JP5673679B2

JP5673679B2 - 顕微鏡

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Publication number: JP5673679B2
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Inventors: 良一左高; まゆみ萩原
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Description

本発明は、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにした顕微鏡に関する。

従来、観察対象の標本を刺激光で刺激しつつ、標本を励起光で走査して標本の観察画像を取得する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。

このような走査型顕微鏡では、同じ波長の刺激光と励起光により標本の蛍光観察を行なう場合には、同一光源からのレーザ光を、分離用のハーフミラーを用いて刺激光と励起光とに分離することが多い。この場合、刺激光と励起光は、それぞれ異なるスキャナにより走査が行なわれた後、合成用のハーフミラーで合成されて標本に照射される。

そして、励起光の照射により標本から蛍光が発生すると、この蛍光は、合成用および分離用のハーフミラーを通って、光検出器に受光され、その結果得られた電気信号に基づいて、標本の観察画像が生成される。ユーザは、このようにして得られた観察画像を見ることで、標本の観察面を観察することができる。

国際公開第ＷＯ２００８／００４３３６号

特開２００７−７８７７３号公報

しかしながら、上述した技術では、標本で発生した蛍光は合成用のハーフミラーや、分離用のハーフミラーを通るたびに半減し、弱まってしまう。そうすると、光検出器では、充分な光量の蛍光を受光することができず、観察画像が暗く不鮮明なものとなってしまう。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにするものである。

本発明の顕微鏡は、標本を刺激するための刺激光の一部、および前記刺激光と同じ波長であり、前記標本から蛍光を発生させるための励起光の一部を反射させるとともに、前記刺激光の一部および前記励起光の一部を透過させることで、互いに異なる方向から入射した前記刺激光と前記励起光を対物レンズに導き、前記対物レンズを介して前記刺激光と前記励起光を前記標本に照射させ、前記励起光の前記標本への照射により発生した蛍光の略全部を反射または透過させる第１の光学部材と、前記刺激光を前記第１の光学部材を介して前記標本に照射させるとともに、前記刺激光を偏向させることで、前記刺激光で前記標本を走査する第１のスキャニング部と、前記励起光を前記第１の光学部材を介して前記標本に照射させるとともに、前記励起光を偏向させることで、前記励起光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、入射した所定の波長の光の一部を反射させるとともに、入射した前記光の一部を透過させることにより前記光を前記刺激光と前記励起光に分離して、前記刺激光を前記第１のスキャニング部に入射させ、前記励起光を前記第２のスキャニング部に入射させる第２の光学部材とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、より明るく鮮明な観察画像を得ることができる。

本発明を適用した顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。ダイクロイックミラーの層構成の例を示す図である。ダイクロイックミラーの光学特性例を示す図である。ダイクロイックミラーの層構成の例を示す図である。ダイクロイックミラーの光学特性例を示す図である。ダイクロイックミラーの層構成の例を示す図である。ダイクロイックミラーの光学特性例を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

［顕微鏡システムの構成］
図１は、本発明を適用した顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。

この顕微鏡システムは、光刺激をしながら蛍光観察を行なう走査型のレーザ顕微鏡１１、レーザ顕微鏡１１の各部を制御するコントローラ１２、およびコンピュータ１３から構成される。

レーザ顕微鏡１１の図示せぬステージには、観察対象の標本１４が載置され、レーザユニット２１から射出された照明光が、標本１４に照射される。

レーザユニット２１には、２つのレーザ光源２２およびレーザ光源２３が設けられており、レーザ光源２２とレーザ光源２３から射出された照明光は、全反射ミラーやハーフミラー等からなるコンバイナミラー２４により同一光路上に合成される。そして、コンバイナミラー２４で合成された照明光は、音響光学フィルタ３５において適宜、波長選択および強度変調され、ファイバカプラ３６により光ファイバ３７に導かれる。

また、レーザユニット２１から光ファイバ３７に入射した照明光は、光ファイバ３７を通ってコリメートレンズ３８に入射し、さらにコリメートレンズ３８により平行光線とされてダイクロイックミラー３９に入射する。

ダイクロイックミラー３９に入射した照明光は、ダイクロイックミラー３９を透過して光路選択部４０に入射する。ここで、ダイクロイックミラー３９は、刺激光および励起光となる照明光の波長帯域の光を透過するとともに、標本１４において発生する蛍光の波長帯域の光を反射するような光学特性を有している。

