JP5334575B2 - ２−インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリン派生物および癌治療におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

［発明の属する技術分野］
本発明は、癌療法の分野に関し、特に癌の治療における２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナトリン派生物の使用に関する。
［発明の背景］

金属キレート剤は、金属過剰による病気の治療に対して開発されている。しかしながら、鉄はエネルギー代謝、呼吸およびＤＮＡ合成に関与する様々なタンパク質の活性部位において重要な役割を有するため、最近になり、鉄をキレート化できる化合物が潜在的な抗癌療法として研究されている。当該タンパク質の１つであるリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）は、ＤＮＡ合成のため、リボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドへ変換するために不可欠な鉄含有タンパク質であるため、抗癌療法の標的となる。多くの鉄キレート剤は、鉄を結合する能力があるため強力な阻害剤である（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２００２）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ ４２（３）：２６７‐８１．）。例えば、β‐サラセミアを含む鉄過剰の病気の治療に臨床的に承認されている鉄キレート剤デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）は（Ｂｕｓｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｂ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｆ．Ｍ．ＴｏｒｔｉおよびＳ．Ｖ．Ｔｏｒｔｉ（２００４）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４（１５）：１６２３‐３５）、ＲＲの阻害剤でもあるとみられている。また、いくつかの侵攻性腫瘍は、ＤＦＯによる鉄キレート化に敏感であるとみられている。しかしながら、ＤＦＯの使用には費用がかかり、長期の皮下投与を必要とし、その化合物は短期の半減期を示す。ＤＦＯに加えて、Ｔｒｉａｐｉｎｅ（現在、第二相）、３１１、ｔａｃｈｐｙｒｉｄｉｎｅ、およびＯ‐Ｔｒｅｎｓｏｘ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ｓｕｐｒａ）などの増殖抑制活性を有する他の鉄キレート剤は開発中である。しかしながら、Ｔｒｉａｐｉｎｅは水可溶分が低いため、抗癌療法として有効性が制限される場合がある。

米国特許第６，５８９，９６６号には、鉄を結合し、腫瘍細胞に対して増殖抑制活性を有する六座の化合物として特徴付けられる金属キレート剤の新規類族が記述されている。さらに、米国特許出願第２００２／０１１９９５５号には、癌を含む、新生物の治療に適切な治療的有用性を示す場合がある３‐ＡＰ（構成上、Ｔｒｉａｐｉｎｅと関連性がある）に基づくさらなる化合物が記述されている。

亜鉛のキレート化は、重要であるが比較的まだ研究されていない鉄キレート剤の生物学的効果の決定因であるかもしれない。例えば、潜在的な抗癌剤として臨床前研究中である鉄キレート剤ｔａｃｈｐｙｒｉｄｉｎｅは、鉄に加えて亜鉛をキレートし、これはその細胞毒性に影響を及ぼす（Ｚｈａｏ，Ｒ．ら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６７（９）：１６７７‐８８．）。亜鉛は、ＤＮＡ‐タンパク質またはタンパク質‐タンパク質の相互作用に関与するタンパク質の数百もの亜鉛依存性酵素および亜鉛フィンガーモチーフにおいて、触媒的、構造的役割を有する。このため、亜鉛の過剰のみならず欠乏も哺乳類の代謝において各種変性を引き起こす。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの亜鉛の減少は、アポトーシスを引き起こすとみられ（ＭｃＣａｂｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｓ．Ａ．ＪｉａｎｇおよびＳ．Ｏｒｒｅｎｉｕｓ（１９９３）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ６９（１）：１０１‐１０）、大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞の細胞増殖を有意に減少させ（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎ Ｂ．，Ｆ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｍ．ＰｆａｆｆｌおよびＨ．Ｄａｎｉｅｌ（２００４）Ｊ．ＮｕｔＲ １３４（１）：５７‐６２）、細胞周期進行を変化させる（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６（３２）：３０４２３‐８）。

あるいは、他の金属キレート剤は、細胞毒性を有するキレート錯体の形成によって抗腫瘍効果を発揮する場合がある。これは、主に酸化還元活性金属、鉄および銅で生じる。例えば、ブレオマイシンは、抗腫瘍活性を有する糖ペプチド抗生物質の類族である。それらは、リンパ腫、扁平上皮細胞癌および胚細胞腫瘍に対する併用化学療法で臨床的に使用される。それらは、ＤＮＡ結合ドメインおよびＦｅ（ＩＩ）またはＣｕ（I）を結合する金属結合ドメインを含有する。酸素および還元体の存在が、ラジカル中間体の形成によりＤＮＡ切断を引き起こす（Ｃｈｅｎ，Ｊ．およびＪ．Ｓｔｕｂｂｅ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５（２）：１０２‐１２）。鉄をキレートしてＲＲを阻害する鉄キレート剤Ｔｒｉａｐｉｎｅは、鉄錯体形成での活性酸素の生成によってＲＲおよび他の重要な分子に損傷を与える場合がある（Ｃｈａｓｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．ら（２００３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９（１）：４０２‐１４）。化合物を体腫瘍の標的にするためのブレオマイシン複合体の使用は、米国特許第４，７５８，４２１号に記載されている。

金属キレート剤、１，１０‐フェナントロリン（ＯＰ）の細胞毒性は、キレート剤とキレート類両方として機能する能力による。キレート剤として、亜鉛または鉄と結合するとみられ、それによって活性のために亜鉛または鉄を必要とする酵素を阻害する。

あるいは、二価金属イオンを有する１，１０‐フェナントロリンのキレート錯体は、細胞毒性を有すると報告され（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ａ．およびＧ．Ａ．Ｌａｙｃｏｃｋ（１９７７）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １６（１）：８９‐９９．）、銅‐キレートは、ＤＮＡの分解を促進する（Ｄｏｗｎｅｙ，Ｋ．Ｍ．，Ｂ．Ｇ．ＱｕｅおよびＡ．Ｇ．Ｓｏ（１９８０）。Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ９３（１）：２６４‐７０）。銅‐ＯＰの錯体は、非共有でＤＮＡ副溝と結合可能で、過酸化水素および還元体の存在下で核酸の一本鎖切断を触媒する（Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．ら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５４（２４）：１２２６９‐７２）。

銅‐ＯＰ錯体は、化学的ヌクレアーゼとして頻繁に使用され、高特異性のＤＮＡ切断剤は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質への付着によって生成されている（Ｐａｎ，Ｃ．Ｑ．，Ｒ．ＬａｎｄｇｒａｆおよびＤ．Ｓ．Ｓｉｇｍａｎ（１９９４）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２（３）：３３５‐４２．）。ＯＰは、マトリクスメタロプロテアーゼの阻害剤としても広く使用され（Ｓｐｒｉｎｇｍａｎ，Ｅ．Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４（４８）：１５７１３‐２０）、亜鉛のキレート化によってグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの合成を阻害するとみられている（Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｊ．およびＤ．ＳｅｖｌｅｖｅＲ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（５）：１２０５‐１３）。

腫瘍抑制遺伝子の脱制御は癌の成長と関係あるが、癌の成長におけるこれらの腫瘍抑制遺伝子の明確な役割はまだ不明である。遺伝子のKrueppel様因子（ＫＬＦ）族は、細胞の成長、増殖、文化および胚発生に様々な制御の役割を有する、進化的に保存された亜鉛フィンガーを含有する転写因子の類族である（Ｇｈａｌｅｂ，Ａ．ら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １５（２）：９２‐６）。ＫＬＦは、特定のアミノ末端領域、それらが結合するプロモーター、およびそれらの機能の細胞状況を通じての補助活性化因子または抑制補体との相互作用によって、転写活性化因子または抑制体あるいはその両方として機能できる（Ｋａｃｚｙｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｔ．ＣｏｏｋおよびＲ．Ｕｒｒｕｔｉａ（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ４（２）：２０６）。ＫＬＦ族の数員は腫瘍抑制因子であると考えられ、発癌に関与する。例えば、ＫＬＦ４の下方制御は大腸癌に見られ（Ｄａｎｇ ＤＴら（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４７６：２０３‐７）、ＫＬＦ５およびＫＬＦ１０の下方制御は乳癌に生じる（Ｃｈｅｎ Ｃら（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：６５６７‐７２；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ Ｍら（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６８：２２６‐３６）。ＫＬＦ６は、前立腺腺癌で見られる頻繁な変異を有する、染色体位置１０ｐ１５にある候補腫瘍抑制遺伝子であるとも示唆されている。また、ＫＬＦ６は、ｐ５３依存性の経路により細胞周期のサイクリン依存性キナーゼ阻害因子をコード化するＷＡＦ１を転写活性化するともみられていた（Ｎａｒｌａ Ｇら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：２５６３‐６）。

ＫＬＦ４の脱制御は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方の大腸癌以外の癌と関連し、ＫＬＦ４に腫瘍抑制剤効果があるかもしれないと示唆されている。結腸直腸癌では、ＫＬＦ４ ｍＲＮＡのレベルは、通常の適合組織に比べて減少し（Ｄａｎｇら（２０００），ｓｕｐｒａ）、結腸直腸癌の細胞株におけるＫＬＦ４の再発現は腫瘍原性の減少をもたらす（Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２（２２）：３４２４‐３０）。ＫＬＦ４の同様の下方制御および増殖抑制効果は、膀胱癌（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｓ．ら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０８（２）：２５１‐６）、胃癌（Ｗｅｉ，Ｄ．ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（７）：２７４６‐５４）、食道癌（Ｗａｎｇ，Ｎ．ら（２００２）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ８（６）：９６６‐７０）、および成人Ｔ細胞白血病（Ｙａｓｕｎａｇａ，Ｊ．ら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（１７）：６００２‐９）においても挙げられている。ＫＬＦ４の腫瘍抑制剤効果とは対照的に、ＫＬＦ４発現の増加は、乳癌（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら（２０００）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（２２）：６４８８‐９５．）および口腔の扁平上皮細胞癌（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら（１９９９）．Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ １０（６）：４２３‐３４．）の進行期間において報告されている。さらに、ＫＬＦ４は、早期浸潤乳管癌における悪性表現型のマーカーとみなされている（Ｐａｎｄｙａ，Ａ．Ｙ．ら（２００４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（８）：２７０９‐１９．）。したがって、ＫＬＦ４が消化管癌および白血病において腫瘍抑制因子の役割を果たしていると思われる一方、他の種類の癌の成長におけるＫＬＦ４の役割はまだ不明である。

ＫＬＦ４の発現は、亜鉛によって陰性的に制御される。ヒトオリゴヌクレオチド配列を使用した大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞における遺伝子発現に対する亜鉛減少の効果に関する研究では、ＫＬＦ４遺伝子発現は検査した１０，０００の標的遺伝子のうち、最も有意に上昇されたものの１つであるとされた。したがって、ＫＬＦ４は細胞内亜鉛状態と成長阻害の直接的リンクであるかもしれないと仮定されている（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，Ｆ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｍ．ＰｆａｆｆｌおよびＨ．Ｄａｎｉｅｌ（２００４）Ｊ．Ｎｕｔｒ １３４（１）：５７‐６２．）。その後の研究において、ＫＬＦ４の発現は金属転写因子‐１（ＭＴＦ‐１）を過剰発現する細胞で増加することがわかった（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，Ｆ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｊ．ＢｕｄｃｚｉｅｓおよびＨ．Ｄａｎｉｅｌ（２００５）．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８３（２）：２２１‐９．）。

ＭＴＦ‐１は標的遺伝子の金属応答配列（ＭＲＥ）に結合する、６つの亜鉛フィンガーを有する亜鉛知覚転写活性化因子であり、ＫＬＦ４のプロモーターも３つのＭＲＥを有する。ＭＴＦ‐１は、通常、亜鉛欠乏細胞において上方制御され、ＭＴＦ‐１発現の増加は、亜鉛欠乏ＨＴ‐２９細胞で見られる（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎら、２００４，ｓｕｐｒａ）。したがって、ＨＴ‐２９におけるＫＬＦ４の亜鉛反応は、ＭＴＦ‐１によって少なくとも一部で調節される（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎら、２００５，ｓｕｐｒａ）。ＫＬＦ４の発現は、第一に、内臓、皮膚および胸腺などの器官の上皮細胞の最終分化状態と関連する（Ｋａｃｚｙｎｓｋｉら、２００３，ｓｕｐｒａ）。

上記のように、１，１０‐フェナントロリン（ＯＰ）は、周知の金属キレート剤である。近年の研究では、１，１０‐フェナントロリンの派生物およびそれらの様々な金属をキレート化する能力を研究した。例えば、Ｃｈａｏらは、１，３‐ビス（［１，１０］）フェナントロリン‐［５，６‐ｄ］イミダゾール‐２‐イル）ベンゼン（ｍｂｐｉｂＨ２）およびその（ｂｐｙ）２Ｒｕ^２＋錯体を合成し、それらの電気化学的および分光学的特性を研究した（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ，２０００，１９７５‐１９８３）。Ｌｉｕらは、２−（２‐ヒドロキシフェニル）イミダゾ［４，５‐ｆ］［１，１０］フェナントロリン（ＨＰＩＰ）でルテニウム錯体を調製し、仔ウシ胸腺ＤＮＡに対するこれらの錯体の結合の性質を研究した（ＪＢＩＣ，２０００，５，１１９‐１２８）。同様に、Ｘｕらは、２（４‐メチルフェニル）イミダゾール［４，５‐ ｆ］１，１０‐フェナントロリンの合成およびそのＲｕ（ＩＩ）錯体、および調製錯体の仔ウシ胸腺ＤＮＡへの結合を記述した（Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７，１２５５‐１２６３）。

国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０４／０５２４３３（ＷＯ２００５／０４７２６６）には、いくつかの１，１０‐フェナントロリン置換化合物を含む、広いクラスの２，４，５‐三置換イミダゾール化合物および癌の治療におけるその使用が記述されている。
この参考資料は、出願者が考える周知の情報が本発明と関連性があるという可能性を示すために提供される。必ずしも承認を目的とせず、これまでのいかなる情報が本発明に反対して先行技術を構成していると解釈されるべきではない。

［発明の要約］
本発明の目的は、２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナトリン派生物および癌の治療におけるその使用の提供である。本発明の一形態によると、癌細胞の増殖を阻害する際の、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供され、

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐Ｓ（Ｏ）_１‐２Ｒ（式中、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである）から単独で選択され、
Ｒ５はＨ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐ＣＨ_２‐アリール、‐ＣＨ_２‐ヘテロアリールである。

本発明のもう１つの形態によると、癌細胞においてアポトーシスを誘導する際の、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供される。
本発明のもう１つの形態によると、細胞において遷移金属イオンをキレートする際の、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供される。

本発明のもう１つの形態によると、癌細胞および／または腫瘍においてKrueppel様因子４（ＫＬＦ４）の発現を増加させる際の、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供される。

本発明のもう１つの形態によると、癌の治療における薬剤の調製の際の、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供される。

本発明のもう１つの形態によると、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供され、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_６‐Ｃ_１４アリールであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_６‐Ｃ_１４アリールで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、ヘテロ原子がＮであるＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_６‐Ｃ_１４アリール、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたＣ_６‐Ｃ_１４アリール、Ｃ_５‐Ｃ_６シクロアルキル、Ｃ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルである。

本発明のもう１つの形態によると、構造式（I）を有する化合物、またはその塩の使用が提供され、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が、単独で水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルコキシ、またはフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはシクロペンチルであり、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、ヘテロ原子がＮであるＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたフェニル、Ｃ_５‐Ｃ_６シクロアルキル、Ｃ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキル、またはアダマンタンであり、およびＲ７は、Ｈである。
［発明の詳細な説明］

本発明は、式Iの２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリン化合物に関する。本明細書において実証されているように、式Iの化合物は、遷移金属の細胞内のキレート化ができ、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性を持つ１つ以上の癌細胞において、増殖抑制効果を及ぼすことができる。それにより、本発明の１つの実施例は、癌細胞の増殖を阻害するための式Iの化合物の使用を提供する。本発明は、癌の治療における式Iの化合物の方法および使用をさらに提供する。

プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導は、癌の治療に対して有用な方法である。本明細書において実証されているように、本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は癌細胞においてアポトーシスを誘導することができるため、細胞毒性効果を及ぼすことができる。それにより、本発明は、癌細胞においてアポトーシスを誘導するための式Iの化合物の方法および使用をさらに提供する。もう１つの実施例では、様々な白血病の治療に対してアポトーシスを誘導するための式Iの化合物の使用が提供される。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、１つ以上の前立腺癌細胞、大腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞および白血病細胞の増殖を選択的に阻害することができる。したがって、この実施例では、本発明は１つ以上の前立腺癌細胞、大腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞および白血病細胞の増殖を選択的に阻害するための式Iの化合物の使用を提供する。１つ以上の前立腺癌細胞、大腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞および白血病細胞の増殖を選択的に阻害する式Iの化合物の能力は、前立腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌および白血病の群から選択された癌を治療するための式Iの化合物の方法および使用をさらに提供する。

上述のとおり、式Iの化合物は、細胞環境において遷移金属イオンをキレートすることができる。それにより、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで遷移金属イオンをキレートするための式Iの化合物の方法および使用をさらに提供する。本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属のキレート化によって、癌細胞において遷移金属で制御される遺伝子の発現を変更することができる。例えば、１つの実施例では、式Iの化合物は、癌細胞において遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させることができる。多くの場合、腫瘍抑制遺伝子の機能は細胞増殖の制御に関連するため、細胞増殖を制御するよう機能する遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現によって、式Iの化合物は癌細胞の増殖を阻害することができる。特定の実施例では、式Iの化合物は、亜鉛制御された腫瘍抑制因子ＫＬＦ４の発現を増加させることができるため、これらに限定されないが、膀胱癌、消化管癌および様々な白血病を含む、ＫＬＦ４が腫瘍抑制因子をして作用する癌細胞増殖の阻害に有用である。

本発明は、例えば式Iの化合物の銅錯体など、式Iの化合物の金属キレート錯体、および癌の治療におけるこれら錯体の使用をさらに提供する。

本発明は、遷移金属のキレート化が必要とされる様々な非治療的状況のみならず、遷移金属をキレートする必要がある病気または疾患の治療において、式Iの化合物の治療的適用を目的とする。

定義

別に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が所属する分野の当業者によって共通に理解される意味と同じである。

用語は以下のように定義される。
本発明の１つの実施例において、式Iの化合物の抗癌活性に関して本明細書において使用される「選択的阻害」は、ＮＣＩ‐ＮＩＨ開発治療プログラムｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーン（以下の表１）で使用される６０の癌細胞株のうち少なくとも５０から構成される癌細胞株のパネルを使用して定義可能であり、パネルは、挙げられる前立腺癌細胞株と挙げられるその他の癌両方のそれぞれからの少なくとも４つの培養細胞株で構成される。化合物は、化合物が乳癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌および腎臓癌のそれぞれからの培養細胞株の阻害に対する平均ＧＩ_５０より少なくとも１０％低い平均ＧＩ_５０を有する選択された癌（すなわち、前立腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌および／または白血病）からの培養細胞株の増殖を阻害するとき、選択された癌の選択的阻害を示すと言われている。

癌細胞において遷移金属腫瘍抑制遺伝子の発現に関する本明細書において使用される用語「下方制御」は、遺伝子は癌細胞で過剰発現していない、すなわち、細胞は、正常細胞と比べて、低下したレベルまたは実質的に同レベルの遺伝子発現を示す。
一例として、大腸癌細胞は正常の結腸細胞と比べてＫＬＦ４遺伝子の発現減少を示し、前立腺癌細胞は正常の前立腺癌細胞を比べると同レベルのＫＬＦ４発現を示すが、発現レベルは、ＫＬＦ４を過剰発現する乳癌細胞より低い。

用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素およびヨウ素原子を言及する。
用語「ヒドロキシル」は、‐ＯＨの基を言及する。
用語「チオール」または「メルカプト」は、‐ＳＨ、および‐Ｓ（Ｏ）_０‐２の基を言及する。
用語「低アルキル」は、１から８の炭素原子の直鎖または分鎖、または環状、アルキル基を言及する。
用語「置換低アルキル」は、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、シアノなどの、１つ以上の基を含む、記述どおりの低アルキルを言及する。これらの基は、低アルキル部分の任意の炭素原子に付着している場合がある。

用語「低アルケニル」は、少なくとも１つの炭素二重結合を有する２から８の炭素原子の直鎖または分鎖炭化水素を言及する。
用語「置換低アルケニル」は、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル アルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、シアノなどの、１つ以上の基を含む、記述どおりの低アルケニルを言及する。これらの基は、安定化合物を生成するために任意の炭素原子に付着している場合がある。
用語「低アルキニル」は、少なくとも１つの炭素三重結合を有する２から８の炭素原子の直鎖または分鎖炭化水素を言及する。

用語「置換低アルキニル」は、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル アルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、シアノなどの１つ以上の基を含む、記述どおりの低アルキニルを言及する。これらの基は、安定化合物を生成するために任意の炭素原子に付着している場合がある。

用語「アルコキシ」は、 Ｒが低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているアシル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロへテロアルキル、または置換シクロへテロアルキルである‐ＯＲの基を言及する。
用語「アルキルチオ」は、 Ｒが低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているアリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである‐ＳＲ、‐Ｓ（Ｏ）_{ｎ＝１‐２}‐Ｒの基を意味する。
用語「アシル」は、Ｒが水素、低アルキル、置換低アルキル、アリール、置換アリールである‐Ｃ（Ｏ）Ｒの基を言及する。
用語「アリールオキシ」は、以下で定義されているように、Ａｒがアリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール基である‐ＯＡｒの基を言及する。

用語「アミノ」は、ＲおよびＲ’が 単独で水素、低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているアリール、置換アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキルまたは置換ヘテロアリール、またはアシルである場合があるＮＲＲ’の基を言及する。
用語「アミド」は、 ＲおよびＲ’が単独で水素、低アルキル、置換低アルキル、以下で定義されているシクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘタリール、置換ヘヘタリールである‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’の基を言及する。
用語「カルボキシル」は、定義されているように、Ｒが単独で水素、低アルキル、置換低アルキル、アリール、置換アリール、ヘタリール、置換ヘタリールなどである‐Ｃ（Ｏ）ＯＲの基を言及する。
用語「アリール」または「Ａｒ」は、少なくとも１つの環が芳香族（例えば、１，２，３，４‐テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、またはフェナントリル、９‐フルオレニル、など）である少なくとも１つの芳香環（例えば、フェニルまたはビフェニル）または複数の縮合環を有する芳香族カルボサイクリック族を言及する。

用語「置換アリール」は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキル アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミド、シアノ、またはＲおよびＲ’がＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールから単独で選択される‐Ｎ＝ＣＲＲ’などの、１つ以上の機能基で任意に置換されたアリールを言及する。

用語「ヘテロサイクル」は、単環（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、ナフタピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニル、インダニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）および環内にＮ、ＯまたはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を有する飽和、不飽和、または芳香族カルボサイクリック族を言及する。
用語「置換ヘテロサイクル」は、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミドまたはシアノなどで任意に置換されたヘテロサイクルを言及する。

用語「ヘテロアリール」または「ヘタリール」は、少なくとも１つの複素環が芳香族である、ヘテロサイクルを言及する。
用語「置換ヘテロアリール」は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミドまたはシアノなどの１つ以上の機能基で任意に一置換または多置換されたヘテロサイクルを言及する。
用語「シクロアルキル」は、３から１５の炭素を含有する環状または多環アルキル基を言及する。多環基では、これらは末端環の１つが芳香族（例えば、テトラリン、など）である場合がある複数の縮合環である場合がある。

用語「置換シクロアルキル」は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、トリフルオロメチル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルキルアルケニル、アルキル アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロへテロアルキル、ニトロ、スルフォアミドまたはシアノなどでの１つ以上の置換基から成るシクロアルキル基を言及する。

本明細書においてほとんど同じ意味で使われるように、用語「療法」および「治療」は、病気、疾患またはそのような状態に関連する症状を軽減し、それらの発症を予防し、それらの病理を改変する意図をもって行われる診療を言及する。したがって、療法および治療という用語は、最も広い意味で使用され、様々な段階の病気、疾患またはそのような状態の予防（予防法）、緩和、管理、軽減、または治療を含む。病気、疾患またはそのような状態の進行の予防または軽減は、これらの用語に含まれる。また、これらの用語に含まれるものとして、生体の生理機能および／または生物化学の改変をもたらす診療がある。療法／治療を必要とする者は、 病気、疾患またはそのような状態を既に有する者のみならず、 病気、疾患またはそのような状態になりやすい者、それらを発症する恐れがある者、および病気、疾患またはそのような状態が予防されている者も含む。したがって、本発明の化合物の治療への応用は、本明細書において定義されるように、療法または治療を言及する。

本明細書において使用されるように、「被検体」または「患者」は、人および他の哺乳類を含む、治療を必要とする動物を言及する。
１つ以上のさらなる治療薬との「併用」での本発明の化合物の投与は、同時（併用）投与および継続的投与を含むことを目的とする。継続的投与は、治療薬および本発明の化合物の被検体への様々な投与順を含むことを目的とする。

本明細書において使用されるように、用語「アジュバント療法」は、一次療法の効用を増加させるために追加される治療を言及する。癌において、アジュバント療法は、通常、全癌細胞を死滅させる可能性を増加させるための、手術（一次療法）の後に行われる化学療法、ホルモン療法または放射線療法を言及する。

本明細書において使用されるように、用語「ネオアジュバント療法」は、一次療法の前に行われる治療を言及する。ネオアジュバント療法の例として、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法がある。

本明細書において使用されるように、用語「約」は、正常値から＋／−１０％のばらつきを言及する。当該ばらつきは、特に言及されているかいないにか関わらず、本明細書において与えられる任意の値に常に含まれる。

