JP5426535B2

JP5426535B2 - 生物学的界面活性剤の消炎剤および組織保存液としての用途

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Publication number: JP5426535B2
Application number: JP2010508300A
Authority: JP
Inventors: スンヨンソン; チャンクカン; ヨンヘキム
Original assignee: ソウルナショナルユニヴァーシティーインダストリーファンデーション
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2028-05-14
Also published as: EP2633859B1; CN101678045B; US9272047B2; WO2008140262A3; CN101678045A; ES2604465T3; KR100785656B1; EP2152279A4; EP2152279A2; US20100267684A1; JP2010536716A; WO2008140262A2; EP2633859A1

Description

本発明は、生物学的界面活性剤の消炎剤および組織保存液としての用途に関する。より詳しくは、本発明は、炎症誘発因子を乳化させて前記炎症誘発因子と受容体との反応を遮断する生物学的界面活性剤を含む消炎剤および組織保存液に関する。

先天性免疫メカニズムは、病原体感染に対して第１次防御役割を果たすと同時に、組織損傷を認識し且つ損傷組織を復旧する中枢的役割を果たす。そして、先天性免疫メカニズムは、マクロファージや樹枝状細胞などの特定細胞、および補体系や凝固系などの体液性因子によって媒介される。

特に、先天性免疫システムにおいて、炎症反応は、細菌内毒素および組織損傷により発生する生体内防御メカニズムであって、炎症細胞（マクロファージ、樹枝状細胞など）および炎症誘導サイトカイン（インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−αなど）の増加、発熱、組織液の局所的浸出、組織回復のための線維増生などを伴う。このような炎症細胞の活性化は、炎症誘導サイトカインの産生だけでなく、炎症細胞遺伝子の転写調節に関与する核転写因子の発現や、炎症細胞の活性化に関与する共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）または主要組織適合複合体（ＭＨＣ；major histocompatibility complex）の発現などによって確認される。

また、先天性免疫メカニズムにおける抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの炎症細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞によって誘発される後天性免疫メカニズムの活性化を直接的または間接的に誘導する。そして、全身炎症反応で活性された後、後天性免疫反応は炎症反応を悪化させたりもする。

先天性免疫システムの異常活性化と炎症反応を誘発しうる物質として、毒素（内毒素または外毒素）がある。大腸菌糖脂質などの内毒素は、親水性部位と疎水性の脂質部位を両方有する両親媒性分子であって、グラム陰性菌の細胞壁を構成する主要物質である。

特に内毒素の脂質部位は、疎水性が強く、細胞毒性の誘導に重要な役割を果たすものと知られている。よって、内毒素によって様々な疾患が誘発されるが、特に敗血症はＥＲ(emergency room)内において、或いは手術中に深刻な問題を引き起こすおそれがある。

敗血症は、細菌の内毒素が血管に沿って循環し、血液および様々な臓器に深刻な炎症反応を誘発し、例えば発熱、嘔吐、下痢、血圧降下、頻呼吸、頻脈、頻尿、昏迷などの症状を誘発する。

敗血症は、先進国における３番目の主要死亡原因である。米国では、毎年７５０，０００名以上の敗血症患者が発生し、死亡者全体の９％を占める。

また、グラム陽性菌またはグラム陰性菌が菌体の外に排出する外毒素も炎症を誘発する。外毒素は、タンパク質からなっており、ジフテリア菌、破傷風菌、ボツリヌス菌などの代謝過程中に生成して放出する。赤痢菌、連鎖球菌等もこれと類似の毒素を生成する。

異常な先天性免疫活性による炎症反応は、臓器移植においても重要な問題として台頭しているが、豚の細胞をヒトに移植する段階で発生する免疫拒否反応がその一つである。このような免疫拒否反応は、血液に存在する自然抗体だけでなく、手術過程中に発生する損傷組織によっても活性化され、深刻な炎症反応を伴いながら組織を壊死させる。

特に、供与者から臓器を摘出するときの虚血による無酸素症、患者に臓器を移植する前の臓器保存過程中の損傷、および再潅流後の活性酸素の生成および炎症反応の増加による臓器損傷が主な問題として台頭してきた。

したがって、移植臓器の損傷および免疫拒否反応を最小化することが可能な臓器保存液が必要である。現在商業的に様々な臓器保存液、例えば米国ウィスコンシン大学のウィスコンシン溶液またはドイツで開発されたＨＴＫ(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate)溶液が使用できる。臓器保存液は、供与者から臓器を摘出する前に潅流液として注入され、或いは患者に臓器を移植する前に臓器を保存するために使用される。ところが、従来の臓器保存液は、臓器移植の際に損傷した臓器によって誘導された炎症反応を抑えるのには限界があった。