光路選択部４０は、照明光の光路上に設けられ、入射した光の光路を選択する。すなわち、光路選択部４０は、モータにより回転駆動するターレットと照明光の光路上に配置され、ターレットに保持される光学部材とから構成される。

光路選択部４０のターレットには、光学部材（偏向素子）として、照明光の波長帯域の光に対してはハーフミラーとして機能し、蛍光の波長帯域の光に対してはミラーとして機能するダイクロイックミラー４０Ａと、ミラー４０Ｂとが保持されている。光路選択部４０に入射した照明光は、その光の波長と、光の光路上に配置された光学部材によって、スキャニング部４１またはスキャニング部４２へと導かれる。

ここで、ダイクロイックミラー４０Ａは、入射した照明光のほぼ半分を透過させ、残り半分の照明光を反射するような光学特性を有している。図１の例では、照明光の光路上にはダイクロイックミラー４０Ａが配置されているので、ダイクロイックミラー３９からダイクロイックミラー４０Ａに入射した照明光のほぼ半分は、ダイクロイックミラー４０Ａで反射されてスキャニング部４１に入射する。また、ダイクロイックミラー３９からダイクロイックミラー４０Ａに入射した照明光の残り半分は、ダイクロイックミラー４０Ａを透過してスキャニング部４２に入射する。

レーザ顕微鏡１１では、ダイクロイックミラー４０Ａからスキャニング部４１に入射した照明光が励起光とされ、ダイクロイックミラー４０Ａからスキャニング部４２に入射した照明光が刺激光とされる。

スキャニング部４２に入射した照明光（刺激光）は、スキャニング部４２により偏向（反射）されて光路選択部４３に入射する。スキャニング部４２は刺激光を偏向させて、刺激光の標本１４への照射位置を図中、左右方向および奥行き方向に変化させることで、標本１４を刺激光で走査する。例えば、スキャニング部４２は、２つのガルバノスキャナにより構成され、スキャニング部４１と較べて、スキャン領域をより自由に設定できるようになされている。

一方、スキャニング部４１に入射した照明光（励起光）は、スキャニング部４１により偏向（反射）されて光路選択部４３に入射する。スキャニング部４１は励起光を偏向させて、励起光の標本１４への照射位置を図中、左右方向および奥行き方向に変化させることで、標本１４を励起光で走査する。例えば、スキャニング部４１は、２つのガルバノスキャナにより構成され、スキャニング部４２と較べて、より高速に走査を行なうことができるようになされている。

光路選択部４３は、光路選択部４０と同じ構成とされており、光路選択部４３には、ダイクロイックミラー４３Ａとミラー４３Ｂが保持されている。このダイクロイックミラー４３Ａは、ダイクロイックミラー４０Ａと同じ光学特性を有しており、照明光の波長帯域の光は予め定められた割合で分離され、蛍光の波長帯域の光はほぼ全反射される。

図１の例では、刺激光および励起光の光路上には、ダイクロイックミラー４３Ａが配置されているので、光路選択部４３に入射した刺激光の一部は、ダイクロイックミラー４３Ａを透過し、リレーレンズ４４および対物レンズ４５を通って、標本１４に照射される。
また、光路選択部４３に入射した励起光の一部は、ダイクロイックミラー４３Ａで反射され、リレーレンズ４４および対物レンズ４５を通って、標本１４に照射される。

これにより、標本１４が刺激光により光刺激されるとともに、励起光によるイメージングが行なわれる。励起光が標本１４に照射されると、標本１４から蛍光が生じ、この蛍光は対物レンズ４５およびリレーレンズ４４を通って光路選択部４３のダイクロイックミラー４３Ａで反射され、さらにスキャニング部４１でデスキャンされる。

そして、デスキャンされた蛍光は、ダイクロイックミラー４０Ａで反射され、さらにダイクロイックミラー３９で反射されて、集光レンズ４６により集光される。集光レンズ４６により集光された蛍光は、ピンホール４７を通って光検出器４８に入射し、受光される。ピンホール４７は、対物レンズ４５の焦点位置、つまり標本１４の観察面と共役な位置に配置されており、ピンホール４７の位置に集光された蛍光だけが光検出器４８に入射するようになされている。

光検出器４８は、入射した蛍光を受光して光電変換することで、蛍光を、蛍光の受光強度を示す電気信号に変換する。光電変換により得られた電気信号は、光検出器４８からコントローラ１２へと供給される。コントローラ１２は、光検出器４８から供給された電気信号に基づいて、標本１４の観察面の画像である観察画像を生成し、コンピュータ１３に供給する。また、コンピュータ１３は、コントローラ１２から供給された観察画像をディスプレイに表示する。

