して生成されたエタノールは、ブロスにおけるギ酸の量を基に約８０％であると算出された。ＰＤＨに基づいてエタノールが生成されたことの証拠に、ｐＨ７．０の発酵で増殖させた変異株の指数増殖前期〜中期におけるＰＤＨ活性が指数増殖後期におけるＰＤＨ活性の約２倍の高さであった（表４）。しかし、培養物が静止期に入ると、静止期の親株における活性の増加とは対照的に、ＰＤＨ活性は減少した。ｐＨ５．０において、変異株の嫌気性増殖は検出されず、気相として空気を用いて（酸素制限条件）ｐＨを制御した発酵を開始することにより、変異株を増殖させることができた。しかし、細胞密度の増加により酸素が制限されると、増殖が停止し、ｐＨ５．０で発酵培養した際の最終的な細胞収率は親株のわずか２分の１程度であった。このような酸素制限発酵において、ldh変異株は、ｐＨ７．０での発酵と比較してかなり低いレベルのエタノールを生成した。ｐＨ５．０で培養した際に得られる生成物のほとんどは、2,3-ブタンジオールであった（表４、図１）。
図１は、ｐＨ５．０（図１（Ａ））およびｐＨ７．０（図１（Ｂ））におけるB. coagulans株ＱＺ４（ldh遺伝子欠失株）の発酵プロファイルを示す。ここでは、ｐＨを制御した小さな発酵槽において、ＬＢ＋グルコース培地を用いて発酵を行った。初期グルコース濃度は、ｐＨ５．０で３０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０で５０ｇ／Ｌとした。ldh変異株ＱＺ４は、ｐＨ７．０で培養すると主要な発酵産物としてエタノールを生成し、ｐＨ５．０で増殖・発酵を行った場合は、主要産物として2,3-ブタンジオールを生成した（表４、図１）。ＰＦＬおよびＰＤＨの両方がｐＨ７．０でのエタノール生成過程におけるアセチル−ＣｏＡの生成に関与し、ＰＤＨが関与して生成されたエタノールは、ブロスにおけるギ酸の量を基に約８０％であると算出された。ＰＤＨに基づいてエタノールが生成されたことの証拠に、ｐＨ７．０の発酵で増殖させた変異株の指数増殖前期〜中期におけるＰＤＨ活性が指数増殖後期におけるＰＤＨ活性の約２倍の高さであった（表４）。しかし、培養物が静止期に入ると、静止期の親株における活性の増加とは対照的に、ＰＤＨ活性は減少した。ｐＨ５．０において、変異株の嫌気性増殖は検出されず、気相として空気を用いて（酸素制限条件）ｐＨを制御した発酵を開始することにより、変異株を増殖させることができた。しかし、細胞密度の増加により酸素が制限されると、増殖が停止し、ｐＨ５．０で発酵培養した際の最終的な細胞収率は親株のわずか２分の１程度であった。このような酸素制限発酵において、ldh変異株は、ｐＨ７．０での発酵と比較してかなり低いレベルのエタノールを生成した。ｐＨ５．０で培養した際に得られる生成物のほとんどは、2,3-ブタンジオールであった（表４、図１）。
ｐＨ５．０での培養におけるpflB遺伝子の発現が比較的低いレベルであること、および酸素制限発酵におけるギ酸のレベルが低いこと（表３，４、図１）は、ｐＨ５．０において、ldh変異株が表現型の上でＬＤＨ要求性およびＰＦＬ要求性であることを示す。E. coliのldh、pfl二重変異株は嫌気要求性であり（非特許文献１５参照）、同様の特徴をB. coagulansも有することが既に報告されている。ldh変異株は、ｐＨ５．０において主要発酵産物として2,3-ブタンジオールを生成したが、この発酵経路を用いて嫌気的に増殖することはできなかった。これは、ｐＨ５．０での発酵に少量の酸素を導入すると2,3-ブタンジオールの生成レベルが高くなり、それに関連して増殖が促進されることから、酸化還元のバランスが崩れたことによるものと考えられる。ブタンジオールはｐＨ７．０での増殖においてもldh変異株の重要な発酵産物であるので、Ｌ−ＬＤＨおよびＡＬＳの両方を欠く二重変異株ＱＺ５を構築した。
（B. coagulans ldh alsS二重変異株）
