JP5652842B2 - 環状二本鎖ｄｎａおよびそれを用いたｄｎａの増幅方法 - Google Patents

Description

本発明は、増幅の対象となる鋳型ＤＮＡ、該鋳型ＤＮＡの製造方法、および該鋳型ＤＮＡを用いたＤＮＡの増幅方法に関する。

ＤＮＡの増幅は、一般的には、増幅の対象となるＤＮＡ（以下、目的ＤＮＡともいう）の断片を含むプラスミド等のベクターを用い、該ベクターを大腸菌内に導入し、大腸菌の増殖させることによって行われる。また、比較的短いＤＮＡを増幅するにあたり最も汎用されている方法は、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法であり、この方法は特定領域を増幅するのには非常に適している。

ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ法に用いる酵素の特性上、ＤＮＡ断片に変異が入りやすく、また増幅の対象となるＤＮＡの配列にも影響を受けやすいため、増幅がほとんど起きない場合がある。さらに、ＰＣＲ産物のままでは使用方法が限定されるため、大腸菌内で目的ＤＮＡ断片を含むプラスミド等のベクターを用いて増幅することが頻繁に行われている。しかし、例えば、レトロウイルス様配列は、配列内に反復配列が有る為に相同組み換えが起きやすく、大腸菌内では非常に不安定であり頻繁に欠失が起きてしまう。さらに、大腸菌に対し致死性の配列を有するＤＮＡ断片を増幅することは不可能である。また、一般的には大腸菌に形質転換できるＤＮＡの大きさは、おおよそ２０ｋｂｐ程度が限界点になるため、それ以上の大きさのＤＮＡ断片を持つプラスミドを大腸菌に形質転換する事は非常に困難であるという問題があった。

最近では、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素とランダムプライマーとを用いた増幅方法（ＭＰＲＣＡ（Multiply-primed rolling circle amplification）法）を応用した、in vitro ＤＮＡクローニング法が普及しつつある。ＭＰＲＣＡ法を利用した場合、上記で示した様な大腸菌では増幅が困難なＤＮＡ断片も増幅が可能になり、増幅産物はプラスミドと同じ使用目的に用いることができる。

一方でＭＰＲＣＡ法を用いたin vitro ＤＮＡクローニング法は、ＤＮＡ結合反応時に、目的のＤＮＡ結合産物以外に、目的外のＤＮＡ結合産物が多量に生成される。したがって、増幅反応の後、多くの目的外のＤＮＡ増幅産物が混入していることになる。この目的外のＤＮＡ結合産物または増幅産物は、大腸菌に遺伝子導入する場合には、産物内のベクターが有する複製開始点の有無による選択が起きることから、大きな問題とはならなかった。しかしながら、in vitroクローニングの場合には、大腸菌による選択が無いため、目的とするＤＮＡ由来の増幅産物が最終産物に含まれる割合が非常に少ない等の問題があった。

さらにＭＰＲＣＡ法は、鋳型ＤＮＡ分子が少なくなればなるほど、非特異なＤＮＡ増幅が目的ＤＮＡの増幅より大きくなるため、環状ＤＮＡの検出時には、ＳＮ比の低下を引き起こし、また環状ＤＮＡ増幅時には目的ＤＮＡの回収ができなくなる。最近、これらの問題を克服する手法として、反応容量を極微量で行うことにより微量の環状ＤＮＡの増幅、検出する方法も報告されているが（非特許文献１および２）、反応手順が煩雑で実際の現場における使用には向いていなかった。
Hutchison, CA., Smith, HO., Pfannkoch, C. & Venter, JC. Cell-free cloning using phi29 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 17332-6 (2005). Marcy, Y., Ishoey, T., Lasken, R.S., Stockwell, T.B., Walenz, B.P., Halpern, A.L., Beeson, K.Y., Goldberg, S.M. & Quake, S.R. Nanoliter reactors improve multiple displacement amplification of genomes from single cells. PLoS Genet., 3, 1702-8 (2007).

