JP5504797B2

JP5504797B2 - 核酸増幅器

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Publication number: JP5504797B2
Application number: JP2009225967A
Authority: JP
Inventors: 中島　　隆
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: JP2011072234A

Description

本発明は、蛍光物質の蛍光を利用して被検出物を検出する検出機及びこの検出機を適用した核酸増幅機に関するものである。

従来、酵素反応を用いた生化学的分析や、抗原抗体反応を用いた免疫学的分析、核酸増幅反応を用いた分子生物学的分析等が広く行われている。このような分析においては、試料に含まれるウイルスや微生物等を検出するため、さまざまな検出機が用いられている。例えば、特許文献１には、核酸増幅反応によって標的核酸と結合すると発光するINAFプローブを使用し、標的核酸を検出する核酸検出機が提案されている。この核酸検出機は、容器に収容された試料に温度サイクルを施して標的核酸を増幅させ、光源により容器の下方から励起光を照射すると標的核酸に結合したINAFプローブが発光する。この光を容器下方の光センサで検出して分析することにより標的核酸を検出する。

特開２００９−７７６３９号公報

しかしながら、上記検出機においては、光センサによって検出された光にノイズが多く含まれており、高い精度の分析結果が得られないため、標的核酸を正確に検出することが困難であるという問題がある。

そこで、本発明は、被検出物を正確に検出することが可能な検出機を提供することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、検出に際して発生するノイズが容器表面における励起光の反射に起因するということを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係る検出機は、透明な容器内における蛍光物質の蛍光を利用して被検出物を検出する検出機であって、容器内の蛍光物質を励起するために容器に光を照射する光源と、前記光源が照射した光により励起された容器内の蛍光物質が基底状態に戻る際、蛍光物質から発生する蛍光を検出する光センサと、を備え、前記光センサは、蛍光物質の蛍光を検出可能であるとともに、前記光源により照射される光のうち直進光及び容器表面で反射した反射光を検出しないよう配置されている。

上記検出機は、光源から容器に対して光を照射して容器内の蛍光物質を励起し、蛍光物質から発生した蛍光を光センサによって検出する。この光センサは、容器内における蛍光物質の蛍光を検出可能であるとともに、光源が照射した照射光のうち、直進光及び容器表面で反射された反射光を検出しない位置に配置されている。このため、上記光センサは、容器内において発生した蛍光物質の蛍光のみを検出することができる。このように、上記検出機は、容器内の蛍光物質の蛍光のみを検出することができるため、蛍光の検出精度を高めることができ、容器内の被検出物を正確に検出することができる。

上記検出機は、容器側方において複数の光源が容器の軸方向に並べられていてもよい。これにより、容器に対する光の照射面積が拡大され、容器内においてより多くの蛍光物質を発光させることができる。

上記検出機において、容器は角柱状であることが好ましい。この構成によると、容器内の蛍光物質から発生した蛍光が容器を透過する際に拡散するのを抑えることができるため、光センサが効率よく蛍光を検出することができる。なお、上記角柱状とは、例えば多角柱や断面星型形状等、種々の形状を含む概念であるが、より好ましくは四角柱状である。

上記検出機において、容器が角柱状の場合、この容器の一側面に光が照射されるよう光源を配置することもできる。この場合、容器の一側面及びこの一側面に対向する側面以外の側面から容器の外側に向かって引いた垂線上に光センサが配置されていることが好ましい。このような構成により、容器側面を透過した蛍光物質の蛍光が光センサに直接照射され、より効率よく蛍光を検出することができる。

上記検出機は、容器内の核酸を加熱及び冷却して増幅させるための核酸増幅機に適用することもできる。この核酸増幅機は、中空のケーシングを備え、このケーシングには容器を保持するための保持孔が形成されている。この保持孔に保持された容器内の被検出物を加熱する場合は、熱風発生器のヒーターをＯＮにし、ファンを駆動してケーシング内の空気を排出口からケーシングの外へと排出する。これにより、ケーシングの外の気圧に比べてケーシング内の気圧が低くなるため、ケーシングの外の空気がヒーターにより加熱されながら熱風発生器を介してケーシング内へと流れ込み、ケーシング内に高温の空気が充填される。一方、容器内の被検出物を冷却する場合は、ヒーターをＯＦＦにし、ファンを駆動してケーシング内の空気をケーシングの外へと排出すると、ケーシングの外の空気が熱風発生器を介してケーシング内へと流れ込み、ケーシング内に常温の空気が充填される。このように、上記核酸増幅機は、ケーシング内を高温及び低温にすることができるため、保持孔に保持された容器内の被検出物を加熱及び冷却して核酸増幅反応を生じさせることができ、反応後の被検出物を上述したような検出機によって検出することができる。