図２は、ｐＨ５．０（図２（Ａ））およびｐＨ７．０（図２（Ｂ））におけるB. coagulans株ＱＺ５（ldh、alsS遺伝子欠失株）の発酵プロファイルを示す。ここでは、ＫＯＨを自動添加することによりｐＨを制御した小さな発酵槽において、ＬＢ＋グルコース培地（３０ｇ／Ｌ）を用いて発酵を行った。ldh alsS二重変異株ＱＺ５をｐＨ５．０およびｐＨ７．０の両方で好気的に増殖させた。ｐＨを制御して好気的に発酵を行わせたところ、この二重変異株の嫌気性増殖はｐＨ７．０の場合のみ検出可能であった。これは、この二重変異株が親株ＱＺ４と共有する特性である（図２）。ｐＨ７．０での発酵における主要生成物は、エタノール、ギ酸、ピルビン酸、および酢酸であった。ｐＨ７．０で培養した二重変異株の発酵ブロスに多くのピルビン酸が含まれていたことは、ＰＤＨとＰＦＬによるピルビン酸の分解率が、解糖によるグルコースからピルビン酸への変換率に匹敵しなかったことを示す。単一変異株ＱＺ４および二重変異株ＱＺ５のどちらも、検出可能なレベルのＬ（＋）−乳酸を生成しなかった。
図２は、ｐＨ５．０（図２（Ａ））およびｐＨ７．０（図２（Ｂ））におけるB. coagulans株ＱＺ５（ldh、alsS遺伝子欠失株）の発酵プロファイルを示す。ここでは、ＫＯＨを自動添加することによりｐＨを制御した小さな発酵槽において、ＬＢ＋グルコース培地（３０ｇ／Ｌ）を用いて発酵を行った。ldh alsS二重変異株ＱＺ５をｐＨ５．０およびｐＨ７．０の両方で好気的に増殖させた。ｐＨを制御して好気的に発酵を行わせたところ、この二重変異株の嫌気性増殖はｐＨ７．０の場合のみ検出可能であった。これは、この二重変異株が親株ＱＺ４と共有する特性である（図２）。ｐＨ７．０での発酵における主要生成物は、エタノール、ギ酸、ピルビン酸、および酢酸であった。ｐＨ７．０で培養した二重変異株の発酵ブロスに多くのピルビン酸が含まれていたことは、ＰＤＨとＰＦＬによるピルビン酸の分解率が、解糖によるグルコースからピルビン酸への変換率に匹敵しなかったことを示す。単一変異株ＱＺ４および二重変異株ＱＺ５のどちらも、検出可能なレベルのＬ（＋）−乳酸を生成しなかった。
この二重変異株は多量のギ酸およびＰＦＬ活性を示す他の生成物を生成したので、ＰＦＬ活性を欠く三重変異株を構築した。しかし、Ｌ−ＬＤＨ活性、ＡＬＳ活性、およびＰＦＬ活性を欠くこの三重変異株は、試験したすべての条件において嫌気的に増殖することはできず、それ以上は利用しなかった。
（Ｄ（−）−乳酸を生成するための増殖に基づく選択）
二重変異株ＱＺ５が生成した少量の乳酸は、Ｄ（−）−乳酸であった（表４）。Ｄ（−）−乳酸生成レベルを増加させることで、Ｌ（＋）−乳酸を主要発酵産物として嫌気的に増殖できる野生株と同様に、二重変異株の嫌気性増殖を促進することが期待される。ldh変異株は、培養ｐＨに関係なく、野生型と比較して高いレベルのldhAｍＲＮＡを生成した（表３）。ｐＨ５．０での変異株の増殖において（ギ酸生成に基づく）ＰＦＬ活性のレベルがとても低いこと（表４）、およびpflBの発現レベルが低いこと（表３）は、ＰＦＬの制御に培養ｐＨが関与していることを示す。ｐＨ５．０での発酵において、Ｄ−ＬＤＨ活性をＰＦＬ活性よりも高くなるようにすること、およびldhAの発現を増加させることの少なくとも一方で嫌気性増殖率および細胞収率を増加させるために、増殖に基づく選択を実施した。対照的に、ｐＨ７．０において、ＰＦＬ活性のレベルが高いldh、alsS二重変異株に対して同様の増殖に基づく選択を行うと、Ｄ−ＬＤＨ活性レベルは増加せずＰＦＬ活性レベルが増加した誘導体が得られる。