したがって本発明は、上記問題点に鑑み、ＤＮＡを簡易な手順で特異的に増幅する方法、とくに目的となるＤＮＡが極微量であっても特異的に増幅することができる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、極微量のＤＮＡであっても特異的に増幅できる方法を確立する上で、目的外のＤＮＡ結合産物などに起因する非特異的なＤＮＡ増幅産物が認められたことから、この非特異的なＤＮＡ増幅を完全に排除するため、鋭意研究を進めたところ、一方の鎖がニックを有しない完全な閉環状であり、他方の鎖が少なくとも１つのニックを有する環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いることにより、鋳型が極微量であっても増幅効率が高く、また目的以外のＤＮＡ増幅を伴わないことができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、ＤＮＡ増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖ＤＮＡであって、一方のＤＮＡ鎖がニックを有しない完全な閉環状であり、他方のＤＮＡ鎖が少なくとも１つのニックを有する、前記環状二本鎖ＤＮＡに関する。
さらに本発明は、他方のＤＮＡ鎖が２以上のニックを有する、前記の環状二本鎖ＤＮＡに関する。

また本発明は、鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖ＤＮＡを製造する方法であって、
一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を少なくとも１つ含む、１または２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションすることを含む、前記方法に関する。
さらに本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の両末端を脱リン酸化し、制限酵素でこれを切断することによって、一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片とすることを含む、前記の方法に関する。
また本発明は、２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片のいずれをも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片とする、前記の方法に関する。
さらに本発明は、さらに、ライゲーションの後に反応液中の直鎖状ＤＮＡを分解処理する工程を含む、前記の方法に関する。

また本発明は、２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を用いて鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖ＤＮＡを製造する方法であって、
（１）一方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素（Ｘ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）と異なる制限酵素（Ｙ）で切断する工程、
（２）他方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を前記制限酵素（Ｙ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）で切断する工程、
（３）工程（１）および（２）で得られた２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする工程、および
（４）反応液中の直鎖状ＤＮＡを分解処理する工程、
を含む、前記方法に関する。
さらに本発明は、前記の環状二本鎖ＤＮＡ、または、前記の方法により製造された環状二本鎖ＤＮＡを製造するためのキットであって、
少なくとも、生理緩衝液、ＡＴＰ、ＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを含む、前記キットに関する。

また本発明は、前記の環状二本鎖ＤＮＡ、または、前記の方法により製造された環状二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマー、ＲＮＡプライマーまたはＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマーとして用いてなる、鎖置換型ＤＮＡ合成によりＤＮＡを増幅する方法に関する。
さらに本発明は、プライマーの５’末端から少なくとも１塩基がＲＮＡである、前記の方法に関する。
また本発明は、プライマーが、鋳型ＤＮＡ特異的プライマーである、前記の方法に関する。
さらに本発明は、プライマーが、ランダムプライマーである、前記の方法に関する。

また本発明は、前記の鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法のためのキットであって、少なくとも、ＲＮＡプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素および鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液を含む、前記キットに関する。
さらに本発明は、前記の鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法によって増幅されたＤＮＡ増幅産物であって、
鋳型の環状二本鎖ＤＮＡの配列が、樹状構造状に１０^５〜１０^１３回繰り返した配列を有する、前記ＤＮＡ増幅産物に関する。