本発明によれば、被検出物を正確に検出することができる。

本発明の一実施形態に係る装置の概略平面図である。同実施形態に係る装置の正面断面図である。同実施形態に係る核酸増幅機及び検出機の概略正面断面図である。同実施形態に係る検出機の（ａ）概略斜視図、及び（ｂ）概略平面図である。同実施形態に係る分注チップの正面断面図である。同実施形態に係る反応容器の正面断面図である。同実施形態に係る分注チップ及び反応容器の正面断面図である。同実施形態に係る分注器の正面図である。同実施形態に係る分注器及び分注チップの正面図である。

以下、本発明に係る検出機及び核酸増幅機を核酸検出装置に適用した場合の一実施形態について図面を参照しつつ説明する。なお、説明の便宜上、図１において下側を手前、上側を奥と称することとする。

本実施形態に係る核酸検出装置１は、図１及び図２に示すように、容器内の試料における核酸増幅反応を生じさせるための核酸増幅機６、及び試料中の核酸を検出するための検出機７を備えている。また、この装置１は、各種容器を保持するラック２、試料及び試薬を分注する分注器３、分注器３を移動させる移動手段４、容器内の試料及び試薬に遠心力を加えるための遠心機５、及び使用済みの分注チップ等を廃棄するための廃棄ボックス１２をさらに備えている。

核酸増幅機６は、図２及び図３に示すように、ケーシング６１、空気を加熱するための熱風発生器６４、及びケーシング６１内の空気を排出するためのファン６５を備えている。ケーシング６１は、上端が開口した有底円筒状のチャンバ６１１と、このチャンバ６１１の開口を覆うように配置されたターンテーブル６１２とを有している。このターンテーブル６１２は、中心軸周りに回転可能であり、後述する反応容器１１を保持するための第２の保持孔６２が同一円周上に複数形成されている。この第２の保持孔６２に反応容器１１を保持すると、反応容器１１の貯留部１１２はチャンバ６１１内に配置されるようになっている。また、ターンテーブル６１２の中央部には、チャンバ６１１内の空気を排出するための円形の排出口６３が形成されている。なお、チャンバ６１１の寸法としては直径６８〜１０６ｍｍ、高さ４５〜７０ｍｍであることが好ましく、この場合、ターンテーブル６１２の排出口６３は直径５０〜６５ｍｍであることが好ましい。熱風発生器６４は、円筒状に形成され、内側にヒーター６４１を有している。この熱風発生器６４は、上端部がターンテーブル６１２の上方に突出するよう排出口６３の内側に設置され、下端部がチャンバ６１１内に開口している。ファン６５は、チャンバ６１１内において熱風発生器６４の下方に設置され、チャンバ６１１内の空気を排出口６３から吹き出すことができるよう構成されている。

検出機７は、図１に示すように、核酸増幅機６の右側に配置された照射部７１と、核酸増幅機６の奥側に配置された光センサ７２とを備えている。照射部７１は、図４に示すように、反応容器１１の貯留部１１２に励起光を照射するための複数の光源７１１を有している。この光源７１１は、反応容器１１の軸方向と平行に並ぶよう配置されており、反応容器１１の四角柱状の貯留部１１２の第１の側面１１４に向かって励起光を照射する。さらには複数の光源光束を反応容器１１の軸方向の直線に集光するために、シリンドリカルレンズなどを使用することが好ましい。光センサ７２は、上記第１の側面１１４に隣接する第２の側面１１５に対向するよう配置されており、反応容器１１内で発生し第２の側面１１５を透過した蛍光を検出する。なお、光源７１１としてはＬＥＤ等を使用することができ、光センサ７２としてはフォトダイオード等を使用することができる。

ラック２は、図１に示すように、手前から奥へと順に、試料及び試薬を分注するための分注チップ８、試料が収容された試料容器９、第１〜第３の試薬が収容された試薬容器１０１〜１０３、空の反応容器１１がそれぞれ１６本ずつ載置されている。

分注チップ８は、図５に示すように、略円錐筒状に形成されており、後述する分注器３の先端部に装着可能なよう上端が開口している。また、分注チップ８は、試料や試薬を吸引及び吐出可能なよう下端に吐出孔８１を有しており、吸引した試料や試薬を内部に保持することができるよう構成されている。この分注チップ８は、保持した試料及び試薬の飛散を防止するために上部が通気性のフィルタで覆われていることが好ましい。

