JP5111385B2 - ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡ干渉の仲介における前記ｄｓＲＮＡの使用に関する。

本願は、２００５年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７３１，５５５号、２００６年７月７日に出願された米国仮特許出願第６０／８１９，０３８号、および２００６年８月７日に出願された米国仮特許出願第６０／８３６，０４０号の利益を主張する。これらの先行出願の各々の内容は、参照により全体が本願に組み込まれる。

近年、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節メカニズムにおいて遺伝子発現を阻止することが示された。特許文献１（ファイア（Ｆｉｒｅ）ら）は、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）において遺伝子の発現を抑制するために少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡを使用することを開示している。ｄｓＲＮＡはまた、他の生物、例えば植物（例えばウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）らの特許文献２；およびハイフェッツ（Ｈｅｉｆｅｔｚ）らの特許文献３を参照）、ショウジョウバエ（例えば非特許文献１を参照）、および哺乳動物（リマー（Ｌｉｍｍｅｒ）の特許文献４およびクロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）らの特許文献５を参照）などにおいても標的ＲＮＡを分解することが示されている。この天然のメカニズムは今や、遺伝子の制御異常または突然変異型遺伝子の発現を原因とする病気を治療するための、新しい種類の医薬品の開発の焦点となっている。

ハンチントン病は、運動障害、認知障害および精神医学的な症状発現を特徴とする進行性の神経変性障害である（非特許文献２）。ハンチントン病は常染色体優性遺伝形式をとり、ヨーロッパを起源とするほとんどの集団において約１０，０００人に１人が発症する（非特許文献３）。ハンチントン病の特徴は、典型的には４０〜５０歳代にひそかに潜行して発症し、死亡するまで１０〜２０年をかけて徐々に悪化する、特徴的な舞踏病性運動障害である。時によりハンチントン病は若年で現れ、典型的には固縮および急速な進行などのより重篤な症状を示す。ハンチントン病の若年発症は、疾病対立遺伝子を父親から受け継いだ場合に多い。ハンチントン病の神経病理学により、脳の尾状核および被殻の領域において最も激しいニューロンの選択的喪失を伴う、特殊なパターンも示されている。ハンチントン病におけるニューロン死の生化学的な根拠はまだ説明されておらず、従ってこの壊滅的な病気の発症および進行を遅延または防止するのに有効な治療は存在しない。

ハンチントン病の実際のメカニズムは捉えがたいままであるが、ハンチントン病は、ＩＴ１５またはハンチンチン（ＨＤ）と名付けられた遺伝子内のグルタミン反復の伸長を原因とする常染色体優性の神経変性障害であることが示されている。この遺伝子は広く発現し、正常な発生に必要であるが、ハンチントン病の病理学は、理由はよく分からないままであるが脳に限定されている。ハンチンチン遺伝子産物は患者および対照者において同じレベルで発現されており、この病気の遺伝学的特徴からは、ポリグルタミン反復の伸長により、恐らくは他の細胞タンパク質との相互作用を介して、有害な機能獲得が引き起こされるものと示唆されている。

ハンチントン病の治療法は現在のところ存在しない。舞踏様運動および興奮性の行動は、抗精神病剤（例えばクロルプロマジン１００〜９００ｍｇ／日の経口投与またはハロペリドール１０〜９０ｍｇ／日の経口投与）により、あるいはレセルピン０．１ｍｇ／日の経口投与で始め、嗜眠、低血圧またはパーキンソニズムなどの副作用が生じるまで増量することにより、ある程度抑えることができるだけである。
国際公開第９９／３２６１９号パンフレット 国際公開第９９／５３０５０号パンフレット 国際公開第９９／６１６３１号パンフレット 国際公開第００／４４８９５号パンフレット 独国特許出願公開第１０１００５８６．５号明細書 ヤン、ディ（Ｙａｎｇ，Ｄ．）ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）１０：１１９１−１２００ マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）およびガセラ（Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５：１２６７−１２７６（１９８６年） ハーパー、ピー．エス．（Ｈａｒｐｅｒ，Ｐ．Ｓ．）ら、「ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）」、ダブリュ．ビー．サウンダース（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、米国フィラデルフィア、１９９１年

ＲＮＡｉおよびハンチントン病治療の分野における著しい進歩にもかかわらず、高い生物活性および生体内での安定性の両方を有する、細胞自身のＲＮＡｉ機構を使用してＨＤ遺伝子を選択的かつ効率的にサイレンシングすることが可能である作用薬であって、かつ標的ハンチンチン遺伝子の発現を有効に抑制することができる作用薬が、依然として必要とされている。

本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにそのようなｄｓＲＮＡを使用して細胞内または哺乳動物中のＨＤ遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、突然変異型ＨＤ遺伝子の発現を原因とする疾患を治療するための、組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満でＨＤ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。

実施形態では、本発明はＨＤ遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含んでなる。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含んでなる。アンチセンス鎖は、ハンチンチンタンパク質をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満である。該ｄｓＲＮＡは、ＨＤ遺伝子を発現している細胞と接触させると、ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。

例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１、２、７、８または１０のセンス配列から成る群から選択される、ｄｓＲＮＡの第１の配列と、表１、２、７、８または１０のアンチセンス配列から成る群から選択される第２の配列とを含んでなるものでよい。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドからなるものでもよいし、あるいは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドなどを含んでなるものでもよい。あるいは、修飾ヌクレオチドは、次の群、すなわち２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含んでなるヌクレオチド、から選択されうる。好ましくは、前記ｄｓＲＮＡの第１の配列は、表２のセンス配列から成る群から選択され、第２の配列は、表２のアンチセンス配列から成る群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡのうちの１つを含む細胞を提供する。該細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞であることが好ましい。
別の実施形態では、本発明は、１以上の本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、生体内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するための、下記工程（ａ）および（ｂ）を含んでなる方法を提供する。
（ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含むことを特徴とする工程。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含んでなる。アンチセンス鎖は、ＨＤ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含み、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、ｄｓＲＮＡは、ＨＤ遺伝子を発現している細胞と接触させると、ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。

（ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、ＨＤ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞のＨＤ遺伝子の発現を抑制する工程。
別の実施形態では、本発明は、ハンチントン病を治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の１つ以上の本発明のｄｓＲＮＡを投与することからなる方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの、少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された調節配列を含んでなるベクターを提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するためのベクターを含んでなる細胞を提供する。該ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの、少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された調節配列を含む。

本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに該ｄｓＲＮＡを使用して細胞内または哺乳動物中のＨＤ遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、ｄｓＲＮＡを使用して、ＨＤ遺伝子またはその突然変異体の発現を原因とする哺乳動物の疾患を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通じて、ｍＲＮＡの配列特異的な分解を導く。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む種々様々な生物において生じる。

本発明のｄｓＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満でありＨＤ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡを使用することにより、ハンチントン病に関与する遺伝子のｍＲＮＡを標的とした分解が可能である。細胞アッセイおよび動物アッセイを使用して、本発明者らは、非常に低用量の上記ｄｓＲＮＡが特異的かつ効率的にＲＮＡｉを仲介する結果、ＨＤ遺伝子の発現を顕著に抑制することができることを実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、ハンチントン病の治療に有用である。

以降の詳細な説明は、標的ＨＤ遺伝子の発現を抑制するためにｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ含有組成物を製造および使用する方法、ならびに上記遺伝子の発現を原因とする疾患および障害を治療するための組成物および方法を開示する。本発明の医薬組成物は、長さが３０ヌクレオチド未満でＨＤ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを、薬学的に許容可能な担体と一緒に含んでなる（ヒトＨＤ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００２１１１）、マウスＨＤ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１０４１４）、およびラットＨＤ ｍＲＮＡ（Ｕ１８６５０））。

従って、本発明のある態様は、本発明のｄｓＲＮＡを薬学的に許容可能な担体と一緒に含んでなる医薬組成物、ＨＤ遺伝子の発現を抑制するために該組成物を使用する方法、および突然変異型ＨＤ遺伝子の発現を原因とする疾患を治療するために該医薬組成物を使用する方法を提供する。

Ｉ．定義
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される一定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分におけるある用語の使用法と、本項に示された該用語の定義との間に明白な矛盾がある場合、本項の定義が優先されるものとする。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含んでいるヌクレオチドを表わす。しかしながら、当然のことであるが、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分をも意味しうる。当業者には良く知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の構成部分で置換し、そのような置換構成部分を有するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を本質的に変化させないでおくことができる。例えば、限定するものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含んでいるヌクレオチドと塩基対形成することができる。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中において例えばイノシンを含んでいるヌクレオチドで置換される場合がある。そのような置換構成部分を含む配列は本発明の実施形態である。

ハンチントン病に関与する遺伝子（ＩＴ−１５）は第４染色体短腕の端部に位置している。この遺伝子のコード領域に突然変異が生じて不安定なトリヌクレオチド反復（シトシン−アデノシン−グアノシン）の伸長が生成される結果、グルタミン酸配列が伸長したタンパク質が生じる。このタンパク質（ハンチンチンと呼ばれる）の正常な機能および異常な機能は未知である。異常ハンチンチンタンパク質はトランスジェニックマウスのニューロンの核に蓄積するように見えるが、この蓄積とニューロン死との因果関係は明らかではない。

本明細書で使用されるように「ハンチンチン」または「ＨＤ」は、ハンチントン病の発症または持続と関連している任意のハンチンチンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。用語「ハンチンチン」または「ＨＤ」はまた、任意のハンチンチンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列、例えばハンチンチンＲＮＡまたはハンチンチンＤＮＡをも意味する（例えばヴァンデレン（Ｖａｎ Ｄｅｌｌｅｎ）ら、２００４年１月２４日、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓを参照）。実施例については、使用するＨＤ ｍＲＮＡ配列を、ヒトＨＤ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００２１１１）、マウスＨＤ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１０４１４）、およびラットＨＤ ｍＲＮＡ（Ｕ１８６５０）とした。

本明細書で使用されるように、「標的配列」は、ＨＤ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシング生成物であるｍＲＮＡなどのヌクレオチド配列の連続した一部分を指す。

本明細書で使用されるように、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して示された配列によって記述されるヌクレオチド鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書で使用されるように、かつ別途記載のない限り、用語「相補的」は、第１のヌクレオチド配列について第２のヌクレオチド配列との関連において記述するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとともに、ある条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、このことは当業者には当然のことである。そのような条件は、例えばストリンジェントな条件であってよく、ここでストリンジェントな条件としては：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間の後に洗浄、が挙げられる。その他の条件、例えば生物体内で遭遇しうるような生理学的に関連のある条件なども当てはまる。当業者であれば、２つの配列の相補性を、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に従って試験するための、最も適した条件一式を決定することができるであろう。