本発明によれば、鋳型が極微量であっても増幅効率が高く、また目的以外のＤＮＡ増幅のない極めて特異性の高いＤＮＡ増幅が、簡便な手順で短期間に行うことが可能である。さらに、鋳型のサイズが限定されず、通常の大きさのもののほか、極めて大きなサイズ（例えば、２０ｋｂｐを超えるもの、数１０〜数１０００ｋｂｐのもの、さらにそれを超えるサイズのもの）を増幅可能である。さらにまた、生物細胞を経由せずに試験管内において、任意のＤＮＡ断片を増幅することができることから、従来の方法では不可能であった大腸菌等の生体内で致死的に働く遺伝子の増幅が可能となる。また、大腸菌等の生体内で頻繁に組み換えを引き起こす配列、例えばレトロウイルス様配列の増幅も可能である。さらにまた、とくに医療用として期待の高いウイルスベクターの増幅において、生物細胞内を経由していないため、エンドトキシン等の毒性物の混入を防ぐことが可能であり、この点においても本発明は極めて有効である。また、生物細胞を経由していないため、ＤＮＡ組み替え生物体による環境汚染を考慮する必要がない。さらに生物細胞内でのＤＮＡ増幅時には必須であった複製起点配列（Ｏｒｉ）が、本方法での増幅には必須ではない。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖がニックを有しない完全な閉環状であり、他方の鎖が少なくとも１つのニックを有するものであって、ＤＮＡ増幅方法、とくに鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法の鋳型として用いることができる。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡのニックを有する鎖は、ライゲーションにより結合する直鎖状二本鎖ＤＮＡの数などに応じて、ニックの数を調整することができ、典型的には、ニックは２以上有している。また本発明の環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合、ニックを有する鎖におけるニック間のＤＮＡ鎖が、ＤＮＡの増幅反応（鎖置換型ＤＮＡ合成）において、初期プライマーとして働く。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡは、例えば、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない少なくとも１種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を含む、１種または２種以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションすることによって製造することができる。

ライゲーションする直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が１種の場合、例えば、出発材料となる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の両末端を平滑化し、さらに脱リン酸化し、その後に、一方の末端近傍（必要に応じて、近傍でなくてもよい）を、平滑末端に消化する制限酵素で処理することによって、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態にし、これをライゲース（ligase）を用いてライゲーション（ligation）する。ライゲーション反応液には、未反応の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片、結合反応したが直鎖状のままの直鎖状二本鎖ＤＮＡ、結合反応により環状になった環状二本鎖ＤＮＡが存在する可能性があるが、適宜、直鎖状二本鎖ＤＮＡを、例えば、直鎖状ＤＮＡ特異的なエクソヌクレアーゼにより分解処理することによって、環状二本鎖ＤＮＡだけを得ることもできる。このように反応液中の直鎖状ＤＮＡを分解処理することにより、目的外のＤＮＡが増幅を実質的になくすことができ、コピー数の少ない鋳型に対しても増幅を可能にし、目的のＤＮＡだけを効率よく増幅することができる。

得られた環状二本鎖ＤＮＡは、１つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片がセルフライゲーションした場合、ニックを有する鎖に１つのニックが存在し、複数の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片がライゲーションした場合、ニックを有する鎖にライゲーションしたＤＮＡ断片の数だけニックが存在する。そしていずれの場合も、環状二本鎖ＤＮＡにおいては、一方の鎖はニックがない状態になる。

ライゲーションする直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が２種以上の場合、該ＤＮＡ断片の数だけ異なる制限酵素を用意することで目的の環状二本鎖ＤＮＡを製造することができる。以下、ＤＮＡ断片が２種の場合について、図１を用いて説明する。

まず、２種の出発材料となる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を用意し、一方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）について、制限酵素（Ｘ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）とは異なる制限酵素（Ｙ）で切断する。他方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）についても、前記制限酵素（Ｙ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）で切断する。そうすると、２種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片（Ａ、Ｂ）は両方とも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態になる（図１ａ）。なお、図１において、制限酵素（Ｘ、Ｙ）は、５’突出末端に消化するものとして示されているが、３’突出末端に消化するものであってもよい。また、例えば、一方のみが平滑末端に消化するものであってもよく、必要に応じて適宜選択して組合わせることが可能である。

得られた一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態の２種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片（Ａ、Ｂ）をライゲーションすると、図１ｂに示すとおり、基本的に、３種類のＤＮＡ結合産物が得られる。すなわち、ＤＮＡ断片（Ａ）同士がリン酸基を介して結合した直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ断片（Ｂ）同士がリン酸基を介して結合した直鎖状二本鎖ＤＮＡ、および、ＤＮＡ断片（Ａ）とＤＮＡ断片（Ｂ）とがリン酸基を介して環状に結合した環状二本鎖ＤＮＡである。したがって、ライゲーション反応液を、例えば、直鎖状ＤＮＡ特異的なエクソヌクレアーゼにより分解処理することによって、環状二本鎖ＤＮＡだけを得ることができる（図１ｃ）。得られた環状二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖にはニックがない状態、他方の鎖にはニックが２つ存在する状態になる（図１ｃ）。