I．２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリン化合物

本発明は、以下の一般式（I）の化合物、

またはその塩を提供し、

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、低アルキル、置換低アルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アシル、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ニトロ、シアノ、または‐Ｓ（Ｏ）_１‐２Ｒ（式中、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロサイクル、ヘテロアリール、置換ヘテロサイクル、または置換ヘテロアリールである）から単独で選択され、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、‐ＣＨ_２‐アリール、‐ＣＨ_２‐ヘテロアリールである。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７はＨであり、Ｒ２およびＲ６は上述されるとおりである。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_６‐Ｃ_１４アリールであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_６‐Ｃ_１４アリールで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、ヘテロ原子がＮであるＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_６‐Ｃ_１４アリール、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたＣ_６‐Ｃ_１４アリール、Ｃ_５‐Ｃ_６シクロアルキル、Ｃ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキル、またはポリシクロアルキルである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルコキシ、またはフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはシクロペンチルであり、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、ヘテロ原子がＮであるＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニル、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたフェニル、Ｃ_５‐Ｃ_６シクロアルキル、Ｃ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキル、またはアダマンタンであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、またはＣ_１‐Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、ヘテロ原子がＮであるＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_５‐Ｃ_６シクロアルキル、アダマンタン、フェニル、またはＣ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、またはＣ_１‐Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、アダマンタン、フェニル、または Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、またはＣ_１‐Ｃ_４Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはアダマンタンであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、ハロゲン、またはＣ_１‐Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_１‐Ｃ_４アルコキシであり、

Ｒ５は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、アダマンタン、フェニル、またはＣ_１‐Ｃ_４アルキルまたはハロで置換されたフェニルであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独で水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_１‐Ｃ_４アルコキシであり、
Ｒ５は、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、フェニルで置換されたＣ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_４‐Ｃ_６シクロアルキルであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキル、またはＣ_５‐Ｃ_６ヘテロシクロアルキルであり、および
Ｒ７は、Ｈである化合物である。

本発明の化合物は、これらに限定されないが、例となる以下の化合物を含む。

本発明は、薬学的に許容される塩などの、式Iで定義される化合物の様々な塩を含む。本発明による化合物は、十分に酸性、十分に塩基性、または両方の機能基を有し、それにより多数の有機および無機塩基、および／または有機および無機酸を反応して薬学的に許容される塩を形成する。

本明細書において使用されるように、用語「薬学的に許容される塩」は、生体に対して実質的に非毒性である式Iの化合物の塩を言及する。代表的な薬学的に許容される塩は、本発明の化合物の薬学的に許容されるミネラル、有機酸、有機または無機塩基との反応によって調製されるそれらの塩を含む。当該塩は、酸付加塩および塩基付加塩として周知される。

酸付加塩を形成するために通常使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸および／またはｐ‐トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ‐ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。当該薬学的に許容される塩の例として、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、塩酸塩、二塩酸塩、イソ酪酸エステル、カプリル酸塩、ヘプタン酸、プロピオラート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン‐１，４‐ジオエート、ヘキシン‐１，６‐ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、キシレンスルホン酸、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ‐ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン‐１‐スルホン酸塩、ナフタレン‐２‐スルホン酸塩、マンデル酸塩などがある。好ましい薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの無機酸で形成された塩、およびマレイン酸およびメタンスルホン酸などの有機酸で形成された塩である。

アミン基の塩は、アミノ窒素がアルキル、低アルケニル、置換低アルケニル、低アルキニル、置換低アルキニルまたはアラルキル部分などの、適当な有機基を持つ第四アンモニウム塩も構成する。

塩基付加塩は、アンモニウムまたはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などの、無機塩基から派生する塩を含む。したがって、本発明の塩を調製するために役立つ塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムなどがある。

当業者は、塩全体が薬理学的に許容され、対イオンが塩全体に望ましくない質を与えない限り、本発明の塩の一部を形成する特定の対イオンは通常重大な特質ではないということを認識する。本発明は、式Iの化合物の薬学的に許容される溶媒和物をさらに含む。多くの式Iの化合物は、水、メタノール、エタノールおよびアセトニトリルなどの溶媒と結合して、対応する水和物、メタノラート、エタノラートおよびアセトニトリラートなどの薬学的に許容される 溶媒和物を形成することができる。

本発明の化合物は、複数の不斉（キラル）中心を有する場合がある。これらのキラル中心の結果として、本発明の化合物は、ジアステレオマーおよびジアステレオマーの混合物のみならず、ラセミ化合物、光学異性体の混合物、および個々の光学異性体として発生する。すべての非対称形、個々の異性体およびその組み合わせは、本発明の範囲内である。

式Iの化合物の立体化学がその活性に重大であれば、後の立体異性体分離の問題を避けるため、化合物の相対立体化学は合成の間、早期に確立されるということを当業者は容易に理解する。その後、さらなる分子の操作には、望ましいキラリティーを維持するため立体特異的方法を使用する。

ＩＩ．式Iの化合物の調製

当技術分野で周知のように、本発明の化合物は、多数の標準的方法で調製することがきる。したがって、式Iの化合物は、例えば、Ｇｒｉｍｍｅｔｔ、（Ｇｒｉｍｍｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｒｅａｃｔｉｏｎ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ａ．Ｒ．ＫａｔｒｉｚｋｙおよびＣ．Ｗ．Ｒｅｅｓ、ｅｄｓ．、Ｖｏｌ．５、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４、ｐｐ．４５７‐４９８；Ｇｒｉｍｍｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ａｎｄ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ、１９９７）によって記述されるように、いくつかの一般的合成法で調製することがきる。

本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、酢酸中の酢酸アンモニウムの存在下において、式ＩＩのジオンをアルデヒド（III）と反応させ、溶液または固相合成によって調製される（例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．１９６７、２２ｂ、１３２；Ｓａｒｓｈａｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９６、３７、８３５‐８３８；Ｂｉａｎら、Ｓｙｎｔｈｓｉｓ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００３、３３、３４７７‐３４８２；Ｈｏｎｇ Ｘｕら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．、２００３、１１、２２６０‐２２６８；Ｈｏｎｇ Ｘｕら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００３、６、７６６‐７６８；Ｂｉａｎら、Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ、２００２、２１、３１３‐３１９； Ｃｈａｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．、２００１、１２、１９２０‐１９２６参照）。

式（ＩＩ）および（III）の化合物は市販されているか、当業者に周知の標準的な方法で調製される場合のいずれかである。式（ＩＩ）の化合物は、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６１、８３、４２０８‐４２１０）；Ｇｕｉｊａｒｒｏら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９、１２１、４１５５‐４１５７）；Ｃｈｉら（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍ．１９９４、２４（１５）、２１１９‐２１２２）およびＡｒｍｅｓｔｏら（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８８、７９９‐８０１）；Ｙａｍａｄａら（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．、１９９０、６３（９）、２７１０‐２７１２）；Ｈｉｏｒｔら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３、１１５、３４４８‐３４５４；およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４、４５（３３）、６３６１‐６３６３）によって記述されるように、いくつかの一般的合成法で調製することがきる。式（III）の化合物は、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒら（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９５８、９１、８５０‐８６１およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８５、８、６４１‐６４５）によって記述されるように、一般的合成法で調製されることができる。例えば、式（III）の化合物は、以下に示すように、式（ＩＶ）の化合物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のＰＯＣｌ_３で反応させることによって調製することがきる。

生産物（１）の分離および精製は、通常、水溶性塩を形成するそれらの性質に基づく。反応媒体が水で希釈されると、不純物は得られた溶液から無極性溶媒で抽出され、水層は塩基性化し、分離したイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリン（１）は、ろ過され、適当な溶媒から再結晶させられる。

式Iの化合物の試験

上述のように、本発明の方法で使用することを意図した式Iの化合物は、遷移金属をキレートし、癌細胞の増殖を阻害することができる。さらに、本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、癌細胞において、ＫＬＦ４などの遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させることができる。本発明のさらなる実施例では、式Iの化合物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導し、癌細胞に対して細胞毒性効果を及ぼす。

遷移金属をキレートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで新生細胞増殖を阻害する式Iの候補化合物の能力は、当技術分野で周知の標準的方法で試験することができる。同様に、腫瘍抑制遺伝子発現の増加および／または癌細胞においてアポトーシスを誘導する化合物の能力も、標準的方法で試験することができる。式Iの候補化合物を試験するための例となる方法は、以下および本明細書に含まれる実施例で提供される。当業者は、化合物を試験するための他の方法は当技術分野で周知であり、候補化合物を試験するためにも適しているということを理解する。

阻害活性を実証する式Iの化合物は、併用療法におけるそれらの潜在的な使用法を評価するため、様々な周知の化学療法薬とともにｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでさらに試験してよい。

式Iの化合物の金属キレート錯体も、本発明によって意図する。当該キレート錯体も、以下で記述される方法を使用して試験することができる。

Ａ．金属キレート化能力

本発明によると、式Iの化合物は、細胞環境において遷移金属イオンをキレートすることができる。１つの実施例では、式Iの化合物は、鉄、亜鉛、銅、ルテニウムおよびコバルトイオンをキレートすることができる。さらなる実施例では、式Iの化合物は、第１遷移金属イオンをキレートすることができる。さらなる実施例では、式Iの化合物は、鉄、亜鉛および銅イオンをキレートすることができる。本発明のもう１つの実施例では、式Iの化合物は、亜鉛イオンをキレートすることができる。もう１つの実施例では、式Iの化合物は、銅イオンをキレートすることができる。

式Iの化合物の金属キレート性は、これらに限定されないが、Ｘ線結晶法、ＮＭＲ分光法、蛍光分光、原子吸光分光法（ＡＡＳ）、電子常磁性共鳴分光法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、複合液体クロマトグラフィー／質量分析法、および電位差滴定法を含む、当技術分野で周知の様々な方法で判断することができる。

例えば、過酢酸（ＰＡＡ）は、マンガン、鉄または銅などの金属イオンの存在下で急速に分解される。金属イオンの存在下でPＡＡ溶液を安定させるためのキレート化合物の効率性は、その化合物の金属キレート能力を判断するために評価することができる。つまり、金属イオンを含有する水溶液を調製し、式Iの候補化合物の適量を溶液に加え、その後、ｐＨおよび温度を調節することができる。そして、式Iの化合物を含有するPＡＡ溶液の安定性の後に、ヨウ素還元滴定が続く。金属キレート化能力を判断する他の試験は、金属イオン選択電極を用いる、
金属イオンを含有する溶液における非キレート金属イオンの測定およびキレート化合物の測定を含む。つまり、金属を含有する溶液はキレート化合物を含有する溶液で滴定され、その後、非キレート金属イオンの量を判断するために金属選択電極で測定し、それによって、式Iの化合物の金属キレート能力が表れる。

式Iの化合物の金属キレート化の性質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ４（２‐ビリジルアゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）金属結合アッセイを使用した分光光度法でも評価することができる。ＰＡＲは、市販されている染料であり、最大吸収度が約５００ｎｍのＭｇ、Ａｌ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｔｈ、Ｕ、Ｎｐおよび特定のｐＨ値のランタニドの陽イオンを有する溶性または不溶性の色の付いた錯体を形成する三座または二座配位子として作用する。式Iの化合物の金属キレート化の性質を判断するため、金属イオンの存在下で形成する得られたＰＡＲ‐金属イオン錯体は、約５００ｎｍで分光光度法によって測定することができ、式Iの化合物を含有するサンプルにおいて形成するＰＡＲ‐金属イオン錯体と、例えば、周知のキレート剤を含有するサンプルおよび／または式Iの化合物は含有しないが対照媒体を含有するサンプルなどの対照サンプルを比較することができる。

細胞環境において遷移金属をキレートする式Iの化合物の能力は、例えば、ｚｉｎｑｕｉｎまたはＰｈｅｎ Ｇｒｅｅｎ ＳＫなどの特定の蛍光指示薬を使用して、候補化合物の存在下または非存在下で細胞内の亜鉛、 キレート可能な鉄または銅の貯留を測定するなど、当技術分野で周知の方法で評価することができる（例えば、Ｚａｌｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９３、２９６（Ｐｔ２）、４０３‐ ８；およびＰｅｔｒａｔら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、３８３（３‐４）、４８９‐５０２参照）。さらに、細胞環境における式Iの化合物の金属キレート能力は、例えば、Ｇｏｗｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９、１８０、１２６‐１３０；ＯｌｌｉｎｇｅｒおよびＲｏｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７、２７２、２３７０７‐２３７１１；ＦｌａｔｍａｒｋおよびＴａｎｇｅｒａｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｂｒｏｗｎ、Ａｉｓｅｎ、ＦｉｅｌｄｉｎｇおよびＣｒｉｃｈｔｏｎ、ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：Ｇｒｕｎｅ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ）、１９７６、ｐｐ．３４９‐３５８；Ｋｏｚｌｏｖら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ、Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９２、１３、９‐１６；ＣａｍｍａｃｋおよびＣｏｏｐｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９９３、２２７、３５３‐ ３８４．Ｙｅｇｏｒｏｖら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９３、１５、５６５‐５７４；Ｃａｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５、２７０、７００‐７０３；およびＮｉｅｌｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３、２５、２２３‐２３２、によって記述されるように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光光度検出、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）または原子吸光分光法などの方法を使用して、細胞内のキレート可能な 金属イオンの貯留を測定することによって、細胞抽出物、単離細胞、組織または体液などの様々な生体サンプルにおいて評価することができる。

細胞環境における式Iの化合物の金属キレート化能力は、候補化合物および様々な濃度の金属イオンの存在下で、細胞成長、金属制御に関連する遺伝子発現の変化、細胞毒性、酵素アッセイ、または当技術分野で周知の他の測定可能な評価項目を評価することによって間接評価することもできる。例えば、式Iの化合物の金属キレート化能力は、候補化合物の存在下および非存在下で細胞の金属貯留を操作し、細胞成長の変化を測定することによって、培養細胞または動物一体において評価することができる。

それに代わって、あるいは、細胞成長の変化の測定に加え、周知の金属制御された遺伝子、またはメタロチオネインや金属転写因子‐１などの金属調節タンパク質の遺伝子発現の変化を、当技術分野で周知の標準プロトコルを使用して判定することができる。当技術分野で周知のように、メタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質の発現は、細胞内の亜鉛濃度によって厳重に制御される。亜鉛の金属転写因子（ＭＴＦ‐１）への結合によって、ＭＴのプロモーターにおいて、ＭＴＦ‐１が金属応答エレメント（ＭＲＥ）に結合できるようになり、次にＭＴ‐遺伝子転写が開始する。それにより、ＭＴまたはＭＴＦ‐１の発現を調節する式Iの化合物の能力は、化合物の金属キレート能力の表れとして判断することができる。当技術分野で周知の他の金属制御された遺伝子として、例えば、鉄レベルで制御される、鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）、フェリチン、またはトランスフェリン受容体をコード化する遺伝子（例えば、ＥｉｓｅｎｓｔｅｉｎおよびＢｌｅｍｉｎｇｓ、Ｊ．ＮｕｔＲ １９９８、１２８（１２）：２２９５‐２２９５；およびＭａｒｔｉｎｉら、Ｊ．ＮｕｔＲ ２００２、１３２（４）：６９３‐６９６参照）、および亜鉛レベルで制御される、亜鉛輸送タンパク質‐１をコード化する遺伝子がある（例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｊ．ＮｕｔＲ ２００４、１３４（１）：５７‐６２；およびＬａｎｇｍａｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５（４４）：３４８０３‐２４８０９参照）。

Ｂ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験

i）癌細胞増殖の阻害

式Iの候補化合物は、標準的方法を使用して癌細胞の増殖を阻害するそれらの能力に対して、まずはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。

一般的に、癌細胞の増殖を阻害する式Iの候補化合物の能力は、以下のように測定することができる。特定の被検癌細胞株の細胞は、適当な密度（例えば、約１×１０^４）に培養され、様々な濃度の候補化合物が追加される。適切な培養時間（通常、約４８から７４時間）の後、例えば、テトラゾリウム塩（または修飾テトラゾリウム塩）切断の測定、またはレザズリン還元試験（Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（１９９３）Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．１１：４８‐５０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：５４２１‐５４２６および米国特許第５，５０１，９５９号）、スルホローダミンアッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１３‐１１８）、天然赤色素試験（Ｋｉｔａｎｏら（１９９１）Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｇ．２１：５３‐５８；Ｗｅｓｔら（１９９２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍ．９９：９５‐１００）またはＸＴＴアッセイなどで、細胞生存が評価される。細胞増殖の阻害は、処理した培養における細胞生存と例えば、候補化合物で前処理されていない培養、対照媒体で前処理されている培養および／または対照化合物（通常周知の治療）で前処理されている培養など、１つ以上の対照培養における細胞生存の比較によって判断される。

代謝活性を測定する、当技術分野で周知の他のアッセイ（テトラゾリウムベースのアッセイ）は、増殖性細胞が代謝的に静止細胞より活性であれば、細胞増殖に対する候補化合物の効果を評価するためにも使用することができる。

候補化合物は、腫瘍細胞の足場非依存性増殖を阻害するそれらの能力をｉｎ ｖｉｔｒｏでも試験することができる。足場非依存性増殖は、腫瘍原性の良い指標になることで当技術分野で周知である。一般的に、足場非依存性増殖は、適切な癌細胞株からの細胞を軟寒天上にプレートし、切な培養期間後に形成されたコロニーの数を判断することによって評価される。その後、候補化合物で処理した細胞の成長は、（上述のように）適切な対照で処理した細胞と比較される。

式Iの化合物を試験するのに適当な各種の癌細胞株は市販されており、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）現在７００以上の異なるヒト癌細胞株を供給すし、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＣＩ‐Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）はＮＣＩ‐ＮＩＨスクリーンで使用されるヒト癌細胞株を含む様々な哺乳類細胞株を供給する。

式Iの化合物を試験するために使用される適当なヒト癌細胞株の例として、これらに限定されないが、ＨＴ‐１３７６、ＨＴ‐１１９７、およびＨｓ１９５．Tの膀胱癌細胞株、ＣａＣｏ、ＣＯＬＯ３２０、ＨＣＴ‐１１６、ＬｏＶｏ、ＮＣＩ‐Ｈ４９８、ＮＣＩ‐Ｈ５４８およびＳＮＵ‐Ｃ２Ｂなどの結腸および結腸直腸の腺癌および癌細胞株、ＨｕＴｕ８０の十二指腸癌細胞株、Ｈｓ７４０T、ＡＧＳ、Ｈｓ７４６Ｔ、ＮＣＩ‐Ｎ８７、ＮＣＩ‐ＳＮＵ‐１およびＲＦ‐４８の胃の腺癌および癌細胞株、ＮＣＩ‐Ｈ６６１およびＮＣＩ‐Ｈ１５８１の大細胞肺癌細胞株、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ、ＬＮＣａＰ‐ＦＧＣおよび２２ＲｖＩの前立腺の腺癌および癌細胞株、ｒａｊｉ、ＮａｍａｌｗａおよびＨＳ ＳｕｌｔａｎのＢｕｒｋｉｔｔｓリンパ腫（非ホジキン）細胞株、Ｕ‐９３７の組織球性リンパ腫細胞株、Ｊｕｒｋａｔの急性リンパ性白血病（Ｔ‐ＡＬＬ）細胞株、Ｋａｒｐａｓ２９９のＴ細胞リンパ腫細胞株、Ｌ‐３６３のプラズマ細胞白血病細胞株、およびＮＣＩ‐Ｈ６３０およびＳＷ８３７の直腸の腺癌および癌細胞株がある。薬剤耐性癌細胞株は、薬剤耐性または多剤耐性新生腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する本発明の化合物の能力を判断するためにも使用することができる。

式Iの候補化合物の差別的新生物選択性も試験することができ、すなわち、通常の増殖性細胞と比較して、新生腫瘍（または癌）細胞に対するいくつかのレベルの選択作用を実証する化合物の能力のことである。化合物に対する正常細胞と癌細胞の感受性差を評価する例となる方法は、Ｖａｓｓｉｌｅｖら（Ａｎｔｉ‐Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（２００１）１６：７）によって記述されている。この方法は、ＩＣ_９０値の比較を含み、すなわち、対数増殖期細胞の９０％の成長阻害を引き起こすために必要な試験化合物のモル濃度のことである。したがって、候補化合物のＩＣ_９０値は、様々な癌細胞株（上記のような細胞株）および正常細胞（ＨＵＶＥＣおよび／またはＷＩ３８細胞）において評価し、比較することができる。ＩＣ_９０値は、当技術分野で周知の様々な標準的方法で測定することができる。癌細胞選択性は、すべての正常培養細胞株に対する平均ＩＣ_９０とすべての癌細胞株に対する平均ＩＣ_９０の比率として計算される。ＩＣ９０率（正常／癌）が＞４の化合物は、癌細胞に対して選択性があると考えられる（Ｌ．Ｔ．Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ａｎｔｉ‐Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、２００１、１６：７‐１７）。

本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、１つ以上の白血病細胞、前立腺癌細胞、非小細胞肺癌細胞および大腸癌細胞の増殖を選択的に阻害する。候補化合物の選択性は、ＮＣＩ‐ＮＩＨ治療薬剤プログラムｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーンで使用されるヒト癌細胞株を使用して評価される。このスクリーンで使用される癌細胞株は、上の表１に表示される。

本発明の実施例によると、化合物は、化合物が、乳癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌および腎臓癌のそれぞれからの培養細胞株の阻害に対する平均ＧＩ_５０より少なくとも１０％低い平均ＧＩ_５０を有する選択された癌（すなわち、前立腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌および／または白血病）からの培養細胞株の増殖を阻害するとき、選択された癌の選択的阻害を示す。１つの実施例では、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞および／または白血病細胞に対する平均ＧＩ_５０は、乳癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌および腎臓癌のそれぞれからの培養細胞株の阻害に対する平均ＧＩ_５０より少なくとも１５％低い。もう１つの実施例では、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞および／または白血病細胞に対する平均ＧＩ_５０は、乳癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌および腎臓癌のそれぞれからの培養細胞株の阻害に対する平均ＧＩ_５０より少なくとも２０％低い。

ＧＩ_５０の計算法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｏｙｄ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ：Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｖｌｅｒｉｏｔｅ，Ｆ．Ａ．；Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｔ．Ｈ．；Ｂａｋｅｒ，Ｌ．Ｈ．、Ｅｄｓ．；Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｈｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、１９９２およびＭｏｎｋｓ，Ａ．ら（１９９１）ＪＮＣＩ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３、７５７‐ ７６６；ｐｐ．１１‐３４参照）。当技術分野で記述されるように、ＧＩ_５０は、ゼロ時間での細胞計数に対するＧＩ_５０の計算における補正を強調するＧＩ_５０値（５０％の成長阻害を引き起こす濃度）の改名である。したがって、ＧＩ_５０は、以下の候補化合物の濃度であり、
１００×（Ｔ−ＴＯ）（Ｃ−ＴＯ）＝５０
そして、試験薬への４８時間の暴露後の試験ウェルの光学濃度はＴ、ゼロ時間の光学濃度はＴＯ、および対照光学濃度はＣである。

例えば、ＮＣＩで現在使用されている以下の手順は、選択された癌細胞株において式Iの候補化合物のＧＩ_５０を評価するために使用することができる。つまり、細胞懸濁液は希釈され（１つのウェルにつき５０００から４０，０００細胞）、１００μＬの希釈細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートに加える。安定化のために、植菌は、３７℃で２４時間の前培養期間が許される。候補化合物の目的とする試験濃度の２倍の希釈物は、ゼロ時間に１００μＬの分割量でマイクロタイタープレートウェルに加えられる。試験化合物は、通常、５つの１０倍希釈で評価される。通常の試験では、最高ウェル濃度は、通常１０Ｅ‐４Ｍであるが、これは試験される化合物によって調整される場合がある。細胞は、５％のＣＯ_２大気および１００％の湿度で４８時間、試験化合物とともに培養される。その後、細胞は、光学濃度を読み取るために使用されるプレートリーダーを使用して、スルホローダミンＢアッセイ（例えば、Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．ら（１９９０）ＪＮＣＩ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２、１１０７‐１１１２；およびＣｈｅｎ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３１、Ａ２６４４参照）で試験する。

ii）遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させる能力

本発明の１つの実施例によると、式Iの化合物は、癌細胞において遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させる。もう１つの実施例では、式Iの化合物は、腫瘍抑制遺伝子の発現が下方制御された癌細胞において、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させる。癌細胞における遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現増加または上方制御された発現は、処理した細胞に対する非処理の細胞における遺伝子の発現の増加パーセントとして判断することができる。１つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約１０％増加させる。もう１つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約２０％増加させる。他の実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約２５％、５０％、７５％または１００％増加させることができる。

癌細胞における遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現の増加または上方制御は、癌細胞における遺伝子発現の「倍」の増加または上方制御としても判断することができ、非処理の癌細胞における遺伝子発現が「１」と示され、処理した癌細胞における遺伝子発現の個々の「倍」の増加が非処理の癌細胞における個々の遺伝子発現に対して示される。本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約１．５倍増加または上方制御することができる。もう１つの実施例では、式Iの化合物は、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を約２倍に増加させることができる。

本発明のもう１つの実施例では、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子はＫＬＦ４である。ＫＬＦ‐４などの腫瘍抑制遺伝子の発現を調節する候補化合物の能力は、ＫＬＦ４ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの変化を測定することによって評価することができる。これらのアッセイ方法は、当技術分野で周知である。

例えば、候補化合物は選択された癌細胞株へ導入することができ、関連する腫瘍抑制遺伝子から転写したｍＲＮＡの量は、ノーザンブロット分析、ＲＴ‐ＰＣＲなどの標準的方法によって測定することができる。あるいは、細胞で生産された腫瘍抑制タンパク質の量は、ウエスタンブロット分析などの標準的方法によって測定することができる。その後、候補化合物で処理した細胞において生産されたｍＲＮＡまたはタンパク質の量は、対照細胞において生産された量と比較することができ、化合物が腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害した成功度を表す。適当な対照細胞には、例えば、非処理の細胞および／または対照化合物で処理した細胞がある。あるいは、候補化合物は、複数の遺伝子の発現を選別するための標準方法を使用して、選択された癌細胞株における遺伝子発現増加させるそれら化合物の能力に関して選別することができる（「発現プロファイリング」）。当該方法は当技術分野で周知であり、例えば、発現が化合物に影響を受けた遺伝子の適当な機能群を同定するため、１０倍（例えば、１９，０００）のヒト遺伝子を含有する高密度マイクロアレイアッセイなどのマイクロアレイ解析がある。

