JP5288182B2 - 遺伝子発現解析による研究、判定又は評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ＳＡＲＴストレス負荷動物に被検物質を投与した後、その神経組織の遺伝子発現変化を解析することによって、ＳＡＲＴストレス負荷による病態及び該被検物質の薬理作用、例えば鎮痛作用、自律神経失調改善作用或いは抗ストレス作用を遺伝子レベルで研究、判定又は評価する方法に関する。
実験動物の飼育環境温度を、昼間は1時間毎に温度を変更し、夜間は低温にして数日間飼育すると、ＳＡＲＴ（Specific Alternation of Rhythm in Temperature）ストレス、即ち反復寒冷ストレスが動物に負荷され、マウス、ラット、モルモット等のＳＡＲＴストレス負荷動物が作製され得る。ＳＡＲＴストレス負荷動物は疼痛過敏、自律神経失調、ストレス状態の病態モデル動物と考えられており、喜多らの方法（日薬理誌、71巻、195頁、1975年）に準じて作製することができる。例えばラットの場合は、飼育環境温度を午前10時から午後5時までは1時間毎に24℃と−3℃に交互に変更し、次いで午後5時から翌朝の午前10時の間は−3℃に維持し、水及び飼料は自由に摂取させ4日間以上飼育して反復寒冷ストレスを負荷する。ラットで−3℃である低温の温度設定は、マウスでは4℃、モルモットでは0℃とすることで、それぞれＳＡＲＴストレスマウス、ＳＡＲＴストレスモルモットを作製できる。
このようにして作製されたＳＡＲＴストレス負荷動物では、反復される寒冷ストレスにより疼痛閾値が低下し、不安・鬱状態となり体重も減少し、ＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）、ノルアドレナリン、ＩＬ−１βの放出がそれぞれ亢進し、セロトニン（５−ＨＴ）の放出が抑制されるという特徴が知られている。
ところで、本発明において被検物質として用いるワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液は、ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚組織から抽出分離した非蛋白性の活性物質を含有するものである。該ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ＳＡＲＴストレス負荷動物において疼痛閾値の低下（疼痛過敏）の抑制作用（鎮痛作用）、ＣＲＨ、ノルアドレナリン、ＩＬ−１βの放出亢進の抑制作用、セロトニン（５−ＨＴ）の放出抑制の亢進作用、体重減少に対する抑制作用（自律神経失調改善作用、抗ストレス作用）等を有していることが過去から知られている（非特許文献１及び２参照）。ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液を有効成分とする医薬品製剤（商品名：ノイロトロピン）は、このＳＡＲＴストレス負荷動物を用いた鎮痛効力試験によって力価検定を行い、定量試験として規定している。
ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は、腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、帯状疱疹後神経痛などの疼痛性疾患の他に、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感・異常知覚・痛み等の広範な適応が認められている非常にユニークな製剤であり、皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として製造承認を受けて市販されている。近年、難治性の神経因性疼痛であるＲＳＤ（反射性交感神経性ジストロフィー、CRPS-type 1）に関して米国で臨床試験が行われている。
また、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が線維筋痛症に有効であることが報告されている（特許文献１参照）。線維筋痛症の発症の原因やメカニズムについては、現在のところ、ストレス等の心理的要因、ウイルス感染、遺伝、免疫異常や神経伝達物質の異常等が推察されているが、まだ解明されておらず、近年、線維筋痛症とＳＡＲＴストレス負荷動物の病態の共通性が示唆されている。
一方、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が鎮痛作用を示す機序として、下行性疼痛抑制系を賦活化する機序が報告されているが、本発明者らはＳＡＲＴストレス負荷による病態とワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の薬理作用のメカニズムのさらなる解明を目的として、ＳＡＲＴストレスを負荷したラットの神経組織 (脊髄後根神経節、脊髄後角、脳組織) を用いてリアルタイムPCRで検討してきた。しかし、リアルタイムPCRでは、解析できる遺伝子数に限界があるため、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が発現量に影響を及ぼす全ての遺伝子を網羅的に探索することができなかった。