これは、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列全長にわたる塩基対の形成を含んでいる。このような配列は、本明細書においては互いに関して「完全に相補的」ということができる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に関して「ほぼ相補的」という場合は、その２つの配列は完全に相補的であってもよいし、あるいはその２つの配列が、該配列の最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１つ以上、好ましくは４つ、３つまたは２つ以下のミスマッチな塩基対を形成してもよい。ただし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に１以上の一本鎖突出部を形成するように設計されている場合、そのような突出部は相補性の測定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、一方の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドともう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとからなるｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうのオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むものは、本発明の目的に関してはこの場合も「完全に相補的」とされうる。

「相補的な」配列はまた、本明細書で使用されるように、該配列のハイブリダイズする能力に関して上記の必要条件が満たされる限り、非ワトソンクリック型の塩基対、または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成された塩基対のうち少なくともいずれか一方を含んでもよいし、あるいは完全に前記塩基対から形成されてもよい。

本明細書中の用語「相補的」、「完全に相補的」および「ほぼ相補的」は、該用語の使用の前後関係から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基の対応に関して使用される場合もあるし、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基の対応に関して使用される場合もある。

本明細書で使用されるように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部にほぼ相補的」なポリヌクレオチドとは、対象のｍＲＮＡ（例えばＨＤをコードするもの）の連続した一部分にほぼ相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、配列がＨＤをコードするｍＲＮＡの連続した一部分にほぼ相補的である場合、そのポリヌクレオチドはＨＤ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

用語「二本鎖構造の（二本鎖）ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用されるように、リボ核酸分子、またはリボ核酸分子の複合体であって、２つの逆平行かつ（上記定義のように）ほぼ相補的な核酸鎖からなる二重鎖構造を有するものを指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、個別のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つの大きな分子の一部であり、したがって、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端との間の連続したヌクレオチド鎖で接続されている場合、この接続しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端との間の連続したヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この接続構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同数または異なる数のヌクレオチドを有しうる。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１以上のヌクレオチド突出部を含みうる。

本明細書で使用されるように、「ヌクレオチド突出部」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、あるいはその逆である場合に、該ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する非対合ヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、非対合ヌクレオチドがｄｓＲＮＡの末端に存在しない、すなわちヌクレオチド突出部がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖構造である、すなわち該分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出部がないｄｓＲＮＡである。

用語「アンチセンス鎖」は、ｄｓＲＮＡの鎖であって標的配列にほぼ相補的な領域を含むものを指す。本明細書で使用されるように、用語「相補領域」は、本明細書で定義されるように、配列（例えば標的配列）にほぼ相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、かつ、存在する場合は、好ましくは末端領域に、例えば５’または３’末端のうち少なくともいずれかから６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。

用語「センス鎖」は、本明細書で使用されるように、ｄｓＲＮＡの鎖であってアンチセンス鎖のある領域にほぼ相補的な領域を含んでいるものを指す。
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を伴わない拡散プロセスまたは細胞の能動的プロセスを通じて為されてもよいし、あるいは補助的な薬剤またはデバイスによって為されてもよい。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されるものではなく；ｄｓＲＮＡは、生体の一部である細胞について「細胞に導入される」場合もある。そのような場合は、細胞への導入は、生体への送達を含むことになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達については、ｄｓＲＮＡが組織部位に注入されてもよいし、あるいは全身投与されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当該技術分野で既知の方法が挙げられる。

用語「サイレンシングする」および「発現を抑制する」は、該用語がＨＤ遺伝子に関するものである限り、本明細書では、ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも部分的に抑制することを指し、該抑制は、ＨＤ遺伝子の転写が行われる第１の細胞または細胞群であってＨＤ遺伝子の発現が抑制されるように処理されたものから単離可能な、ＨＤ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって第１の細胞または細胞群と本質的に同一であるが上記処理が為されていないもの（対照細胞）と比較して減少していることによって明らかにされるようなものである。抑制の程度は通常；
［｛（対照細胞のｍＲＮＡ）−（処理細胞のｍＲＮＡ）｝／（対照細胞のｍＲＮＡ）］・１００％；
で表される。

別例として、抑制の程度は、ＨＤ遺伝子の転写に機能的関連を有するパラメータ、例えば、細胞によって分泌される、ＨＤ遺伝子にコードされたタンパク質の量、あるいは一定の表現型（例えばアポトーシス）を示す細胞の数など、の減少という観点で与えられる場合もある。原則として、ＨＤ遺伝子のサイレンシングは、構成的にあるいはゲノムの工学操作により標的を発現している任意の細胞において、任意の適切なアッセイによって測定可能である。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡがＨＤ遺伝子の発現を一定の度合いで抑制し、したがって本発明に包含されるかどうかを判断するために参照が必要な場合、以下の実施例において提供されるアッセイはそのような参照として有用であろう。

例えば、ある例では、ＨＤ遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される。好ましい実施形態では、ＨＤ遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。より好ましい実施形態では、ＨＤ遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。最も好ましい実施形態では、ＨＤ遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約９８％、９９％またはそれ以上抑制される。

本明細書に記載のように、用語「治療」とは、障害（例えば疾患もしくは状態、疾患の症状、または疾患の素因）を有する患者に治療薬を施用または投与すること、あるいは患者由来の単離組織または細胞株に治療薬を施用または投与することであって、該疾患、該疾患症状または該疾患の素因を矯正、修復、軽減、緩和、修正、是正、改善、改良、または改変を目的とするものを指す。「患者」はヒトの場合もあるが、ヒト以外の動物の場合もある。治療は、ハンチントン病の明らかな症状のうち任意のものの低減を意味し、前記症状は例えば、無関心および短気から完全な双極性障害または統合失調症様障害にわたる認知症または精神障害や、運動系症状、例えばはじくような四肢の動き、浮くような軽い足取り、動作維持困難（挺舌などの動作を持続できない）、顔面のゆがみ、運動失調、およびジストニアなどである。

本明細書で使用されるように、語句「治療上有効な量」および「予防上有効な量」とは、ハンチントン病または同疾患の明らかな症状の治療、予防、または管理において治療上の利点を提供する量を指す。治療上有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、また当該技術分野で周知の要因、例えばハンチントン病のタイプ、患者の病歴および年齢、ハンチントン病の病期、ならびに他の抗ハンチントン病薬の投与などに依存して変化しうる。

本明細書で使用されるように、「医薬組成物」は薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを含んでなる。本明細書で使用されるように、「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効な量」とは、意図される薬理学的、治療上、または予防上の結果を生じるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床治療が、疾患または障害に関連した測定可能なパラメータに少なくとも２５％の低下があれば有効であると考えられる場合、その疾患または障害の治療のために治療上有効な薬物の量は、そのパラメータを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。

用語「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬を投与するための担体を指す。そのような担体には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。該用語は細胞培養培地を明確に除外している。経口投与される薬物については、薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、薬学的に許容可能な添加剤、例えば不活性の賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤および保存剤などが挙げられる。適切な不活性の賦形剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、およびラクトースがあり、またトウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを挙げることができ、潤滑剤は一般に、存在する場合にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望の場合には、胃腸管内での吸収を遅らせるために錠剤をモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような材料でコーティングしてもよい。

本明細書で使用されるように、「形質転換細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞である。
ＩＩ．二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物においてＨＤ遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡはＨＤ遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補領域は長さが３０ヌクレオチド未満であり、前記ｄｓＲＮＡは、前記ＨＤ遺伝子を発現している細胞と接触すると、前記ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。該ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的な２つのＲＮＡ鎖を含んでなる。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＨＤ遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列にほぼ相補的、好ましくは完全に相補的な相補領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は該アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、これら２つの鎖が適切な条件の下で組み合わせられるとハイブリダイズして二重鎖構造を形成するようになっている。好ましくは、二重鎖構造は長さが１５〜３０、より好ましくは１８〜２５、さらにより好ましくは１９〜２４、最も好ましくは２１〜２３塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さが１５〜３０、より好ましくは１８〜２５、さらにより好ましくは１９〜２４、最も好ましくは２１〜２３ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出部をさらに含みうる。ｄｓＲＮＡは、以降にさらに議論するように、当該技術分野で周知の標準的な方法によって、例えば、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）などから市販されているような自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成することができる。好ましい実施形態では、ＨＤ遺伝子はヒトのＨＤ遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１、２、７、８または１０のアンチセンス配列を含み、第二の配列は、表１、２、７、８または１０のセンス配列から成る群から選択される。

さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１、２、７、８または１０に提供された配列群から選択された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択された少なくとも２つの配列を含み、少なくとも２つの配列のうち１つは少なくとも２つの配列のうち別の配列に相補的であり、少なくとも２つの配列のうちの１つは、ＨＤ遺伝子の発現で生成されるｍＲＮＡの配列にほぼ相補的である。好ましくは、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含んでなり、一方のオリゴヌクレオチドは表１、２、７、８または１０に記載されているものであり、第二のオリゴヌクレオチドも表１、２、７、８または１０に記載されている。

当業者はよく知っているように、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二重鎖構造を含んでなるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効なものとして評価されている（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、より短いｄｓＲＮＡや長いｄｓＲＮＡも同様に有効となりうることが他の研究者によって見出されている。上述の実施形態では、表１、２、７、８または１０に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質から、本発明のｄｓＲＮＡは最小２１ｎｔの長さの鎖を少なくとも１つ含むことができる。表１、２、７、８または１０の配列のうちの１つであって一端または両端からわずか数個のヌクレオチドが差し引かれたものを含む短いｄｓＲＮＡが、上述のｄｓＲＮＡと比較して同じように有効かもしれないことを期待するのは合理的と思われる。従って、表１、２、７、８または１０の配列のうちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上連続したヌクレオチドである部分配列を含み、かつ、本明細書中以降に記載のようなＦＡＣＳ分析においてＨＤ遺伝子の発現を抑制する能力が、完全な配列を含んでなるｄｓＲＮＡと高々５、１０、１５、２０、２５、または３０％（抑制）しか違わないｄｓＲＮＡが、本発明によって企図されている。

本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つ以上のミスマッチを含むことができる。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが含むミスマッチは３つ以下である。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチ部分は相補領域の中央に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、該ミスマッチはいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補領域の５’または３’末端のいずれかから５、４、３、２、または１ヌクレオチドに限られることが好ましい。例えば、ＨＤ遺伝子のある領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖については、該ｄｓＲＮＡは、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にはミスマッチを全く含まないことが好ましい。標的配列に対するミスマッチを含んでいるｄｓＲＮＡがＨＤ遺伝子の発現を抑制するのに有効かどうか判断するために、本発明に記載の方法を使用することができる。特にＨＤ遺伝子中の特定の相補領域が、集団内で配列多型の変異を有することが知られている場合、ミスマッチを備えたｄｓＲＮＡの、ＨＤ遺伝子の発現抑制における有効性を考慮することは重要である。