なお、光路選択部４０や光路選択部４３のターレットには、ダイクロイックミラーやミラーの他、光をそのまま通過させる中空なブロックや両面ミラー、素ガラスなどの光学部材が保持されるようにしてもよい。

［偏向素子の構成例１］
次に、図１のダイクロイックミラー４０Ａおよびダイクロイックミラー４３Ａの具体的な構成例について説明する。

例えば、CFP（Cyan Fluorescent Protein）を利用して、FLIP（Fluorescence Loss In Photobleaching）またはFRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）と呼ばれる手法により、標本１４を蛍光観察する場合を考える。この場合、刺激光および励起光の波長は440nmとされ、蛍光は510nmをピークとする、510nmを含む波長帯域の光とされる。

このような例においては、ダイクロイックミラー４０Ａは、図２に示すように、ガラス基板に、ニオブ酸リチウム（Nb2O5）と、二酸化ケイ素（SiO2）を交互に蒸着させて、ガラス基板に層状の蒸着膜を形成することで得られた光学部材とされる。

なお、図２において、「層番号」の欄には、ガラス基板に蒸着される物質の層の位置を特定する層番号が示されている。また、「物質」の欄には、その層番号により特定される層を構成する物質が示されており、「膜厚（nm）」の欄には、層番号により特定される層の厚み（膜厚）が示されている。

図２では、よりガラス基板表面に近い位置にある層ほど、その層の層番号が小さくなるように、各層の層番号が付与されている。例えば、層番号が「１」である層は、ガラス基板表面に対して、ニオブ酸リチウムを蒸着して形成された層（膜）であり、その層の厚さは、37.33nmとされている。また、層番号が「２」である層は、層番号「１」の層の表面に、二酸化ケイ素を膜厚10nmとなるように蒸着して形成された層である。

この例では、ガラス基板に１７６層の膜が形成されて、ダイクロイックミラー４０Ａとされている。このような構成のダイクロイックミラー４０Ａは、図３に示す光学特性を有する。

なお、図３において、縦軸は、ダイクロイックミラー４０Ａに入射した光の透過率を示しており、横軸は光の波長を示している。また、図中、上側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＳ偏光の光の光学特性が示されており、図中、下側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＰ偏光の光の光学特性が示されている。

さらに、図中、上側および下側において、実線、点線、および一点鎖線は、それぞれダイクロイックミラー４０Ａに対する入射角度が４５度、５２度、および３８度である光の光学特性を示している。ここでの入射角度とは、ダイクロイックミラー４０Ａの表面（反射面）の法線と、光の光路とがなす角度である。

図３の例では、波長が420nmから450nmの光の透過率は約５０％となっており、他の波長の光の透過率は、ほぼ０％となっている。したがって、波長が440nmである照明光がダイクロイックミラー４０Ａに入射すると、照明光のほぼ半分はそのままダイクロイックミラー４０Ａを透過し、残りの半分の照明光は、ダイクロイックミラー４０Ａにおいて反射されることになる。これに対して、波長が約476nmである蛍光は、ダイクロイックミラー４０Ａにおいてほぼ全反射されることになる。

また、この例においては、ダイクロイックミラー４３Ａもダイクロイックミラー４０Ａと同じ光学特性を有するものとされる。すなわち、ダイクロイックミラー４３Ａも図２に示した層構成とされ、図３に示した光学特性を有する光学部材とされる。

このように、所定の波長帯域の光を予め定められた透過率で透過させ、他の波長帯域の光をほぼ全反射させる光学特性を有するダイクロイックミラー４０Ａや、ダイクロイックミラー４３Ａをレーザ顕微鏡１１の光路上に配置すれば、蛍光の光量低減を抑制することができる。これにより、励起光と同じ波長の刺激光で光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合においても、より明るく鮮明な観察画像を得ることができる。

［顕微鏡システムの動作］
次に、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａが、図２および図３を参照して説明した構成とされる場合における、顕微鏡システムの動作について説明する。

ユーザがコンピュータ１３を操作して、標本１４の観察開始を指示すると、コントローラ１２は、コンピュータ１３の指示に従って、光路選択部４０および光路選択部４３を動作させる。光路選択部４０は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、ダイクロイックミラー４０Ａを照明光の光路上に配置する。また、光路選択部４３は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、ダイクロイックミラー４３Ａを照明光（刺激光および励起光）の光路上に配置する。