基礎と臨床、15巻、5号、2459頁、1981年
応用薬理、32巻、3号、599頁、1986年
国際公開ＷＯ２００４/０３９３８３号公報
本発明の目的は、ＳＡＲＴストレス負荷による病態及び該被検物質の薬理作用、例えば鎮痛作用、自律神経失調改善作用或いは抗ストレス作用を遺伝子の発現レベルで研究、判定又は評価する方法、並びに、疼痛性疾患、自律神経失調やストレス性疾患に有効な物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明者らは、ＳＡＲＴストレス負荷動物におけるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の鎮痛作用が、痛みの下行性抑制系のストレスによる機能低下を改善するというメカニズムに着目し鋭意研究を行った。その結果、ＳＡＲＴストレス負荷動物に被検物質を投与した後、該動物の神経組織の遺伝子発現を網羅的に探索して、ＳＡＲＴストレス負荷及び該被検物質がその発現量に影響する遺伝子を特定することによって本発明を完成するに至った。
本発明は、ＳＡＲＴストレス負荷動物に被検物質を投与した後、その神経組織の遺伝子発現変化を網羅的に解析することによって、該被検物質の薬理作用、特に鎮痛作用、自律神経失調改善作用或いは抗ストレス作用を遺伝子レベルで研究、判定又は評価する方法を提供するものであり、これにより、疼痛性疾患、自律神経失調、ストレス性疾患等に有効な物質の探索、効果の判定・評価、あるいは、該物質の標的遺伝子の解析等が行い得る。
ＳＡＲＴストレス負荷動物は上述した方法により作製できる。また、被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウイルスを動物に接種して発痘させた組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで吸着成分を溶出することによって得ることができる。
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
（ａ）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（ｂ）前記抽出液を酸性のｐＨに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（ｃ）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（ｄ）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のｐＨに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。
（ａ）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（ｂ）前記抽出液を酸性のｐＨに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（ｃ）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（ｄ）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のｐＨに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。
上記各工程を更に詳しく述べると次のとおりである。
（a）について
ワクシニアウイルスを家兎等のウサギに接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取して破砕し、その１乃至５倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
（a）について
ワクシニアウイルスを家兎等のウサギに接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取して破砕し、その１乃至５倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
（b）について
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離等により析出してきた不溶蛋白質を除去する。
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離等により析出してきた不溶蛋白質を除去する。
（c）について
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
（d）について
吸着剤より有効成分を溶出（脱離）させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
吸着剤より有効成分を溶出（脱離）させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
なお、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造に関しては、より具体的な製法が、例えば上記特許文献１等に記載されている。また、動物の脊髄後根神経節や脊髄後角等の神経組織は常法によって採取すればよい。
