JP5660781B2

JP5660781B2 - β−１，３−グルカン由来ポリアルデヒド／ポリアミンハイドロゲル

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Publication number: JP5660781B2
Application number: JP2009539157A
Authority: JP
Inventors: 健長崎; 達郎林; 建治大畑; 石橋　謙一; 謙一石橋; 鈴木　利雄; 利雄鈴木; 古川　喜朗; 喜朗古川
Original assignee: Daiso Co Ltd; Osaka City University PUC
Current assignee: Osaka Soda Co Ltd; Osaka Metropolitan University
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-11-04
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2028-11-04
Also published as: US20100316719A1; EP2210917A1; WO2009057802A1; JPWO2009057802A1; US8246992B2

Description

本発明は、脳外科や心臓外科などの手術用止血剤等に要求される、生体適合性・生分解性を有し、ゲル化速度・強度に優れた組織接着性ハイドロゲルを形成するための材料および方法に関する。

近年の手術の特徴として迅速化・高度化が挙げられる。そのため、伝統的な圧迫止血・縫合止血の限界が指摘されている。現在市販されている止血剤や組織接着剤であるフィブリン糊は、ウイルス感染の危険性が高く、接着強度が弱いという問題点がある（非特許文献１）。

また、フィブリン糊と同様に臨床で用いられている、ゼラチンに架橋剤であるホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどを加えてゲル化させたポリアミン-アルデヒド系は、血管閉塞等の後遺障害の可能性や低分子アルデヒド類の高い神経・組織障害性が指摘されており、決して満足のいくようなものではない（非特許文献２）。

そこでこれらの問題点を克服すべく、多くの研究が実施されている。例えば、食品添加物を原料とするデキストランとε-ポリ-L-リジン（以下、単にε-PLLとも称する）を原料とする、架橋型シッフ塩基形成に基づく接着剤が研究されているが、ゲル強度は市販止血剤であるフィブリン糊よりも劣り、止血剤としての強度不足が懸念される。この原因として、多糖をアルデヒド化する際の過ヨウ素酸酸化により、デキストランの主鎖のグルコースが開環し、主鎖にアルデヒド基が導入されるが、同時に主鎖断裂が発生し、分子量低下が生ずるためにゲル強度が低下しやすいことが考えられる（非特許文献３）。

強度的に強い接着剤としてはクエン酸を活性エステル化した誘導体とコラーゲン等のタンパクを接着成分とする組織接着剤も研究されている。しかし、活性エステル化合物は化学的に不安定であり、水溶液での長期保存が不可能である。従って使用直前に生体に悪影響を及ぼすリスクを有する溶媒に溶解させる必要性があり、さらに医師が外科手術などで緊急に使用するときには支障を来す可能性が高い（特許文献１および非特許文献４）。
特開2004-261222号公報川村雅文、木村吉成、神山育男、小山孝彦、後藤太一郎、山本学、井上芳正、大塚崇、堀口速史、山内徳子、澤藤誠、渡辺真純、堀之内宏久、小林紘一、日本外科学会雑誌、103、261 (2002) D. Guilmet, J. Bachet, B. Goudot, C. Laurian, F. Gigou, O. Bical, M. Barbagelatta, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 77, 516 (1974) 玄丞烋、中島直喜.須賀井一、堤定美、歯科材料・器械、25、401 (2006) 田口哲志、工業材料、55、41 (2007)

本発明の目的は、現代の外科手術に適応した、ウイルスなどの感染症の危険性が低く、生分解性・生体適合性を有し、安全性が高く、接着速度・強度に優れた、止血剤等として利用できる組織接着性ハイドロゲルの材料およびかかるハイドロゲルを形成する技術を開発することである。

まず、生分解性・生体適合性を有する食品添加物や医薬品として使用実績のある天然高分子を使用することが、安全性を確保する上で有効である。また、ハイドロゲル形成による組織接着効果を高めるためには、ゲル強度の高いハイドロゲルを形成する材料を使用する必要がある。

そこで、本願発明者らは鋭意研究の結果、特定のポリアミンとポリアルデヒドが、かかるハイドロゲルの材料として有効であることを見いだした。

ポリアミンとしては、食品添加物や医薬部外品として承認済みで安全性に優れたε-PLL（下記一般式（I）に示される）を高分子量化したものを用いることとした。一方、ポリアルデヒドとしては、医薬品やサプリメントとして安全性が確認されており、菌類や酵母など微生物に由来する、側鎖グルコースを持つβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースに選択的にアルデヒドを導入したポリアルデヒド（下記一般式（II）に例示される）を用いることとした。これらの組合せ物が、生体適合性が高く、安全性・接着速度・強度に優れたハイドロゲルを形成することを見出し、本発明を完成した。