１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には、１〜４ヌクレオチド、好ましくは１〜２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出部がある。少なくとも１つのヌクレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは、予想外なことに、対応する平滑末端のｄｓＲＮＡよりも優れた抑制特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチド突出部の存在が、ｄｓＲＮＡの全体的な安定性に影響することなくｄｓＲＮＡの干渉活性を強化することを発見した。突出部を１つだけ有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ならびに様々な細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定かつ有効であることが分かった。好ましくは、一本鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端に位置し、あるいは別例としてセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、平滑末端を有していてもよく、該平滑末端は好ましくはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。そのようなｄｓＲＮＡは安定性および抑制活性が改善されており、よって、低用量（すなわち１日につき被投与者の体重１ｋｇあたり５ｍｇ未満）での投与が可能になる。好ましくは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’末端にヌクレオチド突出部を有し、５’末端が平滑末端である。別の実施形態では、突出部中の１つ以上のヌクレオチドがヌクレオシドチオホスフェートで置換されている。

さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性増強のために化学修飾される。本発明の核酸は、参照により本願に組み込まれる「核酸化学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ビューケージ、エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ．）ら編、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載のような当該技術分野で確立された方法によって合成かつ／または修飾されうる。化学修飾には、限定するものではないが、２’修飾、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸塩結合のチオリン酸塩結合による置換、が挙げられる。この実施形態では、二重鎖構造の完全性は少なくとも１つ、好ましくは２つの化学結合により強化される。化学結合は、様々なよく知られた技法のうち任意のものによって、例えば、共有結合、イオン結合、もしくは水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用もしくはスタッキング相互作用；金属イオン配位、またはプリン類似体の使用、によって達成されうる。好ましくは、ｄｓＲＮＡの修飾に使用することができる化学基には、限定するものではないが、メチレンブルー；二機能性化学基、好ましくはビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。１つの好ましい実施形態では、リンカーはヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは固相合成によって作製され、ヘキサエチレングリコールリンカーは標準的な方法（例えば、ウィリアムズ、ディ．ジェイ．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．）およびケー．ビー．ホール（Ｋ．Ｂ．Ｈａｌｌ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：１４６６５−１４６７０）によって組込まれる。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がヘキサエチレングリコールリンカーによって化学的に連結される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドはホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端での化学結合は、三重らせん結合によって形成されることが好ましい。表２は、本発明の修飾ＲＮＡｉ剤の例を提示している。

ある実施形態では、化学結合は１つまたはいくつかの結合基によって形成されてもよく、そのような結合基は好ましくはポリ（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはポリエチレングリコール鎖である。他の実施形態では、化学結合は、プリンの代わりに二本鎖構造に導入されたプリン類似体によって形成される場合もある。さらなる実施形態では、化学結合は二本鎖構造に導入されたアザベンゼンユニットによって形成されうる。さらに別の実施形態では、化学結合は、ヌクレオチドの代わりに二本鎖構造に導入された分岐状のヌクレオチド類似体によって形成されうる。ある実施形態では、化学結合は紫外線によって導入される場合もある。

さらに別の実施形態では、２つの一本鎖のうち一方または両方のヌクレオチドが、細胞内酵素（例えば限定するものではないがある種のヌクレアーゼ）の活性化を防止または阻害するために修飾される場合もある。細胞内酵素の活性化を阻害する技法は当該技術分野で知られており、例えば、限定するものではないが２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電性バックボーン修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、およびホスホロアミデートが挙げられる（例えば、ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１：１１１６−８を参照）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基が、化学基、好ましくは２’−アミノ基または２’−メチル基によって置換される。さらに、少なくとも１つのヌクレオチドがロックされたヌクレオチドを形成するように修飾されてもよい。そのようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’位の酸素をリボースの４’位の炭素に結合するメチレン架橋を含んでいる。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、コシュキン、エイ．エイ．（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０およびオビカ、エス．（Ｏｂｉｋａ，Ｓ．）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入することにより、相補配列への親和性が改善され、融解温度が数度上昇する（ブラーシュ、ディ．エイ．（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．）およびディ．アール．コリー（Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１−７）。

ｄｓＲＮＡにリガンドをコンジュゲートすることにより、ｄｓＲＮＡの細胞内吸収を増強することができる。ある例では、細胞膜の直接的な透過を促進するために、ｄｓＲＮＡに疎水性リガンドをコンジュゲートさせる。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされるリガンドは、受容体依存性エンドサイトーシスの基質である。これらの手法はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を促進するために使用されてきた。例えば、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコレステロールがコンジュゲートされた結果、非コンジュゲート型の類似物と比較して非常に高活性の化合物が生じている。エム．マノハラン（Ｍ． Ｍａｎｏｈａｒａｎ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたその他の親油性化合物には、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、およびメントールが含まれる。受容体依存性エンドサイトーシスのリガンドの一例は葉酸である。葉酸は、葉酸受容体依存性エンドサイトーシスによって細胞内に入る。葉酸を有しているｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体依存性エンドサイトーシスによって効率的に細胞内に輸送されるであろう。リ（Ｌｉ）および共同研究者は、オリゴヌクレオチドの３’末端に葉酸を取り付けた結果、該オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みが８倍増加したと報告している（リ、エス．（Ｌｉ，Ｓ．）；デシュムク、エイチ．エム．（Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．）、ヒュアン、エル．（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，１５４０）。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたその他のリガンドには、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスタ、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、および送達ペプチドが含まれる。

ある種の例では、オリゴヌクレオチドにカチオン性リガンドをコンジュゲートすることにより、ヌクレアーゼに対する耐性が改善されることが多い。カチオン性リガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドが該オリゴヌクレオチド全体にわたって分散された時にｍＲＮＡに対する高い結合親和性を保持することが報告された。エム．マノハラン（Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３ならびに同文献に記載の参照文献を参照されたい。

リガンドがコンジュゲートされた（以降、本明細書では「リガンドコンジュゲート型」とも称する）本発明のｄｓＲＮＡは、ペンダントされた反応性官能基、例えば該ｄｓＲＮＡ上への連結分子の取り付けに由来するもの、を有するｄｓＲＮＡを使用して合成されうる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のうち任意のものを備えて合成されるリガンド、あるいは連結部分が取り付けられているリガンドと、直接反応させることができる。本発明の方法は、一部の好ましい実施形態において、リガンドと適切にコンジュゲートされており、かつ固体支持体材料にさらに取り付けられている場合もあるヌクレオシドモノマーを使用することにより、リガンドコンジュゲート型ｄｓＲＮＡの合成を促進する。任意選択で固体支持体材料に取り付けられたそのようなリガンド・ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合性リガンドを、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に配置された連結部分と反応させることによって、本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態に従って調製される。ある例では、３’末端にアラルキルリガンドが取り付けられているｄｓＲＮＡが、長鎖アミノアルキル基を介して多孔質ガラス支持体にモノマー・ビルディングブロックを最初に共有結合させることにより調製される。その後、該固体支持体に結合したモノマー・ビルディングブロックに、標準的な固相合成技術によってヌクレオチドが結合される。モノマー・ビルディングブロックは、ヌクレオシドでもよいし、固相合成に適合したその他の有機化合物でもよい。

本発明のコンジュゲートに使用されるｄｓＲＮＡは、よく知られた固相合成法によって便利に日常的な作業で作製されうる。そのような合成のための装置は、例えばアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在）などのいくつかの業者から販売されている。当該技術分野で既知のそのような合成のための他の手段も、追加として、あるいは代替として使用可能である。さらに、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技法を使用することも周知である。

特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許文献に見出すことができる。すなわち、ポリアミンがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルのリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーについては米国特許第５，２１２，２９５号；修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；バックボーン修飾型オリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによる該オリゴヌクレオチドの調製については米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系の修飾核酸塩基およびその合成法については米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリン系の修飾核酸塩基については米国特許第５，４５９，２５５号；キラルのリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するプロセスについては米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸については米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタムのバックボーンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチド合成の方法および材料については米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、該アルキルチオ基が、ヌクレオシドの様々な部位のうち任意の部位に取り付けられた他の部分に対するリンカーとして使用されうるヌクレオシド、については米国特許第５，５７８，７１８号；キラル純度の高いホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび関連化合物、例えば２，６−ジアミノプリン化合物、の調製プロセスについては米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４７０号；米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号はいずれもコンジュゲートされた４’−デスメチルヌクレオシド類似体に関し；バックボーン修飾型オリゴヌクレオチド類似体については米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；とりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法については米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号、である。

本発明の、リガンドがコンジュゲートされたｄｓＲＮＡおよびリガンド分子を有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの標準的な前駆体、あるいは、既に連結部分を有しているヌクレオチドまたはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を有しているリガンド−ヌクレオチドまたはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、あるいは、リガンドを有する非ヌクレオシドのビルディングブロック、を利用して適切なＤＮＡ合成装置にて構築可能である。

既に連結部分を有しているヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成が通常どおり完了してから、リガンド分子を連結部分と反応させて、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを形成させる。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子のような様々な分子を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートについては、以前に報告されている（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、国際公開第９３／０７８８３号パンフレットを参照）。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホロアミダイト、ならびに標準的なホスホロアミダイトおよび市販され日常的にオリゴヌクレオチド合成で使用される非標準的なホスホロアミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。

２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基をオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに組み入れることにより、該オリゴヌクレオチドに増強されたハイブリダイゼーション特性が付与される。さらに、ホスホロチオエート・バックボーンを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性が強化されている。したがって、本発明の、官能化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート・バックボーン、あるいは、２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基のうちいずれかまたは両方を含むように補強される場合がある。

いくつかの好ましい実施形態では、５’末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列は、ＤＮＡ合成装置を使用して調製され、次いで、選択されたリガンドの活性エステル誘導体との反応に供される。活性エステル誘導体は当業者にはよく知られている。代表的な活性エステルには、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、選択されたリガンドが連結基を介して５’位に取り付けられたオリゴヌクレオチドが生じる。５’末端のアミノ基は５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を利用して調製することができる。好ましい実施形態では、リガンド分子は、リガンドが直接あるいはリンカーを介して間接的に５’−ヒドロキシ基に連結されているリガンド−ヌクレオシドホスホロアミダイトの使用により、オリゴヌクレオチドの５’位にコンジュゲートされうる。そのようなリガンド−ヌクレオシドホスホロアミダイトは、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドであって５’末端に該リガンドを有しているものを提供するために、典型的には自動合成手順の最後に使用される。

