JP5360855B2 - 心筋梗塞に関する遺伝子検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、心筋梗塞に関する遺伝子検出方法に関し、特にヒトミトコンドリアＤＮＡのハプログループを分類することにより心筋梗塞に関する遺伝子検出を行うものに関する。

ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、３７個の遺伝子を含む１６５６９塩基対の環状二重鎖分子である（非特許文献１：文献名については、末尾にまとめて示す）。ｍｔＤＮＡは、母親を通じてのみ遺伝するという特徴がある。ｍｔＤＮＡ中の母系遺伝性の変異は、過去二十万年以上に渡り、ホモサピエンスがアフリカからアジアおよびヨーロッパに拡張した時代に、新たな突然変異が連続的に追加された事に起因している。ミトコンドリアゲノムの突然変異率は核ゲノムの突然変異率に比べると非常に速い（非特許文献２）ので、ホモサピエンスに蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、比較的短い歴史を持つものではあっても、現代人類の代謝特性に影響している可能性がある。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアハプログループが、寒冷気候と栄養条件への適応を通じて選択されて来たものであると推測することができる。

ｍｔＤＮＡにおける多型は、核ＤＮＡの多型に比べて、個々人の機能的差により広範囲に寄与する。このような事情に鑑みて、本発明者らは、ｍｔＤＮＡの多型（ｍｔＳＮＰｓ）と、エネルギー代謝に関係する疾患等（例えば、長寿（非特許文献３）、パーキンソン病（非特許文献４、５）、アルツハイマー病、肥満（非特許文献６）、やせ（非特許文献７）、２型糖尿病（非特許文献６）、動脈硬化）との関係を明らかにするために研究を重ねてきた。この目的のために、百寿者、パーキンソン患者、アルツハイマー病患者、若年肥満者、非肥満者、血管障害のない２型糖尿病患者、及び血管障害を持つ２型糖尿病患者の７つのグループに属する６７２名（個々のグループについて、それぞれ９６名）のｍｔＤＮＡの１６５６９塩基対の塩基配列を全て決定した。更に、この結果に基づき、東アジアにおけるｍｔＤＮＡ進化系統樹を構築した。これらの知見から、ヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）を構築した。これらのｍｔＳＮＰデータに基づいて、本発明者らは、蛍光ビーズ法を用いた包括的なｍｔＳＮＰ分析システムを開発した。

最近、ヨーロッパ人に関する研究から、１６１８４−１６１９３のｐｏｌｙ（Ｃ）ｔｒａｃｔの遺伝変異が、２型糖尿病発症においては主要な役割を担っていないことが示された（非特許文献８）。従って、非コード領域のみに於ける多型分析は、個々人の代謝特性とミトコンドリアゲノムに於ける機能的多型との間の相互関係については、直接的な証拠を提供し難いと思われる。
また、心筋梗塞・冠動脈疾患といった心疾患と、核ＤＮＡの変異との関係に関する多くの報告がなされているものの、これらの結果については、現在も議論が行われている。その理由としては、遺伝子と疾患との関係が明確でないこと、研究対象のサイズが小さいこと、多型に影響については集団の相違が認められるために特定の集団において認められる関係が他の集団に応用できるか否かに議論があること、環境要因が複雑であるために多型と疾患との関係が明らかと成り難いこと等が挙げられる。

上記の諸点に留意しつつ、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域に於ける包括的な多型分析に基づいて、日本人に於ける心筋梗塞と主要な１２個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）との関係を調べる大規模な関連解析を行った。
本研究者らの研究目的は、ｍｔＤＮＡのハプログループ分けに基づき、心筋梗塞の遺伝的リスクを予測し、それによって心筋梗塞の一次予防に役立てることにある。

本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、強固に連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰとハプログループ（及びサブハプログループ）との関係を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１２個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかったことに加え、選択したｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、新たなｍｔＳＮＰの検出法を開発し、日本人における主要な１２個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）を迅速かつ的確に分類する検出法を開発した。