二重変異株ＱＺ５が生成した少量の乳酸は、Ｄ（−）−乳酸であった（表４）。Ｄ（−）−乳酸生成レベルを増加させることで、Ｌ（＋）−乳酸を主要発酵産物として嫌気的に増殖できる野生株と同様に、二重変異株の嫌気性増殖を促進することが期待される。ldh変異株は、培養ｐＨに関係なく、野生型と比較して高いレベルのldhAｍＲＮＡを生成した（表３）。ｐＨ５．０での変異株の増殖において（ギ酸生成に基づく）ＰＦＬ活性のレベルがとても低いこと（表４）、およびpflBの発現レベルが低いこと（表３）は、ＰＦＬの制御に培養ｐＨが関与していることを示す。ｐＨ５．０での発酵において、Ｄ−ＬＤＨ活性をＰＦＬ活性よりも高くなるようにすること、およびldhAの発現を増加させることの少なくとも一方で嫌気性増殖率および細胞収率を増加させるために、増殖に基づく選択を実施した。対照的に、ｐＨ７．０において、ＰＦＬ活性のレベルが高いldh、alsS二重変異株に対して同様の増殖に基づく選択を行うと、Ｄ−ＬＤＨ活性レベルは増加せずＰＦＬ活性レベルが増加した誘導体が得られる。
図３は、ｐＨ５．０の小さな発酵槽において実施した、ＬＢ＋グルコース培地（３０ｇ／Ｌ）を用いたB. coagulans株ＱＺ５の増殖に基づく選択を示す。ｐＨを５．０に維持したＬＢ＋グルコース培地において発酵を行った株ＱＺ５に対して嫌気的条件下で増殖に基づく選択を行うことにより、約１２０日後に誘導体（B. coagulans株ＱＺ１３）が生産された（図３）。生産された株ＱＺ１３は、ｐＨ５．０での発酵において初期の株ＱＺ５よりも高い細胞収率を示した。ｐＨ７．０での発酵において、株ＱＺ１３とその出発親株であるＱＺ５の細胞収率およびグルコース消費量はほぼ同じであったが、ｐＨ７．０での発酵における株ＱＺ１３のＤ−乳酸の収率は、株ＱＺ５のＤ−乳酸の収率の約１１倍であった（表４）。ＰＤＨ／ＰＦＬが関与した発酵産物の量もまた、株ＱＺ５におけるグルコース消費量の０．８５から約０．４へと減少した。
図４は、ｐＨ７．０の小さな発酵槽において実施した、ＬＢ＋グルコース培地（５０ｇ／Ｌ）を用いたB. coagulans株ＱＺ１３の増殖に基づく選択を示す。株ＱＺ１３によるｐＨ７．０での発酵におけるＰＦＬ／ＰＤＨ由来の生成物を同時還元することによりＤ−乳酸の収率を増加させる必要があるため、ｐＨを７．０に維持したＬＢ＋グルコース培地での発酵において高い増殖率および細胞収率を示す菌株をさらに選択した。４０日間の連続選択およびｐＨ７．０での増菌の後、B. coagulans株ＱＺ１４を得た（図４）。株ＱＺ１４の乳酸収率は発酵グルコースの約０．８で、ＰＦＬ／ＰＤＨが関与した生成物はグルコース由来生成物の約７％に減少した（表４）。株ＱＺ１４の発酵ブロスには、依然として検出可能なレベルのピルビン酸が含まれ、細胞内のＤ−ＬＤＨ活性レベルが解糖によるグルコース・フラックスに匹敵しないことが示された。ＬＤＨ活性とグルコースの解糖系フラックスとのバランスをとることができる変異誘導体を単離するために、乳酸の力価を増加することに焦点を置いて次の選択を行った。
図５は、ｐＨ７．０の小さな発酵槽においてグルコース濃度を増加させながら実施した、ＬＢ＋グルコース培地を用いたB. coagulans株ＱＺ１４の増殖に基づく選択を示す。培地は２０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムも含有する。初期グルコース濃度は５０ｇ／Ｌとした。３回目の植菌の後、グルコース濃度を６０ｇ／Ｌに増加させた。５回目の植菌の後、培地のグルコース濃度は１００ｇ／Ｌとした。グルコース濃度を増加させながら、連続植菌および選択をさらに６０日間行った後、B. coagulans株ＱＺ１５を単離した。ｐＨ７．０でグルコース発酵を行った株ＱＺ１５のＤ（−）−乳酸力価は、８０ｇ／Ｌを超えていた。
図６は、ＬＢ＋グルコース培地に２０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを添加して得られた培地における、ｐＨ７．０でのB. coagulans株ＱＺ１９の発酵プロファイルを示す。株ＱＺ１５の継続的進化により、乳酸へのグルコース・フラックスがさらに増加し、ｐＨ７．０での発酵開始から４８時間以内に９０ｇ／Ｌに達した（株ＱＺ１９、表４、図６）。この高い乳酸力価を有する誘導体を含む発酵ブロスにおいてギ酸は検出されなかった。これら培養物から生成された少量のエタノールおよび酢酸は、ＰＤＨによって生成されたアセチルＣｏＡに由来するものと考えられる（非特許文献１５参照）。