本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの調製は、リガンド分子を構築するための適切な前駆体分子を選択することから始まる。典型的には、前駆体は一般に用いられているヌクレオシドの誘導体が適切に保護されたものである。例えば、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドを合成するための合成前駆体には、限定されるものではないが、２’−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２−保護ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、ならびに３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシドであって該分子の核酸塩基部分に保護がなされている場合もあるもの、が挙げられる。このようなアミノが連結された保護ヌクレオシド前駆体の合成方法は、当業者にはよく知られている。

多くの場合、本発明の化合物の調製の際に保護基が使用される。本明細書中で使用されるように、用語「保護（された）」とは、その構成部分に保護基が付加されていることを意味する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、化合物は１つ以上の保護基を含んでいる。種々様々の保護基を本発明の方法において使用することができる。一般に、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に対して不活性化し、かつ、分子の残り部分をほとんど損ねることなく該分子中のそのような官能基に付加されたり該官能基から除去されたりすることができる。

代表的なヒドロキシル保護基は、例えば、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８：２２２３−２３１１に開示されている。さらなるヒドロキシル保護基、ならびにその他の代表的な保護基は、グリーネ（Ｇｒｅｅｎｅ）およびワッツ（Ｗｕｔｓ）著「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」第２章、第２版、ニューヨーク所在のジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９１年および「オリゴヌクレオチドおよび類似体、実践的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、エクスタイン、エフ．（Ｅｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．）編、ニューヨーク所在のＩＲＬプレス、１９９１年に開示されている。

ヒドロキシル保護基の例には、限定するものではないが、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカーボネート、メシレートおよびトシラートが含まれる。

酸処理に対し安定なアミノ保護基は塩基処理で選択的に除去され、反応性アミノ基を置換のために選択的に利用可能にするために使用される。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（イー．アサートン（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ）およびアール．シー．シェパード（Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ）、「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、エス．ユーデンフレンド（Ｓ．Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ）、ジェイ．マイアンホーファー（Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）編、米国オーランド所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、第９巻、ｐ．１所収）およびＮｓｃ基を例とする様々な置換スルホニルエチルカルバメート（サミュコフ（Ｓａｍｕｋｏｖ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９４，３５：７８２１；ベルハート（Ｖｅｒｈａｒｔ）およびテッサー（Ｔｅｓｓｅｒ）、Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，１９８７，１０７：６２１）である。

さらなるアミノ保護基には、限定するものではないが、カルバメート保護基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；アミド保護基、例えばホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチル；スルホンアミド保護基、例えば２−ニトロベンゼンスルホニル；ならびに、イミンおよび環式イミド保護基、例えばフタルイミドおよびジチアスクシノイル、が挙げられる。これらのアミノ保護基の同等物も、本発明の化合物および方法に包含される。

多くの固体支持体が市販されており、当業者であれば固相合成法で使用すべき固体支持体を容易に選択することができる。ある実施形態では、万能支持体が使用される。万能支持体は、３’末端に異常ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ５００およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ＩＩは、米国バージニア州スターリング、デイビスドライブ２２８２５所在のグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社から市販されている万能支持体である。万能支持体に関するさらなる詳細については、スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、「固相合成の新技術と展望、第３回国際シンポジウム（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、１９９４年、ロジャー・エプトン（Ｒｏｇｅｒ Ｅｐｔｏｎ）編、メイフラワー・ワールドワイド（Ｍａｙｆｌｏｗｅｒ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ）、１１５−１２４；アザエフ、エイ．ブイ．（Ａｚｈａｙｅｖ，Ａ．Ｖ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９９，５５，７８７−８００；ならびにアザエフ（Ａｚｈａｙｅｖ）およびアントポルスキー（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００１，５７，４９７７−４９８６を参照されたい。さらに、より容易に塩基性加水分解を受けるｓｙｎ−１，２−アセトキシホスフェート基を介してオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合される場合は、オリゴヌクレオチドはより穏やかな反応条件下で万能支持体から切断されうることが報告されている。グザエフ、エイ．アイ．（Ｇｕｚａｅｖ，Ａ．Ｉ．）；マノハラン、エム．（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，２３８０を参照のこと。

上記ヌクレオシドは、リンを含むかまたはリンを含まないヌクレオシド間共有結合により連結される。確認しておくと、そのようなコンジュゲートされたヌクレオシドは、リガンドを有しているヌクレオシドまたはリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートと見なすことができる。配列内のヌクレオシドにアラルキルリガンドがコンジュゲートされている連結ヌクレオシドは、コンジュゲートされていない同種のｄｓＲＮＡ化合物と比較して、高いｄｓＲＮＡ活性を示すであろう。

本発明のアラルキルリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドはさらに、リンカー基の仲介を伴わずにヌクレオシドまたはヌクレオチドにリガンドが直接取り付けられている、オリゴヌクレオチドおよび連結ヌクレオシドのコンジュゲートも含む。リガンドは、連結基を介して、リガンドのカルボキシル基、アミノ基、またはオキソ基で取り付けられることが好ましい場合もある。典型的な連結基は、エステル、アミドまたはカルバメート基でよい。

本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに使用するために想定される好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾バックボーンまたは非天然のヌクレオシド間結合を含んでいるオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで定義されるように、修飾型のバックボーンまたはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持しているものと、バックボーンにリン原子を持たないものとが含まれる。本発明に関しては、糖の間のバックボーンにリン原子のない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。

具体的なオリゴヌクレオチド化学修飾について下記に述べる。所与の化合物中のすべての部位が一様に修飾される必要はない。逆に、２以上の修飾が単一のｄｓＲＮＡ化合物に、または該ｄｓＲＮＡ化合物の単一のヌクレオチドに組み入れられることもある。

好ましい修飾型のヌクレオシド間結合またはバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに、正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、その２’−５’結合類似体、および隣接するヌクレオシドユニット対が３’−５’→５’−３’または２’−５’→５’−２’に連結されている逆方向のもの、が挙げられる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形のものも含まれる。

上記のリン原子を含む結合の調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，６９７，２４８号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。

好ましい修飾型のヌクレオシド間結合またはバックボーンであってその中（すなわち、オリゴヌクレオシド中）にリン原子を含んでいないものは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルの糖間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの糖間結合の混合したもの、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式の糖間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサンのバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンのバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルのバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびメチレンチオホルムアセチルのバックボーン；アルケンを含んでいるバックボーン；スルファメートのバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノのバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドのバックボーン；アミドのバックボーン；ならびに構成部分Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２が混在するその他のもの、が挙げられる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。

他の好ましいオリゴヌクレオチドミメティックでは、ヌクレオシドユニットの糖およびヌクレオシド間結合（つまりバックボーン）の両方が、新しい基で置換される。核酸塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドミメティック）の１つであって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたものは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミドを含むバックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンで置換される。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分の原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７に見出すことができる。

本発明のいくつかの好ましい実施形態は、ホスホロチオエート結合を備えたオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを備えたオリゴヌクレオシド、特に、上記に引用された米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［天然のホスホジエステルのバックボーンは、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−として表される］、および上記に引用された米国特許第５，６０２，２４０号のアミドバックボーンを使用する。さらに好ましいのは、上記に引用された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。

本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、追加として、または代替として核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含む場合がある。本明細書中で使用されるように、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、その他の合成および天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル（および他のアルキル）誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル（および他のアルキル）誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換型のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換型のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、が含まれる。

さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９、クロシュビッツ、ジェイ．アイ．（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの、およびサングビ、ワイ．エス．（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．）、第１５章、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，クルック エス．ティ．（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．）およびルブル、ビー．（Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちあるものは、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。それらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており（Ｉｄ、２７６−２７８ページ）、また現時点で好ましい塩基置換であり、２’−メトキシエチル糖修飾と併用した場合はさらに一層好ましい。

上記の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基のうち一部の調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；および同第５，８０８，０２７号；があり、これらはいずれも参照によって本願に組込まれる。

ある実施形態では、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに使用されるオリゴヌクレオチドは、追加として、または代替として１つ以上の置換型糖部分を含む場合がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの、すなわち：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル、あるいはＯ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル（該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニル）のうちの１つを含む。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２であり、前記式中、ｎおよびｍは１から約１０までである。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの、すなわち：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡを開裂する基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有するその他の置換基、のうちの１つを含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、さらに２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても知られている］（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）、つまりアルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好ましい修飾には、１９９８年１月３０日出願の米国特許第６，１２７，５３３号明細書（内容は参照により組込まれる）に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）がある。

他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の部位に、特に３’末端のヌクレオチド上または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド中の糖の３’位になされてもよい。

本明細書中で使用されるように、用語「糖置換基」または「２’−置換基」には、酸素原子とともに、または酸素原子を伴わずにリボフラノシル部分の２’位に取り付けられる基が挙げられる。糖置換基には、限定するものではないが、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、および式（Ｏ−アルキル）_ｍ（ｍは１から約１０まで）のポリエーテルがある。これらのポリエーテルのうち好ましいものは、直鎖状および環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および（ＰＥＧ）含有基、例えばクラウンエーテルならびにオオウチ（Ｏｕｃｈｉ）ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９９２，９：９３；ラバージオ（Ｒａｖａｓｉｏ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６：４３２９；およびデルガルド（Ｄｅｌｇａｒｄｏ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９２，９：２４９（各々その全体が参照により本願に組み込まれる）に開示されているものである。さらなる糖修飾は、クック（Ｃｏｏｋ）、Ａｎｔｉ−Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１９９１，６：５８５−６０７に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、およびアルキルアミノ置換は、発明の名称が「Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｈａｖｉｎｇ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｓ） ｗｉｔｈ ２’ ａｎｄ ５’ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」である米国特許第６，１６６，１９７号明細書（全体が参照により本願に組み込まれる）に述べられている。

本発明に適したさらなる糖置換基には、２’−ＳＲ基および２’−ＮＲ_２基（ここでＲはそれぞれ独立に水素、保護基、または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）が含まれる。２’−ＳＲヌクレオシドは米国特許第５，６７０，６３３号（全体が参照により本願に組み込まれる）に開示されている。２’−ＳＲモノマーのシントンの組み込みは、ハム（Ｈａｍｍ）ら、Ｊ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２：３４１５−３４２０に開示されている。２’−ＮＲヌクレオシドは、ゲッティンゲン、エム．（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｍ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１， ６２７３−６２８１およびポルシン（Ｐｏｌｕｓｈｉｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９６，３７，３２２７−３２３０に開示されている。本発明に適したさらなる代表的な２’−置換基には、式ＩまたはＩＩのうちの１つを有するものが挙げられる。

