JP5698001B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が低下又は喪失し、かつアミノ酸を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を用いたアミノ酸の製造法に関する。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼはオキサロ酢酸とグルタミン酸からアスパラギン酸を生成する酵素である。大腸菌においてオキサロ酢酸とグルタミン酸からアスパラギン酸を合成する酵素としては他に芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼの存在が知られているが主としてアスパラギン酸の合成はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼにおいて行われていると考えられている（非特許文献１）。
エシェリヒア属の微生物のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、その生化学的性質が知られており、当該酵素をコードするaspC遺伝子も知られている（非特許文献２）。また、エシェリヒア属の微生物のaspC遺伝子を過剰発現させることによってＬ−アミノ酸の生産性を改善できることが知られている（特許文献１、２）。
生体のタンパク質はα−アミノ酸のポリマーであるが、基本的にＬ−アミノ酸が構成成分となっている。Ｌ−アミノ酸は、生体の構成成分としての重要性に加え、それ自体が生理活性又は薬理活性を示したり、呈味効果又は栄養効果を示すものも多く、医薬や食品などとして、さまざまな用途が開発されている。
しかし、これまでＬ−アミノ酸の発酵生産において、aspC活性を低下又は喪失させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産効率を向上させることができることを記載及び示唆した報告はない。
Escherichia coli and Salmonela, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996
Kondo K. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1984; 122(1):62-7
本発明が解決しようとする課題は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供すること等である。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物では、Ｌ−アミノ酸の生産効率が向上されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［２］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損した微生物である、［１］記載のＬ-アミノ酸の製造法。
［３］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれる蛋白質である、［１］又は［２］記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
［４］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれるＤＮＡにコードされる、［１］又は［２］に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］微生物がエシェリヒア属に属する微生物である、［１］〜［４］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［６］Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸である［１］〜［５］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［２］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損した微生物である、［１］記載のＬ-アミノ酸の製造法。
［３］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれる蛋白質である、［１］又は［２］記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
［４］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれるＤＮＡにコードされる、［１］又は［２］に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］微生物がエシェリヒア属に属する微生物である、［１］〜［４］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［６］Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸である［１］〜［５］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
本発明により、従来よりもＬ−アミノ酸の生産効率が向上した微生物によるＬ−アミノ酸の効率的な生産が可能となり、医薬や健康食品などの分野で様々な用途が存在するＬ−アミノ酸を、効率よく提供することが可能となる。
１．アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が親株に比べ低下又は喪失した微生物の作製
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供する。したがって、本発明の製造法に用いられる微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることにより得ることができる。
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供する。したがって、本発明の製造法に用いられる微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることにより得ることができる。
本発明における親株とは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された株でもよく、また親株はＬ−アミノ酸を生成する能力を有していてもよいし、有していなくてもよい。親株が有するＬ−アミノ酸を生成する能力は、該親株が元来有するものであっても良いし、後述する方法によって人工的に付与されるものであっても良い。親株がＬ−アミノ酸を生成する能力を有していない場合、該親株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることに加え、後述する方法によってＬ−アミノ酸を生成する能力を人工的に付与することにより、本発明の方法で用いられる微生物を取得することができる。
親株としては、例えば、Neidhardt, F.C.らにより記載されている細菌（Escherichia coli and Salmonella, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996, (1201ページ、Table 1)）をあげることができる。好ましくは、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する細菌を挙げることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラー又はストレプトミセス・リビダンスを挙げることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリを挙げることができる。
Ｌ-アミノ酸を生成する能力を有する微生物は、公知の方法により親株を改良し、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を人工的に付与することにより取得することができる。該公知の方法としては、
（ａ）Ｌ−アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）Ｌ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）親株に比べ、Ｌ−アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)及びAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)及びJ. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)及びAgric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979)及びAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977)、Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2023 (1973)及びAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を取得することができる。
（ａ）Ｌ−アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）Ｌ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）親株に比べ、Ｌ−アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)及びAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)及びJ. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)及びAgric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979)及びAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977)、Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2023 (1973)及びAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を取得することができる。
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又は組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の育種方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の育種方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153 (1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092及び特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を取得することができる。
本発明におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列とは、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個、１〜５個、３個、２個又は１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり得る。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。アミノ酸配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とすることができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。