この結果により、ldh遺伝子及びalsS遺伝子の欠失と、ピルビン酸分岐点における微生物の生理学的な理解に基づく適切な突然変異のための嫌気的条件下での増殖に基づく選択とを組み合わせることで、B. coagulansの主要発酵産物をＬ（＋）−乳酸からＤ（−）−乳酸に変更できることが示された。pflAB遺伝子は最終的な誘導体において欠失がない状態を維持しているが、Ｄ−ＬＤＨによるＤ−乳酸への代謝フラックスを増加させると、原則的には、ＰＦＬによるアセチルＣｏＡへのピルビン酸フラックスが相殺された。ＱＺ１９におけるＤ−ＬＤＨ活性を増加させた突然変異を特定するために、さらに研究を行った（その結果は、２０１１年１１月７日にオンライン発行された米国科学アカデミー紀要に掲載のWangらによる「Evolution of D-lactate dehydrogenase activity from glycerol dehydrogenase and its utility for D-lactate production from lignocellulose」（doi 10.1073/pnas.1111085108）という題名の論文に公開され、その全体が参照として組み込まれる）。
［結論］
遺伝子操作が困難なB. coagulansにおいて特定の遺伝子を欠失させるために開発された方法を用いて、Ｌ−ＬＤＨをコードするldh遺伝子を欠失させた。ldh遺伝子欠失変異株はｐＨ５．０において嫌気的に増殖できなかったが、ｐＨ７．０においては増殖に著しく影響があるわけではなかった。ＰＦＬ、ＰＤＨ、および2,3-ブタンジオール経路により、ｐＨ７．０での発酵性増殖が促進された。ldh、alsS、およびpflBを欠失させることにより、Ｄ−ＬＤＨをコードする遺伝子（ldhA）が染色体に存在しても、変異株の嫌気性増殖が抑えられた。様々な増殖ｐＨにおけるBacillus coagulansの生理的特性、およびこの細菌が嫌気性増殖を行う際のピルビン酸分岐点における炭素の流れを理解した上で、増殖に基づく選択をldh、alsS二重変異株から開始することより、野生型におけるＬ−乳酸収率およびＬ−乳酸力価と同等なレベルのＤ−乳酸生成能力を有する変異株を生産することができた。発酵ブロスに存在する副産物である少量のエタノールおよび酢酸を除去するために、乳酸生成率をさらに増加させることが期待される。本明細書は細菌固有の遺伝子のみを用いて（外因性遺伝子を用いずに）主要発酵産物をＬ（＋）−乳酸からＤ（−）−乳酸に変化させた好熱性乳酸菌に関する最初の報告である。これはさらなる適切な戦略をもたらした選択的突然変異および細菌の生理の評価を基にしている。５０℃〜５５℃の温度範囲において光学的に純粋なＤ（−）−乳酸またはＬ（＋）−乳酸を生成する耐熱性B. coagulans株を利用できることは、乳酸の光学純度を低減する可能性のある潜在的な汚染物質を最小限にすることにより、様々な熱化学的特性を有するバイオ・ポリラクチド・プラスチック類を生成するための原料としての乳酸のコストを低減させるのに役立つと期待されている。
遺伝子操作が困難なB. coagulansにおいて特定の遺伝子を欠失させるために開発された方法を用いて、Ｌ−ＬＤＨをコードするldh遺伝子を欠失させた。ldh遺伝子欠失変異株はｐＨ５．０において嫌気的に増殖できなかったが、ｐＨ７．０においては増殖に著しく影響があるわけではなかった。ＰＦＬ、ＰＤＨ、および2,3-ブタンジオール経路により、ｐＨ７．０での発酵性増殖が促進された。ldh、alsS、およびpflBを欠失させることにより、Ｄ−ＬＤＨをコードする遺伝子（ldhA）が染色体に存在しても、変異株の嫌気性増殖が抑えられた。様々な増殖ｐＨにおけるBacillus coagulansの生理的特性、およびこの細菌が嫌気性増殖を行う際のピルビン酸分岐点における炭素の流れを理解した上で、増殖に基づく選択をldh、alsS二重変異株から開始することより、野生型におけるＬ−乳酸収率およびＬ−乳酸力価と同等なレベルのＤ−乳酸生成能力を有する変異株を生産することができた。