通常、発現プロファイリングは、短いＤＮＡ配列またはオリゴヌクレオチドの既成マイクロアレイを活用する。マイクロアレイの構築方法は、当技術分野で周知である［例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ、ＮＹ．（１９８９および最新版）参照］。 代案として、マイクロアレイは、例えば、周知の腫瘍抑制遺伝子に対応する配列を含むために、特注することができる。予め作られたマイクロアレイは、例えば、ＧｅｎｅＣｈＩＰ（登録商標）（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ａｔｌａｓ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ‐ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＧＥＭ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、ＧｅｎｅＪｅｔ（登録商標） ａｒｒａｙ ａｎｄ ＬｉｆｅＳｅｑ（登録商標）（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＭＩＣＲＯＭＡＸ（登録商標）ヒトｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＲｅｓＧｅｎ（登録商標） ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａ．）など、多くの有機体に対しても市販されている。発現解析に対して、ＲＮＡは候補化合物で処理した細胞および対照細胞から単離させる。必要であれば、ＲＮＡは、分析のために十分な量を確保するため従来の方法によって増幅することができる。その後、ＲＮＡは適当な条件の下、マイクロアレイに交配し、市販のスキャナーおよびソフトウェアによるマイクロアレイの通常分析を行い、発現が対照細胞に対して処理された細胞において変更される遺伝子を同定する。適当な交配条件は、標準的方法を使用して当業者によって容易に判断することができる。当該の他の遺伝子の同定に続き、ｍＲＮＡ定量および個々のタンパク質レベルは、研究中の遺伝子に対する化合物の効果の程度を判断するためにも評価することができる。

iii）アポトーシスの誘導

本発明によるとのもう１つの実施例では、式Iの化合物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導することができる。アポトーシスを誘導する候補化合物の能力の評価方法は、当技術分野で周知であり（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００および最新版、Ｋ．Ｍｏｒｇａｎ、ｅｄ．、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照）、例えば、ＤＮＡフラグメンテーション解析、アネキシンＶ‐ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム染色法を併用するフローサイトメトリー、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴアッセイ）によるＤＮＡ鎖切断の蛍光色素標識およびフローサイトメトリーによる分析、フローサイトメトリーによる検出、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いての免疫細胞化学による原位置での検出、ポリ（ＡＤＰ‐ｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク質分解的切断またはタンパク質分解の免疫組織化学的またはフローサイトメトリー検出、および／またはシステイニル‐アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化の検出を含む。

例えば、アポトーシスに対する式Iの化合物の効果は、一定時間、候補化合物で細胞を培養し、アネキシンＶ‐ＦＩＴＣ‐ヨウ化プロピジウム法を使用してサイトメトリ解析を行うことによって評価することができる。アポトーシスへの参入により、内葉から原形質膜の細胞外側へとホスファチジルセリンの転座が生じる。高親和性によってホスファチジルセリンと結合するタンパク質であるアネキシンＶは、このアポトーシス誘導の膜変化を検出するために使用することができる。ＤＮＡ結合染料のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、容易に非生存細胞に入り、染色するが、生存細胞の膜を越えることはできない。したがって、アネキシンＶのみで染色される細胞は初期アポトーシスであるとみなされ、一方、アネキシンＶおよびＰＩの両方で染色された細胞は後期アポトーシスであるとみなされる。ＰＩのみで染色された細胞は非生存とみなされるが、染色されていない場合は生存細胞を示す。

化合物の作用の潜在的な機序を研究するためのアッセイは、化合物が腫瘍成長のどの状況に影響を与えるかを判断する際に役に立つ情報を提供するため、必要に応じて行われる場合がある。この種の情報は、化合物による治療が有効である癌型を判断するために役立つ場合がある。当該アッセイの例として、これらに限定されないが、細胞周期解析（例えば、フローサイトメトリー方法を使用）、抗血管新生アッセイ（例えば、コード形成およびマトリゲルプラグアッセイなどの様々なマトリゲルアッセイ）および免疫組織化学法がある。

Ｃ．Ｉｎ ｖｉｖｏ試験

ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長、増殖および／または転移を阻害する候補化合物の能力は、当技術分野で周知の標準的方法を使用する適切な動物モデルにおいて判断することができる（例えば、Ｅｎｎａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照）。例となる手順は、以下または実施例において提供される。

例えば、候補化合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ホローファイバーアッセイを使用して試験することもできる（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ，Ｍ．ら（１９９５）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、５７：１３１‐１４１；およびＤｅｃｋｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４０：８２１‐８２６（２００４））。このアッセイでは、ホローファイバー（フッ化ビニリデン樹脂、ＰＶＤＦ）で成長する細胞をマウスの様々な体区画に移植する。１２の腫瘍細胞株の標準パネルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を示す、候補化合物のホローファイバースクリーニングに使用することができる。これらの細胞株は、ＮＣＩ‐Ｈ２３、ＮＣＩ‐Ｈ５２２、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５、ＳＷ‐６２０、ＣＯＬＯ２０５、ＬＯＸ‐ＩＭＶＩ、ＵＡＣＣ‐６２、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ５、Ｕ２５１およびＳＦ‐２９５を含んでよい。

さらに、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏの部分で上げられた株などの代替株は、化合物の特別な試験に使用することができる。細胞株は、標準プロトコルに従って培養し、繊維は細胞をＰＶＤＦの繊維に流し、２ｃｍ間隔でシールすることによって調製する。これらのシールから生成されるサンプルは、組織培養基上に置き、移植前２４から２８時間、５％ＣＯ_２、３７℃で培養する。各マウスに３腹腔内移植（各腫瘍株１つずつ）および３つの皮下移植（各腫瘍株１つずつ）を行うため、各実験用に合計３つの異なる腫瘍株を調製する。移植当日、ゼロ時間細胞量を把握するため、各瘍細胞株の製剤のサンプルは、生存細胞量に対して、例えば、安定した評価項目ＭＴＴアッセイなどによって定量する。マウスは３または４日目から実験用薬剤で処理し、その後繊維移植を行い、毎日４日間継続する。各薬剤は、２つの投与レベルで腹腔内注射にて投与する。繊維は、４回目の化合物治療の次の日にマウスから収集し、安定した評価項目ＭＴＴアッセイに使用する。各サンプルの光学濃度は、５４０ｎｍの分光光度法で判断し、各治療群の平均を計算する。各治療群における各細胞株の最終成長パーセントを計算し、媒体処理された対照における最終成長率と比較する。媒体対照サンプルと比較して、処理されたサンプルにおける最終成長率の５０％以上の減少を陽性とみなす。各陽性結果はスコア２の得点であり、任意の化合物に対して全得点を合計する。１つの薬剤に対する最大可能得点は、９６である（１２の細胞株×２つの部位×２つの投与レベル×２［点］）。

ホローファイバーアッセイにおいて最初に選別された候補化合物は、ｉｐ＋ｓｃの合計スコアが２０点以上、ｓｃスコアが８点以上、または評価されたいずれかの投与レベルで任意の細胞株の細胞殺滅を起こした場合、続いて異種移植モデルにおいて試験する場合がある。この得点システムは、活性化の状態の現在の「標準」薬剤を獲得すると見込まれている検出レベルを示すため、ＣＴＥＰのＤＣＴＤＣ統計学者によって検証されている。

あるいは、式Iの化合物は、直接、異種移植モデルにおいて試験することができる。ヒト腫瘍が動物に移植されている異種移植モデルは、候補化合物の抗癌活性を評価するための標準モデルである。ヒト癌の異種移植モデルの例として、これらに限定されないが、腫瘍成長アッセイで使用される、皮下注射または移植によって埋め込まれたヒト固形腫瘍異種移植片、腫瘍成長アッセイで使用される、脂肪体注射によって移植されたヒト固形腫瘍同種移植片、腫瘍成長アッセイで使用される、関連する組織に直接移植されたヒト固形腫瘍同所異種移植片、生存アッセイで使用される、静脈注射による固形腫瘍または白血病の播腫性疾患モデル、生存アッセイで使用されるマウスにおけるリンパ腫および白血病の実験モデル、およびマウスにおける肺転移の実験モデルがある。移植ヒト腫瘍細胞に加えて、異種移植モデルは、抗癌免疫応答の評価を可能にする移植ヒト末梢血白血球を更に構成することができる。様々な異種移植モデルにおいて、移植ヒト腫瘍細胞は、原発腫瘍細胞または細胞株由来の腫瘍細胞となり得る。

異種移植モデルには、いくつかの宿主動物の選択肢があり、これらに限定されないが、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、無胸腺ヌードマウスおよび無胸腺ラットの使用がある。非肥満性糖尿病／重症複合免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）は、例えば、白血病および／またはリンパ腫細胞などの血液癌細胞の移植に対する様々な異種移植モデルに使用可能な他の宿主動物の代わりとなる。

あるいは、ネズミ癌モデルは、抗癌化合物の選別に使用することができる。適切なネズミ癌モデルの例は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、ネズミ癌細胞が静脈、皮下、脂肪体または同所注射で移植された移植モデル、マウス転移モデル、遺伝子導入マウスモデル、およびノックアウトマウスモデルがある。候補化合物の効果は、正常マウスにおける自然発生癌に対しても評価することができる。

例えば、候補化合物は、０日目に３０から６０ｍｇの腫瘍の断片または適切な数の腫瘍細胞（例えば、約１０^６〜１０^７）を皮下移植または注射したマウスを使用して、固形腫瘍に対してｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。担癌動物は、様々な治療や対照に使用される前に混合される。進行性腫瘍の治療の場合、腫瘍は目的とする大きさまで成長させ、十分に成長していない腫瘍を有する動物は除外する。選択された動物は、治療および対照を受けるために無作為に分配する。非担癌動物は、腫瘍に対する特定の効果から毒性効果を引き離すことを可能にするため、担癌動物と同じ治療にも使用する場合がある。通常、化学療法は、腫瘍の種類によって移植後３〜２２日に開始し、動物は毎日観察する。候補化合物は、例えば、ボーラス投与などによって動物に投与することができる。異なる動物群は、最大体重減少に達成するまで週に約３〜４回体重を測定し、その後、群は試験終了時まで週に少なくとも１回体重を測定する。

腫瘍が所定の大きさおよび／または重さに達するまで、または所定の時間が経つまで、または動物が死亡する（腫瘍が所定の大きさ／重さに達する前これが起こった場合）まで、腫瘍は週に約２〜３回測定する。その後、動物は死亡させ、組織像、大きさおよび／または腫瘍の増殖が評価される。

薬剤耐性腫瘍に対する候補化合物の効果は、異種移植実験において、薬剤耐性または多剤耐性癌細胞を使用してｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。

リンパ腫または白血病などの血液腫瘍に対する候補化合物の効果の研究では、動物は特定の数の細胞を移植または注射され、対照に対して処理されたマウスの生存時間の増加によって抗腫瘍活性を判断する。白血病異種移植モデルにおける病気の負担の評価は、フローサイトメトリーまたは連続する血液サンプルからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、細胞表面マーカーまたは白血病特異遺伝子の発現などの、白血病の様々な指標を測定することによっても行うことができる。

腫瘍転移に対する候補化合物の効果を研究するために、腫瘍細胞は、通常、ｅｘ ｖｉｖｏで化合物で処理し、その後、適当な試験動物へ注射される。その後、注射部位からの腫瘍細胞の拡大は、適当な期間観察する。

他の化学治療薬と併用で作用する、または腫瘍をその効果に敏感にさせる候補化合物の能力は、上記のモデルにおいても試験することができる。この場合、試験動物は、化学治療薬および式Iの候補化合物の両方で処理する。対照動物は、化学療法薬のみで処理した動物、候補化合物のみで処理した動物および／または非処理の動物を含む。

式Iの化合物のＩｎ ｖｉｖｏでの毒性効果は、例えば、治療中に動物の体重に対するそれらの効果を測定する、および動物を死亡させた後に血液学的プロファイルおよび肝臓酵素分析を行うことによって、標準的方法を使用して評価することができる（生存アッセイ）。

表２：ヒト癌のｉｎ ｖｉｖｏモデルの例

さらに、必要に応じて、遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現レベルに対する式Iの化合物の効果は、例えば、腫瘍抑制因子ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの変化を測定することによって、試験動物からの腫瘍で評価することができる。これらのアッセイの実施法は、上述のように当技術分野で周知である。

必要に応じて、１つ以上の標準的免疫組織化学試験は、腫瘍成長、分化、アポトーシスおよび／または血管形成に対する化合物の効果を判断するために、試験動物から分離した組織に対しても行われる場合がある。当該試験の例として、これらに限定されないが、特定の抗体の使用（例えば、増殖を評価するＫｉ‐６７に対する抗体、血管形成を評価するＣＤ３１に対する抗体、ＮＫ細胞の存在を示すＮＫｌ．１に対する抗体、マクロファージの存在を示すＦ４／８０に対する抗体）およびアポトーシスを判断するためのＴＵＮＥＬアッセイがある。

Ｄ．毒性試験

式Iの化合物は、必要に応じて、毒性試験も行うことができる。潜在的な薬剤に対する毒性試験は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｙｅｓ，Ａ．Ｗ．、ｅｄ．、（１９９４）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、３ｒｄ．ｅｄ．、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｍａｉｎｅｓ，Ｍ．、ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ参照）。

式Iの化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの急性毒性試験は、哺乳類の細胞株（例えば、Ｅｋｗａｌｌ，Ｂ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９８３）４０７：６４‐７７参照）を使用して行うことができる。適切な細胞株の選択は、候補化合物の潜在的な適用により、当業者によって容易に判断できる。例えば、これらの試験は、市販の担体の存在下における式Iの化合物でのヒト初代線維芽細胞の治療を含む。その後、細胞は異なる時間で試験を行い、トリパンブルー排除アッセイ、ＸＴＴまたはＭＴＴアッセイなどの標準的生存能力アッセイを使用して細胞の生存能力に対する治療を行う。細胞は、例えば、チミジン混入アッセイなどを使用してＤＮＡを合成するそれらの能力に対して検査もでき、例えば、血球計算細胞分別機（ＦＡＣＳ）を併用する標準的細胞分別アッセイを使用して、細胞周期の動力学的変化に対しても検査できる。

Ｉｎ ｖｉｖｏ毒性試験は、例えば、様々な濃度の候補化合物を適切な動物モデルに注射するなどの標準的手順によって行うことができる。化合物は一度注射することができ、または投与は数日にわたって反復することができる。化合物の毒性効果は、動物の死亡率、行動、外観および体重の変化を観察することによって、適切な期間に評価することができる。評価期間の終了後、動物は死亡させ、関連する器官の外観および重さを判断ることができる。必要であれば、例えば、例えば、血液学的プロファイル、組織学および肝臓酵素分析などの追加評価が行われる場合がある。化合物の毒性の表れは、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌試験の間に得られる場合がある。

式Iの化合物の遺伝毒性は、必要であれば、変異原作用を選別するためのエームズアッセイ、哺乳類の細胞株において遺伝子突然変異を誘導する被験物質の能力を判断するためのマウスリンパ腫アッセイ、例えば、ＤＮＡ再構成または被験物質による損傷を判断するためのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ染色体異常アッセイなどの標準的方法によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができる。他のアッセイとして、被験物質によって誘導された染色体の腕の間での交換を判断する姉妹染色分体アッセイ、および染色体または紡錘体への損傷を判断するｉｎ ｖｉｔｒｏマウス小核アッセイがある。式Iの化合物の遺伝毒性は、必要であれば、ｉｎ ｖｉｖｏ姉妹染色分体交換アッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏ小核アッセイ、またはｉｎ ｖｉｖｏ染色体異常アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでも評価できる。これらのアッセイおよび標準的アッセイの手順は当技術分野で周知であり、例えば、化学薬品の試験に関するＯＥＣＤガイドラインおよびＩＳＯによって開発された手順を参照すること。

IV．式Iの化合物の使用

式Iの化合物は、被検体における癌の治療、安定または予防に使用することができる。これに関連して、化合物は、細胞毒性または細胞静止効果を及ぼし、腫瘍の大きさの減少、腫瘍拡大の減速または予防、腫瘍の消失または切除からその再発までの無病生存時間の延長、腫瘍初発または続発の予防（例えば、転移）、進行時間の延長、腫瘍に伴う１つ以上の悪い症状の軽減、または癌にかかっている被検体の全生存時間を延長させる。本発明の１つの実施例によると、式Iの化合物は、癌細胞におけるアポトーシスの誘導により癌細胞に対する細胞毒性効果を及ぼす。

例となる腫瘍には、これらに限定されないが、白血病、骨髄腫およびリンパ腫などの血液腫瘍、腺癌および扁平上皮細胞癌などの癌腫、黒色腫および肉腫がある。癌腫および肉腫は、多くの場合、「固形腫瘍」として称される。一般に存在する固形腫瘍の例として、これらに限定されないが、脳、胸、首、結腸、頭頸、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、胃および子宮の癌、非小細胞肺癌および結腸直腸癌がある。様々な形のリンパ腫は、固形腫瘍の形成も引き起こす場合があり、そのため、多くの場合、固形腫瘍ともみなされる。

本発明の１つの実施例は、１つ以上の前立腺癌、非小細胞肺癌、大腸癌および白血病の治療における式Iの化合物の使用を提供する。さらに、本発明の１つの実施例によると、式Iの化合物は、癌細胞において遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させるための癌の治療において使用することもできる。特定の実施例では、式Iの化合物は、金属制御された腫瘍抑制遺伝子ＫＬＦ４を、消化（ＧＩ）管、膀胱癌および白血病の癌を含む、腫瘍抑制因子として機能する癌を治療、安定または予防するために使用する。消化管の癌は、胃癌、食道癌、小腸癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌および肛門癌を含む。

１つの実施例では、本発明は、癌細胞における遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させるための式Iの化合物の使用も提供する。もう１つの実施例では、本発明は、癌細胞におけるＫＬＦ４腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させるための式Iの化合物の使用を提供する。

したがって、本発明の１つの実施例によって治療することができる癌は、これらに限定されないが、白血病、そして扁平上皮細胞癌などの腺癌および癌腫を含む。癌腫は、上述のように、多くの場合は「固形腫瘍」としても称され、本発明によって治療することができる一般に存在する固形腫瘍の例として、これらに限定されないが、肛門癌、膀胱癌、大腸癌、結腸直腸癌、十二指腸癌、胃癌、肺（非小細胞）癌、食道癌、前立腺癌、直腸癌および小腸癌がある。それにより、本発明の１つの実施例は、白血病、膀胱癌、肺（非小細胞） 癌、前立腺癌および、これらに限定されないが、肛門癌、大腸癌、結腸直腸癌、十二指腸癌、胃癌、食道癌、直腸癌および小腸癌を含む消化管の癌の群から選択される癌の治療における式Iの化合物の使用を提供する。

用語「白血病」は、造血臓器の進行性、悪性疾患を広く言及する。白血病は、通常、血液および骨髄における白血球および前駆体の増殖および成長障害と特徴付けられるが、未熟赤血球を襲う赤白血病などの他の血球の悪性疾患とも言及することができる。白血病は、一般的に、（１）病気の期間および性質‐急性または慢性、（２）関連する細胞型‐骨髄性（骨髄系）、リンパ性（リンパ系）または単球性、および（３）血液‐白血性または非白血性（亜白血性）における異常細胞数の増加または非増加、に基づいて臨床的に区別される。白血病は、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病、非白血性白血病、非白血性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞性白血病、血液芽球性白血病、血芽球性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ系白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、プラズマ細胞性白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病を含む。

用語「癌腫」は、周囲の組織に浸潤しやすい上皮細胞で構成される悪性新生物を言及し、転移を引き起こす。用語「癌腫」は、腺癌も含む。腺癌は、粒状（分泌）の性質を有する器官を作る細胞に由来する癌腫、または消化管や気管支上皮などの管腔臓器の内側を覆う細胞に由来する癌腫であり、肺および前立腺の癌を含む。

本発明によると、式Iによる化合物は、様々な病期および悪性度の癌細胞、腫瘍および／または癌の成長および進行を治療するために使用することができる。したがって、本発明は、中間期の癌の治療および例えば、病気の進行を減速する、転移を減少させる、患者の生存を増加させるなど、進行性および／または転移性および／または悪性度の高い新生物を含む後期癌の治療のみならず、例えば、病気の治療または癌の後退を引き起こす目的で、小さい、成長が遅い、局所的および／または非侵攻性であるかもしれない早期新生物を含む早期癌の治療において、組み合わせて使用することを目的とする。

本発明は、化合物が無痛性癌、局所再発性、遠位再発性および／または難治性癌（すなわち、治療に反応ていしない癌）を含む再発癌、転移癌、局所進行性癌および侵攻性癌の治療に使用することができるということも目的としている。したがって、「進行性」の癌は、局所的進行性癌および転移癌を含み、患者における顕性疾患を言及し、当該顕性疾患は手術または放射線治療などの局所的な治療に適していない。用語「転移癌」は、体の一部から他の部分へ広がった癌を言及する。進行癌は切除不可能でもあり、つまり周囲の組織まで広がり外科的に排除できない。

当業者は、例えば、侵攻性癌は、通常は転移性でもあるなど、これらのカテゴリーが重複していることを認識する。本明細書において使用されるように、「侵攻性癌」は、急速に成長する癌を言及する。当業者は、乳癌または前立腺癌などのいくつかの癌に対して用語「侵攻性癌」は、任意の癌に対する再発時間の範囲のうち最初の約３分の２の内で再発した進行癌を言及するが、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などの他の癌型に対しては、ほとんどすべての場合、侵攻性とみなされる急速に成長する癌を示す。したがって、この用語は、特定の癌型の小区分を対象にすることができ、またはすべての他の癌型を含む場合がある。

当該化合物は、多剤耐性腫瘍を含む薬剤耐性癌を治療するためにも使用することができる。当技術分野で周知のように、化学療法に対する癌細胞の抵抗性は、癌の管理における中心問題の一つである。

前立腺などの特定の癌は、ホルモン療法によって治療することができ、すなわち、体の天然ホルモンを遮断することによって特定の癌の成長を減速させる、または停止させるホルモンまたは抗ホルモン剤で治療することができる。当該癌は、ホルモン療法に対する抵抗性を発達させたり、または本質的に抵抗性である場合がある。本発明は、当該「ホルモン抵抗性」または「ホルモン耐性」の癌の治療における化合物の使用をさらに目的とする。

本発明は、癌細胞の成長を選択的に阻害する「感作物質」としての化合物の使用も目的とする。この場合、化合物のみでは癌細胞に対する細胞毒性効果を持たないが、癌細胞を弱める方法を提供し、従来の抗癌療法の適用から得られた利点をさらに助長し、あるいはそれ以外の方法で、前記治療法の効果を高める。

したがって、本発明は、１つ以上の治療法と併用して１つ以上の化合物の治療に効果のある量を被検体に投与することを目的とする。化合物は、抗癌療法での治療の前、その間、または後に投与することができる。「抗癌療法」は、癌細胞の成長および／または転移を予防または遅らせる化合物、組成物または治療のことである。当該治療法は、これらに限定されないが、
化学療法薬治療、放射線療法、遺伝子療法、ホルモン処置、免疫療法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療法を含む。有用な化学療法薬の例として、これらに限定されないが、ヒドロキシウレア、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ナベルビン（登録商標）（酒石酸ビノレルビン）、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、シトシン、アラビノシド、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチン、スラミン、タクソール、マイトマイシンＣなどがある。本発明の化合物は、２つ以上の化学療法薬を使用する標準併用療法との併用にも適している。当然のことながら、本発明における使用に対する治療法は、将来開発される新しい化合物または治療も含む。

式Iの化合物は、例えば、治療への応用など、遷移金属のキレート化を目的とする様々な応用における使用にも適している。金属キレート化は、金属中毒、金属毒性、遺伝性疾患および／または輸血依存性貧血に伴う鉄過剰などの体内の金属過剰、微生物感染、免疫媒体病または疾患、皮膚病または疾患、神経系の病気または疾患、循環器病または疾患、老化関連の病気または疾患、あるいは遺伝性の病気または疾患の治療に適切である。本発明の１つの実施例では、式Iの化合物は、例えば、癌以外の病気または疾患の治療のためのｉｎ ｖｉｖｏでの金属イオンのキレートなどの治療への応用で使用することができる。

式Iの化合物は、例えば、剥離、化学分解、変色、沈殿、微生物増殖、乳化不安定性、酸敗臭および／または異臭、異味、混濁、失透、質感の低下、結晶形成、粘性の変化、酸化などの不要な金属イオンに伴う他の問題を予防または抑制するための、遷移金属のキレート化を目的とする製品または過程においても使用することができる。これらの状況におけるキレート剤の使用は、製品品質、消費者に対する魅力、保存期間または価値を改善し、処理効率を上げ、設備ダウンタイムを低下させ、または処理費を減少させることになる。したがって、本発明は、れらに限定されないが 食品および飲料製品、洗浄製品、パーソナルケア製品、医薬品、診断的適用、紙パルプでの適用、水処理での適用、金属加工での適用、繊維製品での適用、農産品および農業での適用、ゴム加工での適用、撮影での適用、印刷用インク、油田での適用、鉱業での適用、ガスの匂い付け、建造での適用、電気的適用、またはスケール除去および予防を含む、様々な適用において金属イオンをキレートするための式Iの化合物の使用を目的とする。