１．実験材料
まず、次のとおりＳＡＲＴストレス負荷動物の神経組織サンプルを作製した。
（１）動物
6週齡のWistar系雄性ラットにＳＡＲＴストレスを負荷し、ＳＡＲＴストレスラットを作製した。ラットには飼料及び水道水を自由に摂取させ、5日間反復寒冷ストレスを負荷し、6日目にストレス負荷から解放し、実験に供した。
まず、次のとおりＳＡＲＴストレス負荷動物の神経組織サンプルを作製した。
（１）動物
6週齡のWistar系雄性ラットにＳＡＲＴストレスを負荷し、ＳＡＲＴストレスラットを作製した。ラットには飼料及び水道水を自由に摂取させ、5日間反復寒冷ストレスを負荷し、6日目にストレス負荷から解放し、実験に供した。
（２）ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物としては、上記特許文献１の実施例２に従って製造されたワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚からの抽出物を20 NU/mLに調製したもの（ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物）を用いた。ＮＵとは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるＳＡＲＴストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のＥＤ50値をもって規定する。１ＮＵはＥＤ50値が100 mg／kgであるときのワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛活性含有成分１mgを示す活性である。
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物としては、上記特許文献１の実施例２に従って製造されたワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚からの抽出物を20 NU/mLに調製したもの（ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物）を用いた。ＮＵとは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるＳＡＲＴストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のＥＤ50値をもって規定する。１ＮＵはＥＤ50値が100 mg／kgであるときのワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛活性含有成分１mgを示す活性である。
（３）ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の投与
上記ＳＡＲＴストレス負荷ラットに、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を体重1kg当り200 NUの投与量で、ＳＡＲＴストレス負荷開始日から１日1回連日腹腔内投与した(正常被検物質投与群及びＳＡＲＴストレス被検物質投与群)。正常対照群及びＳＡＲＴストレス負荷対照群には、生理食塩液を同じスケジュールで投与した。投与液量は、体重1kg当り10 mLとした。群編成としては、正常対照群 (n=3)、正常被検物質投与群 (n=3)、ＳＡＲＴストレス負荷対照群 (n=4)、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群 (n=4) とした。
上記ＳＡＲＴストレス負荷ラットに、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を体重1kg当り200 NUの投与量で、ＳＡＲＴストレス負荷開始日から１日1回連日腹腔内投与した(正常被検物質投与群及びＳＡＲＴストレス被検物質投与群)。正常対照群及びＳＡＲＴストレス負荷対照群には、生理食塩液を同じスケジュールで投与した。投与液量は、体重1kg当り10 mLとした。群編成としては、正常対照群 (n=3)、正常被検物質投与群 (n=3)、ＳＡＲＴストレス負荷対照群 (n=4)、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群 (n=4) とした。
（４）疼痛閾値の測定
疼痛閾値は圧刺激鎮痛効果測定装置を用いたRandall-Selitto変法に準じた試験によって測定した。すなわち、ラット右後肢足蹠に一定の加圧速度で圧刺激を加えて、動物が逃避あるいは鳴諦反応を示す加圧重量 (g) を疼痛閾値とて測定した。5日間のＳＡＲＴストレス負荷終了後、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の最終投与を行い、投与30分後に痛覚閾値を測定した。
疼痛閾値は圧刺激鎮痛効果測定装置を用いたRandall-Selitto変法に準じた試験によって測定した。すなわち、ラット右後肢足蹠に一定の加圧速度で圧刺激を加えて、動物が逃避あるいは鳴諦反応を示す加圧重量 (g) を疼痛閾値とて測定した。5日間のＳＡＲＴストレス負荷終了後、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の最終投与を行い、投与30分後に痛覚閾値を測定した。