つまり、各ハプログループが持っている数個〜二十個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１に記載のｍｔＳＮＰｓを検出すれば、１２個のハプログループへの分類が可能であることを見出した。更に、この方法を用いて、今回、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、日本人における心筋梗塞と主要な１２個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）との関係を調べるために、２１３７名を対象とした大規模な関連解析を行った。その結果、ハプログループＮ９ｂを持つ者は心筋梗塞の危険性が低いこと、ハプログループＧ１を持つ者は心筋梗塞の危険性が高いこと（特に、男性の場合）を明らかとし、基本的には本発明を完成するに至った。

こうして、上記課題を解決するために、本発明に係る心筋梗塞に関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、４８２０Ａを有するサブハプログループＢ４ｂと、１０３９８Ｇ、８７０１Ｇ、１０４００Ｔを有するハプログループＭと、６０２３Ａを有するサブハプログループＢ４ｂ１ａ１と、８７９３Ｃを有するサブハプログループＭ１０と、１０４１０Ｃ、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、８５６Ｇを有するＤ４ｄ１ｂと、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１５８６０Ｇを有するサブハプログループＧ１ａと、９２９６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｂ２ｂと、２７６６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｄ１と、５１４７Ａを有するサブハプログループＹと、９８３３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｋ２と、１５５０８Ｔを有するサブハプログループＢ５ｂとを検出することを特徴とする。

本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。

一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、心筋梗塞との関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよび心筋梗塞との関連が裏付けられるわけではない。

本発明において、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。

本発明によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、心筋梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、心筋梗塞に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

＜研究対象＞
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２１３７名（男性１４４２名、女性６９５名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。
心筋梗塞を伴う１１８１名（男性９２０名、女性２６１名）の対象者は、全てが冠動脈造影と左室造影検査によって、病態が確認された。残りの９５６名（男性５２２名、女性４３４名）は、対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者であった。対照群は、うっ血性心不全、末梢性動脈閉塞性疾患、動脈硬化性疾患、梗塞性・出血性脳卒中、他の脳疾患、および他の血栓・塞栓・出血性疾患の既往歴が無い者であった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。

＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）および日本人の系統樹（非特許文献９）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１４９個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において見出された１２個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。

表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、および各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「Syn」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
本発明者らは、上記２１３７名の被験者について、これらハプログループと心筋梗塞との間の関係について研究を行った。

＜多型の遺伝子タイピング＞
各参加者から５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡを分離した。
ＤＮＡをＰＣＲにかけ、特定のＤＮＡを増幅した。その際に使用したプライマーを表２および表３に示した。ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１０）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。

また、ハプロタイピングのために使用したプライマーは、表４〜表９に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。１８６種類のプローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表４〜表６にはプローブセットＡの詳細を、表７〜表９にはプローブセットＢの詳細を示した。

表２および表３については、左欄よりＰＣＲ法によって合成されるフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列（Sequence）、リバースプライマー（Reverse primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列、および合成されるＤＮＡフラグメント長（Product）を示している。
表４〜表６については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」および「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表７〜表９については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。
表４〜表９に示したプローブセットは、前述の１２個のハプログループを分類するｍｔＳＮＰに加えて、更に細かいサブハプログループを検出するためのプローブを含んでいる。

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１０に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ（本発明における固相に該当する）の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている（本発明における核酸プローブの固相化に該当する）。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。

複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表４〜表６に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表７〜表９に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１２種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）に分類することができる。

図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。

＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、および４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１２５％ Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、および５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。

＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。

＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。

この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。

＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、心筋梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
心筋梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、心筋梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。

ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１２個のハプログループを調べたので、０.０５を１２で除して、０.００４とした。こうして、０.００４未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
２１３７名の被験者に関する基礎的データを表１０に示した。

表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における心筋梗塞（MI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。