なお、本発明において、ポリアミンの原料として用いるε-PLLとは、一般式（I）において、ｐが10〜50であるものをいい、好ましくは、ｐが20〜40であるものであり、さらに好ましくはｐが25〜35であるものである。

本発明において、「ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン」とは、上記一般式 (I)のε-PLLを縮合させて分子量4000〜200000としたもの、および、上記一般式(I)のε-PLLを架橋剤を用いて高分子量化し、分子量4000〜200000としたものの両方をいう。好ましくは、「ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン」の分子量は 10000〜150000であり、さらに好ましくは 20000〜100000である。なお、分子中のシッフ塩基形成可能な一級アミノ基量は、NH2基に対する架橋剤ε-PLL（I）のモル比は0.22であることを考慮すると、元素分析結果からえられるN量の約 10-50％であり、好ましくは「ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン」のシッフ塩基形成可能な一級アミノ基量は元素分析結果からえられるN量の約25-35％、さらに好ましくは、28%である。

なお、本発明において、「β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒドを導入したポリアルデヒド」とは、β型グルコースがβ(1-3)結合により連結した多糖（β-1,3-グルカン）において、β(1-6)結合により側鎖グルコースを有するものであって、その側鎖グルコースの一部または全部の2,3-ジオールおよび／または3,4-ジオールが酸化されアルデヒド基が導入されているものをいう。本発明のポリアルデヒドの構造は一般式（II）に限定されないが、例えば、かかるポリアルデヒドとしては、一般式（II）においてｑが12〜362であるものが挙げられ、さらに好ましくはｑが60〜240であるものが挙げられる。本発明のポリアルデヒドの分子量は9000〜270000であり、好ましくは45000〜180000である。また、β-1,3-グルカンの側鎖グルコースの分岐率、分岐位置は特に限定されない。
なお、分子中のアルデヒド量は一般式（II）における繰り返し単位の１０％〜９９％が酸化反応によりアルデヒド基が導入されたものであり、好ましくは繰り返し単位の１０％〜９５％が、さらに好ましくは２０％〜９５％が酸化されたポリアルデヒドである。
また、分岐率とは主鎖グルコース数に対する側鎖グルコースの割合で次式で定義される。
分岐率＝β-1,6結合の数/（β-1,3結合＋β-1,6結合）

すなわち、本発明は、
（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン、
を含む組合せ物を提供する。

好ましくは、該β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒドおよび該ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンの少なくとも一方は、水溶液の形態であり、さらに好ましくはこれらの両方が水溶液の形態である。

また好ましくは、該ポリアルデヒドは、β-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化によりアルデヒド基を導入されたポリアルデヒドである。β-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化は好ましくはアルカリ性条件下で導入されたものである。好ましくは、該β-1,3-グルカンの側鎖グルコースの分岐率は60％以上である。

一方、ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンは、好ましくは、ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したものであり、好ましくは、架橋剤はジグリシジルエーテルである。さらに、ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンは、分子量10000以上であることをSDS-PAGEで確認できるものであるのが好ましい。

本発明はまた、上記の組合せ物を用いて作成される、
（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン、
を含む組織接着性ハイドロゲルを提供する。

本発明はさらに、
（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン、
を混合することを含む、上記の組織接着性ハイドロゲルの製造方法を提供する。

本発明はさらに、
（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン、
を混合して得られるハイドロゲルを含む止血用組成物を提供する。

本発明はまた、
（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、
（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン、および、
（３）止血用スポンジまたはシート、
を含む止血用組成物を提供する。好ましくは、かかる止血用スポンジまたはシートはコラーゲンスポンジである。

本発明の組合せ物を用いて作成される、（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド／（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンを組成とする組織接着性ハイドロゲルは、脳・心臓・肝臓などの止血剤、血管栓塞剤、肺用のシーラント又は動脈瘤の封止剤等として好適に使用される。

また、本発明の組合せ物を用いて作成される、（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド／（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンを組成とする組織接着性ハイドロゲルは、血管吻合部など軟組織と軟組織、生体腱と骨あるいは歯周組織と歯などの軟組織と硬組織、又は骨と骨あるいは歯と歯などの硬組織と硬組織を接着する生体用組織接着剤としても好適に使用される。

本発明の組合せ物を用いて作成される組織接着性ハイドロゲルは、ゲル化速度・強度に優れ、生体組織のアミン成分とも共有結合しうるために組織接着性が高いものである。また、本発明の組合せ物の各成分ともに天然物由来であり生体内分解吸収性を有し、生体適合性が高いのみならず、高分子であるために、組織浸透性も低い。したがって、本発明の組合せ物を用いて作成される組織接着性ハイドロゲルは、組織障害性が低く安全なものであり、生体内分解吸収性止血剤等として好適である。