ライゲーションする直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が３種の場合は、ＤＮＡ断片（Ａ）、ＤＮＡ断片（Ｂ）、ＤＮＡ断片（Ｃ）に対し、順次、制限酵素（Ｘ、Ｙ）、制限酵素（Ｙ、Ｚ）、制限酵素（Ｚ、Ｘ）の組合せとして、２種の場合と同様の手順で製造することによって、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態にし、ライゲーションすることによって所望の環状二本鎖ＤＮＡを得ることができる。ライゲーションする直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が４種以上の場合も同様である。なお、制限酵素処理、脱リン酸化処理などのうち、複数の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片に共通する処理については、同じ反応溶液内で一度に処理をすることも可能であるが、各ＤＮＡ断片ごとに処理・回収することが好ましい。

さらに、例えば、上記３種の場合の例において、ＤＮＡ断片（Ｂ）についてのみ、脱リン酸化処理を行わないことによって、ライゲーションした後のＤＮＡ断片（Ｂ）の両端にはニックが存在せず、ニックの数を３つから２つに減らすことが可能である。このようにライゲーションする直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が複数の場合、環状二本鎖ＤＮＡにおけるニックを有する鎖のニックの数を適宜調整することができる。

したがって上記のとおり、本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡを製造するための、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、典型的には、
（１）出発材料となる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の両末端を脱リン酸化する工程、
（２）工程（１）の後、制限酵素によって切断する工程
を含む方法によって製造することができる。また、本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡを製造するための直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、少なくとも１種が一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態であることが必要であるが、全種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片が前記の状態であることが好ましい。

なお、上記のとおり、本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖にはニックがない状態、他方の鎖にはニックが存在する状態となるが、従来の脱リン酸化処理およびライゲーション処理では、このような特殊な状態を生じることはなかった。つまり、従来の環状二本鎖ＤＮＡは、例えば、２種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする場合、一方のＤＮＡ断片のみの両端を脱リン酸化処理していた。このように両端を脱リン酸化したＤＮＡ断片と、両端を脱リン酸化していないＤＮＡ断片とをライゲーションする場合は、ニックが両鎖に存在することとなってしまう。

本発明にかかる鋳型となるＤＮＡ（増幅の目的ＤＮＡ）は、当該ＤＮＡを含むあらゆる試料から調製または単離したものでもよい。このようなＤＮＡを含む試料にはとくに制限はなく、ウイルス、原核生物、真核生物の個体そのものあるいはその一部が使用できる。例えば脊椎動物（人を含む）では、糞便、尿、もしくは汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、もしくは胆汁のような体液等が挙げられる。あるいは、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であっても良い。またこれら以外にも、細菌、カビ、酵母、植物、昆虫のような生物がＤＮＡ含有試料として挙げられる。また、前記試料を更に分画してその一部を取り出したものから調製したＤＮＡ含有調製物であってもよい。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡの製造において、用いる試薬、酵素等は、適宜、従来から知られているものを用いることができる。
本発明で用いる各種の制限酵素はとくに限定されないが、平滑末端に消化する制限酵素としては、例えば、ＳｍａＩやＥｃｏＲＶなどが挙げられ、５’突出末端に消化する制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩやＢａｍＨＩなどが挙げられ、３’突出末端に消化する制限酵素としては、例えば、ＰｓｔＩやＫｐｎＩなどが挙げられる。目的外結合産物の環状化を防止する点からは、複数の突出末端を用いるのが好ましく、特に平滑末端に消化する制限酵素を使用する場合、他の５’や３’突出末端に消化する制限酵素を組み合わせてが用いることが好ましい。

脱リン酸化処理には、脱リン酸化酵素が用いられ、とくに限定されないが、例えば、アンタークティックホォスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ社）、牛腸由来アルカリフォスファターゼ（各社）、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（各社）、エビ由来アルカリフォスファターゼ（各社）などを用いることができる。