本発明の製造法に用いられる微生物において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失していることは、当該分野で公知の方法にしたがって測定することができるが、例えば、本発明の製造法に用いられる微生物及び親株それぞれについて、J Bacteriol., 130(1), 429-40 (1977)に記載の方法によりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を測定し、それらを比較することにより確認できる。
本発明の製造法に用いられる微生物は、例えば、親株を通常の突然変異処理法、組み換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは、形質導入法等の、微生物に変異を導入することのできる方法、又はアンチセンス法等のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制できる方法等に供することよって製造することができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、エチルニトロソウレア、ベンゾピレン、アクリジン色素等による処理、及び紫外線照射法等をあげることができる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も変異原として用いることができる。変異原を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店） 日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genet.), 314 (2000)等に記載の方法が用いられ得る。
組み換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、aspCのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、又は付加を導入し、相同組み換え等により該ＤＮＡを親株の染色体に組み込み、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを置換する方法をあげることができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであればいずれでもよく、例えば、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。aspCのＤＮＡとしては例えば、GenBank/EMBL/DDBJ Accession NC000913. 2, gi:49175990の配列の983741から984931番目までの塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
あるいは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり得る。ストリンジェント条件下とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡはまた、配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであってもよい。好ましくは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とし得る。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、公知のエシェリヒア・コリ由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列情報に基づいて、ＰＣＲ法等により取得することができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、又は付加を導入する方法としては、例えば、Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
また、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）中に薬剤耐性を付与する遺伝子を挿入したＤＮＡ断片をＰＣＲ法により作製することもできる。
変異を有するＤＮＡ断片を親株へ導入する方法としては、例えば、ファージ由来のλRedリコンビナーゼを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640 (2000), Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]をあげることができる。
抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組み換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体上のアスパラギン酸アミノトランフェラーゼをコードするＤＮＡが変異体ＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることができる。
親株の染色体上のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに置換、欠失、又は付加を導入する方法としては、他にもバクテリオファージや接合を利用する方法をあげることができ、例えば、Bacterial and Bacteriophage Genetics, Springer-Verlag (1981-2000)に記載の方法をあげることができる。
変異を導入する塩基の数は、置換、欠失、又は付加によって、該ＤＮＡがコードするアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることができる数であれば限定されないが、例えば１〜３００個、好ましくは１〜１５０個、より好ましくは１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、最も好ましくは１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、３個、２個又は１個であり得る。
変異を導入する部位は、該変異によってアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることができる部位であれば必ずしもアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの有する塩基配列中に限られないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写・翻訳調節領域（以下、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子という）中であることが好ましく、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの有する塩基配列中であることがさらに好ましい。
塩基置換を導入してアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させる方法としては、例えば、ナンセンス変異の導入による方法があげられる。ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマー及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られたナンセンス変異が導入されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて親株の染色体上のaspCを置換する方法があげられる。
塩基配列の欠失を導入することによってアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させる方法としては、例えば、ＰＣＲを用いてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の５’側と３’側を増幅し、得られた断片をＰＣＲにより結合させて得られるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
塩基配列を欠失させたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の例としては、例えば、以下の方法により得られる遺伝子をあげることができる。まず、配列番号９、又は１０と１６のプライマーを用いて、大腸菌由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の５’側を、配列番号１１、又は１２と１５のプライマーを用いて３’側を増幅する。増幅された２つの断片を鋳型として、配列番号９、又は１０と１１、又は１２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより配列番号１記載の塩基配列の第１〜９８８番目の塩基が欠失したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を得る。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子に変異を導入せずにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下させることもできる。このような方法として、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする標的ｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含むオリゴヌクレオチド又はＲＮＡを該微生物に導入し、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する、いわゆるアンチセンス法をあげることができる。
「標的ｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部」とは、標的のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも１０塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上含むものである。
アンチセンスＲＮＡのほか、標的ｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ（いわゆるｓｉＲＮＡ）又は標的ｍＲＮＡに対するリボザイムを導入することによってもまた、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下させることができる。
上記の操作を行って得られた微生物の中から、前述のようにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を測定し、親株と比較することによって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が低下又は喪失した微生物を得ることができる。
２．本発明の製造法
本発明はまた、上記１の方法で調製された、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することによる、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明はまた、上記１の方法で調製された、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することによる、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、及びＬ−アミノ酸の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物が資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培養pHは5〜9、好ましくは6〜7.5である。培養時間は、5時間〜5日間、好ましくは16時間〜3日間である。