Ｖ．薬剤組成物

本発明の化合物は、通常、投与の前に調製する。したがって、本発明は、１つ以上の式Iの化合物および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤から成る薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、周知で容易に入手可能な原料を使用して周知の方法によって調製する。周知の癌に対する化学療法と併用して１つ以上の式Iの化合物から成る薬剤組成物は、本発明の目的ともなる。

一般式Iの化合物またはそれらの化合物から成る薬剤組成物は、従来の非毒性な薬学的に許容される担体、アジュバントおよび溶剤を含有する用量単位の製剤で、経口、局所、非経口、吸入やスプレー、または経直腸的に投与してよい。療法の通常の経過では、活性化合物は許容される溶剤に取り込まれ、疎水性または親水性クリームまたはローションなどの、病変部に局所的に投与する組成物を形成し、またはシロップ剤、エリキシル剤、錠剤、トローチ、キャンディー、硬または軟カプセル剤、丸薬、坐薬、油性または水性懸濁液、分散性粉または顆粒、乳剤、注入物質または液剤などの、経口、径直腸または非経口投与に適当な形に取り込まれる。本明細書において使用されるように、非経口という用語は、皮下注射、皮内、関節内、静脈内、筋肉内、血管内、胸骨内、髄腔内注射または注入方法を含む。

本発明は、１つ以上の式Iの化合物および人工膜小胞（リポソーム、脂質ミセルなどを含む）などの溶剤、微小粒子またはマイクロカプセルから成る薬剤組成物も提供する。

経口用の組成物は、個形または液体の剤形のいずれかで調製してよい。液体の剤形は、当技術分野で周知の薬剤組成物の製造方法によって調整することができ、当該組成物は、薬学的に洗練された味の良い製剤を提供するために、甘味剤、着香料、着色料および保存剤で構成される群から選択される１つ以上の薬剤を含有してよい。エリキシル剤は、香りの良い着香料や砂糖およびサッカリンなどの適当な甘味料とともに、水性アルコール（例えば、エタノール）溶剤を使用して調製する。懸濁液は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどを用いて水性溶剤で調製することができる。

錠剤などの個形製剤は、錠剤の製造に適当な非毒性な薬学的に許容される賦形剤と混合して有効成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、例えば、でんぷん、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、および例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの平滑剤、および第二リン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、でんぷん、乳糖、メチルセルロースなどの他の従来の原料および機能的に同様の物質であってよい。錠剤は、コーティングされていない、または消化管での分解および吸収を遅らせ、長時間に及んで持続作用を提供する周知の方法によってコーティングしてよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの遅延物質を使用してよい。

経口用製剤は、有効成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性の個形希釈剤と混合している硬ゼラチンカプセル錠としても存在し、有効成分が水または例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの油性溶剤と混合している軟ゼラチンカプセル錠としても存在する。軟ゼラチンカプセル錠は、許容される植物油、軽質流動ワセリンまたは他の不活性油とともに化合物のスラリーを機械でカプセル化して調製する。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適当な賦形剤と混合して活性物質を含有する。当該賦形剤は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ゴムトラガカントおよびゴムアカシアなどの懸濁化剤であり、分散または湿潤剤は、例えば、レシチン、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなどの、脂肪酸を有するアルキレンオキサイドの縮合物、または例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの、長鎖脂肪族アルコールを有するアルキレンオキサイドの縮合物、または脂肪酸およびポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのヘキシトール由来の部分エステルを有するエチレンオキサイドの縮合物、または例えば、脂肪酸および例えば、ポリエチレンソルビトールモノオレエートなどの無水ヘキシトール由来のを有する部分エステルを有するエチレンオキサイドの縮合物などの、自然に分泌されるリン脂質であってよい。水性懸濁液は、例えば、エチル、またはｎ‐プロピル‐ｐ‐ヒドロキシ安息香酸塩などの１つ以上の保存料、１つ以上の着色料、１つ以上の着香料またはサッカロースやサッカリンなどの１つ以上の甘味剤も含有してよい。

油性懸濁液は、例えば、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油において懸濁することによって調製してよい。油性懸濁液は、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有してよい。上述のような甘味剤および着香料は、味の良い経口剤を提供するために加えてよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化物質の添加によって保存してよい。

水の添加による水性懸濁液の製剤に適当な分散性粉および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存料と混合して有効成分を提供する。適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤は、既に上述のものによって例示されている。追加の賦形剤、例えば、甘味料、着香料および着色料などの追加の賦形剤も存在してよい。

本発明の薬剤組成物は、水中油型乳剤の形であってもよい。油相は、例えば、オリーブ油またはピーナッツ油などの植物油、または例えば、流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの混合物であってよい。適当な乳化剤は、例えば、ゴムアカシアまたはゴムトラガカントなどの自然発生のゴム、例えば、大豆、レシチン、およびエステルまたは脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルなどの自然に分泌されるリン脂質、ソルビタンモノオレエートなどの無水物、および例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキサイドを有する前記部分エステルの縮合物であってよい。乳剤は、甘味料および着香料を含有してもよい。

薬剤組成物は、無菌の注入可能な水性または油性懸濁液の形であってよい。この懸濁液は、それらの適当な分散または湿潤剤を使用する既知の技術によって調製してよく、上述の懸濁化剤でよい。無菌の注入可能な製剤は、例えば、１，３‐ブタンジオールの溶液などの、非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒の無菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。使用してよい許容される溶剤および溶媒は、水、リンガー液および生理食塩液である。さらに、滅菌された固定油は、溶剤または懸濁化剤として通常通りに使用される。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、どの無刺激性固定油でも使用してよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射製剤に使用されている。局所麻酔薬、保存料および緩衝剤などのアジュバントは、注射剤または懸濁液にも含有可能である。

一般式Iの化合物は、併用または単独で薬剤を直腸投与するための坐薬の形で投与してよい。これらの組成物は、その薬剤を常温では個形だが直腸の温度で液状となる適当な刺激性のない賦形剤と混合することによって調製することができ、それによって直腸で融解し、薬剤を放出する。当該物質には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

他の薬剤組成物および薬剤組成物の調製法は当技術分野で周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐａｒｍａｃｙ」 （以前は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２０００）に記述されている。

VI．式Iの化合物の投与

式Iの化合物は、治療する癌によって様々な投与法で被検体に投与してよく、例えば、化合物は、用量単位の製剤で、経口、局所、非経口、吸入やスプレー、または経直腸的に投与してよい。１つの実施例では、化合物は、例えば被検体の血流へのボーラス注射または注入、または経口投与によって被検体へ全身的に投与する。１つ以上の周知の化学治療薬と併せて使用する際、化合物は化学治療薬の投与の前または後、あるいは同時に投与することができる。１つ以上の化学療法薬は、例えば、ボーラス注射、注入または経口投与によって全身的に投与してもよい。

式Iの化合物は、ネオアジュバント療法（から一次療法）の一部、またはアジュバント療法の一部として使用してよい。本発明は、進行度および／または悪性度の高い新生物（すなわち、手術または放射線治療など局所的な治療に適していない顕性疾患）、転移性疾患、局所進行疾患および／または難治性腫瘍（すなわち、治療に反応しない癌または腫瘍治療）の治療を含む、腫瘍の成長および進行における様々な病期での式Iの化合物の使用を目的とする。

「一次療法」は、被検体の癌の初期診断後の最初の治療を言及する。例となる一次療法は、手術、広範囲の化学療法および放射線治療に関与してよい。「アジュバント療法」は、一次療法に続く治療、および再発の危険性がある被検体に投与する治療を言及する。補助的全身療法は、通常、再発を遅らせ、生存を延長し、被検体を治癒するため、一次療法の直後に開始する。

本発明の化合物は、一次療法またはアジュバント療法の一部として、単独で、または１つ以上の他の化学治療薬と併用で使用することができることを目的とする。式Iの化合物および標準的化学療法薬の組み合わせは、化学療法薬の効果を改善するために作用してよいため、標準的癌療法を改善するために使用することができる。この適用は、標準的治療に反応しない薬剤耐性癌の治療において重要になり得る。薬剤耐性癌は、例えば、腫瘍細胞集団の不均一性、化学療法への反応による変化、および高まる悪性の可能性から生じることがある。当該変化は、病気の進行した段階で頻繁にさらに顕著である。

投与する用量は定義された制限に従わないが、通常は有効量である。それは、その目的とする薬理学的および生理学的効果を得る活性遊離薬の代謝放出で用量製剤から生成される薬理的活性遊離型とモルベースで同等のものである。組成物は、単位用量型に調製してよい。用語「単位用量型」は、人の被検体および他の哺乳類に対する単位用量として適当な物理的不連続単位を言及し、各単位は適当な医薬品賦形剤とともに目的とする治療効果を得るために計算された活性物質の所定の量を含有する。各用量単位における化合物の範囲の例として、約０．０５〜約１００ｍｇ、またはより通常には、約１．０〜約５０ｍｇとなる。

本発明の化合物の１日投与量は、単回投与または分割投与で、通常、体重１ｋｇあたり約０．０１〜約１００ｍｇの範囲内である。しかし当然のことながら、投与する化合物の実際の量は、治療する状態、選択した投与法、実際に投与する化合物、個々の患者の年齢、体重および反応、および患者の症状の重篤性を含む、関連する状況を考慮して医師によって判断される。上述の用量範囲は単に一例として提示され、決して本発明の範囲を制限することを目的にしてはいない。場合によっては、前記範囲の下限を下回る用量レベルで十分であるかもしれず、一方、別の場合では、さらに多い容量が、例えば、その多い量をまずいくつかの少ない量に分け１日かけて投与することによって、有害な副作用を引き起こさずに使用される場合がある。

ＶＩＩ．癌患者における臨床試験

当業者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物モデルにおける式Iの化合物の証明された有効性に続き、標準ＧＬＰ動物毒性および薬物動態学的研究のために提出し、その後、癌の治療におけるその効果をさらに評価し、治療的使用に対する規制機関の承認を得るため、臨床試験に参入することができるということを認識する。当技術分野で周知のように、臨床試験は、第一、二、三および四相とされる、試験の相を通して行われる。

まず、選択された式Iの化合物は、通常は非盲検試験である第一相試験において評価する。通常、第一相試験は、投与の最良の形態（例えば、丸薬または注射など）、投与頻度、および化合物の毒性を判断するために使用する。第一相試験は、患者の体内における式Iの化合物の効果を評価するために、血液検査および生検などの実験室試験を頻繁に含む。第一相試験では、少人数の癌患者の群を、式Iの化合物の特定の用量で治療する。試験の間、用量は、最大耐量（ＭＴＤ）および化合物に伴う用量規定毒性（ＤＬＴ）を判断するため、通常、群ごとに増加させる。この過程によって、次の第二相試験で使用する適切な用量が決定する。

第二相試験は、本発明の化合物の有効性および安全性をさらに評価するために行うことができる。第二相試験では、これらの化合物は、第一相試験で効果的であると考えられる用量を使用して、１つの特定の癌の種類または関連する癌のいずれかを有する患者群に投与する。

第三相試験では、化合物が、標準または最も広く受け入れられている治療とどのように類似しているか、あるいは、異なるかを決定することに集中する。第三相試験では、患者は、２つ以上の「治療群」の１つに無作為に割り当てる。２つの治療群を有する試験では、例えば、一方の治療群は標準的治療（対照群）を受け、他方の治療群は本発明による化合物での治療を受ける（治験群）。

第四相試験は、化合物の長期安全性および有効性をさらに評価するために使用する。第四相試験は、第一、二、三相試験ほど一般的ではなく、化合物が標準的用法の承認を受けた後に行われる。

Ａ．臨床試験に対する患者の適任性

参加者の適格基準は、一般的なもの（例えば、年齢、性別、癌の種類）から特定のもの（例えば、前治療の種類及び回数、腫瘍の特性、血球数、臓器機能）まである。適格基準は、試験相によっても変化する場合がある。例えば、第一および二相試験では、多くの場合、異常臓器機能または他の要因のため、治験中の治療により危険にさらされるかもしれない患者は基準によって除外する。第二および三相試験では、多くの場合、病気の種類や病期、および前治療の回数および種類に関して追加基準を含むる。

第一相の癌治験は、通常、他の治療の選択肢が有効ではない１５〜３０人の参加者で構成される。第二相試験は、通常、既に化学療法、手術または放射線治療を受けたが、その治療が有効ではなかった１００人までの参加者で構成される。第二相試験の参加は、多くの場合、過去に受けた治療に基づき制限される。第三相試験は、通常、何百、何千もの参加者で構成される。本発明による化合物と標準的治療の有効性に本当の差があるかどうかを判断するため、この多数の参加者は必要である。第三相は、広い範囲の病気の程度を対象にするため、新たに癌と診断された患者から広範囲の疾患を有する患者までの範囲で構成してよい。

当業者は、調査対象集団の多様性によって、治療がさらに狭義の集団においてより有効であるかもしれないか否か判断不可能とならないようにしながら、臨床試験をできるだけ包含的に計画しなければならないということを認識する。特に第三相試験では、試験の対象となる集団がより多様性を有するほど、一般集団に対して結果をよりよく適用することができる。臨床試験の各相における適切な参加者の選択は、当業者の範囲内とみなされる。

Ｂ．治療前の患者の評価

当技術分野で周知のいくつかの測定は、試験開始前に、まず患者を分類するために使用することができる。患者は、例えば、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ：Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）の癌の状態を表す指標（ＰＳ）などを使用して、最初に評価することができる。ＥＣＯＧ ＰＳは、患者の機能障害によって測定されるように、患者の病気の進行を評価するための広く受け入れられている基準であり、ＥＣＯＧ ＰＳ０は機能障害がないことを示し、ＥＣＯＧ ＰＳ１および２は患者の機能障害は徐々に増大しているがまだ歩行可能であることを示し、ＥＣＯＧ ＰＳ３および４は進行性障害および運動不能を示す。

患者の全体的な生活の質は、例えば、マッギール生活の質に関する質問表（ＭＱＯＬ）（Ｃｏｈｅｎら（１９９５）Ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：２０７‐２１９）などを使用して評価することができる。ＭＱＯＬは、身体症状、身体的、精神的および実存的に健康な状態、支援、または全体的な生活の質を測定する。悪心、不機嫌、食欲、不眠、運動性および疲労などの症状を評価するために、ＭｃＣｏｒｋｌｅおよびＹｏｕｎｇ（（１９７８）Ｃａｎｃｅｒ Ｎｕｒｓｉｎｇ、１：３７３‐３７８）によって開発された苦痛症状尺度（ＳＤＳ）を使用することができる。

患者は、彼らの病気の種類および／または病期、および／または腫瘍の大きさによって分類することもできる。

Ｃ．薬物動態のモニタリング

第一相の基準を満たすため、化合物の分布は、例えば、一定間隔で収集された血液や尿などのサンプルを化学分析することによって観察する。例えばサンプルは、注入開始後約７２時間まで、一定間隔で得ることができる。１つの実施例では、サンプルは、化合物の各注入開始後０、０．３３、０．６７、１、１．２５、１．５、２、４、６、８、１２、２４、４８および７２時間で得られる。

分析が直ちに行われない場合、サンプルは収集後ドライアイス上に保存し、その後移動させ、分析が行われるまで−７０℃で冷凍保存することができる。サンプルは、当技術分野で周知の標準的方法を使用して分析用に調製することができ、その場の化合物の量は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって判断することができる。

薬物動態のデータは、熟練の臨床薬理学者と協力して作成・分析し、例えば、クリアランス、半減期および最大血漿中濃度を判断するために使用することができる。

Ｄ．患者の転帰の観察

臨床試験の評価項目は、評価段階にある化合物の有効性を示す測定可能な転帰である。評価項目は試験開始前に確立され、臨床試験の種類や相によって異なる。評価項目の例として、例えば、腫瘍反応率（通常、パーセントで表示される、特定の量だけ腫瘍が小さくなる試験参加者の割合）、無病生存期間（通常、月数で測定される、癌の発症または再発がない参加者の生存期間）、全生存（通常、臨床試験開始から死亡時刻までで測定される参加者の生存期間）である。進行および／または転移癌に関して、病気の安定（例えば、腫瘍の成長および／または転移が停止したなど、病気が安定した試験参加者の比率）は、評価項目として使用することができる。他の評価項目として毒性および生活の質がある。

腫瘍反応率は、第二相試験の代表的評価項目である。しかしながら、治療によって参加者の腫瘍が小さくなり、無病生存期間が延長するとしても、全生存を延長させないかもしれない。このような場合、副作用や全生存延長の失敗は、さらに長期の無病生存期間の利点を上回るかもしれない。あるいは、無腫瘍期間中の参加者の改善した生活の質は、他の要因を上回るかもしれない。したがって、多くの場合、腫瘍反応率は一次的なものであって、参加者に対する長期生存の利点にならない可能性があるため、反応率は第二相試験において治療の有効性の適当な指標であるが、参加者の生存および生活の質は、通常、第三相試験において評価項目として使用される。

ＶＩＩＩ．キット

本発明は、１つ以上の式Iの化合物を含む治療用キットをさらに提供する。１つの実施例では、治療用キットは、癌の治療において使用するものである。キットの内容物は凍結乾燥でき、キットは凍結乾燥成分を再構成するための適当な溶剤をさらに含むことができる。キットの個々の成分は、別の容器で包装され、当該容器に付随して、医薬品または生物学的製剤の製造、使用および販売を規制する政府機関によって規定された形での通知を含むことができ、その通知はヒトまたは動物への投与のための使用または販売に対する製造機関による承認を反映する。

キットの成分が１つ以上の溶液中にある場合、溶液は、例えば、滅菌溶液などの水溶液であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、化合物は、薬学的に許容される注入可能な組成物へと調製してよい。この場合、容器の手段自体は、製剤を、肺などの被検体の感染部位に適用する、被検体に注入する、またはキットの他の成分に適用または混合してよい吸入剤、シリンジ、ピペット、目薬の容器、または他の同様の器具であってよい。

併用療法の適用のための１つ以上の標準的化学療法薬と併せて、本発明の１つ以上の化合物から成る医薬品のキットまたはパックも本発明で目的とする。

式Iの化合物は遷移金属イオンをキレートすることができるということも、本明細書において実証されている。したがって、本発明は、遷移金属イオンのキレート化のための１つ以上の式Iの化合物から成るキットをさらに提供する。

特定の例を参照して本発明を説明する。当然のことながら、以下の例は本発明の実施例を説明することを目的とし、決して本発明を制限するためのものではない。

実施例

化合物の調製

例となる式（I）の化合物は、以下に示す図式によって調製した。

代表的な手順では、１ｍｍｏｌ（１ｅｑｕｉｖ．）のフェナントロリンキノンは、氷酢酸中の１０ｍｍｏｌ（１０ｅｑｕｉｖ．）の対応する酢酸アルデヒドとアンモニウムの等モル量で還流した。反応過程は、試薬が完全に消費されるまでＴＬＣで観察した。反応終了後、反応混合物は室温まで冷却し、水で希釈し、不純物は得られた溶液からジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出した。水層は塩基性化し、２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリンの分離沈殿物はろ過し、適当な溶剤から再結晶化した。必要があれば、Ｒ７がＨである２‐インドリルイミダゾ［４，５‐ｄ］フェナントロリンは、Ｒ７はＨ以外であるＲ７Ｘで処理し、化合物（I）を得た。

式（III）のインドール‐３‐カルボキサルデヒドは、以下の図式によって調製した。

代表的な実験手順では、１１ｍｍｏｌ（１．１ｅｑｕｉｖ．）のＰＯＣｌ_３は、１５‐２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）において５〜１０℃でインドール（１０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ．）の磁気的に撹拌された溶液に滴下で加えた。混合物は、室温で０．５時間および６０℃で０．５時間撹拌し、室温まで冷却し、１００ｇの氷上に注いだ。得られた溶液はＮａＨＣＯ_３でｐＨ＞７まで塩基性化し、混合物は６０℃で１時間撹拌し、分離沈殿物はろ過し、適当な溶剤から再結晶化した。

融点は、ＭＥＬ‐ＴＥＭＰキャピラリー融点器を使用して記録し、融点は修正しない。^１Ｈ‐ＮＭＲは適当な重水素化溶媒を使用して、室温で５００ＭＨｚブルカー機器で行った。

実施例１：化合物２の調製

フェナントロキノリン（０．４２ｇ）と５‐ブロモインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．４５ｇ）の懸濁液は、酢酸アンモニウム（１．５４ｇ）の存在下、酢酸（１５ｍｌ）において１時間還流した。形成された黄色い沈殿物はろ過し、エタノールで洗浄し、ＤＭＦで結晶化した。
産出０．７０ｇ。（８５％）。融点＞４００℃。
ＤＭＦにおける０．２００ｇの化合物２（０．４８３ｍｍｏｌ）の溶液は、沈殿が見られなくなるまでＨＣＬ（ｇ）で処理した。その後、溶液はろ過し、ジクロロメタンおよびヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させた。結果として得られた望ましいＨＣｌ塩は水溶性であった。

実施例２：化合物３の調製

フェナントロキノリン（１．０５ｇ）と２‐メチルインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．８０ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（３．８５ｇ）の存在下、酢酸（２０ｍｌ）で２時間還流した。冷却した赤い溶液は、水（１５０ｍｌ）に注いだ。不純物はＤＣＭ（３×５０ｍｌ）で抽出し、廃棄した。水層はＮａＯＨ（１００ｍｌの１０％溶液）で中和し、余剰のＮａ_２ＣＯ_３の塩基性溶液にした。分離沈殿物はろ過し、水で洗浄し、１０分間ＥｔＯＨ（３０ｍｌ）において還流した。結晶性生成物（化合物３）はろ過し、ＥｔＯＨ、ＤＣＭおよびヘキサンで洗浄した。産出０．９２ｇ（５７％）。

実施例３：化合物４の調製

フェナントロキノリン（０．１０５ｇ）と５‐フルオロインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．０８２ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．３９ｇ）の存在下、酢酸（３ｍｌ）において０．５時間還流した。分離沈殿物はろ過し、水性５０％エタノールおよびＥｔＯＨで洗浄し、真空下で水抜きした。産出０．１５ｇ（８５％）。

実施例４：化合物５の調製

０．９６ｇのＰＯＣｌ_３は、２０ｍＬのＤＭＦにおいて１０℃で２‐メチル‐５‐クロロインドール（１．０ｇ）に滴下で加えた。混合物は５０℃で１時間撹拌し、冷却後、飽和ＮａＨＣＯ_３で希釈した。懸濁液は６０℃で１５分間加熱し、冷却後、２‐メチル‐５‐クロロインドール‐３‐カルボキサルデヒドの沈殿物をろ過した。産出１．１４ｇ（９９％）。分析サンプルはＥｔＯＨから結晶化した。
フェナントロキノリン（０．２１０ｇ）と２‐メチル‐５‐クロロインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．２０３ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．７７ｇ）の存在下、酢酸（５ｍＬ）において１．５時間還流した。化合物５の分離沈殿物はろ過し、ＡｃＯＨ、ＥｔＯＨ＋Ｈ_２ＯおよびＥｔＯＨ＋ＥｔＯＡｃで洗浄した。産出０．２３０ｇ（６０％）。

実施例５：化合物６の調製

フェナントロキノリン（０．１０４ｇ）と２‐メチル‐５‐ＯＣＨ_３インドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．０９５ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．３８ｇ）の存在下、酢酸（５ｍｌ）において２．５時間還流した。溶液はＤＣＭで希釈し、水で抽出した。水層はＤＣＭで洗浄し（２×４０ｍｌ）、塩基性化し、ＥｔＯＡで抽出した。抽出物は濃縮し、ＥｔＯＨで処理して結晶性生成物（化合物６）を得て、それをろ過し、ヘキサンで洗浄した。

実施例６：化合物７の調製

１．６９ｇのＰＯＣｌ_３は、２０ｍＬのＤＭＦにおいて１０℃で２‐メチル‐５‐フルオロインドール（１．４９ｇ）の溶液に滴下で加えた。混合物は５０℃で１時間撹拌し、冷却後、飽和ＮａＨＣＯ_３で希釈した。懸濁液は６０℃で１５分加熱し、冷却後、２‐メチル‐５‐フルオロインドール‐３‐カルボキサルデヒドの沈殿物をろ過した。産出１．１４ｇ（９９％）。
フェナントロキノリン（０．２１０ｇ）と２‐メチル‐５‐フルオロインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．１７７g）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．７７ｇ）の存在下、酢酸（５ｍｌ）において１．５時間還流し、１％ＨＣｌに注ぎ、ＤＣＭで抽出した。水層はＮａ_２ＣＯ_３で塩基性化し、化合物７の沈殿物はろ過し、ＥｔＯＨから結晶化した。純正産物の産出０．１９ｇ（５２％）。

実施例７：化合物８の調製

２ｍＬのＡｃＯＨにおける化合物６（０．１５０ｇ）とＨＢＲ（４ｍＬ）の混合物は３．５時間還流した。懸濁液は水で希釈し、Ｎａ_２ＣＯ_３の飽和溶液でアルカリ性にし、ＥｔＯＡｃで抽出後、溶媒を真空下で除去した。残留物はトルエン‐ＥｔＯＨおよびＤＭＦから結晶化した。産出０．０３ｇ（２１％）。

実施例８：化合物９の調製

１．７ｇのＰＯＣｌ_３は、２０ｍＬのＤＭＦにおいて１０℃で２‐フェニルインドール（１．９３g）の溶液へ滴下で加えた。混合物は５０℃で１時間撹拌し、冷却後、飽和ＮａＨＣＯ_３で希釈した。懸濁液は６０℃で１５分間加熱し、冷却後、２‐フェニルインドール‐３‐カルボキサルデヒドの沈殿物をろ過した。産出２．０５ｇ（９３％）。
フェナントロキノリン（０．１０５ｇ）と２‐フェニルインドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．１１１ｇ）の混合物は、０．３９ｇの酢酸アンモニウムの存在下、３ｍＬの酢酸において１．５時間還流した。赤い溶液は、水（１００ｍｌ）に注ぎ、ＤＣＭで洗浄した（３×４０ｍｌ）。その後、水層はＮａ_２ＣＯ_３の飽和溶液で中和し、得られた個体はろ過し、ＥｔＯＨで洗浄し、ＤＭＦ：ＥｔＯＨ ：Ｈ_２Ｏ＝１：１：１から結晶化した。０．１２ｇの精製固体が得られ、５８％の産出率であった。