ライゲーション処理には、一般に用いられているＤＮＡライゲース、例えば、Ｔ４ ＤＮＡ ライゲース（各社）、Ｅ.Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ライゲース（各社）などを用いることができる。
直鎖状ＤＮＡの分解処理には、環状ＤＮＡは分解せずに直鎖状ＤＮＡを特異的に分解する酵素、例えば、ＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼ（エクソヌクレアーゼＶ,各社）、エキソヌクレアーゼＩ(各社)、Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ（各社）などを用いることができる。とくに、直鎖状ＤＮＡの末端形状を考慮する必要性がないことから、ＡＴＰを添加した生理緩衝液（組成：３３ｍＭトリス塩酸、６６ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム）において、ＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを用いるのが好ましい。
また、各処理の後のＤＮＡの回収には、通常行われる各種のＤＮＡ精製・回収方法を用いることができる。

本発明は一態様において、前記の各工程で用いられる試薬および／または酵素を組合わせた、前記環状二本鎖ＤＮＡまたは前記環状二本鎖ＤＮＡの製造方法により製造された環状二本鎖ＤＮＡを製造するためのキットとすることができる。好ましくは、該キットは、少なくとも、生理緩衝液、ＡＴＰ、ＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを含む。また、必要に応じて、前記キットの内容を増やすことが可能である。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡは、増幅の目的となるものであり、鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法の鋳型として用いることができる。大きさは、とくに限定されないが、例えば、３０ｂｐ〜５００ｋｂｐ程度であってもよく、とくに生物細胞を経由せず試験管内で増幅できることから、数１０〜数１０００ｋｂｐのもの、さらにそれを超えるサイズのものであってもよい。

ここで鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法とは、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いるＤＮＡ増幅方法をいい、本発明に使用される鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、とくに限定されないが、例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント（Klenow fragment）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社）、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ社）等が挙げられる。さらに、本発明においては、３’−５’エクソヌクレアーゼ（exonuclease）活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が好ましく、そのような酵素としては、例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

ＤＮＡの伸長反応において使用される鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の量（濃度）は、使用する酵素の種類によって至適化することが好ましく、例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの場合、好ましくは終濃度約１〜５０ｎｇ／μｌ、より好ましくは終濃度約５ｎｇ／μｌ程度で使用する。伸張反応は、通常用いられる鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液において行うことができる。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡは、全領域が鎖置換型ＤＮＡ合成によって増幅されるが、必要に応じて、最終的な増幅の目的でない領域（目的外領域）を含んでいてもよい。このように最終的な増幅の目的でない領域を含む場合は、増幅反応後、適宜、当該目的外領域を制限酵素などにより切り出して除くことにより、目的のＤＮＡ増幅産物を得ることができる。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡを用いたＤＮＡ増幅方法においては、ニックを有する鎖におけるニック間のＤＮＡ鎖が、鎖置換型ＤＮＡ合成において、プライマーとして働くが、さらに合成を促進するために、ＤＮＡプライマー、ＲＮＡプライマー、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマー、ＤＮＡ/ＲＮＡキメラプライマーの各種プライマーを用いることができるが、ＲＮＡを含有するプライマーが好ましい。とくに５’末端から少なくとも１塩基がＲＮＡであるプライマーが、プライマー同士のセルフアニールによる目的外ＤＮＡの増幅を低減させるため、陰性対照(ネガティブコントロール)の設定の簡便さなどの観点から好ましい。また、リン酸結合をチオホスフェート結合に置換したＲＮＡプライマーもまた、長時間の反応時におけるプライマー劣化の防止などの観点から好ましく用いられる。

また、プライマーはＤＮＡ増幅の目的・用途などから、鋳型のＤＮＡ配列の一部に特異的に結合する鋳型ＤＮＡ特異的プライマーやランダムプライマーを用いることできる。とくに、プライマー由来の非特異的ＤＮＡ増幅の防止およびプライマー配列の汎用性の観点から、ランダムＲＮＡプライマーが好ましい。
プライマーの長さは、とくに限定されないが、長すぎるとプライマーの二次構造によるアニーリング効率の低下があり、短すぎるとプライマーの融解温度（Ｔｍ）の低下によるアニーリング効率の低下があるため、例えば、６〜５０塩基、好ましくは６〜３０塩基、とくに好ましくは６〜７塩基の長さである。