年齢、高血圧、中性脂肪、空腹時血糖、ヘモグロビンＡｌｃでは心筋梗塞患者群と対照群との間に差がなかった。性別、ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症（HC）、糖尿病については、心筋梗塞患者群のほうが対照群よりも有意に高値であった。ＨＤＬコレステロールは、対照群よりも心筋梗塞患者群の方が、有意に低値であった。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表１１に示した。

表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・高コレステロール血症（HC)・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・ＢＭＩと遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１，Ｍ７ｃを、男性における従来の危険因子である高コレステロール血症・２型糖尿病・ＢＭＩと遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１を、女性における従来の危険因子である高コレステロール血症と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。

ハプログループＮ９ｂは、被験者全員（P = 0.0019）、および男性（P = 0.0007）において、心筋梗塞に対して抵抗性が認められた。また、ハプログループＭ７ｃは、被験者全員において、有意に心筋梗塞に対して抵抗性が認められた(P = 0.0357)。一方、男性の場合には、ハプログループＧ１が心筋梗塞のリスクが高い傾向があった(P<0.05)。
表１２には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。

表より、ハプログループＮ９ｂは、被験者全員において、心筋梗塞のリスクが低いことが明らかとなった（P = 0.0018)。
男性の場合には、高コレステロール血症、糖尿病とともに、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞に対して独立した抵抗性の因子であった（P = 0.0005)。また、女性の場合には、心筋梗塞に関連したハプログループは認められなかった。
表１３には、ｍｔＳＮＰｓのうち、心筋梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。

表中、「＊」は表１において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａ（ＮＤ４：Ｓｅｒ８６Ａｓｎ）、１４８９３Ａ＞Ｇ（Ｃｙｔｂ：ｓｙｎ）、およびハプログループＢ４ｂを代表する４８２０Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）の３個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった（P < 0.005）。一方、ハプログループＭを代表するｍｔＳＮＰである１０３９８Ａ＞Ｇ（ＮＤ３：Ｔｈｒ１１４Ａｌａ）と８７０１Ａ＞Ｇ（ＡＴＰ６：Ｔｈｒ５９Ａｌａ）の２個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に感受性が有ることがわかった（P < 0.005）。

男性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１４８９３Ａ＞Ｇが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった(各々P = 0.0006, P= 0.0007)。さらにハプログループＮ９ｂ＋Ｙを代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａは、心筋梗塞に対して抵抗性を示した。また、ハプログループＢ４ｂを代表するｍｔＳＮＰである４８２０Ｇ＞Ａと６０２３Ｇ＞Ａは、男性の場合には、心筋梗塞に対して抵抗性があった（P < 0.05）。一方、ハプログループＧ１を代表するｍｔＳＮＰである８２００Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.034）。

女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.0012）。また、ハプログループＤ４ａを代表する他の３個のｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ、８４７３Ｔ＞Ｃ、１４９７９Ｔ＞Ｃ、ハプログループＭを代表する３個のｍｔＳＮＰである８７０１Ａ＞Ｇ、１０３９８Ａ＞Ｇ、１０４００Ｃ＞Ｔ、ハプログループＢを代表するｍｔＳＮＰである８２７２ｄ９、およびハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、それぞれ心筋梗塞に対する危険性が高かった（P < 0.05）。
表１４に示すように、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。

表中、「＊」は表１において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
２個のｍｔＳＮＰ（11016G>A (N9a)、4820G>A (B4b)）は、全対照者にとって心筋梗塞に抵抗性を示した(それぞれP = 0.0009, P = 0.0019)。１０個のｍｔＳＮＰ（11016G>A, 4820G>A, 8793T>C, 856A>G,4850C>T, 9833T>C, 8200T>C, 10410T>C, 9296C>T and 15508C>T)の総合的な寄与は０.０１９７（上記１０個の寄与率（R2）の総和）であった。