このように炎症反応を制御することは、臓器移植だけでなく、炎症性疾患において重要な課題である。

従来の消炎剤および炎症抑制効果のある免疫抑制剤は、効果が局所的であったり、持続的な投与が必要であるという欠点がある。また、消炎剤投与の際に様々な副作用が現れるという欠点もある。

非ステロイド性炎症治療剤（ＮＳＡＩＤ）としてのＶｉｏｘｘ^(R) は、関節炎治療剤としても使用されるが、臨床試験の結果、心臓病発病率を２倍高めるものと報告された。よって、Ｖｉｏｘｘ^(R)と類似の炎症抑制メカニズムを持つ他の薬物に対してもその安全性が検討されている。

ステロイド系炎症治療剤の場合にもやはり副作用が発生する。このようなステロイド系薬物を炎症治療剤として乱用する場合、体内抵抗力が減少して例えば糖尿病、骨粗しょう症などの疾患に敏感になる。

また、最初に商業化された敗血症治療剤としてのＸｉｇｒｉｓ^(R)は、凝血過程に介入するため、深刻な出血または脳卒中を誘発するおそれがある。

特許文献１および特許文献２は、グリココール酸ナトリウムおよびその誘導体を開示している。ところが、これらの特許文献は、グリココール酸ナトリウムの薬物伝達能向上剤としての用途を開示しているばかりで、消炎剤としての用途については開示していない。

また、Ｍ．Ｋａｔｓｒｍａらは、結腸内薬物伝達能の向上に関する研究において、グリココール酸ナトリウムまたはポリエチレンオキシドをインスリンと共に投与と、インスリンの結腸内吸収が向上することを報告している（非特許文献１）。ところが、Ｍ．Ｋａｔｓｒｍａらも、グリココール酸ナトリウムおよびその誘導体の消炎効果については開示していない。

したがって、当該技術分野では、従来の消炎剤の欠点を補完して炎症性疾患の治療効果を高めることが可能な新規薬物の開発が切実に要求されている。

米国特許第５，２８３，２３６号明細書米国特許第５，６５８，８７８号明細書

International Journal of Pharmaceutics, 2006, pp.156-162

したがって、本発明の主要な目的は、炎症誘発因子を乳化させて前記炎症誘発因子と受容体との反応を遮断する生物学的界面活性剤を含む消炎剤を提供することである。

本発明の他の目的は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、これらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物、およびこれらの薬学的に許容される塩から選ばれる一つまたはそれ以上の生物学的界面活性剤を含む、組織または細胞保存溶液用添加物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、これらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物、およびこれらの薬学的に許容される塩から選ばれる一つまたはそれ以上の生物学的界面活性剤を含む、敗血症治療剤を提供することである。

前述した本発明の主要な目的は、炎症誘発因子を乳化させて前記炎症誘発因子と受容体との反応を遮断する生物学的界面活性剤を含む消炎剤を提供することにより達成できる。

前記生物学的界面活性剤は、好ましくはコール酸(cholic acid)、ケノデオキシコール酸(chenodeoxycholic acid)、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、リトコール酸(lithocholic acid)、デヒドロコール酸(dehydrocholic acid)、これらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物、およびこれらの薬学的に許容される塩から選択される。

前記コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、およびデヒドロコール酸の構造式は、次のとおりである。

コール酸

ケノデオキシコール酸

デオキシコール酸

リトコール酸

デヒドロコール酸

本明細書において、「共役化合物(conjugate)」とは、前記コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸またはデヒドロコール酸とグリシンまたはタウリンとの共役化合物、例えばグリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸などをいう。

本明細書において、「薬学的に許容される塩」とは、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、またはこれらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物のナトリウム塩またはカリウム塩などをいう。

本発明の消炎剤は、毒素または損傷組織と炎症細胞間の相互作用を遮断して先天性免疫システムの活性化を抑制することにより、毒素による炎症反応と損傷組織による炎症反応を治療および予防する。また、本発明の消炎剤は全身性炎症疾患の治療および予防に使用できる。

本発明の消炎剤は、細菌の毒素、または内因性炎症誘発因子と宿主細胞との相互反応を遮断するために使用できる。

前記消炎剤は、疎水性部位が過度に露出される炎症誘発物質が疾病発生或いは疾病進行の原因である疾患、例えばアルツハイマー病、動脈硬化症、関節リウマチ、退行性関節塩またはタンパク質ミスフォールディング病などにおいて、炎症の治療または予防に使用できる。

生体内で毒性なしに炎症抑制能を示す本発明の消炎剤の投与量範囲は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。

毒素により刺激される、炎症誘導サイトカインの生成および炎症細胞活性は、本発明の消炎剤で処理して毒素による細胞活性化を遮断することにより抑制される。本発明の消炎剤は、１ｍｇ／ｍｌ以下で細胞毒性を示さず、マウス実験において、マウス当たり２５０ｍｇ／ｋｇのグリココール酸ナトリウムの投与で副作用を示さず、１２．５ｍｇ／ｋｇの投与で内毒素によるマウスの死亡率を有意に低下させた。