上記式中；
Ｅは、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｎ（Ｑ_３）（Ｑ_４）またはＮ＝Ｃ（Ｑ_３）（Ｑ_４）であり；Ｑ_３およびＱ_４はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、係留部を備えているかまたは係留部を備えていないコンジュゲート基、固体支持体へのリンカーであるか；あるいは、Ｑ_３およびＱ_４が一緒になって、窒素保護基または環状構造であってＮおよびＯから選択された少なくとも１つの追加のヘテロ原子を任意選択で含むものを形成し；
ｑ_１は１〜１０の整数であり；
ｑ_２は１〜１０の整数であり；
ｑ_３は０または１であり；
ｑ_４は０、１または２であり；
Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ、独立に、Ｃ_４〜Ｃ_７シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１４アリールまたはＣ_３〜Ｃ_１５ヘテロシクリルであって、前記ヘテロシクリル基のヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択され；
Ｚ_４は、ＯＭ_１、ＳＭ_１、またはＮ（Ｍ_１）_２であって；Ｍ_１はそれぞれ、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２であり；Ｍ_２はＨまたはＣ_１〜Ｃ_８アルキルであり；
Ｚ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１０ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル、Ｃ_６〜Ｃ_１４アリール、Ｎ（Ｑ_３）（Ｑ_４）、ＯＱ_３、ハロ、ＳＱ_３またはＣＮである。

代表的な式Ｉの２’−Ｏ−糖置換基は、発明の名称が「Ｃａｐｐｅｄ ２’−Ｏｘｙｅｔｈｏｘｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」である米国特許第６，１７２，２０９号明細書（参照によってその全体が本願に組み込まれる）に開示されている。代表的な式ＩＩの環式２’−Ｏ−糖置換基は、発明の名称が「ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ２’−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ」である米国特許第６，２７１，３５８号明細書（参照によってその全体が本願に組み込まれる）に開示されている。

さらに、リボシル環上にＯ−置換基を有する糖も本発明に適している。環のＯについての代表的な置換基には、限定するものではないが、Ｓ、ＣＨ_２、ＣＨＦ、およびＣＦ_２がある。例えば、シークリスト（Ｓｅｃｒｉｓｔ）ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ ２１， Ｐｒｏｇｒａｍ ＆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， Ｔｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ，Ｓｅｐ．１６−２０，１９９２を参照のこと。

オリゴヌクレオチドは、糖ミメティック、例えばシクロブチル部分をペントフラノシル糖の代わりに有していてもよい。そのような修飾糖の調製に関連した代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３１号 同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７００，９２０号；また同第５，８５９，２２１号があり、これらはいずれも参照によって本願に組込まれる。

追加の修飾が、オリゴヌクレオチド上の別の部位に、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に施されてもよい。例えば、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに修飾を１つ追加することは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞への取り込みを増強する１つ以上の追加のリガンド以外の部分またはコンジュゲートを、オリゴヌクレオチドに化学結合させることを意味する。そのような部分としては、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（レスティンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ，１９９３，３，２７６５）、チオコレステロール（オーベルハウザー（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（セゾン−ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１；カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；スビナルチュク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９５，３６，３６５１；シア（Ｓｈｅａ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）、あるいはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９５，３６，３６５１）、パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）がある。

そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号があり、これらは各々が参照によって本願に組込まれる。

本発明はさらに、オリゴヌクレオチド内の特定の部位についてキラルに関してほぼ純粋なオリゴヌクレオチドを使用する組成物も含んでいる。キラルに関してほぼ純粋なオリゴヌクレオチドの例には、限定するものではないが、少なくとも７５％のＳｐまたはＲｐであるホスホロチオエート結合を有するもの（クック（Ｃｏｏｋ）らの米国特許第５，５８７，３６１号明細書）、ならびにキラルに関してほぼ純粋な（ＳｐまたはＲｐの）アルキルホスホネート、ホスホロアミデートまたはホスホトリエステル結合を有するもの（クック（Ｃｏｏｋ）の米国特許第５，２１２，２９５号および同第５，５２１，３０２号明細書）がある。

ある例では、オリゴヌクレオチドは非リガンド基によって修飾される場合がある。多くの非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞への取り込みを増強するためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようにコンジュゲートするための手法は科学文献から入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール（レスティンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（オーベルハウザー（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（セゾン−ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；スビナルチュク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；シア（Ｓｈｅａ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、あるいはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）であった。そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許文献は、上記に列挙されている。コンジュゲート実施の典型的なプロトコールは、配列の１つ以上の部位にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。その後、該アミノ基を、適切なカップリング剤または活性化剤を使用して、コンジュゲートさせる分子と反応させる。コンジュゲート反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよいし、溶液相中でオリゴヌクレオチドを切断した後に実施してもよい。ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドコンジュゲートを精製すると、典型的には純粋なコンジュゲートが得られる。

別例として、コンジュゲートさせる分子を、該分子中に存在するアルコール性基を介して、あるいはアルコール性基（ホスフィチル化されていてもよい）を有するリンカーを取り付けることによって、ホスホロアミダイトのようなビルディングブロックに変換してもよい。

重要なことは、上記手法のそれぞれが、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成に使用可能だということである。アミノが結合されたオリゴヌクレオチドは、カップリング試薬の使用により直接リガンドと接続されてもよいし、ＮＨＳまたはペンタフルオロフェノレートエステルとしてリガンドを活性化してから接続されてもよい。リガンドのホスホロアミダイトは、カルボキシル基のうちの１つにアミノヘキサノールリンカーを取り付けてから末端のアルコール官能基をホスフィチル化することによって合成されうる。システアミンのようなその他のリンカーも、合成されたオリゴヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーにコンジュゲートするために利用可能である。

ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含んでなる医薬組成物
１つの実施形態では、本発明は、前節に記載のようなｄｓＲＮＡと、以降に記載のような薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含んでなる医薬組成物は、ＨＤ遺伝子の発現または活性に関連した疾患または障害を治療するのに有用である。

別の実施形態では、本発明は、ＨＤ遺伝子の異なる領域を標的とするように設計された少なくとも２つのｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。この実施形態では、個々のｄｓＲＮＡは、参照によってここに組込まれる前節に記載のようにして調製される。１つのｄｓＲＮＡは、ＨＤ遺伝子の少なくとも１つの部分にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有することが可能であり；各々がＨＤ遺伝子の異なる部分にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有する追加のｄｓＲＮＡが調製される。複数のｄｓＲＮＡは同じ医薬組成物中で組み合わせられてもよいし、あるいは別々に製剤化されてもよい。個々に製剤化される場合は、個別のｄｓＲＮＡを含んでいる組成物は同じ担体を含んでも異なる担体を含んでもよく、同じ投与経路で投与されても異なる投与経路で投与されてもよい。さらに、個々のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、ほぼ同時に投与されても、連続して投与されても、あるいは投与日または治療期間を通じて予め設定された間隔で投与されてもよい。

本発明の医薬組成物はＨＤ遺伝子の発現を抑制するのに十分な用量で投与される。本発明者らは、有効性が高められたことにより本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を驚くほど低用量で投与することができることを見出した。１日に被投与者の体重１キログラムあたり５ｍｇのｄｓＲＮＡを最大用量とすると、ＨＤ遺伝子の発現を抑制または完全に抑止するのに十分である。

一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日に被投与者の体重１キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、好ましくは１日に体重１キログラム当たり０．１〜２００マイクログラムの範囲、より好ましくは１日に体重１キログラム当たり０．１〜１００マイクログラムの範囲、さらに好ましくは１日に体重１キログラム当たり１．０〜５０マイクログラムの範囲、最も好ましくは１日に体重１キログラム当たり１．０〜２５マイクログラムの範囲になるであろう。医薬組成物は１日に１回投与されてもよいし、あるいは、ｄｓＲＮＡが、その日を通じて適切な間隔で２、３、４、５または６回以上の分割用量として投与されてもよい。その場合、それぞれの分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは１日あたりの合計用量を達成するように相応に少なくなるはずである。投薬単位は、数日間にわたって送達するために、例えば、数日間にわたりｄｓＲＮＡを持続的に放出する従来の徐放性剤型を使用して、調合されてもよい。徐放性剤型は当該技術分野においてよく知られている。この実施形態では、投薬単位は１日の用量の倍数相当を含んでいる。

当業者には当然のことであるが、ある種の要因は対象を有効に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があり、該要因は、限定するものではないが、例えばその疾患または障害の重症度、事前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、ならびにその他の疾患の存在である。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療は、単回の治療であってもよいし、一連の治療を含んでもよい。本明細書中に別記されるように、本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡについての有効な用量およびｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の評価は、従来の方法論を用いて為されてもよいし、あるいは適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて為されてもよい。

マウス遺伝学の進歩により、ハンチントン病のような様々なヒト疾患に関する研究のための多くのマウスモデルが生み出されている。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験、ならびに治療上有効な用量の決定に使用される。

本発明に包含される医薬組成物は、当該技術分野において周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定することなく、例えば、頭蓋内（実質内および脳室内など）、髄腔内、硬膜外、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道内（エアロゾル）、鼻腔内、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与により投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内、髄腔内、または頭蓋内への注入または注射によって投与される。

筋肉内、頭蓋内、髄腔内、皮下および静脈内での使用については、本発明の医薬組成物は、一般に、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化された無菌の水性の溶液または懸濁液中に提供されることになる。適切な水性ビヒクルには、リンゲル液および等張食塩水がある。好ましい実施形態では、担体は水性緩衝液単独で構成される。この文脈において「単独で」とは、ＨＤ遺伝子を発現する細胞へのｄｓＲＮＡの取り込みに影響を与えるかまたは該取り込みを仲介するおそれのある補助剤またはカプセル化物質が存在しないことを意味する。そのような物質としては、下記に述べるように、例えば、リポソームまたはカプシドのようなミセル構造が挙げられる。驚いたことに、本発明者らは、単に裸のｄｓＲＮＡ（該ｄｓＲＮＡはＨＤ遺伝子の発現を有効に抑制する）および生理学的に許容可能な溶媒のみを含んでいる組成物が、細胞に取り込まれることを発見した。ｄｓＲＮＡを細胞培養物に導入するためには、マイクロインジェクション、リポフェクション、ウイルス、ウイロイド、カプシド、カプソイド、またはその他の補助剤が必要であるが、驚いたことに、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｄｓＲＮＡの取り込みについてこれらの方法および薬剤は必要ではない。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントゴムのような懸濁化剤、ならびにレシチンのような湿潤剤を含みうる。水性懸濁液に適した保存剤には、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートがある。