本発明で使用する例示的なポリアルデヒドの合成スキーム本発明で使用する例示的なポリアミンである高分子量化 ε-PLL（nEG-PLL）のε-PLLからの合成スキーム本発明で使用する例示的なβ-1,3-グルカン由来ポリアルデヒドの側鎖アルデヒド導入率算出のためのヒドラジン化物合成スキーム過ヨウ素酸等量に対するポリアルデヒド化β-1,3-グルカンのアルデヒド導入率を示すグラフ高分子量化ε-PLLのSDS-PAGEの結果を示す写真 2.0-CHOと1EG-PLLからなるハイドロゲル(a)および市販止血剤フィブリン糊(b)のゲル化挙動を示すグラフ 2.0-CHOと1EG-PLLからなるハイドロゲルの外観 10-CHO もしくはAlkali-10-CHOと23EG-PLLからなるハイドロゲルの外観 10-CHOもしくはAlkali-10-CHOと23EG-PLLからなるハイドロゲルのゲル化挙動を示すグラフ

本発明の組合せ物は、天然由来の生分解性高分子である、多糖由来ポリアルデヒドと生分解性ポリアミンとの組合せである。

まず、本発明の組合せ物の第一の成分である、（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒドについて説明する。

本発明の組合せ物において用いられる（１）β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド（以下、単に（１）のポリアルデヒドとも称する）は、サプリメントや食品として認可を受けた側鎖グルコースを有するβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの１０〜９５％、好ましくは２５〜９５％がアルデヒド化されたポリアルデヒドである。

本発明において用いられる（１）のポリアルデヒドにおいて、側鎖グルコースの分岐率は好ましくは５〜８０％であり、さらに好ましくは分岐率は６０％以上であり、特に好ましくは、６５％以上である。

ポリアルデヒドを合成するためのアルデヒド化は酸化剤として過ヨウ素酸塩や四酢酸鉛が使用でき、好ましくは過ヨウ素酸を使用する。過ヨウ素酸による反応では水を溶媒とする均一系反応の他、相間移動触媒を用いた二層系やシリカゲルを用いた不均一系が効果的である。好ましくはアルデヒド基は、溶媒として水と任意の割合で混合可能な極性溶媒（DMSO, DMF, NMP, THF, メタノール、エタノール）の混合溶媒、好ましくは水のみを使用し、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム）、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウムを試薬として用い、その使用量は側鎖グルコース量に対して0.1〜20等量、好ましくは1〜15等量、さらに好ましくは2〜10等量であり、反応温度は４〜50℃、好ましくは４〜25℃、さらに好ましくは4℃であり、反応時間が2〜72時間、好ましくは12〜64時間、さらに好ましくは24〜48時間であり、反応圧力は1〜5気圧、好ましくは1〜2気圧、さらに好ましくは1気圧である反応条件で過ヨウ素酸酸化により導入されたものである。

かかる過ヨウ素酸酸化は好ましくはアルカリ性条件下で行う。アルカリ性条件としてはpH１１〜１４が好ましく、pH１２〜１３がさらに好ましく、pH１３が最も好ましい。アルカリ性条件をもたらす試薬としては、限定されないが、水酸化ナトリウムが挙げられる。

β-1,3-グルカン類は主鎖に1,2-ジオールが存在しないので、例えば、過ヨウ素酸酸化に供した場合、図１に例示するように、側鎖グルコースのみに選択的にアルデヒド基が導入され、主鎖構造は全く影響を受けない。したがって、側鎖グルコース量に対する過ヨウ素酸塩のモル比を0.1〜20等量に調節することより、アルデヒド基の導入を一般式（II）における繰り返し単位の１０％〜９９％がアルデヒド化された生成物を与えるアルデヒド基導入の制御が容易である。また、主鎖構造の変化にもとづく、主鎖断裂の可能性が低く、より強度の高いゲルを形成しうる（T. Nagasaki, M. Hojo, A. Uno, T. Satoh, K. Koumoto, M. Mizu, K. Sakurai, and S. Shinkai, Bioconjugate Chem., 15, 249-259 (2004)）。

次に、本発明の組合せ物の第二の成分である、（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミンについて説明する。

本発明の組合せ物において用いられる（２）ポリ-L-リジンを高分子量化したポリアミン（以下、単に（２）のポリアミンとも称する）は、食品添加物や医薬部外品として認可されているε-PLLを種々の方法で高分子量化したものである。ε-PLLは高分子量化することにより単独でもゲル化することが知られており、粘性が高いほど出血部位からの流出を防止する効果がある（特開2003-171463号公報および特開2003-176353号公報）。