本発明の消炎剤は、経口投与、非経口投与、注射、局所投与または直腸投与の経路で投与できる。また、本発明の消炎剤は、溶液、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、懸濁液、錠剤、カプセルまたは坐薬に剤形化させることができる。

本発明の他の目的は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、これらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物、およびこれらの薬学的に許容される塩から選ばれる一つまたはそれ以上の生物学的界面活性剤を含む、組織または細胞保存溶液用添加物を提供することにより達成できる。

従来の臓器保存液に本発明の添加剤を添加すると、虚血／再潅流損傷腎臓から誘導された炎症反応を抑制するだけでなく、腎臓機能の回復も助ける。よって、臓器または細胞保存溶液の効能を向上させることができる。また、本発明の添加剤は、臓器または細胞保存液にだけでなく、治療目的で組織または細胞を保存するための溶液に添加して使用することもできる。

虚血−再潅流によるラットの腎臓損傷評価において、本発明の添加剤を添加して組織保存液を前処理することにより、腎臓機能の向上および炎症反応の抑制効果を高めることができる。本発明の添加剤は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用することが好ましい。

本発明の別の目的は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、これらとグリシンまたはタウリンとの共役化合物、およびこれらの薬学的に許容される塩から選ばれる一つまたはそれ以上の生物学的界面活性剤を含む、敗血症治療剤を提供することにより達成できる。

本発明の消炎剤は、細胞毒性なしに、毒素または損傷組織による炎症反応を効果的に抑制する。また、臓器または細胞保存溶液に添加する場合、その臓器または細胞の機能を向上させることができる。また、多様な免疫反応に対する抑制剤としても使用できる。

本発明の実施例１における、蛍光物質で標識された大腸菌ＬＰＳとＣＨＯ細胞との相互作用に対するグリココール酸ナトリウムの阻害効能を示すグラフである。核転写因子（ＮＦ−κＢ）プロモーター調節の下でＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞システムを示す図（Ａ）、本発明の実施例１における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞の活性に対するグリココール酸ナトリウムの抑制効能を示すグラフ（Ｂ）である（％ＣＤ２５＋細胞はＮＦ−κＢが活性化された細胞の分率を示す）。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するグリココール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するグリコケデオキシコール酸ナトリウムとタウロケノデオキシコール酸ナトリウムの抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するタウロコール酸ナトリウムとタウロデオキシコール酸ナトリウムの抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するデヒドロコール酸とリトコール酸の抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するケノデオキシコール酸とグリココール酸水和物の抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例２における、大腸菌ＬＰＳで刺激したＣＨＯ細胞のＮＦ−κＢ活性に対するコール酸の抑制効能を示すグラフである。本発明の実施例３における、大腸菌ＬＰＳで刺激した樹枝状細胞の活性に対するグリココール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例３における、大腸菌ＬＰＳで刺激した樹枝状細胞の活性に対するタウロケノデオキシコール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例３における、大腸菌ＬＰＳで刺激した樹枝状細胞の活性に対するタウロデオキシコール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例４における、大腸菌ＬＰＳで刺激したマウス腹腔細胞（Ａ、Ｂ）および樹枝状細胞（Ｃ、Ｄ）の炎症誘導サイトカインの生成に対するグリココール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例５における、大腸菌ＬＰＳで刺激した樹枝状細胞でのＮＯ生成に対するグリココール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例５における、大腸菌ＬＰＳで刺激したマクロファージでのＮＯ生成に対するグリココール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例６における、大腸菌ＬＰＳで刺激した樹枝状細胞によるＴリンパ球の活性に対するグリココール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例７における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対するＬＰＳ投与濃度の決定に関するグラフである。本発明の実施例７における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率に対するグリココール酸ナトリウムの効能を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の炎症誘導サイトカインＩＬ１２ｐ７０の減少を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の炎症誘導サイトカインＩＦＮ−ｇの減少を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の抗炎症サイトカインＩＬ−１０の増加を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の炎症誘導サイトカインＴＮＦ−αの減少を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の炎症誘導サイトカインＭＣＰ−１の減少を示すグラフである。本発明の実施例８における、ＬＰＳが投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにグリココール酸ナトリウムを投与した場合の炎症誘導サイトカインＩＬ−６の減少を示すグラフである。本発明の実施例９における、虚血−再潅流腎臓損傷時の炎症反応および腎臓機能に対するグリココール酸ナトリウムの影響を示すグラフである。本発明の実施例１０における、ＣＨＯ細胞にグリココール酸ナトリウムを処理した場合に細胞毒性がないことを示すグラフ（Ａ）、本発明の実施例１０における、樹枝状細胞にグリココール酸ナトリウムを処理した場合に細胞毒性がないことを示すグラフ（Ｂ）、本発明の実施例１０における、樹枝状細胞媒介Ｔリンパ球にグリココール酸ナトリウムを処理した場合に細胞毒性がないことを示すグラフ（Ｃ）、本発明の実施例１０における、グリココール酸ナトリウムで処理されたマウスから分離した腹腔細胞で細胞毒性が現れないことを示すグラフ（Ｄ）である。本発明の実施例１０における、グリココール酸ナトリウム水和物とデオキシコール酸ナトリウムのＣＨＯ細胞に対する毒性を示す図である。本発明の実施例１０における、グリコケノデオキシコール酸ナトリウムとタウロケノデオキシコール酸ナトリウムのＣＨＯ細胞に対する毒性を示す図である。本発明の実施例１０における、タウロコール酸ナトリウムとタウロデオキシコール酸ナトリウムのＣＨＯ細胞に対する毒性を示すグラフである。本発明の実施例１０における、デヒドロコール酸とリトコール酸のＣＨＯ細胞に対する毒性を示すグラフである。本発明の実施例１０における、ケノデオキシコール酸とグリココール酸のＣＨＯ細胞に対する毒性を示すグラフである。本発明の実施例１０における、コール酸のＣＨＯ細胞に対する毒性を示すグラフである。本発明の実施例１０における、グリココール酸ナトリウムのＢａｌｂ／ｃマウスに対する腹腔内処置時の毒性を示すグラフである。本発明の実施例１０における、グリココール酸ナトリウムのＢａｌｂ／ｃマウスに対する尾静脈処置時の毒性を示すグラフである。