本発明は一態様において、前記試薬および／または酵素を組み合わせた、本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡを鋳型とする鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法のためのキットとすることができる。好ましくは、該キットは、少なくとも、ＲＮＡプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素および鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液を含む。また、必要に応じて、前記キットの内容を増やすことが可能である。

本発明にかかる環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法では、ニックを有する鎖におけるニック間のＤＮＡ鎖が、ＤＮＡの増幅反応（鎖置換型ＤＮＡ合成）において、初期プライマーとして働く。したがって、ＤＮＡの伸張反応によってニックの位置からＤＮＡが合成されていき（図１ｄ）、鋳型の環状二本鎖ＤＮＡの配列が、樹状構造状に１０^５〜１０^１３回程度繰り返した配列（図１において、断片Ａを複製した領域と断片Ｂを複製した領域との組合せ、すなわち環状二本鎖ＤＮＡの全複製を１単位として樹状構造状に１０^５〜１０^１３回程度繰り返した配列）を有するＤＮＡ増幅産物が産生する。さらにこのＤＮＡ増幅産物に、プライマーがアニールし、ＤＮＡの伸張反応が起こり、ＤＮＡをさらに増幅することができる。

産生したＤＮＡ増幅産物は、適宜、所望の断片に切断することにより、種々の用途に用いることができる。また切断後ライゲーションして環状化することにより、鋳型となった環状二本鎖ＤＮＡの複製を大量に得ることも可能である。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。

［実施例１］ ｐＵＣ１９（２．７ｋｂｐ）およびラムダＤＮＡの断片（１５．６ｋｂｐ）の結合産物の製造およびその増幅
プラスミドＤＮＡであるｐＵＣ１９は制限酵素ＢａｍＨＩで、ラムダＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩで切断処理をそれぞれの至適反応液中で３７℃３時間行った。各制限酵素処理液を熱処理により、酵素を失活させた後、牛腸由来アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社）を用いて、至適反応液中において脱リン酸化反応を３７℃１時間行った。

脱リン酸化反応産物は熱処理により酵素を失活させた後、フェノール/クロロフォルム処理後、エタノール沈殿により精製後、ｐＵＣ１９はＥｃｏＲＩでラムダＤＮＡはＢａｍＨＩを用い、それぞれ至適反応液中で、３７℃２時間切断処理を行った。切断反応後、それぞれのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動により、目的ＤＮＡ断片を分離し、目的ＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片を濃度決定の後、それぞれ１×１０^８コピー／マイクロリットルになるように調整し、ＤＮＡ結合反応をＴ４ ＤＮＡ ライゲース（ニューイングランドバイオラブス社）を用いて、２５℃６０分間行った。

熱処理によりＴ４ ＤＮＡ ライゲースを失活後、滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、希釈液２マイクロリットルをＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼ（エピセンチャー社）およびエクソヌクレアーゼＩ（ニューイングランドバイオラブス社）を用いて、直鎖状ＤＮＡ断片の除去処理を至適反応液中で３７℃４時間行った。熱処理により酵素を失活後、滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、希釈液２マイクロリットルを増幅反応の鋳型ＤＮＡ溶液として、チオホスフェート結合ランダムＲＮＡプライマー（６Ｒ５Ｓ：６ｍｅｒのＲＮＡプライマーでＲＮＡ間が全て（５箇所）チオホスフェート結合であるもの）を用いたＭＰＲＣＡ法により増幅反応を３０℃１６時間行った。

熱処理により酵素を失活させた後、増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＶで３７℃１時間処理し、目的のＤＮＡ断片が増幅されているかどうかをアガロースゲル電気泳動により確認した。なお、確認のための制限酵素地図および制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した場合の予想断片の大きさを図２に示す。目的のＤＮＡ断片が適切に増幅されている場合、ＥｃｏＲＶ消化による６．７ｋｂｐの断片が現れる。増幅産物を各種の制限酵素で消化し、電気泳動により確認を行った。結果を図３に示す。