本発明の組合せ物において用いられる（２）のポリアミンは、一般式(I)に示されるε-PLLの分子同士を、所望により架橋剤を用いて、さらに反応、結合させてより高分子量化したものである。高分子量化処理の方法としては、(1)ε-PLL同士をさらに重縮合させる方法、(2)ε-PLLを放射線処理して互いに結合させる方法、及び(3)架橋剤を介してε-PLL分子同士を架橋する方法、等が挙げられる。なお、「高分子量化」は、必ずしも、全てのε-PLL分子を結合させる必要はなく、上記のような高分子量化処理に付した結果、少なくとも一部のε-PLL分子同士が結合して高分子量化した分子が出現していることが電気泳動等により確認できればよく、一部が未反応のまま残っていてもよい。もっとも、高分子量化処理前の平均分子量の２倍以下の分子が、電気泳動により全く又はほとんど検出されない程度の高分子量化を行うことが好ましく、処理前の平均分子量の１０倍以上の分子の出現が電気泳動により明らかに認められる程度の高分子量化を行なうことがさらに好ましい。

上記(1)の重縮合処理は、好ましくは、ε-PLLを１５０℃〜２００℃程度で２０分間〜９０分間程度、真空下又は不活性ガス雰囲気下で加熱することにより行なうことができる。

上記(2)の放射線処理は、例えば、特許第3502879号公報に記載された公知の方法により行なうことができる。すなわち、ε-PLLの水溶液に、放射線や中性子線、好ましくはγ線を照射することにより行なうことができる。γ線を照射する場合、照射量は、特に限定されないが、通常、45〜250kGy程度である。

上記(3)の架橋剤処理は、例えば、特開2003-171464号公報に記載された公知の方法により行なうことができる。架橋剤は、εPLLのアミノ基と反応する官能基を２つ以上有する化合物であれば特に限定されない。例えば架橋剤としては、反応する官能基としてはアルデヒド基、カルボン酸塩化物、カルボン酸無水物、カルボン酸活性エステル（N-ヒドロキシスクしイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、）構造が挙げられる。例えば、図２に例示するように、エチレングリコールジグリシジルエーテルやジプロピレングリコールジグリシジルエーテル等の、グリシジル基を２個以上有するエポキシ化合物を架橋剤として用い、εPLL（３０量体）を溶媒に対して10〜0.1 wt%溶解させた状態で、εPLL（３０量体）に対するエポキシ化合物のモル比を0.05〜0.30量使用し、２５℃〜１００℃で、水溶液中でε-PLLに該架橋剤を反応させて架橋することが好ましい。好ましくは該架橋剤は、ジグリシジルエーテルである。好ましいジグリシジルエーテルは、図２に示すnEGDGE（nエチレングリコールジグリシジルエーテル）において、ｎが1〜50のものである。

なお、前記一般式（I）に示されるε-PLLは、何れの方法によって得られたものであってもよく、リジンから化学合成により得られたものでもよいが、この化学合成品は合成に高度の技術を要し、また高価でもある為、好ましくは、特許第1245361号明細書に記載のストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを、例えば、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε-PLLを分離・採取することによって得られるε-PLLや、特開2003-1714632号明細書に記載の、微生物発酵により得られるε-PLLを用いることができる。

本発明において、所望により架橋剤を用いて、ポリ-L-リジンを高分子量化した（２）のポリアミンの分子量は、ゲル化形成能と細胞毒性・分解性の観点から、分子量が４千〜５０万程度であることをSDS-PAGEで確認できるものであるのが好ましい。SDS-PAGEで確認できる分子量は、好ましくは１万〜４０万であり、例えば、１万〜２５万、さらに好ましくは２万〜１５万程度である。

本発明において、（２）のポリアミンは、所望により、分子量に基づいて分画しても良い。このような分画化により、所望の分子量範囲のポリアミンのみを集めることができる。分子量の分画方法は公知の何れの方法であっても良く、例としてゲル濾過クロマトグラフ法、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフ法、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を挙げることが出来る。

本発明の組合せ物は、通常、（１）のポリアルデヒドと、（２）のポリアミンを別個に包含する２成分系にある。本発明の組合せ物は、（１）のポリアルデヒドを含む水溶液と、（２）のポリアミンを含む水溶液とを別個に包含する２成分系の形態にあるのが好ましい。即ち、（１）のポリアルデヒドおよび（２）のポリアミンの少なくとも一方が好ましくは水溶液の形態であり、さらに好ましくはそれらの両方が水溶液の形態である。（１）のポリアルデヒドおよび（２）のポリアミンは、いずれも水溶液中で安定に保存できる。また、（１）および（２）の両方を水溶液の形態で提供することにより、それぞれの成分を含む水溶液を単に混合するだけで迅速にゲルが形成する。

また、成分（１）および（２）は、溶液中でゲル化するのみならず、止血器具として使用される、止血スポンジまたはシートなどの基材中においても水分の存在下で同様にゲル化する。止血スポンジまたはシートとしては、コラーゲンシート・キトサンシート・ゼラチンシート（シート状以外のスポンジ状など他の形態でも問わない）などが挙げられる。