以下、本発明の構成要素と技術的特徴を次の実施例によってさらに詳細に説明する。ところが、下記実施例は、本発明を詳細に説明するためのものに過ぎず、本発明の構成要素の技術的範囲を限定するものではない。

実施例１．蛍光物質で標識された大腸菌ＬＰＳ(Lipopolysaccharide)とＣＨＯ細胞間の相互作用阻害能の評価
蛍光物質としてのＢＯＤＩＰＹ(Boron dipyrromethene difluoride)で標識された大腸菌ＬＰＳとＣＨＯ細胞を使用した。ガラス管内でグリココール酸ナトリウムとＢＯＤＩＰＹで標識されたＬＰＳとを３７℃で１４時間反応させた。９６ウェルプレートにその反応物をそれぞれウェル当たり２×１０^５個のＣＨＯ細胞と混ぜて３７℃で１４時間培養した。７−ＡＡＤ(7-amino-actinomycin D)を用いて染色した後、フローサイトメーターによって分析を行った。各処理群当り少なくとも２回繰り返し行い、ｔ検定法(t-test)を用いて統計処理した。その結果、ＣＨＯ細胞にＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳのみを処理した実験群と比較してＰ＜０．０５であった。

生きている細胞に対する分析のために、７−ＡＡＤ（−）細胞のみを選別した。図１の結果より、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの濃度が増加するほどＢＯＤＩＰＹの蛍光が増加することを確認した。また、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳと細胞間の相互作用はグリココール酸ナトリウムの濃度に依存的に抑制された。このような抑制能はＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの濃度が増加するほど減少した（図１）。したがって、ＬＰＳにより誘導された炎症反応の実験で見られるグリココール酸ナトリウムによる炎症抑制効果は、グリココール酸ナトリウムがＬＰＳと細胞間の相互作用を遮断した効果であることを確認することができた。

実施例２．大腸菌ＬＰＳにより誘導された核転写因子（ＮＦ−κＢ）活性化抑制能の評価
大腸菌ＬＰＳにより誘導されたＣＨＯ細胞の核転写因子（ＮＦ−κＢ）活性化抑制能を評価するために、次の方法でＣＨＯ細胞のＣＤ５発現度（％）を評価した。また、細胞毒性を評価するために、７−ＡＡＤで染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。担汁酸塩を溶媒による溶解度によって次の３グループに分けた。

グループＩ．水溶性物質：グリココール酸ナトリウム水和物(sodium glycocholate hydrate)、デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholate)、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム(sodium glycochenodeoxycholate)、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム(sodium taruochenodeoxycholate)、タウロコール酸水和物ナトリウム(sodium taurocholate hydrate)、タウロデオキシコール酸水和物ナトリウム(sodium taurodeoxycholate hydrate)

グリココール酸水和物ナトリウム

デオキシコール酸ナトリウム

グリコケノデオキシコール酸ナトリウム

タウロケノデオキシコール酸ナトリウム

タウロコール酸水和物ナトリウム

タウロデオキシコール酸水和物ナトリウム

グループＩＩ．エタノール可溶性物質(Ethanol soluble chemicals)：デヒドロコール酸(dehydrocholic acid)、リトコール酸(lithocholic acid)、ケノデオキシコール酸(chenodeoxycholic acid)、グリココール酸水和物(glycocholic acid hydrate)
グループＩＩＩ．メタノール可溶性物質(Methanol soluble chemical)：コール酸(cholic acid)