実施例９：化合物１０の調製

１．７ｍＬのＰＯＣｌ_３は、２０ｍＬのＤＭＦにおいて１０℃で２（４‐フルオロフェニル）‐インドール（２．１１ｇ）の溶液に滴下で加えた。混合物は５０℃で１時間撹拌し、冷却後、飽和ＮａＨＣＯ_３で希釈した。懸濁液は６０℃で１５分間加熱し、冷却後、２（４‐フルオロフェニル）‐インドール‐３‐カルボキサルデヒドの沈殿物をろ過し、ＥｔＯＨから結晶化した。産出２．１０ｇ（８８％）。
フェナントロキノリン（０．１０５ｇ）と２（４‐フルオロフェニル）‐インドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．１２０ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．３８ｇ）の存在下、酢酸（３ｍＬ）において１．５時間還流し、ＤＣＭ（５０ｍｌ）で希釈し、５０ｍｌの５％ＨＣｌで処理した。黄色い分離沈殿物はろ過し、水性Ｎａ_２ＣＯ_３で処理後、ＥｔＯＡｃで抽出し、溶媒を除去した。残留物はＤＣＭで処理した。化合物１０の分離した個体はろ過し、ヘキサンで洗浄した。産出０．０８ｇ（３７％）。

実施例１０：化合物１１の調製

フェニルヒドラジン（４．３２ｇ）は、３０ｍｌのａｂｓ．ＥｔＯＨにおいて４‐アセチルピリジン（４．７６ｇ）の溶液に加えた。３滴のＡｃＯＨを加え、溶液を室温で撹拌した。発熱反応が発生し、白い沈殿物が現れ始めた。混合物は１時間還流した。冷却後、４‐アセチルピリジンフェニルヒドラゾンの分離沈殿物はろ過し、乾燥させた。産出６．０４ｇ。
ヒドラゾン（３．１０ｇ）とポリリン酸（ＰＰＡ）（１８ｇ）の混合物は、徐々に温度を上げて、温度計で撹拌しながらビーカーで加熱した。混合物は、１０分間１８０〜１９０℃に維持し、冷却後、Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層は濃縮し、シリカゲルでろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。ろ液は蒸発させ、４（２‐インドリル）ピリジンの残留物をトルエンから結晶化した。

１．３２ｇのＰＯＣｌ_３は、２０ｍＬのＤＭＦにおいて１０℃でインドール４（２‐インドリル）‐ピリジン（１．４６ｇ）の溶液に滴下で加えた。混合物は５０℃で１時間撹拌し、冷却した。ＴＬＣは約５０％の変質を示し、その後、０．７ｇのＰＯＣｌ_３を加え、混合物は５５〜６０℃で０．５時間撹拌した。混合物は冷却し、余剰ＮａＨＣＯ_３で処理した。懸濁液は６０℃で１時間加熱し、冷却後、２（４‐ピリジル）インドール‐３‐カルボキサルデヒドの沈殿物をろ過した。産出０．９８ｇ（５９％）。
フェナントロキノリン（０．２１０ｇ）と２（４‐ピリジル）インドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．２１２ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．７７ｇ）の存在下、酢酸（５ｍｌ）において１．５時間還流した。沈殿物はろ過し、ＥｔＯＨに溶解させ、０．１ｍｌのＮＨ_４ＯＨで処理し、溶媒はほとんど乾燥状態になるまで除去した。残留物はＥｔＯＡｃで処理した。化合物１１の沈殿物はろ過した。産出０．２５ｇ（６１％）。

実施例１１：化合物１２の調製

１２ｍＬのＳＯＣｌ_２は、フラスコの外側を冷却しながら、トルエンにおいて２‐インドールカルボン酸（５．４４ｇ）の撹拌懸濁液を滴下で加えた。１時間後、混合物を室温まで暖まることを許し、混合物は週末にかけて撹拌した。トルエン（１００ｍｌ）は、茶色い懸濁液に加え、得られた混合物は乾燥するまで蒸発させた。次の変換のため、酸塩化物は精製せずに使用した。

５０ｍｌのＤＣＭにおける酸塩化物（７．１７４ｇ）の溶液は、フラスコの外側を冷却しながら、ＤＣＭにおいてピペリジン（１０．２ｇ）の溶液に滴下で加えた。混合物は、室温で１時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で処理した。有機層は体積が１５ｍｌになるまで蒸発させ、シリカゲルでろ過した後、ＤＣＭ＋ＥｔＯＡｃで洗浄し、溶媒は１５〜２０ｍｌまで蒸発させ、２‐インドールカルボキシピペリジンの分離結晶はろ過し、室温に１時間置いた後、ヘキサンで処理した。産出５．３７ｇ。

９．０５ｇの結晶アミド（すなわち、２‐インドールカルボキシピペリジン）は、４５〜５５℃の温度を維持しながら、４０ｍｌのＴＨＦにおいて、ＬｉＡｌＨ４（３．２ｇ）の撹拌懸濁液に加えた。すべてのアミドを加えた後、懸濁液は還流しながら２時間撹拌した。反応は、ＥｔＯＡｃおよび６％ＮａＯＨで停止され、ＥｔＯＡｃで抽出し、溶媒は油としての（２‐インドールメチル）Ｎ‐ピペリジンを得るために除去した。

０．８５ｇのＰＯＣｌ_３は、１０ｍＬのＤＭＦにおいて０℃でインドール［すなわち、（２‐インドールメチル）Ｎ‐ピペリジン］（１．０７ｇ）の溶液に滴下で加えた。混合物は、室温で２時間撹拌し、水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで塩基性化し抽出した。有機層は、希釈ＨＣｌで抽出した。ＥｔＯＡｃで水層は分離させ、塩基性化し、抽出した。溶媒は蒸発させた。２（Ｎ‐ピペリジンメチレン）‐インドール‐３‐カルボキサルデヒドの残留物は、ＥｔＯＨから結晶化した。産出０．３０ｇ（２５％）。

フェナントロキノリン（０．１０５ｇ）と２（Ｎ‐ピペリジンメチレン）‐インドール‐３‐カルボキサルデヒド（０．１２１ｇ）の混合物は、酢酸アンモニウム（０．３８ｇ）の存在下、酢酸（３ｍｌ）において１．５時間還流し、その後希釈ＨＣｌに注ぎ、不純物をＤＣＭで抽出した。水層はＥｔＯＡｃで塩基性化し、抽出した。有機層は無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。油性残留物はＤＣＭで処理した。分離結晶化合物１２はろ過し、ＤＣＭ：ヘキサン‐１：１で洗浄した。産出０．０６０ｇ（２８％）。

他の例となる化合物も、当業者に周知の適用または手順に記述される手順を使用して調製した。

実施例１２：ヒト癌細胞株における化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの増殖抑制活性
化合物２および３は、Ｕ．Ｓ．国立癌研究所（ＮＣＩ）のＤＴＰ（開発治療プログラム）によって提供されたｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌スクリーニング業務の一環として、６０のヒト癌細胞株のパネルにおけるそれらの増殖抑制効果に対して評価した。これらの化合物は、ＮＳＣＬＣ、白血病、大腸癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、中枢神経系癌および乳癌を含むほとんどのヒト腫瘍細胞株に対して増殖抑制活性を示し、平均ＧＩ_５０（５０％の成長阻害）値は２μＭ未満であった（図１）。

式Iの化合物の１つである化合物３は、ＧＩ_５０平均値が０．６１μＭ〜１２．３μＭの阻害活性を示した。化合物３は非常に強力だが選択的な結腸、白血病、非小細胞肺癌および前立腺細胞株の阻害因子であった（図２）。白血病細胞株ＭＯＬＴ‐４およびＣＣＲＦ‐ＣＥＭは、それぞれＧＩ_５０値が１６ｎＭおよび３０ｎＭで最も阻害的であった。３つの白血病細胞株（ＭＯＬＴ‐４、Ｋ‐５６２およびＣＣＲＦ‐ＣＥＭ）は、ＧＩ_５０値がナノモルの範囲にあった。ＧＩ_５０値が２．８８μＭであった４つ目の白血病細胞株は、実際には骨髄腫培細胞株であり、他の白血病細胞株とは異なる機能が期待されるかもしれない。

実施例１３：ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞における式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯでの増殖抑制活性
ヒト大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞の増殖を阻害する式Iの化合物の能力は、以下のように試験した。本実施例および後続の実施例で使用したＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞は、２ｍＭのＬ‐グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ、ＷＩＳＥＮＴ Ｉｎｃ．、Ｓｔ‐Ｂｒｕｎｏ、ＱＣ）、抗生物質‐抗真菌剤（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）を添加した成長培地で単分子層として３７℃の５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターで維持した。細胞は１５０ｍｍの組織培養プレート上に移動させ、使用前にサブコンフルーエント（７０〜８０％）になるまで成長させた。化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖抑制活性は、６〜７日間、表１に示す様々な濃度の化合物で細胞を培養することによって評価した。この細胞増殖アッセイにおけるこれらの化合物の効果は、テトラゾリウム塩ＸＴＴをホルマザン（ＸＴＴ細胞増殖キットＩＩ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）の橙色の化合物まで還元させる生細胞の能力に基づいて測定した。この実験結果は表３に示す。

表３ 式Iの化合物の増殖抑制活性

実施例１４：ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞の成長を阻害する化合物３の能力における金属器キレート化の役割の判断
金属キレート化が式Iの化合物の成長阻害活性に関与するかどうかど判断するため、外因性金属（１００μＭのＺｎＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ、ＦｅＣｌ_３．４Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ_２）は、対照媒体ＤＭＳＯ、化合物３（５μＭ）、または化合物１３（２５μＭ）と同時にＨＴ‐２９細胞とともに５日間培養した。化合物１３（以下の構造を参照）は、化合物３ほど強力な化合物ではなく、化合物３とは構造的に密接に関係しているが、フェナントロリン環において不可欠なキレート窒素を不足している。化合物１３の成長阻害は、化合物３とは異なる機序で生じると予測される。

この実験結果を図３に示す。亜鉛（１００μＭ）の添加によって、ＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物３の能力は完全に損なわれ、それは化合物３が亜鉛のキレート剤として機能することができ、余分の亜鉛は内因性金属を不可欠な酵素からキレートするこの化合物の能力を遮断する場合があるということを示す。余分の鉄およびマグネシウムは、化合物３の活性に対して影響がなかった。どの金属も負の対照、化合物１３の活性に対して影響せず、これらの金属は細胞の自力での成長に対しても効果を持たない。化合物３の活性に対する亜鉛の影響は、低濃度の化合物３（１〜２μＭ）、および１００μＭの亜鉛で最も明らかとなった。

実施例１５：ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞の成長を阻害する様々な濃度の化合物３の能力に対する銅の影響
銅のキレート化が式Iの化合物の成長阻害活性に関与するかどうかを判断するため、ＨＴ‐２９細胞は、２５μＭのＣｕＳＯ４．５Ｈ_２Ｏの存在下または非存在下において、５μＭまでの化合物３とともに５日間培養した。図４に示すように、２５μＭの外因性銅をＨＴ‐２９細胞に添加することによって、ＨＴ‐２９細胞に対する化合物３の成長阻害活性は、低濃度の化合物３（２μＭ未満）のみで損なわれた。反対に、高濃度の化合物３（＞２．５μＭ）では、化合物３の活性は外因性銅の添加によって有意に強化した。銅は化合物１３による成長阻害、または細胞の自力での成長に対して影響を示さなかった。１００μＭまでの濃度の銅で同様の結果が得られた。これらの結果は、この化合物は銅のキレート剤として機能することができ、細胞毒性を有するキレート錯体を銅で形成することもできるということを示す。

実施例１６：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＨＴ‐２９大腸癌細胞の成長を阻害する化合物３の能力に対する外因性金属の影響
金属キレート化が化合物３の成長阻害活性に関与するかどうかを判断するため、様々な濃度の外因性金属は、様々な濃度の化合物３と同時にＨＴ‐２９細胞とともに５日間培養した。試験した外因性金属は、ＺｎＣｌ_２（亜鉛）、ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ（銅）、ＦｅＣｌ_２（鉄ＩＩ）、ＦｅＣｌ_３．４Ｈ_２Ｏ（鉄III）、ＭｇＣｌ_２（マグネシウム）、およびＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ（カルシウム）である。体積１００μＬの成長培地にあるＨＴ‐２９細胞（４×１０^３／ウェル）は９６ウェルの細胞培養プレートに播種し、３７℃で一晩培養した。培地は除去し、化合物３または０．１％ＤＭＳＯ媒体対照とともに、図５に示すようにいくつかの濃度の金属イオンを含有する総体積１００μＬの成長培地と入れ替えた。３７℃で５日間細胞を培養した後、細胞生存能力はＸＴＴ（ナトリウム３’‐［ｌ（フェニルアミノ‐カルボニル）‐３，４‐テトラゾリウム］‐ビス（４‐メトキシ‐６‐ニトロ）ベンゼンスルホン酸水和物）を使用して定量した。ＸＴＴ標識試薬（１ｍｇ／ｍＬ）はメーカーの使用説明書に従い電子結合試薬と混合し、５０μＬの混合物は１００μＬの成長培地で培養した細胞に直接加えた。プレートはさらに３７℃で４時間さらに培養し、各ウェルの吸収度は４６０ｎｍのマルチウェル分光光度計（Ｂｉｏ‐Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で測定した。データは空欄に対して調節し、ＤＭＳＯ対照と比較して細胞成長の％として表記した。

結果は、亜鉛（図５Ａ）、銅（図５Ｂ）、およびより少ない程度であるが鉄（ＩＩ）（図５Ｃ）によって化合物３の成長阻害活性は損なわれたが、一方、鉄（III）（図５Ｄ）、マグネシウム（図５Ｅ）およびカルシウム（図５Ｆ）は、化合物３の活性に対して影響を本質的に持たかったことを示した。銅によって、低濃度の化合物３（２μＭ未満）では化合物３の成長阻害活性が損なわれ、高濃度の化合物３（＞２．５μＭ）では化合物３の活性は強化した。どの金属も、化合物３と構造的に密接に関係している負の対照、フェナントロリン環において不可欠なキレート窒素を不足している（データは示されていない）化合物１３の活性に対しては影響がなかった。これらの結果は、化合物３が亜鉛、鉄（ＩＩ）および銅のキレート剤として機能することができ、余分なこれらの金属の存在によって、内因性金属を不可欠な酵素からキレートする化合物３の能力が遮断される場合があるということを示す。化合物３は、細胞毒性を有する キレート錯体を銅で形成するようにも考えられる。

実施例１７：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＨＴ‐２９大腸癌細胞の成長を阻害する化合物５および７の能力に対する外因性金属の効果
細胞において金属をキレートする化合物５および７の能力を判断するため、外因性金属は様々な濃度の化合物５および７と同時に、ＨＴ‐２９細胞に加えた。つまり、ＨＴ‐２９細胞は様々な濃度の化合物５および７、銅（２５μＭのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ）または亜鉛（１００μＭのＺｎＣｌ_２）の有無で５日間処理した。細胞生存能力は、ＸＴＴアッセイによって判断した。ＨＴ‐２９細胞の成長阻害に対する銅および亜鉛の効果は、化合物５に関しては図６Ａに、化合物７に関しては図６Ｂに示す。化合物３と同様に、亜鉛によって化合物５および７の成長阻害活性は損なわれたが、銅によって低濃度の化合物５および７でのみ活性が損なわれた。結果は、化合物５および７が亜鉛および銅のキレート剤として機能し、余分なこれらの金属の存在によって、化合物５および７の成長阻害効果が遮断されるということを示す。

実施例１８：癌細胞に対する化合物３および９の選択性
式Iの化合物が正常細胞の増殖と比べて癌細胞の増殖を選択的に阻害したかを判断するため、化合物３および９に対する増殖のＩＣ_９０値を正常細胞株および癌細胞株において測定した。使用した正常細胞株はＰｒＥＣ（前立腺）、ＨＭＥＣ（胸）、およびＷＤ８（肺線維芽細胞）細胞株で、癌細胞株はＤＵ１４５（前立腺）、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５（胸）、ＨＴ‐２９（結腸）である。ＩＣ_９０値は、対照であるドキソルビシンおよびエトポシドに関しても判断した。細胞は、実施例１３において概して記述されるように培養した。様々な濃度の化合物は、細胞とともに６〜７日間培養し、増殖性細胞数はＸＴＴアッセイを使用して測定した。癌細胞の選択性は、すべての正常細胞に対する平均ＩＣ_９０とすべての癌細胞株に対する平均ＩＣ_９０の割合をして計算した。化合物３および９の両方とも、＞４のＩＣ_９０率（正常／癌）であり、これらの化合物は癌細胞に対して選択的であることを示す。

実施例１９：癌細胞におけるメタロチオネイン１Ａ遺伝子の発現を阻害する化合物３の能力
細胞において亜鉛をキレートする式Iの化合物の能力を判断するため、ヒト大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞における亜鉛制御された遺伝子、メタロチオネイン１Ａ（ＭＴ１Ａ）の発現レベルに対する化合物の効果を判断した。体積１０ｍＬの成長培地にある１×１０^６細胞のＨＴ‐２９細胞は１００ｍｍの皿に播種し、３７℃で一晩培養した。培地は取り除き、３５μＭのＺｎＣｌ_２、１μＭまたは４μＭのＴＰＥＮ（ＮＮＮＮ‐四リン（２‐ピリジル‐メチル）エチレンジアミン）、あるいは１μＭまたは４μＭの化合物３、または０．１％ＤＭＳＯ媒体対照を含有する成長培地と入れ替えた。１６時間の培養後、細胞はトリプシン処理によって分離させ、遠心分離で収集し、ＰＢＳで一度洗浄した。総ＲＮＡは、メーカーの使用説明書に従って、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して抽出し、ＭＴ１ＡｍＲＮＡのレベルは、以下のように、比較ＣＴ法を使用してリアルタイムＰＣＲで測定した。第一鎖ｃＤＮＡは、メーカーの手順に従ってｐｄ（Ｎ）６ランダムへキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびスーパースクリプト（登録商標）ＩＩ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔｐｅｒｓｏｎａｌ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｂｇｅｎｅ、ＵＫ）において２００ｎｇの総ＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲは、上記の手順に従って合成した５μＬのｃＤＮＡ、およびＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスの手順に従い個々のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（ＡＢＩ）を使用して、ＡＢＩプリズム７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で行った。

図７は、ＨＴ‐２９細胞への亜鉛（３５μＭ）の添加によってＭＴ１Ａ遺伝子の発現が増加し、一方、特定の亜鉛キレート剤ＴＰＥＮの添加によってＭＴ１Ａの発現が減少したことを示す。化合物３は５０％以上ＭＴ１Ａの発現を減少させ、不安定な細胞内の亜鉛の量を減少させることができたことを示す。したがって、化合物３は細胞において亜鉛のキレート剤として機能する。

実施例２０：ＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
遷移金属制御腫瘍抑制遺伝子のＲＮＡレベルを調節する式Iの化合物の能力は、以下のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで判断した。化合物３は、大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞において亜鉛制御された腫瘍抑制因子ＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現を増加させるその能力を判断するため試験した。 過去にＫＬＦ４の発現は細胞内の亜鉛濃度の変化によって誘導されるとみられている。ＨＴ‐２９細胞は、媒体対照としてのＤＭＳＯ、３５μＭのＺｎＣｌ_２、１μＭまたは４μＭの化合物３、あるいは１μＭまたは４μＭのＴＰＥＮとともに１６時間培養し、ｍＲＮＡは、実施例１９に記述するように細胞から抽出した。ＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現も実施例１９に記述するように、比較ＣＴ法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物３は、媒体のみで処理したＨＴ‐２９細胞と比較して、ＨＴ‐２９細胞においてＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現（約８倍）を誘導した（図８参照）。

実施例２１：ＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４タンパク質の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＫＬＦ４タンパク質の発現を調節する式Iの化合物の能力は、以下のように判断した。ＨＴ‐２９細胞は、媒体対照（ＤＭＳＯ）、ＴＰＥＮ（４μＭ）、ＺｎＣｌ_２（１００μＭ）、または化合物３（２．５、５、７．５および１０μＭ）で１６時間処理した。細胞は溶解し、同等のタンパク質負荷を確保するため、抗ＫＬＦ４抗体、またはＧＡＰＤＨ抗体でウエスタンブロット法を行った。図９に示すように、１６時間の治療後、化合物３はＨＴ‐２９細胞においてＫＬＦ４タンパク質のレベルを増加させることができた。

実施例２２：サイクリン依存性のキナーゼ阻害因子Ｐ２１の発現に対する化合物３の効果
ＫＬＦ４によって制御される遺伝子の発現に対する式Iの化合物の効果は、以下のように判断した。化合物３は、ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞における細胞周期制御因子ｐ２１（サイクリン依存性のキナーゼ阻害因子）の発現を増加させるその能力を判断するため試験した。腫瘍抑制因子ＫＬＦ４は、ｐ２１の抑制によって細胞周期停止を調節するとみられている。ＨＴ‐２９細胞は、ＤＭＳＯ（媒体対照）、３５μＭのＺｎＣｌ_２、１μＭまたは４μＭのＴＰＥＮ、または０．５μＭ、１μＭ、４μＭ、または７．５μＭの化合物３とともに１６時間培養し、ｍＲＮＡを細胞から抽出した。ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、比較ＣＴ法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。このアッセイは、実施例１９に記述される方法を使用して実施した。化合物３は媒体のみで処理されたＨＴ‐２９細胞と比較して、ＨＴ‐２９細胞において３０〜６０倍のｐ２１の発現を誘導した（図１０参照）。

実施例２３：ＨＴ‐２９およびＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞における細胞周期進行を遮断する化合物３のｉＮ ＶＩＴＲＯでの能力
細胞周期進行を遮断する式Iの化合物の能力を試験するため、化合物３はヒト大腸腫瘍ＨＴ‐２９またはヒト白血病ＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞とともに培養し、フローサイトメトリー分析を使用して細胞周期の異なる段階での細胞集団における変質を判断した。ＨＴ‐２９細胞は、実施例１３に記述するように維持した。本実施例および後続の実施例で使用したＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞は、２ｍＭのＬ‐グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ、ＷＩＳＥＮＴ Ｉｎｃ．、Ｓｔ‐Ｂｒｕｎｏ、ＱＣ）、抗生物質‐抗真菌剤（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）を添加した成長培地で懸濁細胞として３７℃の５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターで維持した。

アッセイは以下のように実施した。ＨＴ‐２９細胞に関しては、体積１０ｍＬの成長培地にある１×１０^６細胞は、１００ｍｍの皿に播種した。ＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞に関しては、体積１０ｍＬの成長培地にある３×１０^６細胞は、２５ｃｍ^２のフラスコに播種した。１６時間後、図１１に示すようにいくつかの濃度の化合物３（ＨＴ‐２９細胞に関しては０．５μＭ、１μＭ、または５μＭ、ＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞に関しては０．２５μＭ、０．５μＭ、または１μＭ）または０．１％ＤＭＳＯ媒体対照を含有する成長培地を添加した。２４時間後、ＨＴ‐２９細胞はトリプシン処理によって分離させた。両細胞型は、４分間２０００ｒｐｍの遠心分離によってそれぞれ収集し、ＰＢＳで一度洗浄し、少なくとも４時間、−２０℃の７０％エタノールで固定した。固定細胞は、３分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、２％ＦＮＳを含有する冷たいＰＢＳで一度洗浄し、３０分間３７℃で３ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）および５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で処理した。染色した細胞の蛍光性は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびセルクエストプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。データは、Ｍｏｄｆｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ）を使用して評価した。値は、フローサイトメトリープロットのゲート分析によって判断した。図１１Ａおよび１１Ｂは、ダブレット除去後の総細胞集団の割合として示す。

結果は、化合物３による両細胞株（図１１Ａおよび１１Ｂ）の処理によって、Ｇ_１相において細胞の割合が用量依存的に増加し、ＳおよびＧ_２／Ｍ相において細胞の割合が減少し、それは化合物３がＧ_１相での細胞周期進行において遮断を誘導したことを示した。

実施例２４：ＣＣＲＦ‐ＣＥＭおよびＭＯＬＴ４白血病細胞においてアポトーシスを誘導する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
アポトーシスの異なる段階で細胞集団を変質させる化合物３の能力は、媒体（ＤＭＳＯ）、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭまたは１μＭの化合物３で２４時間処理したＣＣＲＦ‐ＣＥＭ白血病細胞集団における化合物３の効果を判断することによって測定した。ＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞は播種し、実施例２３に記述するように、上記の濃度の化合物３または０．１％ＤＭＳＯ媒体対照で処理した。２４時間後、細胞は遠心分離によって収集し、成長培地において約１×１０^６細胞／ｍｌになるまで再懸濁した。その後、細胞は、メーカーのＲＡＰＩＤアネキシンＶ結合手順に従い、アネキシンＶ‐ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＯＮＣＯＧＥＮＥ（登録商標）ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＡ）を使用して、アネキシンＶ結合およびＰＩ染色に対して染色した。染色した細胞の蛍光性は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびセルクエストプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。データは、象限統計を得るためＭｏｄｆｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ）を使用して評価した。アネキシンＶのみで染色された細胞は、初期アポトーシスであると考えられ、一方、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムの両方で染色された細胞は後期アポトーシスであると考えられた。ヨウ化プロピジウムのみで染色された細胞は非生存細胞であり、染色されないものは生存細胞である。ＭＯＬＴ‐４白血病細胞は同様に処理した。

化合物３の濃度を上昇させていくと、初期および後期アポトーシス細胞数が増加し、生存細胞は減少した（図１２）。高濃度の化合物３（１．０μＭ）のみで、非生存細胞の増加が見られた。ＭＯＬＴ４白血病細胞においても、同様の結果が得られた（データは表示せず）。したがって、化合物３はアポトーシスを被る細胞を誘導することができた。