また、成分（１）および（２）の他に、水溶性の抗炎症剤、抗菌剤、血管新生剤等の薬剤を含め混合することも可能である。

これら成分を水溶液として提供するための溶媒としては、蒸留水、生分解性高分子と静電的相互作用及びキレート効果によって相互作用する金属イオンを含む水溶液、および緩衝溶液等が挙げられる。これらの溶媒は、有機溶媒ではないので、生体組織に対し、高い毒性を示さない。これらを使用することにより、本発明の組織接着性ハイドロゲルを付着させた周囲の生体組織を浸透圧、ｐＨの変化により壊死させないようにすることができる。好ましくは、緩衝溶液を使うことにより、例えばｐＨを６〜８の間で変化させることが可能となり、ゲル硬化速度の制御が可能になる。

（１）のポリアルデヒドおよび（２）のポリアミンは、水溶液としてではなく、例えば、凍結乾燥粉末等として提供することも可能である。両方を水溶液以外の形態で提供する場合は、DMSO, DMF, NMP, THF, メタノール、エタノール等の溶媒と両方を混合させてゲルを形成させる。

緩衝溶液としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。緩衝溶液としてはさらに、炭酸水素ナトリウム緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液等が挙げられる。また、緩衝溶液を調整する際に用いる無機塩の濃度範囲は０．０１Ｍ〜１０．０Ｍを用いるのが好ましい。

（１）のポリアルデヒドおよび／または（２）のポリアミンを水溶液として提供する場合、蒸留水、金属イオンを含む水溶液、または緩衝溶液等の溶媒中、（１）の濃度は、好ましくは２〜２０wt%であり、（２）の濃度は、好ましくは5〜15wt%である。（１）および（２）の濃縮溶液作製法は、減圧濃縮法や凍結乾燥法などが使用可能である。また、組合せ物を混合して得られるゲル中の（１）および（２）の濃度は、それぞれ2〜10wt%、2〜10wt%であるのが好ましい。ゲル中の（１）：（２）の重量濃度比は１：１〜１：１０、好ましくは、１：１〜１：５である。

本発明は、（１）のポリアルデヒドと（２）のポリアミンを組み合わせて用いて作成される、組織接着性ハイドロゲル、および、（１）のポリアルデヒドと（２）のポリアミンを混合することを含む、組織接着性ハイドロゲルの製造方法も提供する。

本発明の組合せ物における、（１）のポリアルデヒドと（２）のポリアミンとの反応により、より詳細には、ポリアルデヒドのアルデヒド基と、ポリアミンのアミノ基とのシッフ塩基結合によりゲルが形成する。

本発明において、上記（１）および（２）の両成分を水溶液中または止血スポンジまたはシート中で水分の存在下で接触させることにより迅速にゲル化が起きる。こうして形成される組織接着性ハイドロゲルは、温血動物組織の接着、より具体的には、外科手術時の傷口の止血や、創傷の治療のための止血剤として利用することができる。この際、ハイドロゲルに含まれるアルデヒド基の一部が、組織のタンパク質や生体膜構成脂質分子のアミノ基等と反応するため、ハイドロゲルは組織にも結合する。このため、処置時の止血の効果がより高まるのみならず、傷口の処置後、時間が経過してもゲルが移動せず、止血の効果を持続させることができる。
なお、アルデヒド基は完全に反応せず、遊離して残っている方が好ましい。

β-1,3-グルカンの側鎖グルコースに選択的にアルデヒドを導入したポリアルデヒドとε-PLLを高分子量化したポリアミンを成分とする、組織接着性ハイドロゲルは、生体適合性が高く、安全性・接着速度・強度に優れているため、止血剤等として有用である。

本発明を、以下実施例に沿って記述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

β-1,3-グルカンに基づくポリアルデヒドの調製
図１に例示する合成スキームに従い、β-1,3-グルカンの側鎖グルコースにアルデヒド基を導入した。室温下で、水 5 mlに、側鎖グルコースを有するβ-1,3-グルカン（ダイソー社製、アクアβパウダー）100 mgを攪拌させながら溶解した。この溶液に、表１に示すように、β-1,3-グルカンの側鎖グルコースのモル濃度に対して様々なモル等量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、4℃で24時間反応させた。その後、水を10 ml加え、透析（Spectra/Por^{（登録商標）} 7、MWCO 3,500）にて低分子を除去した。透析後、エバポレータで濃縮し、ポリアルデヒド誘導体水溶液を調製した。その一部の凍結乾燥により重量濃度を算出した。濃縮後、一昼夜室温保存すると、中性条件下で合成したすべてのアルデヒド誘導体が、多少の流動性があるもののゼリー状で高い粘性を示した。一方、アルカリ性条件下で合成したアルデヒド誘導体は適度な粘性液体で、供しやすい性状であった。