また、コントローラ１２は、レーザユニット２１に、波長が440nmの照明光を射出させるとともに、音響光学フィルタ３５を制御して、照明光の光量調整を行なわせる。レーザユニット２１から射出された照明光は、光ファイバ３７乃至ダイクロイックミラー３９を通ってダイクロイックミラー４０Ａに入射する。

ダイクロイックミラー４０Ａに入射した照明光は、ダイクロイックミラー４０Ａにおいて、反射または透過により励起光と刺激光に分離される。

すなわち、ダイクロイックミラー４０Ａを透過した照明光は、刺激光となってスキャニング部４２乃至対物レンズ４５を通って標本１４に照射される。このとき、スキャニング部４２は、刺激光を偏向することにより、刺激光で標本１４を走査する。

一方、ダイクロイックミラー４０Ａで反射した照明光は、励起光となってスキャニング部４１、およびダイクロイックミラー４３Ａ乃至対物レンズ４５を通って標本１４に照射される。このとき、スキャニング部４１は、励起光を偏向することにより、励起光で標本１４の観察面を走査する。

このように、顕微鏡システムでは、刺激光と励起光を異なるスキャニング部で走査するので、標本１４の所望する部位を刺激すると同時に、刺激を与える部位とは異なる部位に励起光を照射することができる。これにより、標本１４の特定の部位に刺激光を照射する光刺激時に、標本１４全体に余計なレーザ光が照射されずに済むので、標本１４の退色を防止することができる。

このようにして、標本１４に励起光が照射されると、標本１４からは蛍光が生じ、この蛍光は、対物レンズ４５とリレーレンズ４４を通ってダイクロイックミラー４３Ａで反射され、さらにスキャニング部４１でデスキャンされる。そして、スキャニング部４１から射出された蛍光は、ダイクロイックミラー４０Ａで反射されて、ダイクロイックミラー３９乃至ピンホール４７を通り、光検出器４８に受光される。

光検出器４８で蛍光が光電変換されると、光検出器４８からコントローラ１２には、蛍光の受光量に応じた電気信号が供給されるので、コントローラ１２は、この電気信号から観察画像を生成してコンピュータ１３に供給する。これにより、ユーザは、コンピュータ１３に表示される観察画像を見て、標本１４を観察することができる。

このように、照明光を刺激光と励起光に分離する光学部材、および刺激光と励起光を合成する光学部材として、蛍光をほぼ全反射するダイクロイックミラー４０Ａおよびダイクロイックミラー４３Ａを用いることで、蛍光の光量の低下を抑制することができる。これにより、蛍光の光量を充分に確保し、より明るく鮮明な観察画像を得ることができる。

なお、ダイクロイックミラー４０Ａおよびダイクロイックミラー４３Ａにおいて、蛍光をほぼ全反射すると説明したが、より具体的には、これらのダイクロイックミラーにおける蛍光の反射率は８０％以上であればよい。同様に、ダイクロイックミラー４０Ａやダイクロイックミラー４３Ａにおいて、光をほぼ透過すると説明する場合には、具体的には８０％以上の光を透過させればよい。

［偏向素子の構成例２］
次に、ダイクロイックミラー４０Ａおよびダイクロイックミラー４３Ａの他の具体的な構成例について説明する。ここでは、例えばDRONPA−Greenと呼ばれる手法により、標本１４を蛍光観察する場合について説明する。

そのような場合、波長が405nmおよび488nmの光が刺激光とされ、波長が488nmの光が励起光とされる。また、蛍光は510nmをピークとする、510nmを含む波長帯域の光とされる。

このような例においては、ダイクロイックミラー４０Ａは、図４に示すように、ガラス基板に、ニオブ酸リチウムと、二酸化ケイ素が交互に蒸着されて得られた光学部材とされる。

なお、図４における「層番号」、「物質」、および「膜厚（nm）」の各欄は、図２における場合と同様であるので、その説明は適宜省略する。また、図４においても、よりガラス基板表面に近い位置にある層ほど、その層の層番号が小さくなるように、各層の層番号が付与されている。

図４の例では、ガラス基板上に、ニオブ酸リチウムと二酸化ケイ素が交互に蒸着されて、１０５層の膜が形成され、ダイクロイックミラー４０Ａとされている。このような構成のダイクロイックミラー４０Ａは、図５に示す光学特性を有する。