これにより、次の結果を得た。
（１）ＳＡＲＴストレス負荷ラットの疼痛閾値低下に及ぼすワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の効果
ＳＡＲＴストレスを5日間負荷したＳＡＲＴストレス負荷対照群の疼痛閾値は正常対照群と比較して有意に低下した。これに対し、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で最終投与30分後に疼痛閾値を測定した結果は、ＳＡＲＴストレス負荷対照群と比較して有意な改善が観察された。一方、ＳＡＲＴストレスを負荷せずにワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を投与した正常被検物質投与群では、痛覚閾値の変化は認められなかった。
（１）ＳＡＲＴストレス負荷ラットの疼痛閾値低下に及ぼすワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の効果
ＳＡＲＴストレスを5日間負荷したＳＡＲＴストレス負荷対照群の疼痛閾値は正常対照群と比較して有意に低下した。これに対し、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で最終投与30分後に疼痛閾値を測定した結果は、ＳＡＲＴストレス負荷対照群と比較して有意な改善が観察された。一方、ＳＡＲＴストレスを負荷せずにワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を投与した正常被検物質投与群では、痛覚閾値の変化は認められなかった。
（２）サンプル
上記のとおり、ＳＡＲＴストレス負荷による疼痛閾値の低下とワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛効果が確認できた後、各群のラットを断頭し血液を回収し、脊髄後根神経節及び脊髄後角を摘出した。各々、RNA later（商品名、Ambion社製）に浸してRNAの分解を防止するため冷蔵庫で１晩インキュベート後、-80℃で凍結保存した。
上記のとおり、ＳＡＲＴストレス負荷による疼痛閾値の低下とワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛効果が確認できた後、各群のラットを断頭し血液を回収し、脊髄後根神経節及び脊髄後角を摘出した。各々、RNA later（商品名、Ambion社製）に浸してRNAの分解を防止するため冷蔵庫で１晩インキュベート後、-80℃で凍結保存した。
２．実験方法
次に、上記方法で得られたサンプルを用いて、ＳＡＲＴストレス負荷動物の脊髄後根神経節（DRG）及び脊髄後角（DH）の遺伝子発現量をDNAアレイ（DNAマイクロアレイ、DNAチップ等）で網羅的に定量し、その遺伝子発現変化の病態意義の解明を行った。詳しくは次のとおりである。
次に、上記方法で得られたサンプルを用いて、ＳＡＲＴストレス負荷動物の脊髄後根神経節（DRG）及び脊髄後角（DH）の遺伝子発現量をDNAアレイ（DNAマイクロアレイ、DNAチップ等）で網羅的に定量し、その遺伝子発現変化の病態意義の解明を行った。詳しくは次のとおりである。
（１）Total RNAの調製と品質検定
各々のサンプルのTotal RNAはRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (商品名、Qiagen社製) とRNase-Free DNase Set (商品名、Qiagen社製)を用いて抽出、精製し、2100バイオアナライザー (商品名、Agilent社製) を用いて、RNAの品質検定を実施した。全てのサンプルのtotal RNAの吸光度 (260/280) 比はいずれも2.0-2.1であり、各サンプルはタンパク質を含まない核酸分画であった。RNAの分解の有無をマイクロ電気泳動で解析した結果、サンプル全てに18S リボソームRNAのシャープなピークが認められ、またベースラインの乱れや分解物のピークが認められなかった事から、分解のないRNAサンプルである事が判明した。これらのサンプル中のTotal RNAは、いずれの品質検定にも適合していたので、DNAアレイ実験のサンプルとして用いることにした。
各々のサンプルのTotal RNAはRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (商品名、Qiagen社製) とRNase-Free DNase Set (商品名、Qiagen社製)を用いて抽出、精製し、2100バイオアナライザー (商品名、Agilent社製) を用いて、RNAの品質検定を実施した。全てのサンプルのtotal RNAの吸光度 (260/280) 比はいずれも2.0-2.1であり、各サンプルはタンパク質を含まない核酸分画であった。RNAの分解の有無をマイクロ電気泳動で解析した結果、サンプル全てに18S リボソームRNAのシャープなピークが認められ、またベースラインの乱れや分解物のピークが認められなかった事から、分解のないRNAサンプルである事が判明した。これらのサンプル中のTotal RNAは、いずれの品質検定にも適合していたので、DNAアレイ実験のサンプルとして用いることにした。