アルカリ条件下におけるβ-1,3-グルカンに基づくポリアルデヒドの調製
室温下で、125 mM NaOH水溶液20 mlに、側鎖グルコースを有するβ-1,3-グルカン（ダイソー社製、アクアβパウダー）300 mgをマグネチックスターラーで攪拌させながら溶解した。この溶液に側鎖グルコースのモル濃度に対して10等量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、4℃で24〜72時間反応させた。その後、析出する不溶物を除去するために、桐山ロート（No. 3、40 φ m/m）にて濾過を行い、10 ml×3回洗浄し、透析（Spectra/Por^TM7、MWCO 3,500）にて低分子量を除去した。透析後、エバポレータにて濃縮し、ポリアルデヒド誘導体を調製した。その一部を凍結乾燥にて重量濃度を算出した。濃縮後、すべてのポリアルデヒド誘導体が、薄黄色透明の溶液を呈した。これは上記と調製方法が異なるため、Alkali-10-CHOと名付ける。

表 1 ポリアルデヒド合成の反応条件

*)反応溶液に125 mM NaOH水溶液を使用し、反応時間は24時間。

ヒドラジンを用いた側鎖グルコース残基へのアルデヒド導入率の算出
ポリアルデヒド誘導体に実際にどのくらいアルデヒドが導入されたかを調べた。まず図３に例示するスキームに従い、ヒドラジンを用いてアルデヒドとシッフ塩基を形成させ、NaBH₃CNによって還元しヒドラジン化β-1,3-グルカン（H₂NNH-β-1,3-グルカン）を合成した。このヒドラジン化β-1,3-グルカン溶液の一部を凍結乾燥し、元素分析により得られるN%によりアルデヒド導入率を求めた。結果を図４に示す。酸化反応時の側鎖グルコースに対する過ヨウ素酸等量を増加すると共にアルデヒド導入率は増大し、５等量でほぼ定量的に側鎖グルコースがアルデヒド化することが分かる。また、アルカリ性条件下ではアルデヒド導入率が低下し、反応性が低いことが分かる。ただし、反応時間72時間では導入率は83％まで向上し、中性条件下での導入率と有意な差異は見られない。

ε-PLLに基づく高分子量化ポリアミンの調製
図２に例示する合成スキームに従い、ε-PLLの高分子量化を行った。ε-PLL（Mol wt. 4,000（図２においてm=30）、チッソ（株）製）0.5 gを水 25 mlに溶解した（溶液Ａ）。ジグリシジルエーテル化合物（EG-DGE;図２において、 n=1, 0.124 g; n=9, 0.375 g; n=23, 0.985 g）をエタノール 750 μlに溶解した（溶液Ｂ）。溶液ＡとＢを混合し、70℃の油浴にて18時間反応させた。その後、透析（Spectra/Por^{（登録商標）} 7、MWCO 10,000）にて低分子を除去した。透析後、エバポレータで濃縮し、高分子量化ε-PLL水溶液を調製した。その一部を凍結乾燥により重量濃度を算出した。また、元素分析を行い、純度とアミン含有量を確認した（表２）。

表２高分子量化ε-PLL

SDS-PAGEによる高分子量化ε-PLLの分子量評価
アクリルアミド濃度１５ｗ／ｖ％の分離ゲルを用い電気泳動を行った。泳動サンプル 3 μl（１mg/ml）に超純水（milliQ） 2 μlおよび２ｘサンプルバッファー（10 w/v% 2-メルカプトエタノール、4 w/v%ＳＤＳ、及び10 w/v%スクロースを含む0.125 M（mol/l）トリスバッファー）5 μlを加えて調製したサンプル溶液を９５℃で３分間ボイルした。100 V, 30 mAで約２時間泳動後、ゲルを一晩クーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。その後、ゲルを約12時間脱色し、写真を撮影した（図５）。図中のレーンはそれぞれレーン M:分子量マーカー、レーン1: 1EG-PLL（10 μg）、レーン9: 9EG-PLL（10 μg）、レーン23: 23EG-PLL（0 μg）を示す。いずれのサンプルも分子量１万以上の高分子量化されたバンドが確認できる。

ハイドロゲル形成挙動の検討
ポリアルデヒド水溶液と高分子量化ε-PLLをレオメーター（レオロジカ社製ViscoAnalyser VAR100、ディスク径：20 mm）のサンプルテーブル上に同時に滴下して、そのゲル形成特性を評価した（測定温度：３７℃）。ゲル化時間は、貯蔵弾性率（Ｇ'）＞損失弾性率（Ｇ''）となる時間、ゲル強度はＧ’の絶対値として評価した。代表的結果として、ポリアルデヒドとして2.0-CHO、高分子量化ε-PLLとして1EG-PLLをモル比（-CHO/-NH₂）: 0.27 で混合し得られるゲル特性結果を図６-aに示す。