実施例２５：ホローファイバーアッセイにおける化合物３のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
式Iによる化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの効果は、ホローファイバーアッセイにおける化合物３の効果を判断することによって試験した。本アッセイは、Ｄｅｃｋｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４０：８２１‐８２６（２００４）に記述され、以下のように、１２ヒト腫瘍細胞株（胸；ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５、神経膠腫；Ｕ２５１、ＳＦ‐２９５、卵巣；ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ５、結腸；ＣＯＬＯ‐２０５、ＳＷ‐６２０、黒色腫；ＬＯＸ‐ＩＭＶＩ、ＵＡＣＣ‐６２、および肺；ＮＣＩ‐Ｈ２３、ＮＣＩ‐Ｈ５２２）を無胸腺マウスに移植することによって実施した。細胞培養は、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭのグルタミンを含有するＲＰＭＩ‐１６４０において培養した。細胞は標準的トリプシン処理によって採取し、再懸濁し（２〜１０×１０^６細胞／ｍｌ）、内径１ｍｍのポリビニリデンホローファイバーへ流し入れた（５００，０００Ｄａ．のＭＷ排除）。ＰＶＤＦファイバーに付着した培養は、移植前に２４〜４８時間５％ＣＯ_２において３７℃で培養した。各マウスは計６つの移植片を受け、腹膜に３つのファイバー、皮下区画に３つのファイバーが置かれ、１匹のマウスにつき３つの細胞株、各群に３匹のマウス、媒体のみで処理した対照は６匹とした。薬剤は、４日の治療において２つの異なる用量および２つの投与法（Ｉ．Ｐ．およびＳ．Ｃ．）で試験した。ファイバーは移植後６〜８日で収集し、細胞の生存能力はＭＴＴ法によって評価し、対照と比較して成長において５０％以上の減少がある場合、薬剤は有効であるとみなした。細胞殺滅は、移植片における最初の生存能力と比較した細胞生存能力の減少によって評価した。結果は、阻害された細胞株の数×２つの部位×２つの化合物の用量×因数２＝最大９６に基づいて記録した。合計スコア２０、ＳＣスコア８または１つ以上の細胞株の正味の細胞殺滅を有する化合物は、陽性とみなした。

得られた結果は、表５に示すように、化合物３は２２点のＩＰスコア、１０点のＳＣスコア＝計３２点の陽性細胞殺滅を有することを示した。これらの研究は、化合物３はｉｎ ｖｉｖｏで数種の腫瘍細胞を死滅させるのに有効であることを実証した。

実施例２６：大腸腫瘍異種移植モデルにおける化合物３のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
ｉｎ ｖｉｖｏでの結腸腫瘍成長を阻害する化合物３の能力は、以下のように試験した。ＣＤ‐１雌ヌードマウス（１つの治療群につきマウス７匹、６〜７週）の腹腔内に、ヒト結腸腺癌細胞ＨＴ‐２９細胞（０．１ｍｌのＰＢＳに３×１０^６細胞）を注射した。媒体または５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物３でのマウスの治療は５週間、５日の後に２日間の中断が続く７日周期で、接種（腫瘍の大きさ＝２０〜４０ｍｍ^３）後５日で開始した。腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して実験期間にわたって測定し、腫瘍の重さは動物を死亡させた後に測定した。化合物３は、腫瘍の大きさおよび重さによって測定されたように、媒体処理された対照の動物と比較して、腫瘍成長を阻害することができた（図１３Ａおよび１３Ｂ参照）。

実施例２７：肺大細胞癌異種移植モデルにおける化合粒３のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
ｉｎ ｖｉｖｏでの大細胞肺腫瘍成長を阻害する式Iの化合物の能力は、以下に記述するように、異種移植モデルにおける化合物３の効果を判断することによって試験した。化合物３は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン‐ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ‐ＰＥＧ／５％モル）および卵ホスファチジルコリン（ｅＰＣ／９５％モル）の組成物を有する脂質ベースの製剤として試験した。製剤は次のように調製した。化合物３および脂質（ｅＰＣおよびＤＳＰＥ‐ＰＥＧ）の原液は、ＤＭＦにおいて調製した。その後、一定の体積の化合物３および脂質の原液は、２５ｍｇ／ｍＬの脂質濃度（ｅＰＣ：ＤＳＰＥ‐ＰＥＧ＝９５：５（モル％）および化合物３：総脂質率＝１：１０（ｗ／ｗ）を得るため混合した。混合物は、４時間撹拌し、窒素下で十分に乾燥させ、真空下で一晩放置した。その後、６０℃に加熱したＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）は乾燥膜を再水和するために加えた。溶液はボルテックスし、室温で４８時間撹拌し、２時間半、超音波で分解した。その後、製剤は任意の遊離化合物３を除去するため、５分間１０００ｒｐｍで遠心分離させた。

ＣＤ‐１雌ヌードマウス（６〜７週、１つの治療群につきマウス７匹）の腹腔内に、ヒト肺ＮＣＩ‐Ｈ４６０細胞（０．１ｍｌのＰＢＳに３×１０^６細胞）を皮下に注射した。媒体または化合物３でのマウスの治療は、実験期間中（３５日間）、５日の後に２日間の中断が続く７日周期で、接種（腫瘍の大きさ＝２０〜４０ｍｍ^３）後５日で開始した。マウス は、１週目は８０ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理し、その後、実験終了まで４０ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理した。腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して実験期間にわたって測定し、腫瘍の重さは動物を死亡させた後に測定した。化合物３は、腫瘍の大きさおよび重さによって測定されたように、媒体処理された対照の動物と比較して、腫瘍成長を阻害することができた（図１４Ａおよび１４Ｂ参照）。

実施例２８：大腸腫瘍異種移植モデルにおける化合物３、５および７のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
ｉｎ ｖｉｖｏでの大腸腫瘍細胞成長を阻害する化合物３、５および７の能力は、実施例２６に記述するように、マウス異種移植モデルにおいて試験した。化合物は、ルトロール製剤（ｉ．ｐ．投与）、脂質ベースの製剤ミセル（ｉ．ｖ．投与）、または水性製剤（ｉ．ｐ．投与）として試験した。媒体対照は、ルトロール対照（ｉ．ｐ．投与）、脂質ミセル対照（ｉ．ｖ．投与）、および水対照（ｉ．ｐ．投与）を含んだ。ルトロール製剤は、１５％ルトロールおよび１０％ＤＭＳＯを含有した。脂質ベースの製剤および同様の製剤の組成物は、上記の実施例２７に記述される。
結果は（図１５）、これらの化合物によって、ＨＴ‐２９細胞由来の腫瘍の大きさ（図１５Ａ）および重さ（図１５Ｂ）が減少したことを示した。

実施例２９：肺大細胞癌異種移植モデルにおける化合物３、５および７のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
ｉｎ ｖｉｖｏでの肺大細胞癌細胞成長を阻害する化合物３、５および７の能力は、
実施例２７に記述するように、マウス異種移植モデルにおいて試験した。化合物は、ルトロール製剤（ｉ．ｐ．投与）、脂質ベースの製剤ミセル（ｉ．ｖ．投与）、または水性製剤（ｉ．ｐ．投与）として試験した。媒体対照は、ルトロール対照（ｉ．ｐ．投与）、脂質ミセル対照（ｉ．ｖ．投与）、および水対照（ｉ．ｐ．投与）を含んだ。ルトロール製剤は、１５％ルトロールおよび１０％ＤＭＳＯを含有した。脂質ベースの製剤および同様の製剤の組成物は、上記の実施例２７に記述される。
結果は（図１６）、化合物３、５および７によってＮＣＩ‐Ｈ４６０細胞由来の腫瘍の大きさ（図１６Ａ）および重さ（図１６Ｂ）が減少したことを示した。

実施例３０：ＩＮ ＶＩＶＯでのＫＬＦ４の発現を調節する化合物３の能力
ＨＴ‐２９結腸腫瘍異種移植片においてＫＬＦ４の発現を調節する化合物３の能力は、以下のように判断した。１０匹のＣＤ‐１雌ヌードマウス（６〜７週）の群の背中の中央下部にヒト結腸腺癌細胞ＨＴ‐２９細胞（０．１ｍｌのＰＢＳに３×１０^６細胞）を皮下注射した。媒体または５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物３でのマウスの治療は、実験期間中（３５日間）、５日と２日の周期で、接種（腫瘍の大きさ＝２０〜４０ｍｍ^３）後５日で開始した。治療期間後、動物は死亡させ、腫瘍は切除し、総ＲＮＡはＲｎｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して３０ｍｇの腫瘍組織から抽出した。ＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現は、実施例１９に記述されるように、比較ＣＴ法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物３は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて約１．５倍であり、化合物３で処理したすべてのマウスからの腫瘍異種移植片においてＫＬＦ４の発現を誘導した（図１７）。

実施例３１：ＩＮ ＶＩＶＯでのＰ２１の発現を調節する化合物３の能力
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰ２１の発現を調節する化合物３の能力は、実施例２６に記述するように、ＨＴ‐２９結腸腫瘍異種移植モデルを使用して判断した。ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、実施例３０に記載するように、比較ＣＴ法を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物３は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて、化合物３で処理したすべてのマウスからの腫瘍異種移植片においてｐ２１の発現を誘導した（図１８）。

実施例３２：ＩＮ ＶＩＶＯでのサイクリンＤ１の発現を調節する化合物３の能力
サイクリンＤ１の発現を調節する化合物３の能力は、実施例２６に記述するように、ＨＴ‐２９結腸腫瘍異種移植モデルを使用して判断した。サイクリンＤ１ｍＲＮＡの発現は、実施例３０に記載するように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。化合物３は、媒体のみで処理した腫瘍異種移植片と比べて、化合物３で処理したマウスからの腫瘍異種移植片においてサイクリンＤ１の発現を一貫して減少させた（図１９）。この実験結果は、実施例３０および３１に記述するように、ＫＬＦ４およびＰ２１発現に対するｉｎ ｖｉｖｏでの化合物３の効果に関して記述した結果ともに、図２０に示す。

実施例３３：化合物の亜急性毒性試験
式Iの化合物の亜急性毒性を試験するため、雌マウスに化合物を注射し、死亡率、行動、外観、体重の変化に基づいて毒性を評価した。つまり、体重が約０．０２０ｋｇのＩＣＲ正常雌マウス（５〜６週齢；ｎ＝３３）に１００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの様々な化合物または媒体のみ（ルトロール（Ｍ６８、微粉末））を注射した。３匹ずつのＩＣＲ雌マウスの群に、１日２回、４．０ｍｇ／ｍｌの各化合物の１回２５０μＬの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を（１００ｍｇ／ｋｇ）を１週間（群I）、または１日２回、２．０ｍｇ／ｍｌの各化合物の１回２５０μＬの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を（５０ｍｇ／ｋｇ）を１週間（対照群）与えた。

試験する化合物は、４．０ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で、１週間に十分な量を調製した。つまり、５０ｍｇの各化合物は、１．２５ｍｌの１００％ＤＭＳＯに溶解し、６．２５ｍｌのルトロール（水中に３０％）および５ｍｌの水で希釈し、水中１５％ルトロールにおいて４ｍｇ／ｍｌの化合物の溶液を調製した。次に、４ｍｌの各調製液は４ｍｌの水中１５％ルトロールでさらに希釈し、２．０ｍｇ／ｍｌの各化合物の溶液を得た。媒体対照溶液に関しては、８ｍｌの水中１５％ルトロールを調製した。４．０ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の化合物はおよび媒体対照は、上述のように投与した。毒性は死亡率、行動、外観、体重の変化に基づいて評価し、表６に示す。

表６：亜急性毒性試験

実施例３４：ＨＴ‐２９細胞における化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの細胞内局在性
癌細胞における式Iの化合物の細胞内局在性は、以下のように判断した。化合物３は本質的に蛍光性であるため、ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞において蛍光顕微鏡法によって癌細胞におけるその細胞内局在性を調べることは可能であった。細胞は５分間（図２１Ａ）または４時間（図２１Ｂおよび２１Ｃ）１０または２５μＭの化合物３で処理し、ＰＢＳで一度洗浄し、１０分間３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、再度３回洗浄し、サイトシールを付けた。画像は励起フィルターが３６０〜３７０ｎｍのＺｅｉｓｓレーザースキャン蛍光顕微鏡で得た。結果を図２１Ａ〜Ｃに示す。図２１Ａおよび２１Ｂに関しては、蛍光像を微分干渉コントラスト画像に重ねた。図２１ＢおよびＣは同じ画像である。化合物３は治療から５分以内で細胞に入り込み、細胞核および細胞質へ均等に分布したが、ＨＴ‐２９細胞の原形質膜から除外された（図２１Ａ）。４時間の治療までに、化合物３は主に細胞核（核周辺領域）の外側に局在したが、一部はまだ細胞核内に位置していた（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。

実施例３５：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＤＮＡを切断する化合物３の能力
化合物３は、銅および還元剤であるアスコルビン酸の存在下においてｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドＤＮＡを切断するその能力に対して試験した。実験は、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファ（ｐＨ６．７）、１μｇの超螺旋プラスミドＤＮＡ、１００μＭのアスコルビン酸、２５μＭの薬剤化合物（または媒体）、および１０μＭのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏを含有する計２０μＬにおいて行った。反応混合物は３７℃で３０分間培養し、反応を止めるため１μｌの０．１ＭのＥＤＴＡを加えた。ＤＮＡローディングバッファーを加え、反応は、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルにおいて８０Ｖで８０分行った。化合物３および陽性対照である１，１０‐フェナントロリン（ＯＰ）は両方ともプラスミドＤＮＡを切断することができ、超螺旋型および開環型を低分子量のＤＮＡ断片に変換した。非キレート化合物１３、および媒体対照ＤＭＳＯは、ＤＮＡを切断できなかった（図２２Ａ）。化合物３もＯＰも、銅または還元剤の非存在下においてＮＤＡを切断できなかった。

銅以外のイオンでも十分であるかを判断するため、ＤＮＡ切断反応を亜鉛または鉄の存在下でも実施した。反応は、２５μＭのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、またはＦｅＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏの存在下で、上記のように行った。亜鉛も鉄も、化合物３での切断反応において銅と換えることができた（図２２Ｂ）。アスコルビン酸の存在下での銅のみで、環状ＤＮＡを開ける超螺旋ＤＮＡの比率を変更することができることに注意する。

化合物３が有効となる、化合物と銅の比率を判断するため、図２２Ａのように反応を行った。図２３で示すように、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、および１：１という化合物３と銅の比率は、１０μＭの一定のＣｕ濃度を維持し、化合物３の濃度を変化させることによって得られた。１：１．５、１：２、１：２．５、および１：３という化合物３とＣｕの比率は、１０μＭの化合物３の一定の濃度を維持し、銅の濃度を変化することによって得られた。化合物３は銅に対して１．５：１より大きい比率である場合ＤＮＡを効果的に切断し、１：１、１：２、１：２．５という比率では切断できなかった。しかしながら、化合物３は１：３という比率でも切断できた（図２２Ｃ）。これらの結果により、形成される銅‐化合物３錯体の種類、および最も細胞毒性を有するものに関しての目安が得られた。

他の式Iの化合物、化合物５、７、９および１３でも、銅に対する２．５：１の比率で、ＤＮＡを切断するそれらの能力に関して試験した（図２３）。示された化合物３：銅の比率、さらに化合物３の非存在下での銅の濃度は、上述のようにＤＮＡ切断アッセイで使用した。化合物９および１２もＤＮＡを切断できるとみられた。

実施例３６：ＨＴ‐２９大腸腫瘍細胞における式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯでの増殖抑制活性
ヒト大腸腫瘍ＨＴ‐２９細胞の増殖を阻害する式Iの化合物の能力は、実施例１３の記述のように試験した。本実験の結果を表７に示す。

実施例３７：式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯおよびＩＮ ＶＩＶＯでの効果
金属転写因子‐１（ＭＴＦ‐１）は、亜鉛による活性化によって構成的に発現する転写因子であり、金属応答配列と結合することによって標的遺伝子を制御する。低酸素誘導性酸化的ストレスおよび細胞内貯蔵からの亜鉛放出後の急速に増殖する腫瘍細胞の低酸素微環境におけるＭＴＦ‐１の活性化は、腫瘍の成長および進行に関与している。Ｋｒ（ｕｐｓｉｏｎ）ｐｐｅｌ様因子４（ＫＬＦ４）は、Ｓｐ／ＫＬＦ族転写因子の一員であり、ＧＣボックスおよびＣＡＣＣＣボックスのＤＮＡ配列と結合することによって標的遺伝子を制御する。ＫＬＦ４は、ｐ２１^{ｗａｆ１／ｃｉｐ１}の活性化およびサイクリンＤ１プロモーターと結合する正の制御因子Ｓｐ１を無効にすることによるサイクリンＤ１発現の抑制などの機序による、細胞成長の負の制御因子である。ＫＬＦ４の腫瘍抑制の役割は、Ｔ細胞白血病、消化器、膀胱および前立腺の癌において認められる。ＭＴＦ‐１、Ｓｐ１およびＫＬＦ４による自己制御能は、ＫＬＦ４の上流の正の制御因子である。ＭＴＦ‐１を下方制御する一連の新規の小分子が開発され、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性は選別されている。式Iの化合物は、図２４で示すようにリガンドベースの構造設計による３０００以上のイミダゾール‐フェナントロリン構造から選択された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞成長阻害に対する式Iの化合物の効果は、前記の実施例に記述する方法によって分析した。実施例１２で示すように、非経口の化合物３による細胞成長阻害は、国立癌研究所の６０‐培養細胞株アッセイおよびによって選別し、白血病、非小細胞癌、大腸癌、腎臓癌および前立腺癌のパネルは、特に化合物３に敏感であった。試験したすべての培養細胞株の平均ＧＩ_５０は、図２で示すように０．６２μＭであった。

実施例２５に示すように、化合物３による細胞成長阻害は、国立癌研究所のホローファイバーアッセイによってｉｎ ｖｉｖｏで選別した。少なくとも皮下での８点または任意の培養細胞株の細胞殺滅がある２０点以上の総合点は、有意な活性抗癌化合物とみなした。化合物３は、上の表５に示すように、皮下での１０点および正の細胞殺滅がある総合点３２点を示した。
腫瘍細胞成長阻害は、異なる癌細胞型における式Iの化合物によって、癌細胞増殖アッセイにおいてはｉｎ ｖｉｔｒｏで見られ、ホローファイバーアッセイおよびマウス腫瘍異種移植モデルにおいてはｉｎ ｖｉｖｏで見られた。

実施例３８：ヒト癌細胞株における細胞成長阻害およびＫＬＦ４遺伝子発現を調節する式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
式Iの化合物による細胞成長阻害ＩＣ_５０（μＭ）は、ＸＴＴ細胞増殖アッセイによって様々な癌細胞型に関して試験した。低ミクロモルまたはミクロモル以下のＩＣ_５０は、表８に示すように、異なる癌の種類において見られた。黒色腫細胞株Ｋ‐ＭＥＬ‐２に対する以下に示される式Iの化合物の成長阻害効果は、Ｌｏｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって再現可能であった。
乳癌細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５における式Iの化合物のＩＣ_５０値は、表８に示すように０．２μＭ〜０．６μＭであった。

式Iの化合物によって誘導されるＫＬＦ４の遺伝子発現レベルは、ＲＴ‐ＰＣＲによって様々な癌細胞型に対しても調べた。化合物で処理された細胞におけるＫＬＦ４の倍変化は、「１」とする個々の細胞型の媒体対照で処理された細胞におけるＫＬＦ４発現を基準にして示された。ＫＬＦ４発現の増加は、表８にも示すように異なる癌の種類において見られた。遺伝子発現の研究は、乳癌細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５の遺伝子発現パターンは他の乳房の腫瘍株よりも、黒色腫細胞株のパターンと酷似していることを明らかにした（Ｒｏｓｓら（２０００）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２４（３）：２２７‐２３３）。さらに、雌ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体に移植したＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５の異種移植片は、色素系と一致する免疫組織化学的染色を示した（Ｅｌｌｉｓｏｎ Ｇ、Ｋｌｉｎｏｗｓｋａ Ｔ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ＲＦ、Ｄｏｃｔｅｒ Ｅ、Ｆｒｅｎｃｈ Ｔ、Ｆｏｘ
Ｆｏｘ ＪＣ（２００２）ＭｏＩ Ｐａｔｈｏｌ、５５（５）：２９４‐２９９）。乳癌細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５は、他の乳癌細胞株とは異なって機能することが予想されるかもしれない。

実施例３９：肺大細胞癌および大腸腫瘍異種移植モデルにおける式Iの化合物のＩＮ ＶＩＶＯでの効果
マウス異種移植モデルにおける式Iの化合物による腫瘍成長阻害を図２５に示す。非小細胞肺癌（Ｈ４６０）（図２５Ａ）および結腸腺癌（ＨＴ‐２９）（図２５Ｂ）に対する投与法およびスケジュールの研究、非小細胞肺癌（Ｈ４６０）に対する最小有効量（図２５Ｃ）、および非小細胞肺癌（Ｈ４６０）における式Iの最適化した化合物の効果（図２５Ｄ）。

実施例４０：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物３の能力に対する外因性金属の効果
亜鉛減少誘導の細胞成長阻害を図２６に示す。ＨＴ‐２９細胞の化合物３媒介の細胞成長阻害に対する金属イオン補給剤の効果は、ＸＴＴ細胞増殖アッセイによって調べた。細胞成長阻害は、図２６Ａおよび２６Ｂに示すように亜鉛のみで完全に覆された。

実施例４１：ＨＴ‐２９細胞における細胞周期進行を遮断する化合物３および化合物７のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
細胞周期解析は、図２７Ａに示すように化合物３で処理したＨＴ‐２９細胞、または図２７Ｂに示すように化合物７で処理したＨＴ‐２９細胞においてフローサイトメトリーによって評価した。Ｇ１／Ｓ相での細胞周期停止は治療後に見られた。

実施例４２：金属をキレートする式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
化合物３および化合物７の金属キレート化の性質を図２８に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの４（２‐ビリジルアゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）金属結合アッセイは、ＰＡＲと結合するＺｎおよびＣｕ^＋２は化合物３によって弱まったことを示し、化合物３のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＺｎおよびＣｕ^＋２をキレートする性質が示された。結果を図２８Ａ（ＺｎＣｌ_２）、２８Ｂ（ＣｕＣｌ_２）および２８Ｃ（ＦｅＣｌ_２）に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの４（２‐ビリジルアゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）亜鉛結合アッセイは、以下のように行った。三重ウェルの９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＣ）に、０．２Ｍのトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５における体積１０μＬの指定された最終濃度のＺｎＣｌ_２を１０μＬの８０％アセトニトリル‐２０％ＤＭＳＯ媒体対照とともに、または８０％ アセトニトリル‐２０％ ＤＭＳＯに溶解した指定された最終濃度式Iの化合物とともに、室温で１５分培養した。その後、０．２Ｍのトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５における２００μＭの最終濃度での８０μＬのＰＡＲを加え、ＰＡＲ‐Ｚｎ^＋２錯体の着色を５００ｎｍのマルチウェル分光光度計（Ｂｉｏ‐Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で測定した。

実施例４３：ＨＴ‐２９細胞における金属感受性遺伝子の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
個々の金属特異性キレート剤と比較して、ＨＴ‐２９細胞における金属感受性遺伝子の発現の変化は、図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃに示すようにＲＴ‐ＰＣＲによって調べた。
亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネイン１Ａ（ＭＴ１Ａ）（図２９Ａ）、銅輸送体、ＳＬＣ３１Ａ１としても知られるＣｔｒ１（図２９Ｂ）および鉄輸送体トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）（図２９Ｃ）の発現に対する化合物３および化合物７での治療の効果は測定し、それぞれ周知の亜鉛キレート剤ＴＰＥＮ、銅キレート剤テトラミンおよび鉄キレート剤ＤＦＯと比較した。Ｃｕ^＋２のｉｎ ｖｉｔｒｏでのキレート化に関わらず、化合物３での治療後の銅感受性遺伝子の増加は一時的なものであった。対照的に、亜鉛感受性遺伝子における持続的な減少は、化合物３での治療の有意な結果として細胞内の亜鉛減少を示した。

実施例４４：ＩＮ ＶＩＶＯでのＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現を調節する式Iの化合物の能力
ＨＴ‐２９大腸癌異種移植組織における亜鉛感受性の転写因子ＭＴＦ‐１と細胞周期の制御因子サイクリンＤ１発現の間の相関を図３０に示す。サイクリンＤ１遺伝子プロモーター領域（図３０Ａに示す）における推定のＭＴＦ‐１結合ＤＮＡ配列の存在に基づき、異種移植組織におけるＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現レベルは、組織ＲＮＡ抽出物を使用してＲＴ‐ＰＣＲによって調べた。ＭＴＦ‐１発現の減少は、図３０Ｂに示すように化合物３、図３０Ｃに示すように化合物７で、サイクリンＤ１発現の減少と相関した。

実施例４５：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現を調節する化合物３の能力
ＨＴ‐２９細胞におけるＭＴＦ‐１とサイクリンＤ１の遺伝子発現の間の相関を図３１に示す。ＲＴ‐ＰＣＲによって測定した、ＭＴＦ‐１（図３１Ａ）およびサイクリンＤ１（図３１Ｂ）発現における時間依存性の減少は、化合物３での治療後に見られた。サイクリンＤ１（図３１Ｄ）発現の減少は、ｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの後に見られた。ｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの後のＭＴＦ‐１レベルを図３１Ｃに示す。
ＭＴＦ‐１の発現および活性は、式Iの化合物によって減少した。ＭＴＦ‐１の下方制御は、サイクリンＤ１発現の減少と相関した。