反応容器１１は、図６に示すように、下端が閉じ、分注チップ８を内部に挿入可能なよう上端に開口１１１が形成されている。この反応容器１１は、下部に試料及び試薬を貯留するための細長い貯留部１１２が形成され、上部には分注チップ８を収容するための収容部１１３が形成されている。反応容器１１は、図７に示すように、分注チップ８が挿入された場合に分注チップ８によって開口１１１が封鎖され、かつ分注チップ８と互いに嵌合するよう構成されている。なお、反応容器１１の材料としては、熱可塑性樹脂又はガラスが好ましいが特に限定されず、熱可塑性樹脂の場合は、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルのいずれか、又はこれらのうち２種以上から成るポリマーアロイ若しくはポリマーブレンドであることが好ましい。

分注器３は、図８に示すように、例えばシリンジやピペットといった一般的な分注機構３１を有しており、この分注機構３１により先端部に分注チップ８が装着された状態で試料や試薬を吸引及び吐出する（図９）。また、分注器３は、上下に移動可能な円筒部３２を先端部に有しており、この円筒部３２が下方に移動して先端部に装着された分注チップ８を押し下げることで分注チップ８を取り外すことができるよう構成されている。

移動手段４は、図１及び図２に示すように、奥行き方向に延びるＹ軸アーム４ｙ、幅方向に延びＹ軸アーム４ｙの表面を奥行き方向に摺動するＸ軸アーム４ｘ、及び高さ方向に延びＸ軸アーム４ｘの表面を幅方向に摺動するＺ軸アーム４ｚを備えており、このＺ軸アーム４ｚに上下に移動可能なよう分注器３が取り付けられている。このような構成により、移動手段４は分注器３を奥行き方向、幅方向、及び高さ方向に自在に移動させることができる。

遠心機５は、遠心力によって反応容器１１内の試料及び試薬を下端へと移動させるものであり、図１に示すように、ラック２の奥側に設置されている。遠心機５の実施形態は特には限定されないが、例えば、図２に示すように、遠心機５は、反応容器１１を保持するための第１の保持孔５３１が複数形成された回転部５３を有しており、この回転部５３が駆動部５２により回転する回転軸５１に取り付けられていてもよい。

次に、核酸検出装置１の作動について説明する。

まず、ラック２に保持されているある一つの分注チップ８を使用して、この分注チップ８と同列に並ぶ試料容器９及び第１〜第３の試薬容器１０１〜１０３からこれらと同列に並ぶ反応容器１１に試料及び試薬を分注する。詳述すると、移動手段４のＸ軸アーム４ｘをＹ軸アーム４ｙに沿って装置１の奥行き方向に移動させ、Ｚ軸アーム４ｚをＸ軸アーム４ｘに沿って装置１の幅方向に移動させることにより、ラック２に保持された分注チップ８の上方に分注器３を移動させる。この分注器３をＺ軸アーム４ｚに沿って下降させて分注器３の先端部を分注チップ８内に挿入し、分注器３の先端部に分注チップ８を装着する（図９）。次に、移動手段４により、分注チップ８が装着された分注器３をラック２上の試料容器９まで移動させ、分注器３の分注機構３１により吐出孔８１から分注チップ８内に試料容器９内の試料を一定量吸引する。吸引した試料を分注チップ８内に保持したまま、分注器３を移動手段４によりラック２上の第１〜３の試薬容器１０１〜１０３に移動させ、分注機構３１によりこの第１〜３の試薬容器１０１〜１０３内の第１〜３の試薬を分注チップ８内に順に吸引する。その後、分注チップ８内に試料及び第１〜３の試薬を保持した状態で移動手段４により分注器３を反応容器１１まで移動させ、分注器３先端部の分注チップ８を反応容器１１に挿入して分注チップ８と反応容器１１とを互いに嵌合させるとともに、分注チップ８の吐出孔８１より反応容器１１内に試料及び第１〜第３の試薬を吐出する。

次に、移動手段４により、反応容器１１及び分注チップ８が装着された分注器３を遠心機５まで移動させ、第１の保持孔５３１に反応容器１１を挿入し、分注器３から分注チップ８を取り外して分注器３のみを上昇させる。そして、遠心機５の駆動部５２を駆動して回転部５３を回転させ、反応容器１１内の試料及び第１〜第３の試薬に遠心力を加えることで、上記試料及び第１〜第３の試薬を反応容器１１の下端側へと移動させて貯留部１１２に充填する。その後、分注器３を下降させて分注器３の先端部に分注チップ８を再度装着する。