培養物中に蓄積したＬ−アミノ酸は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−アミノ酸は、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を欠失した菌株の造成
（１）ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの作製
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むＤＮＡ断片は以下のようにして調製した。
ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）を鋳型として０．１μｇ、配列番号３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片を常法にて精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、ＤＮＡ断片精製キットと略す）を用いて精製し、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を得た。
さらにｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ７７２８２由来）を鋳型として配列番号５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにして同様にＰＣＲ反応を行い、常法にて精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動とＤＮＡ精製キットを用いて精製し、レバンシュークラーゼ遺伝子断片を得た。ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、アガロース電気泳動とＤＮＡ断片精製キットを用いて精製した。上記３つのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換して、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することによりクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むｐＨＳＧｃａｔｓａｃＢが取得されていることを確認した。得られたプラスミドを鋳型に配列番号７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片精製キットにより精製して、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）が含まれるＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットと略す）を得た。
（１）ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの作製
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むＤＮＡ断片は以下のようにして調製した。
ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）を鋳型として０．１μｇ、配列番号３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片を常法にて精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、ＤＮＡ断片精製キットと略す）を用いて精製し、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を得た。
さらにｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ７７２８２由来）を鋳型として配列番号５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにして同様にＰＣＲ反応を行い、常法にて精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動とＤＮＡ精製キットを用いて精製し、レバンシュークラーゼ遺伝子断片を得た。ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、アガロース電気泳動とＤＮＡ断片精製キットを用いて精製した。上記３つのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換して、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することによりクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むｐＨＳＧｃａｔｓａｃＢが取得されていることを確認した。得られたプラスミドを鋳型に配列番号７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片精製キットにより精製して、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）が含まれるＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットと略す）を得た。
（２）ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００９２６Ｄ−５）を鋳型として０．１μｇ、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各４００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で７分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行って、ａｓｐＣを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片と上記（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｓｐＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００９２６Ｄ−５）を鋳型として０．１μｇ、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各４００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で７分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行って、ａｓｐＣを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片と上記（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｓｐＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（３）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
上記（２）で得られたａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片をＤａｔｓｅｎｋｏらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０（２０００）］に従って大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ＃７７３９としてYale 大学The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）に導入し、染色体ＤＮＡとの相同組換えを起こさせた。クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択し、出現したコロニーを採取して、シュークロース６０ｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上で生育しない株を選抜した後、次にａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を同様に導入した。シュークロース非感受性、かつクロラムフェニコール感受性となった株を選抜して、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの削除に成功した株、ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株を得た。また、確認のため、得られた株の染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出し、これを鋳型として配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ、マーカー除去用ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片が増幅された。
上記（２）で得られたａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片をＤａｔｓｅｎｋｏらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０（２０００）］に従って大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ＃７７３９としてYale 大学The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）に導入し、染色体ＤＮＡとの相同組換えを起こさせた。クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択し、出現したコロニーを採取して、シュークロース６０ｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上で生育しない株を選抜した後、次にａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を同様に導入した。シュークロース非感受性、かつクロラムフェニコール感受性となった株を選抜して、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの削除に成功した株、ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株を得た。また、確認のため、得られた株の染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出し、これを鋳型として配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ、マーカー除去用ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片が増幅された。
ＢＷ２５１１３株、及びａｓｐＣ欠失変異株によるＬ−グルタミン酸生産試験
実施例１で得たａｓｐＣ欠損株ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＣ株を得た。具体的には８ｍＬのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌して４２℃一晩振とう培養を行い、得られた培養液をＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕にストリークし、出現したコロニーの中からアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で生育できなくなったものを選抜した。
