JP5699429B2

JP5699429B2 - Ｆｃレセプターの精製方法

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Publication number: JP5699429B2
Application number: JP2009287774A
Authority: JP
Inventors: 陽介寺尾; 半澤　敏; 敏半澤
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: JP2011126827A

Description

本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、Ｆｃレセプターを発現する宿主の培養液から、Ｆｃレセプターを精製する方法に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は１０^−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるサブクラスのうち、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３と強く結合し、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４との結合は弱いことが知られている。

ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。

ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子工学的手法により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を利用した発現が報告されている。

近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィー担体の捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。しかしながら、前記目的でＦｃγＲＩを利用するには、ＦｃγＲＩを高純度に精製することが重要である。

特表２００４−５３０４１９号公報

Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ＴｏｓｈｉｙｕｋｉＴａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９

遺伝子工学的手法を用いたＦｃγＲＩの生産は、通常、ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することにより宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することでＦｃγＲＩを発現し生産する。培養液中には、培養する際の栄養源（アミノ酸類、糖類、微量金属類など）や、宿主自身が生産する副生成物といった様々な夾雑物が存在する。そのため、前記形質転換体により形質転換体外へＦｃγＲＩを発現する場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養上清を得た後、前記夾雑物を除去する精製を行なう必要がある。一方、前記形質転換体により形質転換体内にＦｃγＲＩを発現する場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養細胞を得た後、機械的せん断、浸透圧ショック、酵素処理、薬剤処理などにより培養細胞を破砕する必要がある。なお、前記破砕操作により、細胞内の全ての内容物が破砕液中に放出するため、形質転換体外へ発現する場合よりも複雑な精製方法が必要となる場合がある。

通常、培養液から目的とするタンパク質を精製分離するには、硫安分画や限外ろ過による大まかな分離を行なった後、モードの異なる２種類以上のクロマトグラフィーを組み合わせて行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離は、電荷、親水性／疎水性の差、タンパク質分子の大きさなどにより目的タンパク質を精製分離する。なお、各クロマトグラフィーにおける溶媒の種類や吸着／洗浄／溶出方法は、適宜検討の上行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離の中でも、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィー（疎水クロマトグラフィー）は、試料溶液中に高濃度の塩類が添加されている場合であっても希釈や透析による塩濃度を下げる操作が不要であり、低い塩濃度の緩衝液で目的タンパク質の溶出が行なえるなどの利点があるため、第一段階または第二段階のカラムとして好ましく用いられる。しかしながら、疎水クロマトグラフィーを用いてＦｃγＲＩを精製する際、通常の溶出で用いられる塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどの塩類を含まない緩衝液で溶出させると、ＦｃγＲＩの回収率が著しく低くなる問題があった。また、前記問題を解決するため、従来から知られているエタノールや塩酸グアニジンを添加する方法を検討したものの、エタノールを添加すると塩が析出する問題が新たに発生し、塩酸グアニジンを添加すると腐食性の問題が新たに発生した。また、これらの方法によってもＦｃγＲＩの回収率は十分ではなかった。

そこで本発明は、疎水クロマトグラフィーを用いてＦｃγＲＩを精製する際、より高純度かつ高い回収率でＦｃγＲＩを精製する方法を提供することが課題である。

本発明者らは、疎水クロマトグラフィー用担体を用いてＦｃγＲＩを精製する際、前記担体からＦｃγＲＩを溶出させる際に用いる緩衝液に添加する成分および濃度について鋭意検討した結果、本発明を見出した。

すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを精製する方法であって、前記担体に吸着したヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを溶出させる際に１０％（ｗ／ｖ）以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの精製方法。

（２）宿主が大腸菌である、（１）に記載の精製方法。

（３）疎水クロマトグラフィー用担体がフェニル基を導入した担体である、（１）または（２）に記載の精製方法。

以下に、本発明について詳細に説明する。

本発明における、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主とは、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。

前記宿主の培養液から、疎水クロマトグラフィー用担体に吸着させるヒトＦｃγＲＩを含む溶液（アプライ液）を取得するには、例えば、宿主細胞外にＦｃγＲＩが発現する場合は培養液を遠心分離して得られる培養上清から、宿主細胞内にＦｃγＲＩが発現する場合は培養液を遠心分離して得られる培養細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後遠心分離により破砕残渣を除去することで得られる細胞破砕液から、それぞれ所定濃度の塩類（硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなど）を含んだ緩衝液を添加後、遠心分離により夾雑タンパク質を除去することで取得することができる。

本発明の精製方法で用いる、疎水クロマトグラフィー用担体は、フェニル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、エーテル基といった疎水基を担体に結合したものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＰｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＢｕｔｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨｅｘｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＥｔｈｅｒ−６５０（以上、東ソー株式会社製）、ＯｃｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）があげられる。中でも本発明の精製方法は、フェニル基を導入した担体を用いた精製に好ましい。なお、前記疎水クロマトグラフィー用担体を用いて本発明の精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラムに充填して行なえばよい。また、前記疎水クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な塩（硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなど）を含む適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシン（Ｇｌｙ）−ＮａＯＨ、リン酸塩など）により平衡化しておく。

前述の方法で得られたアプライ液を、平衡化した疎水クロマトグラフィー用担体に導入することでヒトＦｃγＲＩを含むタンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、緩衝液を用いて吸着したヒトＦｃγＲＩを溶出させるが、通常の溶出で用いられる塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどの塩類を含まない緩衝液で溶出させると、ＦｃγＲＩの回収率が著しく低くなる問題があった。そこで、疎水性相互作用を弱める働きがあるグリセロール、エタノール、塩酸グアニジンを添加し、ヒトＦｃγＲＩの精製度および回収率を検討した結果、グリセロール、特に１０％（ｗ／ｖ）以上のグリセロールを緩衝液に添加することにより、高純度かつ高い回収率でヒトＦｃγＲＩを精製することを実現した（実施例１、比較例１から４、表１参照）。