（２）DNAアレイ実験（Cyanine 3標識相補的RNA(Cy3-cRNA)調製とハイブリダイゼーション）
遺伝子発現の網羅的解析には、ラットゲノムオリゴマイクロアレイキット (商品名、Agilent社製、製品番号G4131A) を使用した。ターゲットの調製、ハイブリダイゼーション及び洗浄法は、アジレント 1色法対応DNAマイクロアレイキットプロトコル (Ver 1.0) に従って実施した。
Total RNAから逆転写反応により二本鎖相補的DNAを作製した後、Low RNA Input リニア増幅 & ラベル化キットを用いてCy3標識シトシン3リン酸 (Cy3-CTP) 存在化で増幅・ラベリングし、RNeasy Mini kit (商品名、Qiagen社製) でCy3-cRNAを精製した。
遺伝子発現の網羅的解析には、ラットゲノムオリゴマイクロアレイキット (商品名、Agilent社製、製品番号G4131A) を使用した。ターゲットの調製、ハイブリダイゼーション及び洗浄法は、アジレント 1色法対応DNAマイクロアレイキットプロトコル (Ver 1.0) に従って実施した。
Total RNAから逆転写反応により二本鎖相補的DNAを作製した後、Low RNA Input リニア増幅 & ラベル化キットを用いてCy3標識シトシン3リン酸 (Cy3-CTP) 存在化で増幅・ラベリングし、RNeasy Mini kit (商品名、Qiagen社製) でCy3-cRNAを精製した。
U-3300 Spectrophotometer (商品名、Hitachi社製) を用いて、サンプルの濃度と蛍光色素の取込みを確認したところ、Cy3-cRNAは1000倍以上に増幅され、また、全てのサンプルのCy3取込み率は9 pmoL/μg以上で、アジレントのプロトコールに示されている基準範囲内 (9-15 pmoL/μg) であった。従って、Total RNAから作製したCy3-cRNAの増幅効率と蛍光色素の取込み率は、プロトコールの基準範囲内であり、増幅と蛍光色素の取込みが適正に実施されていることが確認された。
上記で得られたCy3-cRNAは、Gene Expression Hybridization Kit (商品名、Agilent社製) に添付の試薬を用いて断片化後、Hybridization Bufferと混和し、ラットゲノムオリゴマイクロアレイスライド上に添加して65℃で17時間ハイブリダイゼーションを行った。反応終了後に洗浄・乾燥したDNAマイクロアレイ上の各プローブに相補的に結合したCy3-cRNA量の蛍光強度をDNAマイクロアレイスキャナー (商品名、Agilent社製、 G2565BA) で10μmの分解能で測定した。
（３）データ解析
〔１〕蛍光強度の数値化とデータ処理
数値化変換ソフトFeature Extraction Ver 8.5 (商品名、Agilent社製) を用いて、各スポット内の一定範囲の蛍光強度の数値化と異常スポットの検出を行い、バックグラウンド値と統計的に有意差のないスポットを排除した。
〔１〕蛍光強度の数値化とデータ処理
数値化変換ソフトFeature Extraction Ver 8.5 (商品名、Agilent社製) を用いて、各スポット内の一定範囲の蛍光強度の数値化と異常スポットの検出を行い、バックグラウンド値と統計的に有意差のないスポットを排除した。
〔２〕遺伝子発現量の補正と標的遺伝子群の絞込み
遺伝子発現解析ソフトGene Spring Ver 7.3 (商品名、Silicon Genetics社製)を用いて、アレイ間及びプローブ間の遺伝子発現レベルを補正した後、発現パターンの異常な遺伝子の排除と標的遺伝子の選択を下記に従って行った。
（A）発現パターン（Flag）に基づく選択：Flagの異常な遺伝子を除去した。
（B）分散分析による遺伝子発現レベルの有意差に基づく遺伝子の選択：正常対照群 (n=3)、ＳＡＲＴストレス負荷対照群 (n=4)及びＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群 (n=4) 間の分散分析（one way ANOVA）で、遺伝子発現レベルに有意（P<0.05）差のある遺伝子を選択した。
（C）標的遺伝子群の選択：ＳＡＲＴストレス負荷と被検物質の遺伝子発現に対する効果を組み合わせて標的遺伝子を絞り込む為、正常対照群に比べＳＡＲＴストレス負荷群で遺伝子発現が1.25倍以上に増加し、かつＳＡＲＴストレス負荷群に比べＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で発現が1.25倍以上に減少した遺伝子群を選択した。その逆で、正常対照群に比べＳＡＲＴストレス負荷群で遺伝子発現が1.25倍以上に減少し、かつＳＡＲＴストレス負荷群に比べＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で発現が1.25倍以上に増加した遺伝子群を選択した。
遺伝子発現解析ソフトGene Spring Ver 7.3 (商品名、Silicon Genetics社製)を用いて、アレイ間及びプローブ間の遺伝子発現レベルを補正した後、発現パターンの異常な遺伝子の排除と標的遺伝子の選択を下記に従って行った。