ａｓｐＣ変異株ＢＷＣ株、及び親株であるＢＷ２５１１３株（ＣＧＳＣ＃７７３６）をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養した後、それぞれをＬＢ液体培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕３５０ｍＬの入った三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液２０ｍＬを、本培養培地〔グルコース４５ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、チアミン塩酸塩８ｍｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕７８０ｍＬの入ったジャーファーメンターに植菌し、攪拌回転数毎分８００回転、通気毎分１Ｌ、３０℃で１６時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表１に示す。
実施例１で得たａｓｐＣ欠損株ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＣ株を得た。具体的には８ｍＬのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌して４２℃一晩振とう培養を行い、得られた培養液をＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕にストリークし、出現したコロニーの中からアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で生育できなくなったものを選抜した。
ａｓｐＣ変異株ＢＷＣ株、及び親株であるＢＷ２５１１３株（ＣＧＳＣ＃７７３６）をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養した後、それぞれをＬＢ液体培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕３５０ｍＬの入った三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液２０ｍＬを、本培養培地〔グルコース４５ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、チアミン塩酸塩８ｍｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕７８０ｍＬの入ったジャーファーメンターに植菌し、攪拌回転数毎分８００回転、通気毎分１Ｌ、３０℃で１６時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表１に示す。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｓｐＣを欠損させたＢＷＣ株では、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）の生産量が親株ＢＷ２５１１３株に比べて明らかに向上していた。
プロリン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
（１）プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、ｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片、ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｕｔＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｕｔＡの５’領域を配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２１の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｕｔＡの３’領域を配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２２の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｕｔＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ｐｕｔＡ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｏＢを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｒｏＢの５’’領域を配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２９の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｒｏＢの３’領域を配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３０の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号２５、及び２７の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｒｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｒｏＢ遺伝子の５’側領域を、配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の３１９番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたｐｒｏＢ７４がコードするγグルタミルキナーゼはプロリンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ｇｅｎｅ，６４，１９９（１９８８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
（１）プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、ｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片、ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｕｔＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｕｔＡの５’領域を配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２１の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｕｔＡの３’領域を配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２２の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｕｔＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ｐｕｔＡ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｏＢを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｒｏＢの５’’領域を配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２９の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｒｏＢの３’領域を配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３０の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号２５、及び２７の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｒｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｒｏＢ遺伝子の５’側領域を、配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の３１９番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたｐｒｏＢ７４がコードするγグルタミルキナーゼはプロリンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ｇｅｎｅ，６４，１９９（１９８８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
（２）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのｐｕｔＡ欠失変異の導入
プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡ／ｐＫＤ４６株を得た。
プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡ／ｐＫＤ４６株を得た。
（３）遺伝子置換法によるＢＷＡ株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
（４）遺伝子置換法によるｐｒｏＢ７４変異の導入
ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６株をそれぞれに得た。
ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６株をそれぞれに得た。
ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株によるＬ−プロリン生産試験
実施例３で得たＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させ、ＢＷＡＰ株及びＢＷＡＣＰ株をそれぞれ得た。ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養し、菌株をそれぞれＬＢ液体培地８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液０．４ｍＬを、それぞれ、本培養培地〔グルコース２０ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、炭酸カルシウム２５ｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で３０時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表２に示す。
実施例３で得たＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させ、ＢＷＡＰ株及びＢＷＡＣＰ株をそれぞれ得た。ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養し、菌株をそれぞれＬＢ液体培地８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液０．４ｍＬを、それぞれ、本培養培地〔グルコース２０ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、炭酸カルシウム２５ｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で３０時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表２に示す。