細胞の培養および刺激
本実験のために、図２Ａに示す核転写因子（ＮＦ−κＢ）プロモーター調節下にＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞を使用した。本実験では、トール様受容体（ＴＬＲ２、Toll-like receptor）とＣＤ１４遺伝子で形質転換されたＣＨＯ細胞（以下、３ＦＰ細胞）を使用した。

Ｈａｍ’ｓ基礎培地(Ham’s F-12 basal medium)（５％ＦＢＳ、０．５８４ｇ／ｌＬ−グルタミン、フェニシリン−ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシン、５０μｇ／ｍｌＧ４８１、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有）で選択培養された３ＦＰ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理して分離した後、２４ウェルプレートに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにシーディングし、１８時間培養した。翌日、胆汁酸誘導体とＬＰＳで処理し、３７℃で、ＣＯ_２インキュベーター内で１５ｈｒ培養した。

フローサイトメトリー実験
１５時間の細胞刺激後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して上澄み液を除去した。２００μｌのＦＡＣＳバッファ（１％ＢＳＡと１ｍＭＥＤＴＡを含有した１×ＰＢＳ）で２回洗浄した。遮蔽溶液（１：１０のノーマルマウス血清と１：３のａｎｔｉ−ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤ、２．４Ｇ２）を含むＰＢＳ）２０μｌを各ウェルに添加した後、氷上で３０分間反応させた。抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（１：１６）と抗ヒトＣＤ１４−ＦＩＴＣ（１：３２）との混合液を添加した後、氷上で３０分間反応させた。２００μｌのＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、２００μｌの７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、１：２０）を添加した。１０分間氷上で反応させた後、フローサイトメーターを用いてＣＤ２５の発現能と細胞毒性を評価した。

ＬＰＳで刺激されたＣＤ２５発現能において胆汁塩が及ぼす影響評価
１）グループＩ．水溶性物質
ＬＰＳ刺激を受けた７−ＡＡＤ（−）である、生きている３ＦＰ細胞のＣＤ２５発現を調べた結果、胆汁酸誘導体のうち、グリココール酸水和物ナトリウムの他にもグリコケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸水和物ナトリウム、タウロデオキシコール酸水和物ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムがＬＰＳによるＣＤ２５発現（ＮＦ−κＢ活性）に対する抑制効果を示した（図２Ｂおよび図３〜図８）。

生きている細胞のみを分析するために、７−ＡＡＤ（−）細胞を選別し、ＣＤ５発現増加によって核転写因子の活性化を確認した。図２Ｂに示すように、３ＦＰ細胞の大腸菌ＬＰＳによる核転写因子の活性化は、グリココール酸ナトリウムの濃度に依存的に抑制された。０．５ｍｇ／ｍｌのグリココール酸ナトリウムの存在下で２１．７±０．９％（ｐ＜０．０５）、１ｍｇ／ｍｌで８８．２±１．２％（ｐ＜０．０５）の核転写因子活性抑制を示した。

２）グループＩＩ．エタノール可溶性物質
ＬＰＳ刺激を受けた７−ＡＤＤ（−）である、生きている３ＦＰ細胞のＣＤ２５の発現を調査した結果、胆汁酸誘導体のうち、デヒドロコール酸、グリココール酸水和物、リトコール酸およびケノデオキシコール酸がＣＤ２５発現（ＮＦ−κＢ活性）に対する抑制効果を示した（図６および図７）。

３）グループＩＩＩ．メタノール可溶性物質
ＬＰＳ刺激を受けた７−ＡＡＤ（−）である、生きている３ＦＰ細胞のＣＤ２５の発現を調査した結果、胆汁酸誘導体のうち、メタノールに溶かしたコール酸は抑制効果を示した（図８）。

実施例３．樹枝状細胞を活性化させるＬＰＳに対するグリココール酸ナトリウムの抑制能の評価
大腸菌ＬＰＳにより誘導される抗原提供細胞の活性化過程に対するグリココール酸ナトリウムの影響を評価するために、組み換え活性化遺伝子２（Ｒａｇ２、recombination activating gene 2）が欠損したマウスの骨髄から細胞を分離した。分離された細胞をウェル当たり２×１０^５個ずつ仕込み、１．５ｎｇ／ｍｌの顆粒球集落形成因子（ＧＭ−ＣＳＦ、granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）と０．７５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−４で処理して６日間の培養によって樹枝状細胞に分化させた。

グリココール酸ナトリウムとＬＰＳを樹枝状細胞とよく混合した。３７℃で１８時間刺激させ、抗−ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、抗−Ｉ−Ａｂ−ＰＥ、抗−ＣＤ８６−ＰＥ、７ＡＡＤ、抗−ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで染色した後、フローサイトメーターによって細胞分析を行った。各処理群当たり少なくとも２回繰り返し行い、ｔ検定法を用いて統計処理した。その結果、ＬＰＳのみを処理した実験群と比較してＰ＜０．０５であった。