発酵ブロスに存在する副産物である少量のエタノールおよび酢酸を除去するために、乳酸生成率をさらに増加させることが期待される。本明細書は細菌固有の遺伝子のみを用いて（外因性遺伝子を用いずに）主要発酵産物をＬ（＋）−乳酸からＤ（−）−乳酸に変化させた好熱性乳酸菌に関する最初の報告である。これはさらなる適切な戦略をもたらした選択的突然変異および細菌の生理の評価を基にしている。５０℃〜５５℃の温度範囲において光学的に純粋なＤ（−）−乳酸またはＬ（＋）−乳酸を生成する耐熱性B. coagulans株を利用できることは、乳酸の光学純度を低減する可能性のある潜在的な汚染物質を最小限にすることにより、様々な熱化学的特性を有するバイオ・ポリラクチド・プラスチック類を生成するための原料としての乳酸のコストを低減させるのに役立つと期待されている。
Claims (18)
- 全部又は一部が欠失されたＬ（＋）−乳酸脱水素酵素遺伝子と、
全部又は一部が欠失されたアセト乳酸合成酵素遺伝子とを含み、
ｐＨ５．０又はｐＨ７．０に維持された嫌気的条件下で炭素源を含む培地において培養され、細胞収率の高い、及び／又は乳酸生産量の多い細胞を選択し、前記選択された細胞を前記条件下で培養することを所定の期間繰り返すことにより生じたＤ（−）−乳酸を生成するための遺伝子変異を有する
単離されたBacillus spp.の遺伝子組換え細菌細胞。 - 請求項１に記載の細菌細胞であって、
前記遺伝子組換えは
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に突然変異を生じさせること、あるいは
乳酸脱水素酵素（ldh）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）、およびアセト乳酸合成酵素（alsS）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の一部または全部を欠失させることを含む
細菌細胞。 - 請求項２に記載の細菌細胞であって、
前記遺伝子の突然変異は、前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームに１つまたは複数の点突然変異を導入すること、または１つまたは複数の終止コドンを導入することを含む
細菌細胞。 - 請求項１に記載の細菌細胞であって、
外因性遺伝子の全部または一部を含まない
細菌細胞。 - 請求項１に記載の細菌細胞であって、
前記細菌細胞が有する乳酸脱水素酵素、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性は、全部又は一部が欠失した前記Ｌ（＋）−乳酸脱水素酵素遺伝子、及び全部又は一部が欠失したアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方をコードする温度感受性プラスミドを前記細菌細胞に形質転換することによる相同組換えによって不活化される
細菌細胞。 - 請求項１に記載の細菌細胞であって、
Bacillus coagulansの菌株ＮＲＲＬ Ｂ−５０４４０、Bacillus coagulansの菌株ＮＲＲＬ Ｂ−５０４４１、Bacillus coagulansの菌株ＮＲＲＬ Ｂ−５０４４２またはBacillus coagulansの菌株ＮＲＲＬ Ｂ−５０４４３である
細菌細胞。 - Bacillus spp.である第１の細菌細胞を培養することによりＤ（−）−乳酸を生成する方法であって、
前記第１の細菌細胞のＬ（＋）−乳酸脱水素酵素遺伝子とアセト乳酸合成酵素遺伝子との全部又は一部を欠失させて不活化した第２の細菌細胞を取得し、