実施例４６：ＩＮ ＶＩＴＲＯでＫＬＦ４結合活性を調節する化合物３の能力
腫瘍抑制因子ＫＬＦ４の誘導を引き起こすＭＴＦ‐１発現の減少を図３２に示す。ＫＬＦ４遺伝子プロモーター領域上の部位に結合する重複転写因子（図３２Ａに示す）に基づき、ＭＴＦ‐１結合は、他のＫＬＦ４誘導因子であるＳｐ１およびＫＬＦ４の結合増加を助ける場合がある。ＨＴ‐２９細胞核抽出物からのＳｐ１（図３２Ｂ）およびＫＬＦ４（図３２C）のＤＮＡ結合活性の増加は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって示された。
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は以下のように行った。ＨＴ‐２９細胞からの核抽出物（各実験群において１００ｍｍの培養皿に１０^７細胞）は、核抽出物イオンキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して調製した。

ＥＭＳＡアッセイは、メーカーの使用説明書に従い、ＫＬＦ４およびＳｐ１ ＥＭＳＡ「ゲルシフト」キット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して行った。つまり、５μｇの核抽出物は各結合反応に使用した。３０分の結合反応後、サンプルは４℃、１２０Vで６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＢｒｉｇｈｔＳｔａＲ（登録商標）‐Ｐｌｕｓ正荷電ナイロン膜に移動した。膜上のビオチンで標識プローブは、ＥＣＬ検出システム（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して可視化した。
ＭＴＦ‐１活性の減少は、正の制御因子であるＳｐＩおよびＫＬＦ４自己制御能によるＫＬＦ４の誘導を助ける。

実施例４７：ＩＮ ＶＩＴＲＯでサイクリンＤ１プロモーターと結合するＫＬＦ４を調節する化合物３の能力
ＨＴ‐２９細胞においてサイクリンＤ１の抑制を引き起こすＫＬＦ４発現の減少を図３３に示す。サイクリンＤ１遺伝子プロモーター領域（図３３Ａ）上の部位に結合する重複転写因子に基づき、負の制御因子ＫＬＦ４の結合増加は、正の制御因子 Ｓｐ１の結合に取って代わる場合がある。サイクリンＤ１プロモーターとのｉｎ ｖｉｖｏでのＫＬＦ４およびＳｐ１結合は、クロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）によって示された。ＫＬＦ４結合の増加およびＳｐ１結合の減少は、化合物３での治療後に見られた。

クロマチン免疫沈降沈殿（ＣｈＩＰ）は以下のように行った。ＨＴ‐２９細胞からの細胞溶解物（各実験群における３つの１５ｃｍ培養プレートに５．５×１０^５細胞）は、指定された実験の最後に調製し、ＣｈＩＰアッセイは、メーカーの使用説明書に従って抗‐ＫＬＦ４および抗Ｓｐ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）およびＣｈＩＰ‐ＩＴＴＭキット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して行った。５’プライマー（５’‐ＣＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡ‐３’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］および３プライマー（５’‐ＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＡ‐３’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］であるサイクリンＤ１プロモーターの‐２３１から‐９２領域を含むプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにおいて合成した。
サイクリンＤ１プロモーターとのＫＬＦ４（負の制御因子）結合の減少は、Ｓｐ１（正の制御因子）結合を阻害し、サイクリンＤ１発現を抑制する。

実施例４８：ＨＴ‐２９細胞における細胞成長を阻害し、ＫＬＦ４の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＨＴ‐２９細胞成長におけるＫＬＦ４発現の有意性を図３４に示す。ＲＴ‐ＰＣＲで測定したＫＬＦ４遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ４遺伝子の有効なノックダウンを示した（図３４Ａ）。ＸＴＴアッセイで測定した細胞増殖は、ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ４遺伝子のノックダウン後の化合物３媒介の細胞成長阻害の損失を示した（図３４Ｂ）。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）トランスフェクションは以下のように行った。予め指定されたＭＴＦ‐１ｓｉＲＮＡ（ＩＤ＃１５７３４）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）は、内因性ＭＴＦ‐１ｍＲＮＡを分解するために使用した。同様に、予め指定されたＫＬＦ４ｓｉＲＮＡ（ＩＤ＃１１５４９２）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）は、内因性ＫＬＦ４ｍＲＮＡを分解するために使用した。非特異的な二本鎖ＲＮＡである、
（５’Ｒ（ＣＵＡＧＧＧＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＧＡＧ）ｄ（ＴＴ）３’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３］および
（３’ｄ（ＴＴ）Ｒ（ＧＡＵＣＣＣＡＵＣＵＧＣＵＡＣＵＣＵＣ）５’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４］
は、無関係の遺伝子の配列に基づいて、Ｑｉａｇｅｎ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において合成した。ＨＴ‐２９細胞（３５ｍｍの培養皿に３×１０^５細胞）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、メーカーの使用説明書に従い、指定された濃度のｓｉＲＮＡまたはスクランブルＲＮＡ対照で６時間トランスフェクトした。培養期間の最後では、トランスフェクション培地に完全な成長培地を添加し、指定された実験の前に細胞を３７℃で２４時間培養した。

実施例４９：ＣＤ‐１ヌードマウスにおけるヒト肺大細胞癌（Ｈ４６０）の成長に対する式Iの化合物の効果
ヒト肺大細胞癌（Ｈ４６０）のマウス異種移植モデルにおける式Iの化合物による腫瘍成長阻害は、上記の実施例で記述するように実施した。結果を図３５に示す。

実施例５０：式Iの化合物による亜鉛イオンのＩＮ ＶＩＴＲＯでのキレート化
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて亜鉛イオンで化合物３のキレート化の性質を判断するため、異なる濃度の化合物３とともにＺｎＣｌ_２を前培養した後、亜鉛感受性の蛍光染料Ｚｉｎｑｕｉｎを使用して、遊離亜鉛イオンを蛍光分光分析によって測定した（図３６）。２μＭのＺｎＣｌ_２は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において指示された濃度の化合物３とともに培養し、その後、１０μＭの最終濃度のＺｉｎｑｕｉｎを３０分間加えた。亜鉛結合後のＺｉｎｑｕｉｎの蛍光性は、３６４ｎｍの励起および４８５ｎｍの発光波長でＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ発光蛍光分光計において測定した。
Ｚｉｎｑｕｉｎの蛍光性の用量依存的減少が見られ、亜鉛イオンでの化合物３のキレート化の結果として、Ｚｉｎｑｕｉｎとの程度の少ない亜鉛イオン結合が示された。ＦｅＣｌ_２およびＣｕＳＯ_４での同様の実験は、Ｚｉｎｑｕｉｎの蛍光性を示さず、亜鉛イオンのみに対するＺｉｎｑｕｉｎの蛍光性の特異性を示した。

実施例５１：式Iの化合物での治療後のＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞における細胞内の亜鉛イオンのキレート化
細胞内の亜鉛イオンでの化合物３のキレート化の性質を判断するため、３５μＭのＺｎＣｌ_２が最初から組み込まれているＨＴ‐２９細胞、または最初から組み込まれていないＨＴ‐２９細胞を化合物３、周知の亜鉛キレート剤ＴＰＥＮまたは媒体対照（ＤＭＳＯ）で処理し、前記の実施例に記述するようにＺｉｎｑｕｉｎの蛍光性を測定することによって、細胞内の遊離亜鉛を判断した。ＨＴ‐２９細胞（４×１０^５細胞／群）は、３５μＭのＺｎＣｌ_２で２０分間前処理し、その後、指示された濃度の化合物３またはＴＰＥＮおよび１０μＭのＺｉｎｑｕｉｎを３７℃で３０分間加え、蛍光数を測定した（図３７Ａ）。ＨＴ‐２９細胞における内因性亜鉛イオンのキレート化の測定に関して、ＨＴ‐２９細胞（１．５×１０^６細胞／群）は、指示された濃度の化合物３および１０μＭのＺｉｎｑｕｉｎで３７℃で３０分間処理し、蛍光数を測定した（図３７Ｂ）。
最初から組み込まれている亜鉛および内因性亜鉛レベルの両方の用量依存的減少は、化合物３またはＴＰＥＮでの治療後に見られた。

実施例５２：ＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞における亜鉛のキレート化およびメタロチオネイン１Ａ遺伝子の発現に対する式Iの化合物の効果
化合物３での治療後の細胞内の亜鉛レベルの減少を確認するため、亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネイン１Ａ（ＭＴ１Ａ）の遺伝子発現の変化を細胞内の亜鉛状態マーカーとして測定した。

以下のように、ＨＴ‐２９細胞は１μＭの化合物３で指示された時間処理し、ＭＴ１Ａ遺伝子発現を以下のように測定した。総ＲＮＡはトリゾール法を使用して抽出し、遺伝子発現レベルは定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）によって測定した。ＭＴ１Ａ遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。ＭＴ１Ａの倍変化は、ＤＭＳＯ対照のＭＴ１Ａレベルに対して、個々の時点で示された。ＭＴ１Ａ遺伝子発現の減少は、図３８Ａに示すように８時間の治療後にはっきりと見られた。
ＭＴ１Ａ遺伝子発現が細胞内の亜鉛レベルを反映したことを検証するため、ＨＴ‐２９細胞を、１μＭの化合物３、３５μＭのＺｎＣｌ_２または化合物３とＺｎＣｌ_２の併用で１６時間処理した（図３８Ｂ）。ＭＴ１Ａ遺伝子発現は、上述のようにＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＭＴ１Ａ遺伝子発現は、ＺｎＣｌ_２で処理した細胞における細胞内の亜鉛イオンの増加に反応して上昇した。化合物３での治療後に細胞内の亜鉛減少へ反応したＭＴ１Ａ発現の減少は、亜鉛補給物の添加によって逆転した（図３８Ｂ）。

実施例５３：ＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞における亜鉛キレート化およびＫｒ（ｕｐｓｉｏｎ）ｐｐｅｌ様因子４（ＫＬＦ４）遺伝子の発現に対する式Iの化合物の効果
化合物３での治療後の亜鉛減少によるＫＬＦ４遺伝子発現の変化は、以下のようにＲＴ‐ＰＣＲによって判断した。ＨＴ‐２９細胞は、指示された時間、１μＭの化合物３で処理（図３９Ａ）、またはＨＴ‐２９細胞は１μＭの化合物３、３５μＭのＺｎＣｌ_２または化合物３とＺｎＣｌ_２の併用で１６時間処理した（図３９Ｂ）。総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。
ＫＬＦ４の時間依存的増加は、１μＭの化合物３でＨＴ‐２９細胞を４時間治療した後に見られ、最大増加は１６時間の時点であった（図３９Ａ）。ＫＬＦ４遺伝子発現の増加は亜鉛補給物の添加によって逆転し（図３９Ｂ）、細胞内の亜鉛状態に反応したＫＬＦ４遺伝子発現の変更の有意性が示された。

実施例５４：ＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞における亜鉛感受性金属応答配列（ＭＲＥ）結合転写因子１（ＭＴＦ１）の遺伝子発現およびＤＮＡ結合活性に対する式Iの化合物の効果
ＭＴＦ‐１の遺伝子発現は、１μＭの化合物３でＨＴ‐２９細胞を指示された時間治療した後、ＲＴ‐ＰＣＲによって調べた。ＭＴＦ‐１発現の減少は、化合物３での８時間の治療の後に見られた（図４０Ａ）。

培養の早期にＭＴＦ‐１活性の変化を検証するため、ＭＴＦ‐１遺伝子発現が有意に減少する前に、以下のように、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって、化合物３で４時間処理したＨＴ‐２９細胞の核抽出物において、ＭＴＦ‐１核転座およびＤＮＡ結合活性を判断した（図４０Ｂ）。ＨＴ‐２９細胞は、ＤＭＳＯ、３５μＭのＺｎＣｌ_２（陽性対照）および１μＭの化合物３で４時間処理した。核タンパク質は抽出し、ビオチンで標識ＭＴＦ‐１結合オリゴヌクレオチドプローブとともに培養した。ＭＴＦ‐１結合による標識プローブの遅延運動性は、バンドシフトとして見られた（図４０Ｂ）。３つのシフトバンド（黒い矢印）はレーン１に見られ（ＤＭＳＯ）、ＭＴＦ‐１の構造性ＤＮＡ結合パターンが示された。亜鉛で処理した群では、２つのさらなるシフトバンド（白い矢印）が見られ（レーン３）、亜鉛依存性のＭＴＦ‐１活性の増加が示された。亜鉛活性化シフトバンドは、化合物３で処理した（レーン５）において見られず、亜鉛依存性のＭＴＦ‐１活性は化合物３によって増加しなかったことが示された。余分の非標識プローブは、核抽出物におけるＭＴＦ‐１と結合する標識プローブと競争するレーン２、４および６において加え、それぞれ、レーン１、３および５におけるＭＴＦ‐１結合シフトバンドの特異性が示された。

陽性対照であるＺｎＣｌ_２で処理した群において見られた運動性シフトバンドと比較して、運動性シフトの有意な変化は化合物３で処理された細胞において見られず、亜鉛依存性のＭＴＦ‐１活性は化合物３での治療後に増加しなかったことが確認された。

実施例５５：ＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４の対抗者であるＫｒ（ｕｐｓｉｏｎ）ｐｐｅｌ様因子５（ＫＬＦ５）の遺伝子発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＫＬＦ４および５は、ＫＬＦ族転写因子の近似する２つの員であるが、ＫＬＦ５は細胞増殖を刺激し、一方、ＫＬＦ４は細胞成長を阻害する（Ｇｈａｌｅｂら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５（２）：９２‐９６）。ＫＬＦ４および５は同様のＧＣ‐リッチＤＮＡ共通配列と結合するが、反対の転写活性を示す。ＫＬＦ４は、ＫＬＦ４プロモーターにおけるＧＣ‐リッチ領域と結合することによって自己の遺伝子を自動的に活性化することができるが、一方、ＫＬＦ５は、同じＤＮＡ要素と結合することによってＫＬＦ４転写を抑制する（Ｄａｎｇら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（１３）：２７３６‐２７４１）。

ＫＬＦ４の誘導に関して、ＭＴＦ‐１発現／活性の減少の結果を検証するため、ＭＴＦ‐１標的ｓｉＲＮＡを使用してＭＴＦ‐１ｍＲＮＡを分解し、ＭＴＦ‐１、ＫＬＦ４およびＫＬＦ５の遺伝子発現を以下のようにＲＴ‐ＰＣＲによって測定した。ＨＴ‐２９細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を使用して、１００ｎＭのＭＴＦ‐１ｓｉＲＮＡで６時間トランスフェクトした。トランスフェクション培地を正常成長培地と入れ替え、１８時間培養した後、総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＭＴＦ‐１遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの使用によってＭＴＦ‐１翻訳を阻害した後、ＫＬＦ５遺伝子の発現減少が見られたが、ＫＬＦ４発現は増加した（図４１Ａ）。

化合物３での経時的治療後のＫＬＦ５遺伝子発現の減少も、以下のように判断した。ＨＴ‐２９細胞は、１μＭの化合物３で指示された時間処理した（図４１Ｂ）。 総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。上述の結果と一致して、ＫＬＦ５遺伝子発現の減少も、１μＭの化合物３での４時間の治療後にＨＴ‐２９細胞において見られた（図４１Ｂ）。

実施例５６：ＨＴ‐２９細胞における細胞周期調節タンパク質Ｐ２１遺伝子およびタンパク質発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ｐ２１遺伝子およびタンパク質の発現は、化合物３での治療後に調べた。１μＭの化合物３で処理したＨＴ‐２９細胞におけるｐ２１の遺伝子発現は、以下のように指示された時間に判断した。
総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した（図４２Ａ）。細胞溶解物におけるｐ２１タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって（図４２Ｂ）以下のように測定した。ＨＴ‐２９細胞は、２０μＭのＭＧ‐１３２（プロテアソーム阻害剤）の存在下または非存在下で１μＭの化合物３で指示された時間処理した。

ｐ２１の遺伝子発現減少は、４時間の化合物３での治療後にＲＴ‐ＰＣＲによって見られた（図４２Ａ）が、ｐ２１タンパク質発現の同程度の増加は、ウエスタンブロット分析（データは表示せず）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のいずれによっても見られなかった（図４２Ｂ）。しかしながら、ｐ２１タンパク質レベルの増加は、ＨＴ‐２９細胞がプロテアソーム阻害剤ＭＧ‐１３２の存在下で化合物３とともに培養した場合に見られ、ｐ２１遺伝子発現の有意な増加にもかかわらず、ｐ２１タンパク質が急速に分解されたことが示された。

実施例５７：細胞周期調節タンパク質サイクリンＤ１の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
化合物３での治療後のサイクリンＤ１の遺伝子およびタンパク質発現は、それぞれ図４３Ａおよび４３Ｂにおいて示すように、以下のようにＲＴ‐ＰＣＲおよびエスタンブロット法によって判断した。ＨＴ‐２９細胞は１μＭの化合物３で指示された時間処理した。総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＨＴ‐２９細胞溶解物におけるサイクリンＤ１タンパク質発現は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、それに続くエスタンブロット法によって判断した。
サイクリンＤ１の遺伝子（図４３Ａ）およびタンパク質（図４３Ｂ）レベルの両方における減少は、化合物３での８時間の治療後に見られた。

実施例５８：腫瘍抑制遺伝子、早期成長反応タンパク質‐１（ＥＧＲ‐１）の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
Ｓｐ１のように、Ｅｇｒ‐１も亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインとの転写因子であり、標的化遺伝子の制御プロモーター領域におけるＧＣ‐リッチ配列を認識する（Ａｌ‐Ｓａｒｒａｊら（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４（１）：１５３‐１６７）。Ｅｇｒ‐１遺伝子発現の変化は、以下のように、ＲＴ‐ＰＣＲによって化合物３で処理したＨＴ‐２９細胞において見られた（図４４Ａ）。ＨＴ‐２９細胞は、１μＭの化合物３で指示された時間処理した。総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。亜鉛補給物の効果を判断するため、ＨＴ‐２９細胞を１μＭの化合物３、３５μＭのＺｎＣｌ、または化合物３とＺｎＣｌ_２の併用で８時間処理した。Ｅｇｒ‐１遺伝子発現はＲＴ‐ＰＣＲで判断した（図４４Ｂ）。
Ｅｇｒ‐１遺伝子発現における有意な増加は、図４４Ａに示すように化合物３での治療後、早くて２時間で見られ、図４４Ｂに示すように亜鉛補給物の添加によって可逆であった。

実施例５９：ＨＴ‐２９細胞における遺伝子発現を調節する化合物３および化合物７のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
化合物３および化合物７に反応した遺伝子発現パターンは、以下のようにＲＴ‐ＰＣＲで検証した（図４５）。ＨＴ‐２９細胞は、１μＭの化合物３または化合物７で８時間処理した。総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。関連する遺伝子の同様の発現が見られた。

実施例６０：ＨＴ‐２９大腸癌異種移植モデルにおけるＫＬＦ４およびサイクリンＤ１の遺伝子発現を調節する化合物３の能力
ｉｎ ｖｉｖｏでのＫＬＦ４およびサイクリンＤ１発現における化合物３媒介の変化の効果を調べるため、媒体対照（ルトロール）および化合物３で処理したＨＴ‐２９大腸癌細胞を移植したマウスの異種移植組織における個々の遺伝子の発現をＲＴ‐ＰＣＲで分析した（図４６）。つまり、以下のように、化合物３での１４日間の治療後のＨＴ‐２９異種移植組織におけるＫＬＦ４およびサイクリンＤ１遺伝子発現を測定した。ＨＴ‐２９細胞を皮下移植したマウスは、媒体対照（ｉ．ｐ．投与）または１００ｍｇ／ｋｇの化合物３（ｉ．ｐ．投与）で１４日間処理した（各群ｎ＝６）。総ＲＮＡは抽出し、遺伝子発現レベルをＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＫＬＦ４およびサイクリンＤ１遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。ＫＬＦ４およびサイクリンＤ１における倍変化は、ルトロールで処理した６匹の対照マウスからの個々の遺伝子発現の平均に対して示された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９培養細胞株における発現パターンと一致して、ＫＬＦ４遺伝子発現の増加およびサイクリンＤ１遺伝子発現の減少は、ｉｎ ｖｉｖｏで見られた（図４６）。

実施例６１：亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネインからの亜鉛をキレートする化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
細胞内の亜鉛は、１分子につき７または８つの亜鉛を貯蔵する貯蔵タンパク質メタロチオネイン（ＭＴ）と緩く結合した不安定なプールとして存在する。不安定な亜鉛プールは、完全活性化のために亜鉛との可逆的結合を必要とする酵素または転写因子に亜鉛を提供する（Ｔａｐｉｅｒｏ ａｎｄ Ｔｅｗ（２００３）Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、５７（９）：３９９‐４１１）。ＭＴから亜鉛を除去する化合物３の効率性を調べた。＞９５％のＭＴにおいて１分子につき７つまでの亜鉛を有するＭＴ‐１ａおよびＭＴ‐２ｅを主に含有するウサギの肝臓から分離したＭＴ‐１は、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ＭＴにおける亜鉛の含有量は、前の実施例に記述するように、４（２‐ビリジルアゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）比色亜鉛アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。ＰＡＲ‐亜鉛イオン錯体形成後のＰＡＲの吸収度における変化は、５００ｎｍで測定した（Ｄｉｎｋｏｖａ‐Ｋｏｓｔｏｖａら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４（１８）：６８８９‐６８９９）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで化合物３によるＭＴ‐１からの亜鉛のキレート化を判断するため、体積１００ｍｌの０．２Ｍトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５における２５μＭのＭＴ‐１を９６ウェルプレートに加えた。８０％アセトニトリル／２０％ＤＭＳＯにおける化合物３（０．１５〜６０μＭ）を室温で１５分間ＭＴ‐１に加えた。ＰＡＲ（０．２Ｍトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５において２００μＭ）を加え、ＰＡＲ‐亜鉛錯体の着色を、図４７に示すように５００ｎｍのマルチウェル分光光度計で測定した。

２５μＭのＭＴのＰＡＲ吸収度における用量依存的減少は、化合物３の用量の増加に伴い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの治療後に見られ（図４７）、細胞内の不安定な亜鉛プールからの化合物３による亜鉛の除去が証明された。

実施例６２：ＭＴＦ‐１ＤＮＡ結合活性を生じさせる化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
亜鉛フィンガーを含有する転写因子である金属応答配列（ＭＲＥ）結合転写因子（ＭＴＦ‐１）のＤＮＡ結合活性を不活性化する化合物３の効率性を調べた。亜鉛のＭＴＦ‐１の活性化亜鉛フィンガーとの可逆的結合は、ＭＴＦ‐１の核転座およびＭＴＦ‐１のＭＲＥとの最大結合に必要とされる（ＬｉｃｈｔｌｅｎおよびＳｃｈａｆｆｎｅｒ（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２３（１１）：１０１０‐１０１７）。

ＨＴ‐２９細胞は、３５μＭのＺｎＣｌ_２で４時間処理し、亜鉛で処理された細胞からの核抽出物（亜鉛活性化ＭＴＦ‐１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化合物３で処理し、ＭＴＦ‐１のＭＲＥ配列とのＤＮＡ結合活性は電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物４によるＭＴＦ‐１ＤＮＡ結合の不活性化を図４８Ａに示す。
細胞における化合物３によるＭＴＦ‐１の不活性化を調べるため、ＨＴ‐２９細胞は化合物３で１〜４時間処理し、核抽出物におけるＭＴＦ‐１のＤＮＡ結合活性はＥＭＳＡで試験した。ＭＴＦ‐１活性の有意な減少は、化合物３でのＨＴ‐２９細胞の治療後４時間で見られた（図４８Ｂ）。

実施例６３：ＨＴ‐２９細胞におけるＭＴＦ‐１ＤＮＡ結合活性を調節する化合物３の能力
ＭＴＦ‐１標的化遺伝子のプロモーター領域、細胞周期制御遺伝子サイクリンＤ１とのＭＴＦ‐１結合の減少を調べるため、ＨＴ‐２９細胞は化合物３で１６時間処理し、サイクリンＤ１プロモーターとのＭＴＦ‐１結合は、クロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって試験した。化合物３での１６時間の治療の終了時、細胞は１％ホルムアルデヒドで架橋転写因子およびそれらの標的クロマチンに固定した。クロマチン錯体はせん断され、ＭＴＦ‐１で結合したクロマチンはＭＴＦ‐１に対する抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）によって破壊した。架橋は逆転し、ＭＴＦ‐１関連ＤＮＡはサイクリンＤ１プロモーターの‐２３１〜‐９２領域を含むプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。５’プライマー（５’‐ＣＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＳ’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］および３’プライマー（５’‐ＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＡ‐Ｓ’）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにおいて合成した。サイクリンＤ１プロモーターとのＭＴＦ‐１結合の増加は、図４９に示すように３５μＭのＺｎＣｌ_２での治療後に見られ、サイクリンＤ１がＭＴＦ‐１標的化遺伝子であることが示された。基礎レベルのＭＴＦ‐１結合と比較して、化合物３後にサイクリンＤ１プロモーターとのＭＴＦ‐１結合の減少が見られ、化合物３がＭＴＦ‐１による構造性のサイクリンＤ１遺伝子転写活性化を阻害したことが示された（図４９）。

実施例６４：ＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞における亜鉛キレート化およびサイクリンＤ１遺伝子の発現に対する式Iの化合物の効果
特にＧ１／Ｓ相に関連する、実施例２３及び４１に示すように化合物３媒介の細胞周期停止に関与する細胞周期制御経路を検証するため、Ｇ１／Ｓ位相進行の主要な細胞周期制御因子サイクリンＤ１の発現を調べた。ＲＴ‐ＰＣＲで測定によると、サイクリンＤ１遺伝子発現は、１μＭの化合物３でのＨＴ‐２９細胞の１６時間の治療の後、有意に減少し、２５μＭのＺｎＣｌ_２の存在下で逆転し、サイクリンＤ１発現の減少は亜鉛減少の結果であったことが確認された（図５０Ａ）。サイクリンＤ１のタンパク質発現の減少は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、それに続くウエスタンブロット法によっても確認された（図５０Ｂ）。さらに、他の種類のサイクリンの発現の測定によって、サイクリンＥの発現の減少が確認された（図５０Ｂ）。