（A）発現パターン（Flag）に基づく選択：Flagの異常な遺伝子を除去した。
（B）分散分析による遺伝子発現レベルの有意差に基づく遺伝子の選択：正常対照群 (n=3)、ＳＡＲＴストレス負荷対照群 (n=4)及びＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群 (n=4) 間の分散分析（one way ANOVA）で、遺伝子発現レベルに有意（P<0.05）差のある遺伝子を選択した。
（C）標的遺伝子群の選択：ＳＡＲＴストレス負荷と被検物質の遺伝子発現に対する効果を組み合わせて標的遺伝子を絞り込む為、正常対照群に比べＳＡＲＴストレス負荷群で遺伝子発現が1.25倍以上に増加し、かつＳＡＲＴストレス負荷群に比べＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で発現が1.25倍以上に減少した遺伝子群を選択した。その逆で、正常対照群に比べＳＡＲＴストレス負荷群で遺伝子発現が1.25倍以上に減少し、かつＳＡＲＴストレス負荷群に比べＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群で発現が1.25倍以上に増加した遺伝子群を選択した。
〔３〕標的遺伝子の推定
選択された標的遺伝子の機能は、遺伝子データベースGenBank及び文献データベースPubMedを用いて調査した。
選択された標的遺伝子の機能は、遺伝子データベースGenBank及び文献データベースPubMedを用いて調査した。
３．結果
上記試験方法に基づいて行った結果は以下のとおりであった。
（１）標的遺伝子群の選択
DNAアレイ上の41,071個のプローブに結合した遺伝子が発する蛍光量を数値化すると共に発現パターン（Flag）の異常な遺伝子を排除した。残った遺伝子群（DRG-Flag:19,371遺伝子、DH-Flag:20,623遺伝子）について、正常対照群、ＳＡＲＴストレス負荷群、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群の3群間に於ける分散分析（one way ANOVA）で有意（p<0.05）差が認められる遺伝子を選択した（DRG-ANOVA:1,538遺伝子、DH-ANOVA:3,570遺伝子）。分散分析で選択された遺伝子群から、上記標的遺伝子群の選択法により、各サンプルにおいて発現量に変化が認められた以下の遺伝子群を選択し、表１乃至５に示した。尚、下記の表中、(-)はGene symbolがない分子、(predicted)は推測された分子であることを表し、また、SARTの数値は正常対照群を1.00とした時のSARTストレス負荷群の発現量、SART-NSPの数値はSARTストレス負荷群を1.00とした時のSARTストレス負荷被検物質投与群の発現量を示す。
上記試験方法に基づいて行った結果は以下のとおりであった。
（１）標的遺伝子群の選択
DNAアレイ上の41,071個のプローブに結合した遺伝子が発する蛍光量を数値化すると共に発現パターン（Flag）の異常な遺伝子を排除した。残った遺伝子群（DRG-Flag:19,371遺伝子、DH-Flag:20,623遺伝子）について、正常対照群、ＳＡＲＴストレス負荷群、ＳＡＲＴストレス負荷被検物質投与群の3群間に於ける分散分析（one way ANOVA）で有意（p<0.05）差が認められる遺伝子を選択した（DRG-ANOVA:1,538遺伝子、DH-ANOVA:3,570遺伝子）。分散分析で選択された遺伝子群から、上記標的遺伝子群の選択法により、各サンプルにおいて発現量に変化が認められた以下の遺伝子群を選択し、表１乃至５に示した。尚、下記の表中、(-)はGene symbolがない分子、(predicted)は推測された分子であることを表し、また、SARTの数値は正常対照群を1.00とした時のSARTストレス負荷群の発現量、SART-NSPの数値はSARTストレス負荷群を1.00とした時のSARTストレス負荷被検物質投与群の発現量を示す。
〔１〕脊髄後根神経節（DRG）において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を亢進し、被検物質が発現を抑制）が認められた37遺伝子（表１及び表２）
〔２〕脊髄後根神経節において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を抑制し、被検物質が発現を回復）が認められた12遺伝子（表３）
〔３〕脊髄後角（DH）において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を亢進し、被検物質が発現を抑制）が認められた10遺伝子（表４）
〔４〕脊髄後角において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を抑制し、被検物質が発現を回復）が認められた27遺伝子（表５）
（２）標的遺伝子の機能解析
上記において選択された標的遺伝子の機能は、遺伝子データベースGenBank及び文献データベースPubMedを用いて調査し、類似した機能をまとめて表６乃至表１１に示した。尚、下記の表中、(-)はGene symbolがない分子、(predicted)は推測された分子であることを示す。