男性の場合には、ハプログループＮ９ｂを代表するｍｔＳＮＰである１４８９３Ａ＞Ｇは、防御的な因子であった(P = 0.0005)。４個のｍｔＳＮＰ（14893A>G, 4820G>a, 8200T>C, 8793T>C）の総合的な寄与は０.０１３７（上記４個の寄与率（R2）の総和）であった。
女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に対する危険因子であった（P = 0.0012）。５個のｍｔＳＮＰ（10410T>C, 9296C>T, 10398A>G, 856A>G, 9833T>C）の総合的な寄与は０.０３２０（上記５個の寄与率（R2）の総和）であった。

＜考察＞
我々は、１２種類の主要なミトコンドリアハプログループと心筋梗塞との関係に付いて、２１３７名の日本人を対象とした大規模な関連解析を行った。年齢、性別、喫煙履歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無で補正したところ、全対象者について、ハプログループＮ９ｂを持つ者は心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0019)。特に、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0007)。ハプログループＮ９ｂは、４カ所の多型（10607, 11016, 13183, 14893）で特徴付けられる。このハプログループは、東アジア全体で見ると、大変まれであり中国南部と韓国にはほとんど認められない。一方、土着の琉球人とアイヌ人を含めた日本人には最もよく認められる（非特許文献９）。

遺伝子型タイピングに用いられる２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１３１８３Ａ＞Ｇとを除くと、ハプログループＮ９ｂを特徴付けるほとんどのｍｔＳＮＰは同義置換である（例えば、5147G>A, 10607C>T, 14893A>G 。非特許文献１）。ハプログループＮ９ｂを特徴付けるｍｔＳＮＰのうち、心筋梗塞の危険性に関連する可能性のある機能的多型としては、２つの多型、すなわち１１０１６Ｇ＞Ａ（ND4: Ser>Asn）と１３１８３Ａ＞Ｇ（ND5: Ile>Val）がある。アミノ酸残基が、種の中で保存されているかどうか確認するために、この２個の多型について、ｍｔＳＮＰデータベースに登録された６１種類の哺乳類のアミノ酸配列と比較した。１３１８３Ａ＞Ｇ多型は、グランサム値（Grantham value）が２９であり保存的置換であった（非特許文献１１）。また、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸は多様性があるために、機能的多型の一つである可能性は低かった。

一方、１１０１６Ｇ＞Ａ多型については、Ｓｅｒ＞Ａｓｎはグランサム値は４６であり、保存的置換としての値は高くなかった。しかし、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸がセリンであったのは、３種類の生物種（ヒト、シロガオオマキザル、およびアフリカサバンナゾウ）で認められるのみであった。従って、セリンは、ヒトにとって特徴的なアミノ酸の一つである可能性が高い。

ハプログループＭ７ｃは、２個の多型（4071, 4850）によって特徴付けられる。ハプログループＭ７ｃは、全対象者において、心筋梗塞が有意に低かった(P<0.05)。このハプログループは、中国全体では最も多様性が高いが（７６％±１１％）、アイヌでは存在せず、本州人には頻度が少ないが、マレーシアサバー州の住民とフィリピン人にはよく見られる（非特許文献９）。ハプログループＭ７ｃに属するＨＮｓｑ０１６０は、９０１７Ｔ＞Ｃ（グランサム値８９のＩ１６４Ｔとなる）を伴い、百寿者に認められる。したがって、ハプログループＭ７ｃは、心筋梗塞に対抗し、長寿に関係が深いと思われる。

本研究では、男性の場合には、ハプログループＧ１は、心筋梗塞の危険因子であった(P<0.05)。ハプログループＧの本幹には、３個のｍｔＳＮＰｓ（709, 4833, 5108）がある（非特許文献５、９)。近年、８２００位と１５４９７位のｍｔＳＮＰｓがハプログループＧ１の決定に用いられるようになった(非特許文献９、非特許文献１９)。１５３２３Ｇ＞Ａと１５４９７Ｇ＞Ａは、Ｃｙｔｂに非同義置換を生じる多型であり、これらが機能的な多型である可能性がある。１５３２３Ｇ＞Ａにより生じるＡｌａ１９３Ｔｈｒと、１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒの２つのアミノ酸置換のグランサム値は、それぞれ５８、５６である。ＣｙｔｂにおけるＧｌｙ２５１は、６１種類の哺乳類中、５５種類で保存されている。国立長寿研究所の加齢研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）で行われた研究によれば、１５４９７Ｇ＞Ａは、中年・初老日本人対象における肥満に関係があった（非特許文献１２）。