2.0-CHOと1EG-PLLからなる混合物は１秒以内にゲル化することがわかった。また、比較例として、市販止血剤（フィブリン糊）であるボルヒール（化学及血清療法研究所製）の処方に従って形成するハイドロゲルの形成特性を図６-bに示す。2.0-CHOと1EG-PLLからなるハイドロゲルのゲル強度はフィブリン糊の強度と比較し、明らかに優れていることが分かる。

また、2.0-CHOと1EG-PLLからなるハイドロゲルの外観を図７に示す。図７の左側が2.0-CHOと1EG-PLLの混合後10分後の様子であり、右側は過ヨウ素酸酸化前のアルデヒド基を有さないβ-1,3-グルカン(0-CHO-β-1,3-グルカン)と1EG-PLLの混合後10分後の様子である。アルデヒドとアミンとのシッフ塩基形成により、ハイドロゲルが形成されることが分かる。

さらに、β-1,3-グルカンの過ヨウ素酸酸化条件（中性もしくはアルカリ性）によるポリアルデヒドのハイドロゲル形成への影響を検討した。先ずハイドロゲルの外観を図８に示す。図８(a)が10-CHOと23EG-PLLの混合後10分後の様子であり、図８(b)はAlkali-10-CHOと23EG-PLLの混合後10分後の様子である。アルカリ性条件下で合成したAlkali-10-CHOを用いた方が明らかにゲル中に含まれる水分が多く。実際に膨潤率を算出すると、10-CHOとAlkali-10-CHOでそれぞれ180％と580％を与え、アルカリ性条件下で合成したAlkali-10-CHOとのハイドロゲルが優れていることが分かる。

次に、レオメーターを用い、10-CHOとAlkali-10-CHOのゲル形成挙動の違いを観察した。その結果を図９に示す。統計処理上大きな差は見られなかった（p=0.054, N=3）ものの、中性条件下アルデヒド化した10-CHOと比較し、アルカリ性条件下で合成したポリアルデヒドを使用した場合に、よりゲル強度の強いハイドロゲルを形成する傾向が見られた。

ラットを用いた止血効果の検討
止血効果測定に用いたラットは月齢不明、超特大を使用した。ラットへの麻酔は、ネンブタール原液を 0.5 ml腹腔内麻酔およびハロタンによる吸入麻酔を行った。術中も吸入麻酔は継続させた。止血モデルには、I．腹壁筋層の小血管切開による小出血モデル、II．下大静脈の穿刺による静脈性大出血モデル、III．大腿動脈切開による動脈性大出血モデルの3モデルにて行った。

ラットを用いた止血操作法および組織接着評価法
止血操作は、(1)ハイドロゲル（10-CHO + 9EG-PLL）＋コラーゲンインスタット（インスタット（商標）；コラーゲンシート止血剤（ジョンソン・アンド・ジョンソン社製）、以下同じ）(2)ハイドロゲル（Alkali-10-CHO + 23EG-PLL ）＋コラーゲンインスタット、(3)ボルヒール（ボルヒール（商標）；生体組織接着剤（化学及血清療法研究所製））＋コラーゲンインスタット（ポジティブコントロール）、(4)コラーゲンインスタットのみ（ネガティブコントロール）にて行った。止血操作に用いた各化合物水溶液の濃度は表３に示す。

表３止血実験に用いた各化合物の重量濃度

(1)・(2)では、コラーゲンインスタットにアルデヒド誘導体を浸透させ、出血点へインスタットを塗布し、インスタットに向けて、nEG-PLLを1、2滴滴下し、10〜20秒間せっしで軽く押さえた。患部の止血を確認し、綿棒でインスタットをこそいで、組織との接着性を観察した。(3)では、コラーゲンインスタットにフィブリノーゲンを浸透させ、出血点へインスタットを塗布し、インスタットに向けて、トロンビン液を1、2滴滴下し、10〜20秒間せっしで軽く押さえた。患部の止血を確認し、綿棒でインスタットをこそいで、組織との接着性を観察した。(4)では、出血点へインスタットを塗布し、10〜20秒間せっしで軽く押さえた。患部の止血を確認し、綿棒でインスタットをこそいで、組織との接着性を観察した。

腹壁筋層の小血管の小出血モデルの作製法および止血結果
腹壁筋層の小血管の小出血モデルにおいて、小血管を露出させるのに、ラットをあおむけに寝かせ、表皮を微小手術機器にて腹部を正中切開にて除去し、露出した腹壁筋層を鋭的切開にて出血させ、(1)〜(3)による止血効果を測定した。下大静脈の穿刺による静脈性大出血モデルにおいて、胸骨付近まで手術機器にて開腹し、脂肪などを適宜切除していき、露出した下大静脈を注射針による穿刺にて出血させ、(1)〜(4)にて止血効果測定を行った。大腿動脈切開による動脈性大出血モデルにおいて、開腹したラットの左足側の大腿動脈を露出させ、鋭的切開にて出血させ、(1)および(2)にて止血効果測定を行った。
腹壁筋層の小血管切開による小出血モデルにおける止血は、(1)〜(3)すべてにおいて完全なる止血が確認された。