本発明の有用な医薬組成物には、体内から急速に消失しないようにｄｓＲＮＡを保護するカプセル化製剤、例えば制御放出製剤、例えば植込剤およびマイクロカプセル化された送達システムも含まれる。生物分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明白であろう。材料も、アルザコーポレイション（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカル社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ）から商業的に購入することができる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的設定されたリポソームを含む）も、薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、当業者に周知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；国際公開第９１／０６３０９号パンフレット；および欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−４３０７５号明細書（これらの文献は参照により本願に組込まれる）に記載のようにして調製することができる。

前述の小さい干渉ＲＮＡのベクターを使用して、本発明は、小さい干渉ＲＮＡを脳内の標的位置に送達するためのデバイス、システムおよび方法をも提供する。想定される送達経路は、埋め込み型、留置型の実質内カテーテルの使用によるものであり、該カテーテルは、本発明のｄｓＲＮＡを含んでいる少量の流体を局所の脳組織に直接注入するための手段を提供する。別の想定送達経路は、埋め込み型、留置型の脳室内カテーテルの使用によるものであり、該カテーテルは、本発明のｄｓＲＮＡを含んでいる少量の流体を脳脊髄液に直接注入するための手段を提供する。これらのカテーテルの基端は、患者の頭蓋に外科的に取り付けられた埋め込み型の脳内アクセスポートに、あるいは患者の胴に配置された埋め込み型薬物ポンプに接続されうる。

別例として、埋め込み式ポンプのような移植可能な送達デバイスが使用されてもよい。本発明の範囲内の送達デバイスの例には、治験中のデバイスであるモデル８５０６（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のメドトロニック社（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）製）があり、該デバイスは、頭蓋上で皮下に移植可能であり、治療薬を脳に送達可能なアクセスポートを提供する。送達は、定位的に埋め込まれたポリウレタンカテーテルを介して為される。モデル８５０６のアクセスポートとともに機能しうる２つのカテーテルモデルには、米国特許第６，０９３，１８０号（参照により本願に組み込まれる）に開示されている、大脳の脳室へ送達するためのメドトロニック社製のモデル８７７０脳室カテーテル、ならびに、米国特許出願第０９／５４０，４４４号および同第０９／６２５，７５１号（参照により本願に組み込まれる）に開示されている、脳組織自体へ送達（つまり実質内へ送達）するためのメドトロニック社製ＩＰＡ１カテーテルが含まれる。後者のカテーテルは、該カテーテルの通路に沿った複数の部位に治療薬を送達するために、先端に複数の出口を有している。前述のデバイスに加えて、本発明による小さい干渉ＲＮＡベクターの送達は、種々様々のデバイス、例えば、限定するものではないが、米国特許第５，７３５，８１４号、同第５，８１４，０１４号および同第６，０４２，５７９号（いずれも参照によって本願に組込まれる）を用いて達成することができる。本発明の教示を用いれば、また当業者であれば、これらおよびその他のデバイスおよびシステムが、本発明による神経変性疾患治療のための小さい干渉ＲＮＡベクターの送達に適切でありうることを認識するであろう。

１つのそのような実施形態では、該方法は、カテーテルの基端に接続されたポンプを脳の外側に移植するステップと、ポンプを操作して、少なくとも１つの小さい干渉ＲＮＡまたは小さい干渉ＲＮＡベクターの所定用量を、カテーテルの放出部を通して送達するステップとをさらに含む。さらなる実施形態は、前記脳の外側のポンプへの、少なくとも１つの小さい干渉ＲＮＡまたは小さい干渉ＲＮＡベクターの供給を、周期的に更新する追加のステップを含む。

したがって、本発明は、米国特許第５，７３５，８１４号および同第６，０４２，５７９号に教示されているもののような移植可能なポンプおよびカテーテルを使用して、ならびに、米国特許第５，８１４，０１４号に教示されているもののような、脳に送達される小さい干渉ＲＮＡベクターの量を制御する注入システムの一部としてのセンサをさらに使用して、小さい干渉ＲＮＡベクターを送達することを含む。その他のデバイスおよびシステム、例えば、いずれも参照により本願に組込まれる米国特許出願第０９／８７２，６９８号（２００１年６月１日出願）および同第０９／８６４，６４６号（２００１年５月２３日出願）に開示されたデバイスおよびシステムを、本発明の方法に従って使用することもできる。

そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を測定する手法によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の策定において使用することができる。本発明の組成物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む、循環血中濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変動しうる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療上有効な量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（つまり症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、該化合物の循環血漿中濃度範囲、または適切な場合には標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿中濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度減少の達成）を達成するように、動物モデルにおいて策定可能である。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィによって測定可能である。

上記に議論したように、ｄｓＲＮＡを個々にまたは複数として投与することに加えて、本発明のｄｓＲＮＡは、疾患の治療に有効な他の既知の作用薬と組み合わせて投与することができる。どの場合も、投与する医師は、当該技術分野で既知または本明細書に記載の標準的な有効性の尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節することができる。

ＨＤ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療する方法
１つの実施形態では、本発明は、ＨＤ遺伝子または突然変異型ＨＤ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を有するかまたは疾患を発症するリスクを有する対象の、治療方法を提供する。この実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＨＤタンパク質の発現をコントロールするための治療薬として作用する。該方法は、ＨＤ遺伝子の発現が少なくとも一部消失するように、本発明の医薬組成物を患者（例えばヒト）に投与することを含む。特異性が高いので、本発明のｄｓＲＮＡはＨＤ遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的とする。

神経変性疾患
ハンチントン病は、ハンチントン舞踏病、慢性進行性舞踏病、および遺伝性舞踏病としても知られている。ハンチントン病は、舞踏様運動と進行性知能低下とを特徴とする常染色体優性遺伝疾患で、通常は中年期（３５〜５０歳）に発症する。この疾患は男女に等しく発症する。尾状核が萎縮し、小細胞群が変性し、神経伝達物質であるγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびＰ物質のレベルが減少する。この変性により、ＣＴスキャンでみられる特徴的な「有蓋貨車側脳室」が生じる。

ハンチントン病の遺伝子（ＩＴ−１５）は、第４染色体の短腕の先端に位置している。遺伝子突然変異はコーディング領域に生じ、不安定な伸長トリヌクレオチド反復（シトシン−アデノシン−グアノシン）を引き起こし、伸長したグルタミン酸配列を有するタンパク質が生じる。このタンパク質（ハンチンチンと呼ばれる）の正常および異常な機能は不明である。異常ハンチンチンタンパクは、トランスジェニックマウスのニューロン核に蓄積するようにみえるが、この蓄積とニューロン死の因果関係は不明である。

本明細書で使用されるように、「ハンチンチン」または「ＨＤ」は、ハンチントン病の発症または維持に関連した任意のハンチンチンタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。用語「ハンチンチン」および「ＨＤ」はまた、任意のハンチンチンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列、例えばハンチンチンＲＮＡまたはハンチンチンＤＮＡをも意味する（例えばヴァンデレン（Ｖａｎ Ｄｅｌｌｅｎ）ら、２００４年１月２４日、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓを参照）。

症状および兆候は潜行的に発症する。無関心や短気から完全な双極性障害または統合失調症様障害まで広範にわたる認知症または精神障害が、運動障害に先行することもあれば、運動障害の経過中に発症することもある。無快感症または反社会的行動が最初の行動症状の場合もある。運動系症状としては、はじくような四肢の動き、浮くような軽い足取り、動作維持困難（挺舌などの動作を持続できない）、顔面のゆがみ、運動失調、ジストニアがある。

ハンチントン病の治療方法は現時点では存在しない。舞踏様運動および興奮性の行動は、抗精神病剤（例えばクロルプロマジン１００〜９００ｍｇ／日の経口投与またはハロペリドール１０〜９０ｍｇ／日の経口投与）により、あるいはレセルピン０．１ｍｇ／日の経口投与で始め、嗜眠、低血圧またはパーキンソニズムなどの副作用が生じるまで増量することにより、ある程度抑えることができるだけである。

本発明の別の実施形態は、ハンチントン病を治療するための、ヒト、特にヒト脳の線条体に投与される抗ハンチンチンｄｓＲＮＡの使用を提供する。
本発明に包含される医薬組成物は、当該技術分野で周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定するものではなく、例えば、頭蓋内（実質内および脳室内など）、髄腔内、硬膜外、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道内（エアロゾル）、鼻腔内、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与により投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内、髄腔内、または頭蓋内への注入または注射により投与される。

ＨＤ遺伝子の発現を抑制する方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＤ遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。該方法は、標的ＨＤ遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の組成物を哺乳動物に投与することを含む。特異性が高いため、本発明のｄｓＲＮＡは、標的ＨＤ遺伝子のＲＮＡ（第一次ＲＮＡまたはプロセシング後ＲＮＡ）を特異的に標的とする。ｄｓＲＮＡを使用してこれらのＨＤ遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法は、本明細書中に別記されるようにして実施することができる。

１つの実施形態では、該方法はｄｓＲＮＡを含んでなる組成物を投与することを含み、該ｄｓＲＮＡは、治療される哺乳動物のＨＤ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。治療される生物がヒトのような哺乳動物である場合、組成物は、当該技術分野で周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定するものではなく、例えば、頭蓋内（実質内および脳室内など）、髄腔内、硬膜外、静脈内、筋肉内、頭蓋内、皮下、経皮、気道内（エアロゾル）、鼻腔内、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与により投与可能である。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内、髄腔内、または頭蓋内への注入または注射により投与される。

別途定義のないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または等価である方法および材料は本発明の実行または試験において使用することができるが、適切な方法および材料について下記に述べる。本明細書において言及されたすべての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うことになる。さらに、材料、方法および実施例は単なる例証であり、限定することを意図したものではない。

ＨＤ遺伝子の遺伝子ウォーキング
ＢｉｏＥｄｉｔ配列アラインメントエディタ（ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒ）（バージョン７．０．４．１）のＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメント機能を用いて、ヒト（ＮＭ＿００２１１１）、マウス（ＮＭ＿０１０４１４）、およびラット（Ｕ１８６５０）のｍＲＮＡ配列の大域的アラインメントを実施した。

前記ソフトウェアに組み込まれた配列分析機能により、保存領域を同定した。保存領域は、内部にギャップを含まない、アラインしたすべての配列についての長さが最小１９塩基の連続配列として定義した。保存領域の配列の部位はヒトの配列に従って数えた。