図９〜図１１に示すように、生きている樹枝状細胞のみを分析するために、ＣＤ１１ｃ（＋）／７ＡＡＤ（−）細胞のみを選別した後、樹枝状細胞共刺激分子とＩ−Ａｂの発現能を分析した。１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳによるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａｂの上昇した発現は、グリココール酸ナトリウムによって濃度依存的に抑制能を示し、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムとタウロデオキシコール酸水和物ナトリウムによってもそれぞれ濃度依存的に抑制能を示すことからみて、ＬＰＳによる樹枝状細胞活性が有意に抑制されることが分かる。

実施例４．大腸菌ＬＰＳによる試験管内炎症サイトカインの生成に対する抑制能の評価
ＬＰＳにより誘導される炎症サイトカインの生成に対するグリココール酸ナトリウムの影響を評価するために、実施例３と同様の方法で樹枝状細胞を製造し、マクロファージをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔から分離した。その後、ガラス管内でグリココール酸ナトリウムとＬＰＳを３７℃で１時間反応させた後、細胞とよく混合した。各細胞を３７℃で１４時間刺激させた後、上澄み液を回収した。

分離された細胞培養上澄み液内の腫瘍壊死因子−αおよびインターロイキン−１２ｐ４０の濃度を酵素免疫測定法（enzyme-linked immunoabsorbent assay；ＥＬＩＳＡ）によって決定した。

ＬＰＳ刺激によるマクロファージおよび樹枝状細胞から腫瘍壊死因子−αの生成は、０．５ｍｇ／ｍｌではそれぞれ４２．２±０．９％（ｐ＜０．０５）、７０．２±２．３％（ｐ＜０．０５）が抑制され、１ｍｇ／ｍｌでは８７．８±０．２％（ｐ＜０．０５）、１０１．０±０．２（ｐ＜０．０５）が抑制された。ＬＰＳによるインターロイキン−１２ｐ４０の生成において、マクロファージと樹枝状細胞は０．５ｍｇ／ｍｌのグリココール酸ナトリウムでそれぞれ９．８±１１．０％、４．７±３．１％（ｐ＜０．０５）が抑制され、１ｍｇ／ｍｌで５４．３±４．１％、１０６．６±１．３％が抑制されたことを確認することができた（図１２）。

全ての実験を各処理群当たり少なくとも２回繰り返し行い、ｔ検定法を用いて統計処理した。その結果、ＬＰＳのみを処理した実験群と比較してＰ＜０．０５であった。

実施例５．大腸菌ＬＰＳによる樹枝状細胞およびマクロファージにおける酸化窒素（ＮＯ）の生成に対する抑制能の評価
ＬＰＳにより誘導される細胞毒性因子ＮＯの生成に対するグリココール酸ナトリウムの影響を評価するために、実施例４と同様の方法で樹枝状細胞とマクロファージを製造した。ＬＰＳとグリココール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸水和物ナトリウムを樹枝状細胞に処理し、前記樹枝状細胞を３７℃で１８時間刺激させた後、新しい９６ウェルプレートに、樹枝状細胞を含む最終反応物を均一に混ぜて１００ｍｌずつ入れた。等量のＧｒｉｓｓｒｅａｇｅｎｔを添加した後、ホイルで包んで１５分間室温で反応させた。ＥＬＩＳＡリーダー機を用いて５４０ｎｍで吸光度を測定した。マクロファージの場合も、腹腔から分離した後、グリココール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムおよびタウロデオキシコール酸ナトリウムをＬＰＳと処理して１８時間刺激を与えた後、樹枝状細胞と同一の方法で実験を行った。

ＬＰＳ刺激によるマクロファージと樹枝状細胞からのＮＯの生成は、図１３Ａおよび図１４Ａに示すようにグリココール酸ナトリウムによる抑制能を示した。また、図１３Ｂ、図１３Ｃおよび図１４Ｂ、図１４Ｃに示すように、タウロケノデオキシコール酸ナトリウムとタウロデオキシコール酸水和物ナトリウムにおいてもそれぞれ大きい抑制能を示すことからみて、これらの３つの胆汁酸誘導体が炎症疾患の増幅に重要なＮＯの生成を遮断することが分かった。