腹壁筋層の小血管の小出血モデルの作製法
腹壁筋層の小血管の小出血モデルにおいて、小血管を露出させるのに、ラットをあおむけに寝かせ、表皮を微小手術機器にて腹部を正中切開にて除去し、露出した腹壁筋層を鋭的切開にて出血させ、(1)〜(3)による止血効果を測定した。

大腿動脈切開による動脈性大出血モデルの作製法
大腿動脈切開による動脈性大出血モデルにおいて、開腹したラットの左足側の大腿動脈を露出させ、鋭的切開にて出血させ、(1)および(2)にて止血効果測定を行った。

ラット出血モデルにおける止血効果
I.腹壁筋層の小血管切開による小出血モデル
II．下大静脈の穿刺による静脈性大出血モデル
III．大腿動脈切開による動脈性大出血モデル
上記３タイプの止血実験結果を表４に示す。アルカリ性条件下で合成したポリアルデヒドを用いたハイドロゲルは市販止血剤であるボルヒールと同等の止血効果を有することが分かる。

表４止血効果測定の結果

ラットを用いた組織に対する組織接着性の検討
(1)ハイドロゲル（10-CHO + 9EG-PLL）＋コラーゲンインスタット
(2)ハイドロゲル（Alkali-10-CHO + 23EG-PLL ）＋コラーゲンインスタット
(3)ボルヒール＋コラーゲンインスタット（ポジティブコントロール）
(1)〜(3)の止血系において損傷部位、正常組織に対しての組織接着性の評価を行った。評価場所は、i．各損傷部位、ii．筋肉、iii．心筋、iv．肝臓、v．腸、vi．腹膜、vii．紙にて行った。組織接着性の評価方法は、コラーゲンインスタットにアルデヒド誘導体またはフィブリノーゲンを浸透させ、評価場所へインスタットを塗布し、インスタットに向けて、nEG-PLLまたはトロンビン液を滴下し、10〜20秒間せっしで軽く押さえ、綿棒でインスタットをこそいで、組織との接着性を観察した。上記３タイプの組織接着性結果を表５に示す。各i〜viiでの接着性は、(1)ではviiを除くほとんどの組織と接着することがなく、(2)ではvやviといった組織表面がつるつるとした組織とは接着しなかったが、その他とは接着した。しかし、その接着強度は弱かった（(3)の5割程度）。(3)ではvを除いたそのほかの組織とはかなりの強さで接着した。

表５組織接着性の評価

＊ iにおいて、動脈性出血を除く。

本発明の（１）のポリアルデヒドと（２）のポリアミンの組合せ物を用いて作成される組織接着性ハイドロゲルは、脳・心臓・肝臓などの止血剤、血管栓塞剤、肺用のシーラント又は動脈瘤の封止剤として使用される。また、血管吻合部など軟組織と軟組織、生体腱と骨あるいは歯周組織と歯などの軟組織と硬組織、又は骨と骨あるいは歯と歯などの硬組織と硬組織を接着する生体用組織接着剤としても使用される。

Claims

（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、
を含む組合せ物。
該ポリアルデヒドおよび該ポリアミンの少なくとも一方が水溶液の形態である請求項１記載の組合せ物。
該ポリアルデヒドおよび該ポリアミンの両方が水溶液の形態である請求項１または２記載の組合せ物。
架橋剤がジグリシジルエーテルである請求項１〜３のいずれかに記載の組合せ物。
該ポリアミンが分子量10000以上であることをSDS-PAGEで確認できるものである請求項１〜４のいずれかに記載の組合せ物。
該ポリアミンが分子量４０００〜２０００００の範囲である請求項１〜４のいずれかに記載の組合せ物。
請求項１〜６のいずれかに記載の組合せ物を用いて作成される、
（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、
を含む組織接着性ハイドロゲル。
（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、
を混合することを含む、請求項７記載の組織接着性ハイドロゲルの製造方法。
（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、
を混合して得られるハイドロゲルを含む止血用組成物。
（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、および、
（３）止血用スポンジまたはシート、
を含む止血用組成物。
止血用スポンジまたはシートがコラーゲンスポンジである、請求項１０記載の止血用組成物。
（１）側鎖グルコースの分岐率が６０％以上であるβ-1,3-グルカンの側鎖グルコースの過ヨウ素酸酸化をアルカリ性条件下で実施して該側鎖グルコースにアルデヒド基を導入したポリアルデヒド、および、
（２）ε-ポリ-L-リジンを架橋剤により架橋したポリアミン、
を混合して得られるハイドロゲルを含む生体用組織接着剤。