前記第２の細菌細胞をｐＨ５．０又はｐＨ７．０に維持された嫌気的条件下で炭素源を含む培地において培養し、前記第２の細菌細胞よりも細胞収率の高い、及び／又は乳酸生産量の多い細胞を選択し、前記選択された細胞を前記条件下で培養することを第１の期間継続して、第３の細菌細胞を取得する
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、さらに
Ｄ（−）−乳酸を単離または精製する
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記培地は２％から２０％（ｗ／ｖ）の間の濃度の炭素源を含む
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記炭素源はグルコースである
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第１の期間は、１２０日以上である
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第３の細菌細胞は、ｐＨ５．０に維持された嫌気的条件下で前記第２の細菌細胞を培養することにより取得され、さらに、
前記第３の細菌細胞を、ｐＨ７．０に維持された嫌気的条件下で炭素源を含む培地において第２の期間培養し、前記第３の細菌細胞よりも細胞収率の高い、及び／又は乳酸生産量の多い細胞を選択し、前記選択された細胞を前記条件下で培養することを第２の期間継続して、第４の細菌細胞を取得する
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項１２に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第２の期間は、４０日以上である
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項１３に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、さらに、
前記第４の細菌細胞を、ｐＨ７．０に維持した嫌気的条件下で炭素源を含む培地において第２の期間培養し、前記第４の細菌細胞よりも細胞収率の高い、及び／又は乳酸生産量の多い細胞を選択し、前記選択された細胞を前記条件下で培養することを第３の期間継続して、第５の細胞を取得する
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項１４に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第５の細胞を取得することは、前記炭素源の濃度を増加させながら前記培養と選択とを繰り返す
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項１５に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第２の期間は、６０日以上である
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項８に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第１の細菌細胞のＬ（＋）−乳酸脱水素酵素遺伝子とアセト乳酸合成酵素遺伝子との全部又は一部を欠失させることは、
前記第１の細菌細胞のＬ（＋）−乳酸脱水素酵素遺伝子及びアセト乳酸合成酵素遺伝子の少なくともいずれか一方の一部が欠損した遺伝子断片を含む温度感受性プラスミドを前記第１の細菌細胞に形質転換させ、
前記プラスミドを安定に維持できる第１の温度で培養した後、前記プラスミドが前記細菌細胞から取り除かれる第２の温度で培養することを含む
Ｄ（−）−乳酸生成方法。 - 請求項１７に記載のＤ（−）−乳酸生成方法であって、
前記第１の細菌細胞に形質転換させることは、相同組換えにより形質転換させる
Ｄ（−）−乳酸生成方法。
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