実施例６．大腸菌ＬＰＳによる樹枝状細胞媒介のＴリンパ球活性抑制能の評価
ＬＰＳにより活性化される抗原提供細胞はＴリンパ球を活性化させる。ＬＰＳが樹枝状細胞を活性化させる段階において、グリココール酸ナトリウムにより遮断された樹枝状細胞がＴリンパ球を活性化させることができるかを評価した。Ｒａｇ２遺伝子を欠損させた雄マウスの骨髄から細胞を採取した後、９６ウェルプレートにウェル当たり４×１０^３個仕込み、１．５ｎｇ／ｍｌの顆粒球集落形成因子と０．７５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−４を処理して、６日間の培養によって樹枝状細胞に分化させた。ガラス管内でグリココール酸ナトリウムをＬＰＳと共に３７℃で１時間反応させた後、樹枝状細胞をよく混合した。樹枝状細胞を３７℃で１４時間刺激し、Ｈ−Ｙ抗原に特異的なＴリンパ球受容体（ＴＣＲ、T cell receptor）を持つＭａｒｉｌｙｎ雌マウスから分離されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球を樹枝状細胞と共に７２時間培養した。［３Ｈ］−メチルチミジンを、ウェル当たり１μＣｉを添加して１８時間培養した後、細胞を回収してベータカウンターによってＣＰＭ(Count per minute)を決定した。

ＬＰＳによる樹枝状細胞媒介のＴリンパ球増殖において０．５ｍｇ／ｍｌのグリココール酸ナトリウム処理の際に１０４．９±３．２％（ｐ＜０．０５）が抑制された。また、１ｍｇ／ｍｌの存在下で１０５．１±２．３％（ｐ＜０．０５）の抑制効果を示した（図１５）。樹枝状細胞またはＴリンパ球のみを培養した実験群において、ＬＰＳまたはグリココール酸ナトリウムによってＴリンパ球の増殖が観察されなかった。これにより、ＬＰＳから誘導された樹枝状細胞の活性はグリココール酸ナトリウムによって抑制され、結果として樹枝状細胞により媒介されるＴリンパ球の活性化が抑制されることが分かる（ｐ＜０．０５）。

実施例７．ＬＰＳマウス敗血症モデルにおけるグリココール酸ナトリウムの防御能の評価
グリココール酸ナトリウムのＬＰＳによる中和能の評価のために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをグループ当たり３匹ずつ使用した。ＬＰＳのＬＤ５０を測定するために、ＬＰＳ(salmonella enteritidis strain)を２０ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの濃度でマウス腹腔内に投与した。ＬＰＳ２０ｍｇ／ｋｇの濃度が防御能試験に最適の濃度であることを確認した（図１６）。

ＬＰＳによるグリココール酸ナトリウムの生体内中和能を評価した。２０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを使用し、グリココール酸ナトリウムを１２．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内に２回投与して生存率を確認した。ＬＰＳ腹腔投与後６０時間内に全て死亡した陰性対照群と比較して、グリココール酸ナトリウム１２．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇをＬＰＳ投与１時間後と６時間後に２回腹腔内投与した実験群において４０％と６０％の生存率を示した（図１７）。

実施例８．ＬＰＳによる生体内炎症サイトカイン生成の抑制能の評価
実施例７と同様にＬＰＳ２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した後、グリココール酸ナトリウムを１２．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内に２回投与した後、指定しておいた時間に合わせてマウスの尾から採血し、しかる後に、遠心分離（２４００×ｇ、１０分）して血清のみを得た後、ＣＢＡ(cytometric bead array)キットを用いてサイトカイン発現の変化を確認した。

ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−ｇは４ｈ、８ｈおよび１２ｈにグリココール酸ナトリウムの投与による減少を示し（図１８および図１９）、ＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１、ＩＬ−６は１２ｈ、２４ｈ、４８ｈでグリココール酸ナトリウムの投与による顕著な減少を示した（図２１、図２２および図２３）。炎症抑制サイトカインに属するＩＬ−１０は、グリココール酸ナトリウムを投与した実験群で有意な増加を示した(図２０)。

実施例９．臓器移植用保存液の添加剤としての抗炎症効能の評価
虚血−再潅流腎臓損傷実験モデルで炎症反応および腎臓機能に対するグリココール酸ナトリウムの影響を評価した。６週齢のＳＤ(Sprague-Dawley)雄ラットをグループ当たり５匹ずつ使用し、実験１日前に全てのラットは餌と水の供給を遮断した。アバーティン(avertin; tribromoethanol/amyl hydrate)で１ｍｇ／１００ｇずつ腹腔内投与してラットを麻酔した後、腹部中央線に沿って腹壁切開した。大動脈と大静脈に血管用クランプ(vascular clamps)をかけ、左の腎臓に流れる全ての血流を遮断し、臓器保存溶液を注入する前に左の腎臓静脈に小孔を穿孔することにより、溶液圧力による腎臓の物理的損傷を最小化した。しかる後に、３１Ｇの針を用いてＨＴＫ(Histidine-tryptophan-ketoglutarate) またはＨＴＫと０．５ｍｇ／ｍＬのグリココール酸ナトリウムとの混合液（ＨＴＫＮ）を４ｍｌ／ラットずつ血管に注入した後、血管の損傷部位を１０−０ｓｕｔｕｒｅを用いて縫合した。この状態で３０分間維持し、血管用クランプを取り除き、開腹された部位を縫合した。２４時間再潅流させた後、手術したラットを再麻酔し、しかる後に、心臓から血液を採取して血漿または血清を調製した。陰性対照群(sham operation group)も虚血−再潅流損傷およびＨＴＫまたはＨＴＫＮ（グリココール酸ナトリウムが含有されたＨＴＫ溶液）溶液処理過程以外は、前述と同様の方法で施術した。全ての施術は少なくとも３回繰り返し行った。酵素免疫測定法によって血漿内のＩＬ−６濃度を決定し、自動分析機で血清内ＢＵＮ(blood urea nitrogen)、Ｃｒｅ(Creatinine)、ＡＳＴ(aspartateaminotransferase)の濃度数値を得た。