上記において選択された標的遺伝子の機能は、遺伝子データベースGenBank及び文献データベースPubMedを用いて調査し、類似した機能をまとめて表６乃至表１１に示した。尚、下記の表中、(-)はGene symbolがない分子、(predicted)は推測された分子であることを示す。
〔１〕脊髄後根神経節において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を亢進し、被検物質が発現を抑制）が認められた37遺伝子には、マクロファージの走化や活性化及び炎症に関する機能を有する遺伝子等が含まれることが確認された（表６及び表７）。
〔２〕脊髄後根神経節において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を抑制し、被検物質が発現を回復）が認められた12遺伝子には、細胞育成に関連する機能を有する遺伝子等が含まれることが確認された（表８）。
〔３〕脊髄後角において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を亢進し、被検物質が発現を抑制）が認められた10遺伝子には、細胞接着に関連する機能を有する遺伝子等が含まれることが確認された（表９）。
〔４〕脊髄後角において発現量に変化（ＳＡＲＴストレス負荷が発現を抑制し、被検物質が発現を回復）が認められた27遺伝子には、ミエリン形成、神経骨格形成及び過分極に関連する機能を有する遺伝子等が含まれることが確認された（表１０及び表１１）。
上記の通り、本実験において、ＳＡＲＴストレス負荷動物の脊髄後根神経節内で、ケモカイン、マクロファージ、細胞接着、炎症関連機能に関する遺伝子発現が亢進していることが確認された。これらの遺伝子発現の亢進は、脊髄後根神経節内へのマクロファージ系細胞の遊走やその活性化の促進による痛覚過敏や、ストレスによる疾患等に関与しているものと考えられる。一方、ＳＡＲＴストレス負荷動物の脊髄後角内では、ミエリン形成やClチャネル機能に関する遺伝子発現が低下していることが確認された。ミエリン形成に関する遺伝子発現の低下は痛覚過敏の原因と考えられている脱髄様変性を誘発する可能性があり、また、過分極を誘導するClチャネル機能に関する遺伝子発現の低下は痛覚過敏の発生と強い関連があるものである。本実験において、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物がこれらの遺伝子発現の制御を介して鎮痛作用や抗ストレス作用を発揮する可能性が示唆された。
以上のとおり、上記実験において、ＳＡＲＴストレス負荷及びワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物投与で発現の変動が確認された遺伝子は、ＳＡＲＴストレス負荷動物における疼痛閾値低下等の生理機能異常あるいはストレス性疾患の病因に関与する遺伝子である可能性があり、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物が関与する標的遺伝子である可能性がある。従って、これら遺伝子発現の変化が被検物質により正常化された場合、該被検物質は腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、帯状疱疹後神経痛、RSD、線維筋痛症などの疼痛性疾患や神経因性疼痛、自律神経失調或いはストレスによる生理機能異常などに対して有効な薬物となる可能性がある。
上記のとおり、本発明方法により、ＳＡＲＴストレス負荷やワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物投与で発現が変動する遺伝子を検出・同定できることが確認できた。従って、本発明は、ＳＡＲＴストレス負荷動物に被検物質を投与した後、神経組織の遺伝子発現を解析することによって、該被検物質の鎮痛作用、自律神経失調或いは抗ストレス作用等の薬理作用を研究、判定又は評価する方法として有用である。
Claims (3)
- ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛作用、自律神経失調改善作用又は抗ストレス作用を評価する方法であって、ＳＡＲＴストレス負荷動物（ヒトを除く）にワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を投与し、該動物の脊髄後根神経節又は脊髄後角の遺伝子発現解析を行い、
（１）脊髄後根神経節において、前記抽出物を投与しないＳＡＲＴストレス負荷動物（ヒトを除く）と比較して、発現が１．２５倍以上減少する、下表のProbes欄に記載のプローブに結合するGene Symbol欄に記載の遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子、
- ＳＡＲＴストレス負荷動物がラットである請求項１に記載の方法。
- 遺伝子発現解析が、DNAアレイを用いたものである請求項１又は２に記載の方法。
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