本発明の精製方法において、溶出した画分中のヒトＦｃγＲＩの分析方法は、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよいが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による分析方法が好ましい。

本発明の精製方法により得られたヒトＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、本発明の方法によって精製したものをそのまま用いてもよいし、さらに高度に精製したものを用いてもよいし、またその中間の純度の精製度合いのものを用いてもよい。

本発明はヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトＦｃγＲＩを精製する際に、１０％（ｗ／ｖ）以上のグリセロールを含む緩衝液で前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩを溶出させることを特徴としている。本発明の精製方法により、高純度かつ高い回収率でヒトＦｃγＲＩを精製することができる。また、本発明の精製方法は前記担体に導入するヒトＦｃγＲＩを含む溶液量（アプライ量）に係わらず適用可能な方法であるため、ヒトＦｃγＲＩの分析目的に適用できることはもちろん、工業的なヒトＦｃγＲＩ生産の一工程にも適用することができる。

本発明の精製方法で得られたヒトＦｃγＲＩは、そのまま、またはさらなる精製により、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。

ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図。

以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１
（１）ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を２ＹＴ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に植菌し、３０℃でＯＤ（Ａｂｓ：６６０ｎｍ）＝３になるまで培養した。
（２）１５℃に冷却後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を０．０５ｍＭになるように添加し、さらに一晩培養した。
（３）培養液より菌体を回収後、抽出液（０．６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０２％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＰＭＳＦ、０．３ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．００１％Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））に菌体を懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出後、遠心分離により無細胞抽出液（アプライ液）を調製した。
（４）１ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ（東ソー株式会社製）ゲルをオープンカラムに充填し、５ｍＬの緩衝液Ａ（６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））にてゲルを平衡化した。
（５）（３）で調製したヒトＦｃγＲＩを含む無細胞抽出液（アプライ液）１０ｍＬを導入し、１０ｍＬの緩衝液Ａにより洗浄後、５ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）によりヒトＦｃγＲＩを溶出させた。

１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にて溶出させることにより、７７％のヒトＦｃγＲＩを回収することができた。なお、本精製により比活性（総タンパク質中［ｇ］のヒトＦｃγＲＩ含有量［ｍｇ］）は１．３１から３．３７に上昇した。

比較例１
実施例１の（５）におけるヒトＦｃγＲＩの溶出を、５ｍＬの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で行なったほかは、実施例１と同様の実験を行なった。結果、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したときのヒトＦｃγＲＩの回収率は３０％であり、比活性は１．５０であった。

比較例２
実施例１の（５）におけるヒトＦｃγＲＩの溶出を、５ｍＬの５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で行なったほかは、実施例１と同様の実験を行なった。結果、５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したときのヒトＦｃγＲＩの回収率は４６％であり、比活性は４．５７であった。

比較例３
実施例１の（５）におけるヒトＦｃγＲＩの溶出を、５ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で行なったほかは、実施例１と同様の実験を行なった。結果、１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したときのヒトＦｃγＲＩの回収率は４５％であり、比活性は１．７１であった。

比較例４
実施例１の（５）におけるヒトＦｃγＲＩの溶出を、５ｍＬの０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で行なったほかは、実施例１と同様の実験を行なった。結果、０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したときのヒトＦｃγＲＩの回収率は６３％であり、比活性は４．６９であった。

実施例１および比較例１から４までの結果を表１にまとめる。

実施例２
（１）実施例１の（１）から（２）の操作により得られた培養液から菌体を回収（菌体収量：１４００ｇ）した。
（２）（１）で得られた菌体を、以下の示す方法で２回に分けてヒトＦｃγＲＩを精製した（１回の処理量７００ｇ）。
（２−１）７００ｇの菌体ペレットに５倍量となるよう抽出液（０．６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０２％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＰＭＳＦ、０．３ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．００１％Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を加え、室温で３０分撹拌し、菌体内タンパク質を抽出した。
（２−２）遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により菌体破砕物を除去後、上清を回収して無細胞抽出液を３５００ｍＬ得た。
（２−３）無細胞抽出液に２１０ｇの硫酸アンモニウム（終濃度６％）を撹拌しながら徐々に加え、１時間撹拌を継続した。
（２−４）遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により上清を回収後、次工程の疎水性クロマトグラフィーに供するために、ｐＨを８．０へ調整後、全量を７０００ｍＬとなるよう希釈し、これをアプライ液とした。
（２−５）緩衝液Ａで平衡化した５００ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ（東ソー株式会社製）ゲルをオープンカラムに充填後、（２−４）のアプライ液を導入し、ヒトＦｃγＲＩを含むタンパク質をゲルに吸着させた。
（２−６）２０００ｍＬの緩衝液Ａにてゲルを洗浄後、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にて１００ｍＬずつの画分に溶出させた。

結果、ヒトＦｃγＲＩの回収率は８３％であり、比活性は１．２１から７．０９に約６倍上昇した。表２に全菌体（１４００ｇ）からの精製テーブルを示す。

Claims

ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から、疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを精製する方法であって、
前記担体に吸着したヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを溶出させる際に、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの精製方法。
宿主が大腸菌である、請求項１に記載の精製方法。
疎水クロマトグラフィー用担体がフェニル基を導入した担体である、請求項１または２に記載の精製方法。