ＢＷＡＰ株に比べてａｓｐＣを欠損させたＢＷＡＣＰ株では、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）の生産量が明らかに向上していた。
アルギニン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
（１）Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、ａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片、ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＡの５’’領域を配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３７の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＡの３’領域を配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３８の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５６番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたａｒｇＡ２１５がコードするＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素はアルギニンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１８０５（１９９８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＲを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＲの５’領域を配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４５の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＲの３’領域を配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４６の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＲ遺伝子の５’側領域を、配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ａｒｇＲ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（１）Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、ａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片、ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＡの５’’領域を配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３７の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＡの３’領域を配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３８の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５６番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたａｒｇＡ２１５がコードするＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素はアルギニンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１８０５（１９９８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＲを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＲの５’領域を配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４５の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＲの３’領域を配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４６の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＲ遺伝子の５’側領域を、配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ａｒｇＲ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（２）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのａｒｇＡ２１５変異の導入
Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株を得た。
Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株を得た。
（３）遺伝子置換法によるａｒｇＲ欠失変異の導入
ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、上記（２）で得られた株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＲ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、上記（２）で得られた株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＲ／ｐＫＤ４６株を得た。
（４）遺伝子置換法によるＢＷＲ株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＲ株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株、ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＲ株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株、ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ＢＷＲ株、及び当該菌株のａｓｐＣ欠失株によるＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−オルニチン生産試験
実施例５で得たＢＷＲ／ｐＫＤ４６株、及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＲ株、及びＢＷＲＣ株を得た。実施例４と同じ方法で、ＢＷＲ、ＢＷＲＣの各菌株のアミノ酸の生産試験を行った。
結果を表３に示す。
実施例５で得たＢＷＲ／ｐＫＤ４６株、及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＲ株、及びＢＷＲＣ株を得た。実施例４と同じ方法で、ＢＷＲ、ＢＷＲＣの各菌株のアミノ酸の生産試験を行った。
結果を表３に示す。
ａｓｐＣを欠損させたＢＷＲＣ株では、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）の生産量が親株ＢＷＲ株に比べて明らかに向上していた。またＬ−シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）に関しても親株ＢＷＲ株に比べてＢＷＲＣ株が高い生産性を示した。
ヒドロキシプロリン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
実施例３の（２）、及び（３）にて作製したＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＡ株、及びＢＷＡＣ株を得たのち、文献［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０，５２２（２０００）］記載のプラスミドｐＷＦＰ１をＤｏｗｅｒらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）］にしたがってエレクトロポレーション法により導入し、アンピシリン耐性を指標にそれぞれの形質転換体を得た。
実施例３の（２）、及び（３）にて作製したＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＡ株、及びＢＷＡＣ株を得たのち、文献［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０，５２２（２０００）］記載のプラスミドｐＷＦＰ１をＤｏｗｅｒらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）］にしたがってエレクトロポレーション法により導入し、アンピシリン耐性を指標にそれぞれの形質転換体を得た。
ＢＷＡ／ｐＷＦＰ１株、及び当該菌株のａｓｐＣ欠失株ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１株によるＬ−プロリン及びＬ−ヒドロキシプロリン生産試験
実施例４と同じ方法で、実施例７で作製したＢＷＡ／ｐＷＦＰ１、ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１の各菌株のアミノ酸生産試験を行った。
結果を表４に示す。
実施例４と同じ方法で、実施例７で作製したＢＷＡ／ｐＷＦＰ１、ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１の各菌株のアミノ酸生産試験を行った。
結果を表４に示す。
ａｓｐＣを欠損させたＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１株では、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の生産量がＢＷＡ／ｐＷＦＰ１株に比べて明らかに向上していた。
本発明により、従来よりもＬ−アミノ酸の生産効率が向上した微生物によるＬ−アミノ酸の効率的な生産が可能となり、医薬や健康食品などの分野で様々な用途が存在するＬ−アミノ酸を、効率よく提供することが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０２８６９３（出願日：２００９年２月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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Claims (3)
- Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
より選ばれる蛋白質であり、かつ、
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸であることを特徴とする、製造法（ただし、D−アミノ酸が添加された培地を用いる方法を除く）。 - アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、請求項１記載のＬ-アミノ酸の製造法。
- アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（２）より選ばれるＤＮＡにコードされる、請求項１又は２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
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