なお、図５において、縦軸は、ダイクロイックミラー４０Ａに入射した光の透過率を示しており、横軸は光の波長を示している。また、図中、上側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＳ偏光の光の光学特性が示されており、図中、下側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＰ偏光の光の光学特性が示されている。さらに、図中、上側および下側において、実線、点線、および一点鎖線は、それぞれダイクロイックミラー４０Ａに対する入射角度が４５度、５２度、および３８度である光の光学特性を示している。

図５の例では、波長が400nmから420nmの光の透過率はほぼ１００％となっており、波長が470nmから500nmの光の透過率は約５０％となっている。さらに、波長が500nmから670nmの光の透過率はほぼ０％となっている。

したがって、波長が405nmおよび488nmの光からなる照明光がダイクロイックミラー４０Ａに入射すると、405nmの光のほぼ全部と、488nmの光のほぼ半分とがダイクロイックミラー４０Ａを透過して、刺激光となる。また、488nmの光のほぼ半分がダイクロイックミラー４０Ａで反射されて、励起光とされる。

さらに、ダイクロイックミラー４３Ａも、ダイクロイックミラー４０Ａと同じ層構成および光学特性を有するものとされる。そのため、刺激光のうち、405nmの光のほぼ全部と、488nmの光のほぼ半分とがダイクロイックミラー４３Ａを透過して、標本１４に照射される。また、励起光のうち、488nmの光のほぼ半分がダイクロイックミラー４３Ａで反射されて、標本１４に照射される。

一方、標本１４で発生した波長が約510nmである蛍光は、ダイクロイックミラー４３Ａ、およびダイクロイックミラー４０Ａでほぼ全反射されて、光検出器４８に受光される。
このようなダイクロイックミラー４３Ａ、およびダイクロイックミラー４０Ａの構成においても、蛍光の光量低減が抑制され、より明るく鮮明な観察画像が得られる。

［偏向素子の構成例３］
ダイクロイックミラー４０Ａおよびダイクロイックミラー４３Ａのさらに他の具体的な構成例について説明する。この例でもDRONPA−Greenと呼ばれる手法により、標本１４を蛍光観察する場合について説明する。

この場合においても、波長が405nmおよび488nmの光が刺激光とされ、波長が488nmの光が励起光とされる。また、蛍光は510nmをピークとする、510nmを含む波長帯域の光とされる。

このような例においては、ダイクロイックミラー４０Ａは、図６に示すように、ガラス基板に、ニオブ酸リチウムと、二酸化ケイ素が交互に蒸着されて得られた光学部材とされる。なお、図６における「層番号」、「物質」、および「膜厚（nm）」の各欄は、図２における場合と同様であるので、その説明は適宜省略する。また、図６においても、よりガラス基板表面に近い位置にある層ほど、その層の層番号が小さくなるように、各層の層番号が付与されている。

図６の例では、ガラス基板上に、ニオブ酸リチウムと二酸化ケイ素が交互に蒸着されて、１８５層の膜が形成され、ダイクロイックミラー４０Ａとされている。このような構成のダイクロイックミラー４０Ａは、図７に示す光学特性を有する。

なお、図７において、縦軸は、ダイクロイックミラー４０Ａに入射した光の透過率を示しており、横軸は光の波長を示している。また、図中、上側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＳ偏光の光の光学特性が示されており、図中、下側には、ダイクロイックミラー４０Ａに入射したＰ偏光の光の光学特性が示されている。さらに、図中、上側および下側において、実線、点線、および一点鎖線は、それぞれダイクロイックミラー４０Ａに対する入射角度が４５度、５２度、および３８度である光の光学特性を示している。

図７の例では、波長が400nmから430nmの光の透過率はほぼ１００％となっており、波長が430nmから500nmの光の透過率は約９０％となっている。すなわち、430乃至500nmの波長帯域の光については、透過と反射の割合が、９対１となっている。さらに、波長が510nmから660nmの光の透過率はほぼ０％となっている。

したがって、波長が405nmおよび488nmの光からなる照明光がダイクロイックミラー４０Ａに入射すると、405nmの光のほぼ全部と、488nmの光の約９０％がダイクロイックミラー４０Ａを透過して、刺激光となる。また、488nmの光の約１０％がダイクロイックミラー４０Ａで反射されて、励起光とされる。

さらに、ダイクロイックミラー４３Ａも、ダイクロイックミラー４０Ａと同じ層構成および光学特性を有するものとされる。そのため、刺激光のうち、405nmの光のほぼ全部と、488nmの光の約９０％がダイクロイックミラー４３Ａを透過して、標本１４に照射される。また、励起光のうち、488nmの光の約１０％がダイクロイックミラー４３Ａで反射されて、標本１４に照射される。