ホワイトヘッド研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のｓｉＲＮＡ設計ウェブインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／）（ユアン（Ｙｕａｎ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００４ ３２：Ｗ１３０−Ｗ１３４）を使用して、保存領域を標的とするすべてのｓｉＲＮＡ候補を同定し、また該候補それぞれについてヒト、マウスおよびラットのＲｅｆＳｅｑデータベース中の配列に対する標的外（オフターゲット）の適合を同定した。交差反応性の基準を満たすｓｉＲＮＡを候補物群から選び出し、ソフトウェアに組み込まれたオフターゲット分析に供した。これについては、選択されたすべてのｓｉＲＮＡについて、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔアルゴリズムによってＮＣＢＩのヒト、マウスおよびラットＲｅｆＳｅｑデータベースに対して３回分析した。

ｂｌａｓｔの結果をダウンロードして分析し、そのアンチセンス鎖について最もオフターゲットの適合を生じやすいものを同定し、またミスマッチを生じる部位を抽出した。全てのｓｉＲＮＡ候補について、予測された特性に従って格付けした。これについては、異なる基準を適用して、次の特性、すなわち：ヒト、マウスおよびラットの配列を標的とすること（一定の交差反応性）、４つ以上のＧが連続して並んでいないこと、ヒト、マウスおよびラットについてオフターゲットの適合を生じることが予想されないこと、を備えたｓｉＲＮＡを同定した。適用された基準を含んだｓｉＲＮＡを選択して合成した（表１および２）。

アンチセンスの分野の研究者が経験してきたように、リボ核酸は、事実上すべての生物学的環境中に存在する様々なヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼなど）によって急速に分解されることが多い。この脆弱性は、ヌクレアーゼがもはや攻撃できないようにこれらのオリゴヌクレオチドを化学修飾することにより、回避される可能性がある。従って、２’−Ｏ−メチル置換を用いてｓｉＲＮＡを合成し（表２）、内在性ＨＤ遺伝子の発現（ＨＤのｍＲＮＡレベル）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性に関して試験した。

ｄｓＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書中で具体的に示されない場合、その試薬は、分子生物学に適用するための品質／純度規格の分子生物学用試薬を供給する任意の業者から入手可能である。

ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（ＴＭ）８９０９合成装置（ドイツ連邦共和国ダルムシュタット所在のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）および固体支持体として多孔質ガラス（ＣＰＧ、５００Å、ドイツ連邦共和国ハンブルク所在のＰｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）を使用して、１マイクロモル規模で固相合成により作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチル・ヌクレオチド含有ＲＮＡは、対応するホスホロアミダイトおよび２’−Ｏ−メチル・ホスホロアミダイト（ドイツ連邦共和国ハンブルク所在のＰｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）をそれぞれ使用した固相合成によって生成させた。これらのビルディングブロックを、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ビューケージ、エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）ら編、ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（米国ニューヨーク州ニューヨーク所在）に記載のような標準的なヌクレオシドホスホロアミダイトの化学的手法を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（英国グラスゴー所在のＣｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ）溶液に置き換えることにより導入した。さらなる補助試薬はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（ドイツ連邦共和国グリースハイム所在）から入手した。

陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗製オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製は、確立された手法によって実行した。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ、ドイツ連邦共和国ウンターシュライスハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ）所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ）を使用して、波長２６０ｎｍにおける各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収によって測定した。二本鎖ＲＮＡは、相補鎖の等モル溶液をアニーリング用バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却することにより生成させた。アニーリングさせたＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。

３’−コレステロールコンジュゲート（３’にコレステロールがコンジュゲートされた）ｓｉＲＮＡ（本明細書では、コレステリル基への連結がホスホジエステル基を介するかホスホロチオエートジエステル基を介するかによって−Ｃｈｏｌまたは−ｓＣｈｏｌと称する）の合成用には、適切に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成に使用した。修飾固体支持体は以下のように準備した。

ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボン酸 ＡＡ

４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、撹拌かつ氷冷したエチルグリシネート塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水（５０ｍＬ）中溶液に添加した。その後、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、該混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、該溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、蒸発濃縮した。残留物を蒸留してＡＡを得た（２８．８ｇ、６１％）。

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ

Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解して氷冷した。０℃の該溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を添加した。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボン酸（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。該溶液を室温にしてさらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣによって確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加してジイソプロピル尿素を沈澱させた。該懸濁液をろ過した。ろ液を、５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して粗製生成物を得て、該粗製生成物をカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製して１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを生成させた。

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃のジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンに溶解した。該溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗製生成物をその塩酸塩に転化することよって精製した。

３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル ＡＤ

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中に添加した。この懸濁物を氷上で０℃に冷却した。該懸濁物にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。該反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した（１０．３ｇ、９２％）。

１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル ＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン３０ｍＬ中でスラリー化した。該混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステル体ＡＤを、撹拌しながらゆっくり２０分以内に添加した。添加の間、温度は５℃未満に維持した。０℃で３０分間撹拌を続け、氷酢酸１ｍＬを添加し、直ちに４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏの水中（４０ｍＬ）溶液を添加した。得られた混合物を各１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を各１０ｍＬのリン酸バッファーで２回洗浄し、脱水し、蒸発乾固させた。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬずつの冷炭酸バッファー（ｐＨ９．５）３部で抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、４０ｍＬずつのクロロホルム５部で抽出して合わせ、脱水し、蒸発乾固させた。残留物を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィによって精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステルを得た（３９％）。

［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＦ

ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の還流混合物に、メタノール（２ｍＬ）を１時間かけて少量ずつ添加した。還流温度で撹拌を１時間継続した。室温に冷却した後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空下で濃縮して得た生成物をカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）で精製した（８９％）。

（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＧ

ジオールであるＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）とともに真空内で蒸発させて乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。この反応は、室温で一晩実施した。メタノールを添加して反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、濃縮した。残存ピリジンを、トルエンとともに蒸発させて除去した。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィで精製した（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３中でＲｆ＝０．５）（１．７５ｇ、９５％）。

コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル ＡＨ

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で真空中にて一晩乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液をアルゴン雰囲気下に室温で１６時間撹拌した。その後、該溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮乾固した。残留物をそのまま次のステップに使用した。

コレステロールで誘導体化したＣＰＧ ＡＩ

コハク酸塩であるＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２５ｍＬ）中溶液、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中溶液を連続して添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．６ｍｌ）中溶液を添加した。この反応混合物の色は明るいオレンジ色になった。この溶液を、リストアクション（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ）振盪機で短時間激しく撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。この懸濁物を２時間激しく撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗でろ過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続的に洗浄した。未反応のアミノ基を、無水酢酸／ピリジンを使用してマスキングした。ＣＰＧの装荷の達成は、ＵＶ測定法により測定された（３７ｍＭ／ｇ）。

５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書では「５’−Ｃ３２−」と称する）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書では「５’−Ｃｈｏｌ」と称する）を有するｓｉＲＮＡの合成は、国際公開第２００４／０６５６０１号パンフレットに記載のようにして実施したが、ただしコレステリル誘導体については、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して酸化ステップを実施し核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入した。

核酸配列は、標準名称法を用いて、また具体的には表３の略語を用いて以降に示す。

ＨｅＬａ細胞における内在性ヒトＨＤ ｍＲＮＡの発現に対するＨＤ ｄｓＲＮＡのスクリーニング
ＨｅＬａ細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国メリーランド州ロックヴィル所在）から入手し、Ｈａｍ’ｓＦ１２（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を補足した培地中で、加湿型インキュベータ（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ（Ｒ）、ドイツ連邦共和国ランゲンゼルボルト所在のＫｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）にて５％ＣＯ_２を含む大気中３７℃で培養した。

ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションについては、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に細胞密度２．０×１０^４個／ウェルとして播種し、直接トランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ（単一用量スクリーニングについては３０ｎＭ）のトランスフェクションは、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴＭ）（ドイツ連邦共和国カールスルーエ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ）を用いて製造業者の説明に従って実施した。用量−応答曲線については、ｓｉＲＮＡ濃度を３倍希釈系列で３０ｎＭ〜１４ｐＭとした。

トランスフェクションの２４時間後にＨｅＬａ細胞を溶解させて、ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（Ｒ）Ｅｘｐｌｏｒｅキット（米国フリーモント、ダンバートン・サークル所在のＧｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ）を用いてプロトコールに従って定量した。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて、４つの個々のデータポイントを集めた。ＨＤ遺伝子と無関係なｓｉＲＮＡ二重鎖を対照（「ＶＥＧＦ ｃｔｒｌ」）として使用した。所与のＨＤ特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、処理した細胞中のＨＤ ｍＲＮＡ濃度の、対照ｓｉＲＮＡ二重鎖で処理した細胞中のハンチンチンｍＲＮＡ濃度に対する割合（％）として表した。

表１は、ｓｉＲＮＡ（配列は表１に記載）を３０ｎＭの単一用量で試験したｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨｅＬａスクリーニングの、４回の独立した実験の結果を示している。処理した細胞中に残存しているＨＤ ｍＲＮＡの、対照に対する割合（％）、±標準偏差が、表１の右端のカラムに示されている。図１は、ｓｉＲＮＡ（配列は表２に記載）を３０ｎＭの単一用量で試験したｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨｅＬａスクリーニングの、２回の独立した実験の結果をグラフで示している。表２では二重鎖の名称をＡＬ−ＤＰ−ｘｘｘｘと記載しているが、図１では同じ二重鎖を単に「ｘｘｘｘ」と記載している。例えば、表２のＡＬ−ＤＰ−５９９７は図１の「５９９７」に相当する。ここでもまた、処理した細胞中に残存しているＨＤ ｍＲＮＡの、対照に対する割合（％）、±標準偏差が、表２の右端のカラムに示されている。３０ｎＭでは、多くのｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞中のＨＤ ｍＲＮＡのレベルを７０％以上低減する有効性を示した。

表４は、選択した２５種のｓｉＲＮＡに関する２〜５回の独立した実験からの、ＩＣ５０、ＩＣ８０および最大抑制率を示す。いくつかのｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０１４、ＡＬ−ＤＰ−６０２０、およびＡＬ−ＤＰ−６０３２、＊で示す）は、この実験例において特に有効であり、１０〜１３０ｐＭのＩＣ５０値を示した。

Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ細胞およびＵ８７ＭＧ細胞における内在性ＨＤ ｍＲＮＡの発現に対する選択されたＨＤ ｄｓＲＮＡのスクリーニング
Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（ＴＭ）細胞（ＰＣ１２のサブクローン）をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）から入手し、ＲＰＭＩ １６４０（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）に５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、１０％ＤＨＳ（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を補足した培地中で、加湿型インキュベータ（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ（Ｒ）、ドイツ連邦共和国ランゲンゼルボルト所在のＫｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）にて５％ＣＯ_２を含む大気中３７℃で培養した。