虚血−再潅流損傷に対してＨＴＫ溶液を処理した実験群において、ＩＬ−６生成濃度は、４６６±２１８ｐｇ／ｍｌであり、ＨＴＫＮを処理した実験群では２６０±１４４ｐｇ／ｍｌ（ＨＴＫ処理群と比較してｐ=０．０８）に減少することにより、炎症反応が抑制されることを確認することができた（図２４）。また、腎臓機能の指標であるＢＵＮ、Ｃｒｅ、ＡＳＴがＨＴＫ処理群に比べてＨＴＫＮ処理群で全て有意な低い数値を示した。よって、グリココール酸ナトリウムが腎臓の虚血−再潅流損傷を抑制することが分かった（図２４）。

実施例１０．毒性評価
これらの実施例で使用したＣＨＯ細胞、樹枝状細胞、Ｔリンパ球に対するグリココール酸ナトリウムの細胞毒性有無を評価した。７ＡＡＤ染色後のＦＡＣＳ分析を行った。まず、ガラス管内でグリココール酸ナトリウムを３７℃で１時間放置した後、細胞とよく混合した。ＣＨＯ細胞または樹枝状細胞を３７℃で１４時間培養し、Ｔリンパ球の場合、１４時間培養された樹枝状細胞をＴリンパ球とよく混ぜて４日培養した後、各細胞を７ＡＡＤで染色してから、フローサイトメーターによって細胞分析を行った。

マウス毒性評価のために、７〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスをグループ当たり５匹ずつ使用して本実験を行った。ガラス管内でリン酸感傷食塩水に溶かしたグリココール酸ナトリウムを３７℃で１時間放置した後、マウスの腹腔内に投与した。投与１時間後、腹腔細胞を分離して７ＡＡＤで染色した後、細胞分析を行った。７ＡＡＤ染色において、陽性対照群として、５回以上冷凍解凍した細胞を使用した。実験結果は、ｔ検定法を用いて統計処理し、グリココール酸ナトリウムを処理していない実験群と比較してｐ＜０．０５であった。

ＣＨＯ細胞（図２５Ａ）、樹枝状細胞（図２５Ｂ）、および樹枝状細胞媒介のＴリンパ球（図２５Ｃ）は１ｍｇ／ｍｌのグリココール酸ナトリウムの存在下で陰性対照群と比較して７ＡＡＤ（＋）が２〜４％増加し、１ｍｇ／ｍｌのグリココール酸ナトリウムによる有意な細胞毒性がないことが分かる（図２５）。マウス当たり５ｍｇ（２５０ｍｇ／ｋｇ）のグリココール酸ナトリウムを投与したマウス内からも分離された腹腔細胞の致死率がリン酸緩衝食塩水のみを投与した対照群と有意な差異がないことを確認することができた（図２５Ｄ）。

図２６〜３１では、図２５Ａと同様の方法で行い、胆汁酸塩のそれぞれの溶媒による溶解度によって３グループに分けて細胞毒性実験を行った。それぞれの溶媒に対する陰性対照群に比べて、胆汁酸塩の水溶性物質、エタノール可溶性物質、およびメタノール可溶性物質から有意な細胞毒性が発見されなかった。

グループ当たり５匹ずつ６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを用いてグリココール酸ナトリウムを濃度別に腹腔および尾静脈に１回投与して急性毒性を評価した。グリココール酸ナトリウムは、腹腔投与実験において、５００ｍｇ／ｋｇ濃度以上では毒性が現れたが、既存の効能を示した２５０ｍｇ／ｋｇ濃度およびそれ以下の濃度では１００％マウスが生存した（図３２）。また、グリココール酸ナトリウムの濃度別生体内尾静脈投与実験によって、１５０ｍｇ／ｋｇ濃度以下で１００％マウスが生存することを確認した（図３３）。

Claims

タウロデオキシコール酸ナトリウムを含む、敗血症を治療するための治療薬。
前記治療薬が、非経口投与又は注射経路で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の治療薬。
前記治療薬が、溶液又は懸濁液の剤形であることを特徴とする、請求項１に記載の治療薬。