また、この例のように、ダイクロイックミラー４０Ａやダイクロイックミラー４３Ａとして、刺激光や励起光となる488nmの光の透過と反射の割合が適切な値であるものを予め用意しておくことで、音響光学フィルタ等による刺激光や励起光の光量調整が不要となる。

なお、以上においては、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａで反射された照明光が、励起光とされる例について説明したが、これらのダイクロイックミラーを透過した照明光が励起光とされるようにしてもよい。

そのような場合には、照明光のうち、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａを透過した光が励起光とされ、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａで反射された光が刺激光とされる。また、この場合には、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａは、標本１４から発生した蛍光のほぼ全部を透過させる光学特性を有するようにされる。

さらに、以上においては、ダイクロイックミラー４０Ａとダイクロイックミラー４３Ａを、共焦点顕微鏡として機能するレーザ顕微鏡１１の光路中に配置する例について説明したが、本発明は共焦点顕微鏡に限らず、標本１４を光刺激しながら蛍光観察する顕微鏡に適用可能である。

例えば、異なる光源から射出された、同じ波長の刺激光と励起光が、ダイクロイックミラー４３Ａで合成されて標本１４に照射され、標本１４からの蛍光のほぼ全部がダイクロイックミラー４３Ａで反射または透過されるような構成の顕微鏡とされてもよい。このような顕微鏡では、必ずしも刺激光や励起光で標本１４を走査する必要はなく、走査が行なわれる場合には、この顕微鏡は共焦点顕微鏡（走査型顕微鏡）として機能することになる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１レーザ顕微鏡，１２コントローラ，１３コンピュータ，１４標本，２１レーザユニット，４０光路選択部，４０Ａダイクロイックミラー，４１スキャニング部，４２スキャニング部，４３光路選択部，４３Ａダイクロイックミラー，４５対物レンズ

Claims

標本を刺激するための刺激光の一部、および前記刺激光と同じ波長であり、前記標本から蛍光を発生させるための励起光の一部を反射させるとともに、前記刺激光の一部および前記励起光の一部を透過させることで、互いに異なる方向から入射した前記刺激光と前記励起光を対物レンズに導き、前記対物レンズを介して前記刺激光と前記励起光を前記標本に照射させ、前記励起光の前記標本への照射により発生した蛍光の略全部を反射または透過させる第１の光学部材と、
前記刺激光を前記第１の光学部材を介して前記標本に照射させるとともに、前記刺激光を偏向させることで、前記刺激光で前記標本を走査する第１のスキャニング部と、
前記励起光を前記第１の光学部材を介して前記標本に照射させるとともに、前記励起光を偏向させることで、前記励起光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、
入射した所定の波長の光の一部を反射させるとともに、入射した前記光の一部を透過させることにより前記光を前記刺激光と前記励起光に分離して、前記刺激光を前記第１のスキャニング部に入射させ、前記励起光を前記第２のスキャニング部に入射させる第２の光学部材と
を備えることを特徴とする顕微鏡。
前記第２の光学部材は、前記標本から前記第１の光学部材、および前記第２のスキャニング部を通って入射した前記蛍光の略全部を反射または透過させる
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記第１の光学部材および前記第２の光学部材は、前記刺激光および前記励起光の略半分を透過させるとともに、前記刺激光および前記励起光の略半分を反射させる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。
前記第１の光学部材および前記第２の光学部材は、前記刺激光のうち、前記励起光と同じ波長の光の略半分を反射および透過させるとともに、前記刺激光のうち、前記励起光と異なる波長の光の略全部を反射または透過させる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。
前記第１の光学部材は、前記蛍光を前記励起光が前記第１の光学部材に向けて照射される側と同じ側に反射または透過する
ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記第１の光学部材を透過又は反射した前記蛍光は、前記励起光を偏向した前記第２のスキャニング部で再度偏向される
ことを特徴とする請求項１乃至５の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記第１のスキャンニング部を制御することによって前記刺激光を前記標本の所望の部位に照射しながら、前記第２のスキャニング部を制御することによって前記励起光を前記所望の部位とは異なる部位に照射する
ことを特徴とする請求項１乃至６の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記蛍光の波長は、５００ｎｍ乃至６７０ｎｍの範囲の一部を含む
ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記第１の光学部材は、第１の物質と第２の物質を交互に基板上に形成してなる
ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか一項に記載の顕微鏡。