実施例６５：ＩＮ ＶＩＴＲＯでのＨＴ‐２９細胞におけるＭＴＦ‐１の遺伝子発現に対する式Iの化合物の効果
亜鉛減少に対する細胞反応を評価するため、亜鉛感受性の転写因子ＭＴＦ‐１の遺伝子発現を調べた。ＲＴ‐ＰＣＲで測定すると、ＭＴＦ‐１の遺伝子発現の有意な減少（図５１）は１μＭの化合物３でＨＴ‐２９細胞を８時間治療した後に見られ、それは亜鉛補給物の添加によって回復し、化合物３での治療によるＭＴＦ‐１の発現減少は亜鉛減少の結果であったことが確認された。

ＨＴ‐２９細胞は、ＺｎＣｌ_２で処理し、サイクリンＤ１遺伝子の発現をＲＴ‐ＰＣＲで測定した。遺伝子発現の倍変化は、対照細胞におけるサイクリンＤ１遺伝子の発現に対して示された。サイクリンＤ１遺伝子の発現減少は、ＭＴＦ‐１の活性化因子として亜鉛での細胞の治療後に見られた（図５１Ｂ）。
対照またはＭＴＦ‐１ｓｉＲＮＡで処理したＨＴ‐２９細胞は、ＺｎＣｌ_２で、またはＺｎＣｌ_２なしで処理し、サイクリンＤ１遺伝子の発現をＲＴ‐ＰＣＲで測定した。遺伝子発現の倍変化は、対照群においてはトランスフェクションなしで対照細胞のサイクリンＤ１遺伝子の発現に対して示され、トランスフェクション群では非特異性ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞におけるサイクリンＤ１遺伝子の発現に対して示された。サイクリンＤ１発現の亜鉛依存性増加は、ＭＴＦ‐１遺伝子が化合物３の添加の前にｓｉＲＮＡによって分解された時になくなった（図５１Ｃ）。

実施例６６：ＳＩＲＮＡ媒体ＭＴＦ‐１ノックダウンによるＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４の発現を調節する化合物３のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＫＬＦ４誘導に対するＭＴＦ‐１発現の減少の有意性を評価するため、化合物３での治療に反応によるＫＬＦ４遺伝子発現は、ＭＴＦ‐１ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＴ‐２９細胞においてＲＴ‐ＰＣＲで測定した。ＫＬＦ４遺伝子発現の倍変化は、媒体対照で処理した非特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＫＬＦ４発現に対して示された。ＫＬＦ４の基本的発現遺伝子は、ＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの後、有意に減少し、構造性のＭＴＦ‐１依存的ＫＬＦ４遺伝子転写が示された（図５２）。しかしながら、ＫＬＦ４遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子のノックダウンにかかわらず、化合物３での治療の後、増加し続け（図５２）、化合物３での治療によるＫＬＦ４遺伝子のＭＴＦ‐１に依存しない活性化が示唆された。

実施例６７：Ｈ‐４６０非小細胞肺癌細胞におけるＫＬＦ４、ＫＬＦ２およびＫＬＦ６遺伝子の発現に対する式Iの化合物のＩＮ ＶＩＴＲＯでの効果
他の潜在的な腫瘍抑制因子であるＫＬＦ２（肺ＫＬＦ）（Ｗａｎｇら（２００５）ＯＮＣＯＧＥＮＥ、２２（２４）：３８７８‐３８８５）およびＫＬＦ６（Ｉｔｏら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６４（１１）：３８３８‐３８４３）の発現レベルは、非小細胞癌細胞株であるＨ‐４６０において評価した。対照Ｈ−４６０細胞におけるＫＬＦ２、４および６の発現は、ＲＴ‐ＰＣＲで測定した。遺伝子発現は、「１」とするＫＬＦ４発現に対して示された（図５３Ａ）。ＫＬＦ４発現が最も高く、「１」とするＫＬＦ４発現に対して、ＫＬＦ２および６の０．０５および０．３倍のみの発現が検出された（図５３Ａ）。

媒体対照または２．５μＭの化合物３または化合物７で処理したＨ‐４６０細胞におけるＫＬＦ２、４および６の発現は、ＲＴ‐ＰＣＲで測定した。遺伝子発現は、「１」とする媒体対照で処理した群における個々の遺伝子発現に対して示された。化合物３または化合物７での治療も、最も有意に変化した遺伝子としてＫＬＦ４の増加を示した（図５３Ｂ）。

実施例６８：大腸癌異種移植モデルにおける化合物３のＩＮ ＶＩＶＯでの効果およびＭＴＦ１、サイクリンＤ１およびＫＬＦ４の発現の調節
化合物３の腫瘍抑制効果は、化合物３で処理したＨＴ‐２９を移植した無胸腺マウス（図５４Ａ）において評価し、ＨＴ‐２９異種移植組織におけるＭＴＦ‐１、ＫＬＦ４およびサイクリンＤ１の遺伝子発現と相関させた（図５４Ｂ）。ＣＤ‐１無胸腺ヌードマウス（各群４匹）は、ＨＴ‐２９細胞（０．１ｍＬのＰＢＳに３×１０^６細胞）を皮下に注射した。腫瘍細胞の接種後５日目から５日間、２００μＬの媒体対照または１００ｍｇ／ｋｇの化合物３をマウスの腹腔内に注射し、その後１０日間の間隔をあけ、それを２周期（第１周期の注射は５日目〜９日目、第２周期の注射は２０日目〜２４日目）行った。腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して治療の期間中測定した（図５４Ａ）。マウスは、腫瘍細胞の接種後３４日目に死亡させた。腫瘍組織は切除し、直ちに凍結し、ＲＮＡ抽出および遺伝子発現をＲＴ‐ＰＣＲで分析するまで−８０℃で保存した（図５４Ｂ）。遺伝子発現の倍変化は、ルトロール媒体対照を注射した４匹の対照マウスの平均値に対して示された。

腫瘍の大きさにおける有意な減少は、媒体対照を注射したマウスに比べて、化合物３で処理したマウスにおいて見られた（図５４Ａ）。異種移植組織における遺伝子発現の分析も、媒体対照を注射した群に比べて、化合物３で処理したマウスにおいてＫＬＦ４の有意な増加およびＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の遺伝子発現の減少を示した（図５４Ｂ）。

実施例６９：ＨＴ‐２９細胞におけるＭＴ１Ａ、ＭＴＦ１、サイクリンＤ１およびＫＬＦ４の発現を調節する化合物３および化合物７のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＭＴ１Ａ（図５５Ａ）、ＭＴＦ‐１（図５５Ｂ）、サイクリンＤ１（図５５Ｃ）およびＫＬＦ４（図５５Ｄ）の遺伝子発現を調節する式Iの化合物の能力は、ＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＨＴ‐２９細胞は、１μＭの化合物３または化合物７、３５μＭのＺｎＣｌ_２、化合物３とＺｎＣｌ_２の併用、または化合物７とＺｎＣｌ_２の併用で８〜１６時間処理した。個々の遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。遺伝子発現の倍変化は、ＤＭＳＯ対照の個々の遺伝子レベルに対して示された。１μＭの化合物３で見られたように、ＭＴ１Ａ、ＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現減少およびＫＬＦ４の発現増加は、化合物７でも検出された。遺伝子発現変化が細胞内の亜鉛枯渇の結果であることを強調するように、化合物３または化合物７の治療後のＭＴ１Ａ（８時間）（図５５Ａ）、ＭＴＦ‐１（８時間）（図５５Ｂ）およびサイクリンＤ１（８時間）（図５５Ｃ）の減少およびＫＬＦ４（１６時間）（図５５Ｄ）の増加は、亜鉛補給物の添加によって逆転した。

実施例７０：ＩＮ ＶＩＴＲＯでの化合物３および化合物６４による遷移金属イオンのキレート化
化合物６４の金属キレート化の性質および異なる金属イオンに対する相対的親和力は前記の実施例に記述する手順を使用して、４（２‐ビリジルアゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）比色亜鉛アッセイで評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物３の効果と比較した。ＺｎＣｌ_２（図５６Ａ）、ＣｕＣｌ_２（図５６Ｂ）またはＦｅＣｌ_２（図５６Ｃ）の指示された最終濃度は、８０％アセトニトリル‐２０％ＤＭＳＯ媒体対照または２００μＭの式Iの化合物とともに培養した。ＰＡＲ‐金属イオン錯体の着色は、５００ｎｍのマルチウェル分光光度計で測定した。

亜鉛または銅それぞれの用量を増加させて添加した後のＰＡＲ‐Ｚｎ^２＋（図５６Ａ）およびＰＡＲ‐Ｃｕ^２＋（図５６Ｂ）の吸収度における用量依存的増加は、化合物３および化合物６４の存在によってなくなり、Ｚｎ^２＋およびＣｕ^２＋との結合に対してＰＡＲと競合する化合物のキレート化の性質が示された。ＰＡＲ‐Ｆｅ^２＋の用量依存的着色は、化合物の添加によって受ける影響は少なく（図５６Ｃ）、化合物３および化合物６４は両方ともＦｅ^２＋よりＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋を優先することが示された。

実施例７１：ＨＴ‐２９細胞におけるＭＴ１Ａ、ＭＴＦ‐１、サイクリンＤ１およびＫＬＦ４の遺伝子発現を調節する化合物６４のＩＮ ＶＩＴＲＯでの能力
ＨＴ‐２９細胞におけるＭＴ１Ａ（図５７Ａ）、ＭＴＦ‐１（図５７Ｂ）、サイクリンＤ１（図５７Ｃ）およびＫＬＦ４（図５７Ｄ）の遺伝子発現に対する化合物３および化合物６４の効果は、ＲＴ‐ＰＣＲで判断した。ＨＴ‐２９細胞は、１μＭの化合物３または化合物６４、３５μＭのＺｎＣｌ_２、化合物３とＺｎＣｌ_２の併用、または化合物６４とＺｎＣｌ_２の併用で８〜１６時間処理した。個々の遺伝子発現は、同じサンプルにおいてβ‐アクチン遺伝子発現で正規化した。遺伝子発現の倍変化は、ＤＭＳＯ対照の個々の遺伝子レベルに対して示された。

１μＭの化合物３で見られたように、ＭＴ１Ａ、ＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現減少およびＫＬＦ４の発現増加は、化合物６４でも検出された。化合物３または化合物６４での治療後のＭＴ１Ａ（８時間）（図５７Ａ）、ＭＴＦ‐１（８時間）（図５７Ｂ）およびサイクリンＤ１（８時間）（図５７Ｃ）の減少およびＫＬＦ４（１時間）（図５７Ｄ）の増加は、亜鉛補給物の添加によって逆転した。

公開された特許出願を含むすべての特許、出版物の開示および本明細書で参照されるデータベース登録は、各当該個々の特許、出版物、およびデータベース登録が特別そして個別に参照することにより組み込まれるように指示されているのと同じ程度に、全体として参照することにより特別に組み込まれる。

本発明はある特定の実施例を参照して記述されているが、その様々な変更は、本明細書に添付される請求項で要約されるように、発明の精神と範囲から逸脱することなく当業者とって明らかである。

本発明のこれらおよび他の特徴は、付図を参照する以下の詳細な説明においてより明らかとなる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの多数の癌細胞株における化合物２および化合物３の増殖に対するＧＩ_５０値の平均値及び中央値を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの多数の癌細胞株の増殖に対する化合物３の効果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物３および化合物１３の能力に対する金属イオンの効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物３の能力に対する銅イオンの効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物３の能力に対する金属イオンの効果を表す。（Ａ）亜鉛イオンの効果、（Ｂ）銅イオンの効果、（Ｃ）鉄（ＩＩ）イオンの効果、（Ｄ）鉄（III）イオンの効果、（Ｅ）マグネシウムイオンの効果、および（Ｆ）カルシウムイオンの効果。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞の成長を阻害する化合物５（Ａ）および化合物７（Ｂ）の能力に対する銅または亜鉛イオンの効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるメタロチオネイン遺伝子ｍＲＮＡの発現に対する化合物３の効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４ｍＲＮＡの発現に対する化合物３の効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４タンパク質の発現に対する化合物３の効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるｐ２１ ｍＲＮＡの発現に対する化合物３の効果を表す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞（Ａ）およびＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞（Ｂ）において細胞周期進行を阻止する化合物３の能力を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＣＲＦ‐ＣＥＭ細胞においてアポトーシスを誘導する化合物３の能力を示す。 結腸腺癌異種移植モデルにおいて腫瘍の大きさ（Ａ）および腫瘍の重さ（Ｂ）を減少させる化合物３の能力を表す。 肺大細胞癌異種移植モデルにおいて腫瘍の大きさ（Ａ）および腫瘍の重さ（Ｂ）を減少させる化合物３の能力を表す。 結腸腺癌異種移植モデルにおいて腫瘍の大きさ（Ａ）および腫瘍の重さ（Ｂ）を減少させる化合物３、５および７の能力を表す。 肺癌異種移植モデルにおいて腫瘍の大きさ（Ａ）および腫瘍の重さ（Ｂ）を減少させる化合物３、５および７の能力を表す。 結腸腺癌異種移植モデルからの腫瘍におけるｉｎ ｖｉｖｏのＫＬＦ４ ｍＲＮＡレベルに対する化合物３の効果を表す。 結腸腺癌異種移植モデルからの腫瘍におけるｉｎ ｖｉｖｏのｐ２１ ｍＲＮＡレベルに対する化合物３の効果を表す。 結腸腺癌異種移植モデル（Ａ）からの腫瘍におけるｉｎ ｖｉｖｏのサイクリンＤ１ ｍＲＮＡレベルに対する化合物３の効果を表す。 結腸腺癌異種移植モデルにおけるＫＬＦ４、ｐ２１およびサイクリンＤ１ ｍＲＮＡレベルに対する化合物３の効果の比較を表す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における化合物３の細胞内局在を表す。（Ａ） 化合物３で５分間処理した細胞、（Ｂ）および（Ｃ）４時間処理した細胞。（Ａ）および（Ｂ）では、微分干渉コントラスト画像は蛍光像で重ね撮りした（Ｂ）および（Ｃ）は同一画像。 （Ａ）金属イオンの存在下、（Ｂ）銅、亜鉛または鉄（ＩＩ）イオンの存在下、および（Ｃ）様々な量の銅の存在下でＤＮＡを切断する化合物３および１３の化合物の能力を表す。 ＤＮＡを切断する化合物３、５、７、９、１２および１３の能力を表す。 式Iの化合物の開発を示す。 非小細胞肺癌異種移植モデル（Ａ）および 結腸腺癌異種移植モデル（Ｂ）において腫瘍成長を阻害する化合物３および７の能力、 非小細胞肺癌異種移植モデル（Ｃ）において腫瘍成長阻害する化合物７の能力、および 非小細胞肺癌異種移植モデル（Ｄ）において腫瘍成長阻害する化合物７、６３、６４、６９、７２、７３、７４、１８および７８の能力を表す。 化合物３媒介の細胞成長阻害、Zｎ^＋２、Ｃｕ^＋２とＦｅ^＋２（Ａ）およびＦｅ^＋３、Ｃａ^＋２とＭｇ^＋２（Ｂ）に対する金属イオン補給の効果を表す。 化合物３（Ａ）および化合物７（Ｂ）で処理したＨＴ‐２９細胞における細胞周期解析を表す。 ＺｎＣｌ_２（Ａ）、ＣｕＣｌ_２（Ｂ）およびＦｅＣｌ_２（Ｃ）の存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物３および化合物７の金属キレート化の性質を現す。 化合物３、化合物７または個々の金属特異性キレート剤で処理したＨＴ‐２９細胞における、金属感受性の遺伝子、亜鉛感受性の遺伝子メタロチオネイン１Ａ（Ａ）、銅感受性の銅輸送体１（Ｂ）および鉄感受性のトランスフェリン受容体１（Ｃ）の発現の変化を表す。 サイクリンＤ１遺伝子プロモーター（Ａ）におけるＭＴＦ‐１結合ＤＮＡ配列および化合物３（Ｂ）および化合物７（Ｃ）で処理したＨＴ‐２９大腸癌異種移植組織におけるＭＴＦ‐１およびサイクリンＤ１の発現レベルを表す。

ＲＴ‐ＰＣＲで測定した、ＨＴ‐２９細胞における化合物３治療後のＭＴＦ‐１（Ａ）およびサイクリンＤ１（Ｂ）発現、およびｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウン後のＭＴＦ‐１発現（Ｃ）およびサイクリンＤ１発現（Ｄ）。 ＫＬＦ４遺伝子プロモーター（Ａ）上の転写因子結合部位、および化合物３で処理したＨＴ‐２９細胞におけるＳｐＩ（Ｂ）およびＫＬＦ４（Ｃ）のＤＮＡ結合活性を表す。 サイクリンＤ１遺伝子プロモーター（Ａ）上の転写因子結合部位、およびクロマチン免疫沈降アッセイによるＨＴ‐２９細胞における化合物３治療後のサイクリンＤ１プロモーターへのｉｎ ｖｉｖｏのＫＬＦ４およびＳｐＩ結合（Ｂ）を表す。 ＲＴ‐ＰＣＲで測定されたＫＬＦ４遺伝子発現（Ａ）および細胞増殖（Ｂ）に対するＨＴ‐２９細胞における化合物３の効果およびｓｉＲＮＡによるＫＬＦ４遺伝子のノックダウンを表す。 肺大細胞癌異種移植モデルにおいて腫瘍細胞成長を阻害する化合物７、４１、４２、５０、５２、５３、５４、５５および４の能力を表す。 亜鉛感受性の 染料Ｚｉｎｑｕｉｎを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで亜鉛イオンをキレートする化合物３の能力を表す。 ＺｎＣｌ_２で予め組み込んだ（Ａ）または予め組み込んでいない（Ｂ）（内因性亜鉛イオン）ＨＴ‐２９細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで亜鉛イオンをキレートする化合物３の能力を表す。 経時的（Ａ）および亜鉛補給物での治療後（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における金属感受性遺伝子、亜鉛感受性遺伝子メタロチオネイン１Ａの発現に対する化合物３の効果を表す。 経時的（Ａ）および亜鉛補給物での治療後（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における金属感受性の腫瘍抑制因子ＫＬＦ４の発現に対する化合物３の効果を表す。 経時的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における亜鉛感受性の金属応答配列（ＭＲＥ）結合転写因子１（ＭＴＦ‐１）の発現に対する化合物３の効果を表す。

ＭＴＦ‐１、ＫＬＦ５およびＫＬＦ４の発現に対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるｓｉＲＮＡ治療によるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの効果（Ａ）、および経時的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ５の発現に対する化合物３の効果（Ｂ）を表す。 ｍＲＮＡレベル（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）の、経時的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における細胞周期調節タンパク質ｐ２１の発現に対する化合物３の効果を表す。 ｍＲＮＡレベル（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）の、経時的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるサイクリンＤ１の発現に対する化合物３の効果を表す。 経時的（Ａ）および亜鉛補給物での治療後（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における腫瘍抑制遺伝子、早期成長応答タンパク質（ＥＧＲ‐１）の発現に対する化合物３の効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるＭＴ１Ａ、ＭＴＦ‐１、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｐ２１、サイクリンＤ１およびＥｒｇ‐１の遺伝子発現レベルに対する化合物３および化合物７の効果を表す。 マウスからのＨＴ‐２９大腸癌異種移植組織におけるＫＬＦ４およびサイクリンＤ１の遺伝子発現レベルに対する化合物３のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの亜鉛貯蔵タンパク質メタロチオネイン１（ＭＴ‐１）から亜鉛をキレートする化合物３の能力を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物３による治療後の亜鉛活性化ＭＴＦ‐１のＤＮＡ結合活性の不活性化（Ａ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における化合物３によるＭＴＦ‐１のＤＮＡ結合活性の不活性化（Ｂ）を表す。 クロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）による、サイクリンＤ１プロモーター領域へのＨＴ‐２９細胞におけるＭＴＦ‐１のＤＮＡ結合活性を減少させる化合物３の能力を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるサイクリンＤ１の遺伝子発現に対する化合物３および亜鉛補給物の効果（Ａ）、およびサイクリンＤ１および他のサイクリンのタンパク質レベルに対する化合物３の効果（Ｂ）を表す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における、ＭＴＦ‐１の発現に対する化合物３および亜鉛補給物の効果（Ａ）、サイクリンＤ１の発現に対する亜鉛補給物の効果（Ｂ）、およびサイクリンＤ１の発現に対する亜鉛補給物およびｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの効果（Ｃ）を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞における、ＫＬＦ４の発現に対する化合物３およびｓｉＲＮＡによるＭＴＦ‐１遺伝子ノックダウンの効果を表す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるＫＬＦ４、ＫＬＦ２およびＫＬＦ６の遺伝子発現レベルの比較（Ａ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨ‐４６０癌細胞におけるＫＬＦ４、ＫＬＦ２およびＫＬＦ６の発現対する化合物３および化合物７の効果（Ｂ）を表す。 結腸腺癌異種移植モデルにおける腫瘍の大きさを減少させる化合物３の能力（Ａ）および結腸腺癌異種移植モデルからの腫瘍におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＭＴＦ‐１、サイクリンＤ１およびＫＬＦ４ ｍＲＮＡレベルに対する効果（Ｂ）を表す。 ＭＴ１Ａ（Ａ）、ＭＴＦ‐１（Ｂ）、サイクリンＤ１（Ｃ）およびＫＬＦ４（Ｄ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるｍＲＮＡレベルに対する化合物３、化合物７および亜鉛補給物の効果を表す。 ＺｎＣｌ_２（Ａ）、ＣｕＣｌ_２（Ｂ）およびＦｅＣｌ_２（Ｃ）の存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物３および化合物６４の金属キレート化の性質を現す。 ＭＴ１Ａ（Ａ）、ＭＴＦ‐１（Ｂ）、サイクリンＤ１（Ｃ）およびＫＬＦ４（Ｄ）のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＴ‐２９細胞におけるｍＲＮＡレベルに対する化合物３、化合物６４および亜鉛補給物の効果を表す。

Claims (37)

1. 式Ｉ
   

   

   式中：
   Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は、水素であり；
   Ｒ２は、ハロゲン、低級アルキル、シアノ、アリール、ニトロ、アルコキシまたはヒドロキシルであり、および
   Ｒ６は、低級アルキル、ハロゲン、シクロアルキル、アリール、または置換アリールである、および
   そこにおいて低級アルキルは、１〜８の炭素原子を有するアルキル基である
   で表される化合物またはその塩。
2. 式中：
   Ｒ６が、低級アルキル、シクロアルキルまたは置換アリールである
   請求項１に記載の化合物
3. 式中：
   Ｒ２が、ハロゲン、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、シアノ、フェニル、ニトロ、ＯＣＨ _３ 、またはヒドロキシルである
   請求項１または２に記載の化合物。
4. 式中：
   Ｒ６が、ＣＨ _３ 、イソプロピル、ｔ−ブチル、アダマンタン、シクロペンタン、または置換フェニルである
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
5. 式中：
   Ｒ２が、ハロゲンであり；および
   Ｒ６が、低級アルキルである
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
6. 式中：
   Ｒ２が、ハロゲンであり；および
   Ｒ６が、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである
   請求項５に記載の化合物。
7. 式中：
   Ｒ６がＣＨ _３ 、イソプロピル、またはｔ−ブチルである
   請求項５または６に記載の化合物。
8. 式中：
   Ｒ６が、ＣＨ _３ である
   請求項５または６に記載の化合物。
9. 式中：
   Ｒ２が、ＦまたはＢｒである
   請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
10. 式中：
    Ｒ２が、Ｆである
    請求項９に記載の化合物。
11. 化合物が：
    

    

    

    

    

    あるいはその塩である、請求項１に記載の化合物。
12. 化合物が：
    

    

    あるいはその塩である、請求項５に記載の化合物。
13. 化合物が：
    

    

    またはその塩である、請求項１２に記載の化合物。
14. 塩がＨＣｌ塩である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその塩、および薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物。
16. 組成物がリポソームまたは脂質ミセル製剤を含む、請求項１５に記載の薬剤組成物。
17. 組成物が静脈投与用に製剤化される、請求項１５または１６に記載の薬剤組成物。
18. 癌の治療を必要とする対象（但しヒトを除く）において癌を治療するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
19. 癌を治療するための治療薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
20. 癌細胞の増殖を阻害することを必要とする対象（但しヒトを除く）において癌細胞の増殖を阻害するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
21. 癌細胞の増殖を阻害するための治療薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
22. 対象（但しヒトを除く）の癌細胞においてアポトーシスを誘発するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
23. 癌細胞においてアポトーシスを誘発するための治療薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
24. 癌が固形腫瘍である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用。
25. 固形腫瘍が非小細胞肺癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌または黒色腫である、請求項２４に記載の使用。
26. 癌が非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、白血病、直腸癌、黒色腫、前立腺癌またはＣＮＳ癌である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用。
27. 癌が白血病である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用。
28. 癌が非小細胞肺癌である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用。
29. 癌が大腸癌である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用。
30. 対象（但しヒトを除く）の癌細胞においてKrueppel様因子（ＫＬＦ４）の発現を増加させるための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
31. 癌細胞においてKrueppel様因子（ＫＬＦ４）の発現を増加させるための治療薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
32. 癌が白血病、膀胱癌または消化管癌である、請求項３０または３１に記載の使用。
33. 消化管癌が大腸癌または結腸直腸癌である、請求項３２に記載の使用。
34. 化合物がリポソームまたは脂質ミセル製剤として製剤化される、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の使用。
35. 静脈投与のために製剤化される、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の使用。
36. 非治療的適用におけるキレート遷移金属イオンにおける、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
37. 遷移金属イオンが亜鉛イオン、鉄イオンまたは銅イオンである、請求項３６に記載の使用。
    

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