次に、移動手段４により、反応容器１１及び分注チップ８が装着された分注器３を核酸増幅機６まで移動させ、第２の保持孔６２に反応容器１１を挿入し、分注器３から分注チップ８及び反応容器１１を取り外して分注器３のみを上昇させる。

このような手順を繰り返し、核酸増幅機６に試料及び試薬が収容された反応容器１１を必要な数だけセットする。その後、以下に詳述するように、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程から成る核酸増幅反応を行い、蛍光物質によって標識された標識プローブを用いて標的核酸の検出を行う。なお、蛍光物質としては、例えば、標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光するものを用いることができ、フルオロセイン又はその誘導体や、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体といった標識プローブ末端においてグアニンとシトシンとの塩基対形成時に消光するものが好ましい。

変性工程においては、熱風発生器６４のヒーター６４１をＯＮにし、ファン６５を駆動することでチャンバ６１１内の空気をターンテーブル６１２の排出口６３より排出する。これにより、チャンバ６１１内の気圧が低くなるため、チャンバ６１１の外の空気がヒーター６４１により加熱されながら熱風発生器６４の内側を通ってチャンバ６１１内へと導入される。このようにして、チャンバ６１１内の温度を所定の温度（９０〜１０５℃）まで上昇させ、第２の保持孔６２に保持されている反応容器１１内の試料を加熱することにより、反応容器１１内の試料に含まれる二重鎖核酸が一重鎖に解離する。

アニーリング工程では、ヒーター６４１をＯＦＦにし、ファン６５を駆動することでチャンバ６１１内の高温の空気を排出口６３より排出する。これにより、チャンバ６１１の外の常温の空気が熱風発生器６４を介してチャンバ６１１内へと導入される。このようにして、チャンバ６１１内の温度を所定の温度（３５〜６５℃）まで低下させ、反応容器１１内の試料を冷却することにより、反応容器１１内における試料中の各一重鎖核酸の５’末端にプライマーがアニーリングする。このとき、試料中に標的核酸が存在する場合は、標識プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションする。チャンバ６１１内の温度を上述した所定の温度（３５〜６５℃）に保った状態で一定時間（０．０１〜５分）が経過した後、照射部７１の光源７１１により反応容器１１の第１の側面１１４に励起光を照射する。標識プローブは標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光する性質を有するため、反応容器１１内においては標的核酸とハイブリダイゼーションしていない標識プローブのみが励起されて蛍光を発生させる。この蛍光のうち、反応容器１１の第２の側面１１５を透過したものが光センサ７２により検出される。その後、ターンテーブル６１２を回転させ、別の第２の保持孔６２に保持された反応容器１１に対しても光の照射及び蛍光の検出を行う。

伸長工程では、変性工程と同様にして、チャンバ６１１内の温度を所定の温度（４０〜８０℃、好ましくは４５℃〜７５℃）まで上昇させて反応容器１１内の試料を加熱すると、反応容器１１内において一重鎖核酸の５’末端にアニーリングしているプライマーが伸長して二重鎖核酸の複製物が生成される。このとき、標的核酸にハイブリダイゼーションしていた標識プローブは標的核酸から解離する。

以上のような変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を繰り返すことにより、反応容器１１の試料中の核酸は増幅される。試料中に標的核酸が含まれている場合は標的核酸も増加するため、アニーリング工程において標的核酸にハイブリダイゼーションする標識プローブの数が増加し、光センサ７２によって検出される蛍光量が減少する。この蛍光量の減少により、反応容器１１内の試料に含まれる標的核酸の有無を判断する。

核酸の検出終了後、核酸増幅機６の第２の保持孔６２内の反応容器１１及び分注チップ８を分注器３の先端部に再び装着し、移動手段４により分注器３を廃棄ボックス１２まで移動させ、分注チップ８及び反応容器１１を分注器３から取り外して廃棄ボックス１２内に廃棄する。