また、本発明者らの研究成果によれば、年齢と喫煙状態の補正をすると、女性の場合には、体重、ＢＭＩ、ウエスト・ヒップ比、脂肪量、脂肪のない量（fat-free mass）、腹腔内脂肪、中性脂肪は、１５４９７Ｇ型に比べると、１５４９７Ａ型の方が有意に増加していた。また、血糖とヘモグロビンＡｌｃには違いが見られなかったが、血清中インシュリン量は、１５４９７Ｇ型より１５４９７Ａ型の方が２０％高値であった。したがってこれらの観察では、１５４９７Ａは、高血圧、高血糖、高コレステロール血症を伴わない単純肥満と関係があることが示唆された。したがって、Ｃｙｔｂ遺伝子の１５４９７Ｇ＞Ａ多型は、不完全なサイトクロムｂ分子を形成し、エネルギー代謝の減少を引き起こすような、重要な多型である可能性がある。

１５４９８Ｇ＞Ａ多型によるＧｌｙ２５１Ａｓｐ置換は、病的であると言われている。この位置のグリシンがアスパラギン酸に変わると、複合体IIIのユビキノン結合部位のＱｐ部位の残基であるＧｌｕ２７１によって、電気的な斥力を生じることになる（非特許文献１３、１４）。そうすると、Ｑｐ部位の構造を変化させ、ヒドロキノン結合が弱くなる。１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒ置換は、Ｇｌｕ２７１による斥力を生じることにならないが、この置換はＱｐ部位のユビキノンとの結合に影響を与える可能性が高い。

本研究の当初の目的は、心筋梗塞に対抗する或いは危険性のあるハプログループを明らかにする事であった。しかし、我々が予想しなかった事に、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭで示されるｍｔＳＮＰが心筋梗塞に関連している事が示唆された。厳格な基準（P>0.005）で選んだ多型の中には、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭと心筋梗塞との間に有意な関連が示された。心筋梗塞・冠動脈疾患を含む心疾患と、核ＤＮＡの変異との間の関係を評価した報告が多く認められる。現在までに、心筋梗塞と関係のある多くの遺伝子（例えば、connexin 37, plasminogen-activator inhibitor type 1, and stromelysin-1遺伝子など）が報告されている。冠動脈疾患の遺伝的リスクを診断するシステムが、これらの核ＤＮＡ多型を基礎として展開されている（非特許文献１５）。ｍｔＤＮＡと核ＤＮＡとの多型が、心筋梗塞の予測をする情報を与えることが判明し、それによって、この疾患の一次予防に有用であろう。

近年、脳梗塞などの動脈硬化性疾患とミトコンドリア多型やハプロタイプの関係を論じた報告が散見される。Ｆｉｎｎｉｌａらは、コンホメーション感受性ゲル電気泳動（conformation sensitive gel electrophoresis：CSGE）とダイレクト・シークエンス法を用いることによって、患者群と対照群のｍｔＤＮＡのコード領域の全塩基配列を決定し、１２３０８Ａ＞Ｇ多型によって見いだされるハプログループＵが、偏頭痛において後頭葉発作のリスクの構成要素になることを示した（非特許文献１６、１７）。

我々の大規模研究によれば、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは心筋梗塞の発症が有意に低くなる保護因子であった。一方、女性の場合には、そのような関係は見られなかった。この理由については、現段階では不明である。
一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献２０）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。