図３に示すとおり、目的のＤＮＡが合成されたことを示す６．７ｋｂｐのＥｃｏＲＶ処理断片が得られた。また各種の制限酵素処理による断片長も予想のものと一致した。さらに目的外増幅産物は見られず、良好なＤＮＡ増幅が行われたことが示された。

本発明の環状二本鎖ＤＮＡの製造方法および製造された環状二本鎖ＤＮＡを用いたＤＮＡ増幅方法を示す模式図である。 本発明の一実施態様である環状二本鎖ＤＮＡの制限酵素地図および制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した場合の予想断片の大きさを示す説明図である。 本発明の一実施態様におけるチオホスフェート結合ＲＮＡプライマー（６Ｒ５Ｓ）を用いたＭＰＲＣＡ法によるＤＮＡ増幅を確認した電気泳動写真である。種々の制限酵素処理の後に電気泳動を行った。ＵＤ：制限酵素処理をしていない増幅産物。Ｅ：ＥｃｏＲＩで切断。ＢＥ：ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断。ＥＶ：ＥｃｏＲＶで切断。ＮＬ：ライゲーション処理を行っていないもの。ＮＴ：ＤＮＡ無添加。ＬＰ：直鎖状のｐＵＣ１９（１００ｎｇ）。ＬＦ：ラムダＤＮＡ（１５．７ｋｂｐ）（１００ｎｇ）。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡラダーマーカー。矢印は、目的のＤＮＡから切り出される６．７ｋｂｐのＥｃｏＲＶ処理断片の位置を示す。

Claims (12)

1. 鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖ＤＮＡを製造する方法であって、
   直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の両末端を脱リン酸化し、制限酵素でこれを切断することによって、一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を得ること、および、
   得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を少なくとも１つ含む、１または２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションすること
   を含む、前記方法。
2. ２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片のいずれをも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片とする、請求項１に記載の方法。
3. さらに、ライゲーションの後に反応液中の直鎖状ＤＮＡを分解処理する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を用いて鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖ＤＮＡを製造する方法であって、
   （１）一方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素（Ｘ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）と異なる制限酵素（Ｙ）で切断する工程、
   （２）他方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を前記制限酵素（Ｙ）で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素（Ｘ）で切断する工程、
   （３）工程（１）および（２）で得られた２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする工程、および
   （４）反応液中の直鎖状ＤＮＡを分解処理する工程、
   を含む、前記方法。
5. 請求項３または４に記載の方法により製造された環状二本鎖ＤＮＡからなる、鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅反応用の鋳型ＤＮＡの溶液。
6. 請求項３または４に記載の方法により製造された環状二本鎖ＤＮＡからなる、鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅反応用の鋳型ＤＮＡの溶液を製造するためのキットであって、
   少なくとも、生理緩衝液、ＡＴＰ、ＲｅｃＢＣＤヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを含む、前記キット。
7. 請求項５に記載の鋳型ＤＮＡの溶液に含まれる環状二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマー、ＲＮＡプライマーまたはＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマーとして用いてなる、鎖置換型ＤＮＡ合成によりＤＮＡを増幅する方法。
8. プライマーの５’末端から少なくとも１塩基がＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
9. プライマーが、鋳型ＤＮＡ特異的プライマーである、請求項７または８に記載の方法。
10. プライマーが、ランダムプライマーである、請求項７または８に記載の方法。
11. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載の鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法のためのキットであって、少なくとも、ＲＮＡプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素および鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液を含む、前記キット。
12. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載の鎖置換型ＤＮＡ合成によるＤＮＡ増幅方法によって増幅されたＤＮＡ増幅産物であって、
    鋳型の環状二本鎖ＤＮＡの配列が、樹状構造状に１０^５〜１０^１３回繰り返した配列を有する、前記ＤＮＡ増幅産物。

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