以上のように、上記実施形態によれば、反応容器１１の貯留部１１２は四角柱状に形成されており、この貯留部１１内の蛍光物質に蛍光を生じさせるために第１の側面１１４に向かって光源７１１により光が照射される。発生した蛍光を検出するための光センサ７２は、第１の側面１１４に隣接する第２の側面１１５に対向して配置されている。このため、光源７１１により照射した光のうち、貯留部１１２を通過して直進した直進光や第１の側面１１４で反射した反射光が光センサ７２に照射されることがなく、光センサ７２は、貯留部１１２内で発生し第２の側面１１５を透過した蛍光のみを検出することができる。これにより、蛍光の検出精度が向上し、核酸を正確に検出することができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である。例えば、上記実施形態に係る検出機７は、複数の光源７１１が反応容器１１の軸方向と平行に並べられていたが、容器に光を照射することができればこれに限定されず、例えば、容器の軸方向に円弧状や稲妻状に並べられた複数の光源によって容器に光を照射してもよいし、また、一つの光源によって光を照射してもよい。

また、上記実施形態に係る検出機７において、光センサ７２は、光が照射される第１の側面１１４に隣接する第２の側面１１５に対向するよう配置されていたが、容器内で発生した蛍光を検出可能であって、光源により照射された光のうち、直進光及び容器表面で反射した反射光が検出されない位置に配置されていればこれに限定されない。例えば、検出に際し、同一水平面上において光源、容器及び光センサを結ぶ線が鋭角又は鈍角を成すよう、光源及び光センサを配置することもできるし、また、光源を容器下方に配置するとともに光センサを容器側方に配置することもできる。

上記実施形態に係る核酸増幅機６は、ターンテーブル６１２の上面に蓋が設置されていなかったが、これに限定されず、ケーシングの保持孔に容器を挿入可能な貫通孔が形成された蓋が設置されていてもよい。

また、上記実施形態に係る核酸増幅機６は、第２の保持孔６２に反応容器１１が保持された際、反応容器１１の下端部のみがケーシング６１内に配置されていたが、容器内の被検出物を加熱又は冷却することができればこれに限定されず、容器全体がケーシング内に配置されるよう構成されていてもよい。

また、上記実施形態においては反応容器１１の下部が四角柱状に形成されていたが、これに限定されず、円柱状や多角柱状等、種々の形状に形成することもできる。また、容器全体が円柱状や多角柱状に形成されていてもよい。

また、上記実施形態においては本発明に係る検出機により核酸を検出していたが、これに限定されるものではなく、例えば、光センサとして分光光度計を用いて中性脂肪やコレステロール等を検出することもできる。

６核酸増幅機
６１ケーシング
６２保持孔
６３排出口
６４熱風発生器
６４１ヒーター
６５ファン
７検出機
７１１光源
７２光センサ
１１容器

Claims

透明な容器に収容された核酸を増幅させるための核酸増幅機であって、
前記容器内における標識プローブの蛍光を利用して標的核酸を検出する検出機と、
容器下部が内部に配置されるよう容器を保持する少なくとも一つの保持孔、及び内部の空気を排出するための排出口が形成されている中空のケーシングと、
一方端が前記ケーシング内に開口し、内部にヒーターを有する筒状の熱風発生器と、
前記ケーシング内に取り付けられ、前記ケーシング内の空気を前記排出口から吹き出すファンと、を備え、
前記容器は角柱状であり、
前記検出機は、
前記容器内の標識プローブを励起するために前記容器の一側面に光を照射する光源と、
前記一側面及び前記一側面に対向する側面以外の側面から前記容器の外側に引いた垂線上に配置されて、前記光源が照射した光により励起された前記容器内の標識プローブが基底状態に戻る際、標識プローブから発生する蛍光を検出する光センサと、を備え、
前記光センサは、前記容器内の標識プローブの蛍光を検出可能であるとともに、前記光源により照射される光のうち、直進光及び前記容器表面で反射した反射光を検出しないよう配置され、
前記ヒーター及び前記ファンの駆動が切り替えられることで、前記ケーシング内の空気を前記排出口から排出して、前記ケーシングの外の空気を前記ヒーターに加熱させながら前記ケーシング内に導入して、前記ケーシング内の温度を上昇させた後、前記ケーシング内の高温の空気を前記排出口から排出して、前記ケーシング内の外の常温の空気を前記ケーシング内に導入することで、前記ケーシング内の温度を低下させることが可能とされ、
前記光源は、前記ケーシング内の温度が低下した状態で前記容器に光を照射し、
前記光センサは、前記光の照射により前記標的核酸とハイブリダイゼーションしていない前記標識プローブから発生された蛍光を検出する核酸増幅機。
前記光源は、前記容器側方において前記容器の軸方向に並ぶよう複数設置されている、
請求項1に記載の核酸増幅機。