最近数年間の間に、心筋梗塞と核ＤＮＡにコードされる遺伝子中の多型との関係を調べた報告が相次いでいる（非特許文献１５）。対象となった遺伝子としては、例えばシクロオキシゲナーゼ２（非特許文献２１）、ロイコトリエンＡ４ヒドロゲナーゼ（非特許文献２２）、５−リポキシゲナーゼ活性化蛋白質（非特許文献２３）、リンフォトキシンα（非特許文献２４）、ＬＧＡＬＳ２コード化ガレクチン２（非特許文献２５）、細胞骨格蛋白パラディン、チロシンキナーゼ、２つのＧタンパク結合受容体（非特許文献２６）などがある。また、初期の心筋梗塞と遺伝子中の多型との関係を調べた報告として、対象とされた遺伝子には、血小板脱顆粒中のＶＡＭＰ８、リボ核蛋白をコードするＨＮＲＰＵＬ１（非特許文献２７）、プラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター・タイプ１（非特許文献２８）、血清マトリックスメタロプロテアーゼ３（非特許文献２９）がある。そうすると、ｍｔＤＮＡの多型と核ＤＮＡの多型との両者が、心筋梗塞などの冠状動脈疾患に対する遺伝的リスクを評価するために役立ち、疾患の一次予防に寄与すると思われる。
このように、本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、心筋梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、心筋梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

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Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。 ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。

Claims (2)

1. 日本人被験者のヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、４８２０Ａを有するサブハプログループＢ４ｂと、１０３９８Ｇ、８７０１Ｇ、１０４００Ｔを有するハプログループＭと、６０２３Ａを有するサブハプログループＢ４ｂ１ａ１と、８７９３Ｃを有するサブハプログループＭ１０と、１０４１０Ｃ、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、８５６Ｇを有するサブハプログループＤ４ｄ１ｂと、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１５８６０Ｇを有するサブハプログループＧ１ａと、９２９６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｂ２ｂと、２７６６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｄ１と、５１４７Ａを有するサブハプログループＹと、９８３３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｋ２または１５５０８Ｔを有するサブハプログループＢ５ｂであるかを調べ、前記ハプログループＮ９ｂを有する日本人は心筋梗塞の危険性が低いこと、ハプログループＧ１を有する日本人男性は心筋梗塞の危険性が高いことを評価するための判断材料の一つとすることを特徴とする心筋梗塞に関する遺伝子検出方法。
2. 前記ハプログループの検出方法が、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であり、この方法の実施に用いるためのオリゴヌクレオチドのうち、
   （１）ハプログループＮ９ｂを検出するために、１１０１６Ａ及び１４８９３Ｇを限定して指標とし、
   １１０１６Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３５：tcacaatcat ggcaagccaa cgcと配列番号３６：agtgagccta gggtgttgtg agであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号２１３：gatagtggtt cattggataであり、
   １４８９３Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号４９：tccgcatgat gaaacttcgg ctと配列番号５０：ggcccctcag aatgatattt ggcであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１３８：tgcatggcta ggaacagtcc tと配列番号１３９：gcatggctag gaatagtccであり、
   （２）ハプログループＧ１を検出するために、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ及び１５４９７Ａを限定して指標とし、
   ７０９Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１：acatcacccc ataaacaaat aggttと、配列番号２：gcttctattg acttgggtta atcgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１５８：gaactcactg gaatggggatであり、
   ４８３３Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１５：tccacagaag ctgccatcaa gtaと、配列番号１６：gagagtgagg agaaggctta cgtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号８３：aggttaccca aggcgcccctであり、
   ５１０８Ｃの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１７：cagctacgca aaatcttagc atacと、配列番号１８：ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号８６：ttatcctaac taccaccgcaであり、
   ８２００Ｃの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号２５：ggggtatact acggtcaatg ctcと、配列番号２６：tcattttggt tctcagggtt tgttatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１９３：acgatgggca tgaagctgtgであり、
   １５４９７Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号５１：gacagtccca ccctcacacg atと、配列番号５２：gggacggatc ggagaattgt gtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１４７：ccagacctcc taagcgacであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子検出方法。