Ｕ８７ＭＧ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国メリーランド州ロックヴィル所在）から入手し、Ｈａｍ’ｓＦ１２（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を補足した培地中で、加湿型インキュベータ（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ（Ｒ）、ドイツ連邦共和国ランゲンゼルボルト所在のＫｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）にて５％ＣＯ_２を含む大気中３７℃で培養した。

６種の選択されたｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０１４、ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２）を用いたＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ細胞およびＵ８７ＭＧ細胞のトランスフェクション、ならびにＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（Ｒ）Ｅｘｐｌｏｒｅキットを用いたハンチンチンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルの定量は、ＨｅＬａ細胞について述べたのと同様の方法で実施した。

ＩＣ５０値を表５に示す。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（ラット）細胞およびＵ８７ＭＧ（ヒト）細胞のいずれにおいても、ＩＣ５０は概してＨｅＬａ細胞の場合よりも高かった。試験した６種のｓｉＲＮＡのうち、ＡＬ−ＤＰ−６０１４は、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ細胞のＨＤ ｍＲＮＡに対して他の５種のｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２）よりも著しく有効性が低く、ＡＬ−ＤＰ−６０００は、Ｕ８７ＭＧ細胞のＨＤ ｍＲＮＡに対して他の５種のｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０１４、ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２）よりも著しく有効性が低かった。

ＨＤを標的とするｄｓＲＮＡはＨｅＬａ細胞において内在性ＨＤタンパク質を低減する
前述のようにして、Ｈｅｌａ細胞を培養し、ＨＤに対する６種のｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０１４、ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２）および１つの無関係な対照ｓｉＲＮＡ（「ｃｔｒｌ」）を含む記載のｓｉＲＮＡ１００ｎＭを用いて、該細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞をハーベストして溶解した。溶解産物中のタンパク質を８％の変性ＰＡＧで分離した。ハンチンチンおよびβ−アクチンを、該タンパク質に結合する抗体を使用した標準的なウェスタンブロット法の手順で検出した。ハンチンチンの検出については、メンブレンを、マウス抗ハンチンチンタンパク質モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、英国所在）で処理し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼが連結されたヤギ抗マウス二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州所在）で処理した。β−アクチンは、ヤギ抗アクチンポリクローナルＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州所在）と、続いてロバ抗ヤギＩｇ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州所在）とを用いて検出した。

図２に結果を示す。ＡＬ−ＤＰ−５９９７（「５９９７」）、ＡＬ−ＤＰ−６０００（「６０００」）、ＡＬ−ＤＰ―６００１（「６００１」）、ＡＬ−ＤＰ−６０１４（「６０１４」）、ＡＬ−ＤＰ−６０２０（「６０２０」）およびＡＬ−ＤＰ−６０３２（「６０３２」）は、いずれも１００ｎＭにおいてハンチンチンタンパク質のレベルを対照タンパク質β−アクチンに比べて減少させたが、対照の無関係なｓｉＲＮＡ（「ｃｔｒｌ」）はいずれのタンパク質のレベルにも影響しなかった。これらの結果は、ＨＤを標的とするｄｓＲＮＡがＨＤ ｍＲＮＡのレベルだけでなくＨＤタンパク質のレベルも有効に低減することを実証している。

ＨＤを標的とする選択されたｄｓＲＮＡの脳脊髄液（ＣＳＦ）中における安定性
選択された６種のｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１、ＡＬ−ＤＰ−６０１４、ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２）を、子ウシおよびブタのＣＳＦ中、ならびに比較のためＰＢＳ中で、３７℃で４８時間にわたり５ｕＭでの安定性を試験した。ＣＳＦ中でのインキュベーションは、１、２、４、８、２４および４８時間の時点でプロテイナーゼ消化によって停止させ、ＰＢＳ中でのインキュベーションは０時間および４８時間で停止させた。ろ過したサンプルを変性条件下のＩＥＸ−ＨＰＬＣに注入し、各々の一本鎖の回収率（％）を、対応するピーク下面積を測定してその面積をＰＢＳ中０時間で得られた面積に対する相対値として表すことにより測定した。図３および表６に結果を示す。ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００およびＡＬ−ＤＰ−６０１４は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方について、少なくとも９０％が子ウシおよびブタのＣＳＦ中いずれにおいても回収された（表６）。これに対し、ＡＬ−ＤＰ−６００１のアンチセンス鎖は９２％が子ウシＣＳＦ中で回収されたが、ブタＣＳＦ中ではアンチセンス鎖の７３％しか回収されなかった。ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２については、アンチセンス鎖の少なくとも１９％が子ウシおよびブタのＣＳＦいずれにおいても回収できなかった。

ＡＬ−ＤＰ−６０２０およびＡＬ−ＤＰ−６０３２について、これら両方の鎖について考えられるすべてのフラグメントについて計算された理論上の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって見出された実験上の質量と比較することにより、以下の切断部位をマッピングした。ＡＬ−ＤＰ−６０２０のアンチセンス鎖については、フラグメント５’−ｇａｕｕｕｕｍａｇｇａａｕｕｃｃｍａａｕ−環状−ＰＯ_４−３’（配列番号８７４）は、計算上の質量５９７３．５Ｄａおよび実験上の質量５９７３．０Ｄａに基づき、３’−（ｎ−３）に相当する。ＡＬ−ＤＰ−６０３２のアンチセンス鎖については、フラグメント５’−ｕｕｍａｇｇａａｕｕｃｃｍａａｕｇａｕｃＴＴ−３’（配列番号８７５）は、計算上の質量６３５５．０Ｄａおよび実験上の質量６３５５．６Ｄａに基づき、５’−（ｎ−１）に相当する。これらの切断部位をもとに、追加の２’−ＯＭｅ基を１つ含む追加の化学的安定化を施した２つの新しい二重鎖を設計した（表７）。すなわち、ＡＬ−ＤＰ−７１００（原型はＡＬ−ＤＰ−６０２０）およびＡＬ−ＤＰ−７１０１（原型はＡＬ−ＤＰ−６０３２）である。

選択した４種のｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１およびＡＬ−ＤＰ−７１００）について、ラットＣＳＦ中ならびに比較のためＰＢＳ中で、３７℃で１４日間にわたり５ｕＭでの長期安定性を試験した。ＣＳＦ中でのインキュベーションは、０、１、３、５、７、１０または１４日間実施し、ＰＢＳ中でのインキュベーションは１４日間実施した。上述のようにしてサンプルを処理した。図４に結果を示す。ＡＬ−ＤＰ−６０００については、第１４日時点でのＣＳＦ安定性は、技術的な理由で得られない。４種のｄｓＲＮＡはいずれも、ラットＣＳＦ中で３７℃にて１０〜１４日間非常に安定しており、アンチセンス鎖またはセンス鎖の損失は≦３０％である。

ＨｅＬａ細胞における内在性ヒトＨＤ ｍＲＮＡの発現に対する、ＨＤを標的とするコレステロールコンジュゲート型ｄｓＲＮＡの有効性
従来の研究［ソーチェク（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ）ら、２００４年］により、細胞への取り込みまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの効能のうち少なくともいずれか一方に対する、コレステロールのコンジュゲーションの有益な効果が実証されている。本発明者らは、それぞれＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００およびＡＬ−ＤＰ−７１００のコレステロールコンジュゲート型であるｄｓＲＮＡ、ＡＬ−ＤＰ−６９８２、ＡＬ−ＤＰ−６９８３およびＡＬ−ＤＰ−７１３０（表８）を合成し、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を評価した。前述のようにして、Ｈｅｌａ細胞を培養し、濃度３０ｎＭ〜１４ｐＭのｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６９８２、ＡＬ−ＤＰ−６９８３、ＡＬ−ＤＰ−７１３０、ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００およびＡＬ−ＤＰ−７１００を用いてトランスフェクションした。

トランスフェクションの２４時間後に、ＨｅＬａ細胞を溶解し、上述のようにしてハンチンチンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを定量した。各ｓｉＲＮＡについて、４つの個々のデータポイントを集めた。ＨＤ遺伝子と無関係なｓｉＲＮＡ二重鎖を対照として使用した。ＨＤを標的とする所与のｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、処理細胞中のＨＤ ｍＲＮＡ濃度の、対照ｓｉＲＮＡ二重鎖で処理した細胞中のＨＤ ｍＲＮＡの濃度に対する割合（％）として表した。ＸＬ−ｆｉｔを使用してＩＣ５０値を計算した。３回の独立した測定から平均のＩＣ５０値を計算し、表９に示す。

非コンジュゲート型ｄｓＲＮＡはＨＤ ｍＲＮＡに対しｉｎ ｖｉｔｒｏで予想通り（表４）の有効性を示した。コレステロールコンジュゲート型ｄｓＲＮＡはＨＤ ｍＲＮＡに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性を保持してはいるが、非コンジュゲート型の元の分子に比べて有効性がやや低下している。

ＨＤを標的とする非コンジュゲート型またはコレステロールコンジュゲート型ｄｓＲＮＡのラットおよびマウスにおけるＣＮＳ投与による、内在性ＨＤ ｍＲＮＡレベルのｉｎ ｖｉｖｏ下方調節
ＨＤを標的とする非コンジュゲート型またはコレステロールコンジュゲート型ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性および生体内分布の両方を評価するために、ＡＬ−ＤＰ−５９９７を基にしたｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１９９７およびＡＬ−ＤＰ−１９９８（表１０）を合成した。該ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’端（該ｄｓＲＮＡのＨＤ ｍＲＮＡを標的とするヌクレオチド領域の外側）の２つの２’−デオキシチミジン−５’−リン酸ヌクレオチドが、５−ブロモ−２’−デオキシウリジンに置き換えられたものである。

ラットでは、１．３ｍｇのＡＬ−ＤＰ−１９９７もしくはＡＬ−ＤＰ−１９９８、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ビヒクル対照）を、７日間にわたる連続的な線条体内注入によって投与した。体重およそ２５０〜３００ｇのオスのスピローグ・ドーリー・ラットに、３０ゲージの注入カニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ、米国バージニア州ロアノーク所在）を定位的に移植し、片側性の注射が線条体の中心へ向かうようにした（ブレグマに対し、前後方向＋０．７ｍｍ、内外側方向＋３．０ｍｍ；頭骨表面に対し、背腹方向５ｍｍ）。小型の浸透圧ポンプ（モデル１００７Ｄ）を、製造業者の仕様書に従って一晩下準備し、皮下に移植し、カテーテルによって接続して、（処理群当たりラット４匹に）ＰＢＳ、１．１ｍＭのＡＬ−ＤＰ−１９９７または１．１ｍＭのＡＬ−ＤＰ−１９９８を７日にわたり０．５ｕＬ／時で送達するようにした。７日の注入期間の終わりに動物を屠殺し、脳を摘出し、注入部位を含む同側の線条体を急速冷凍した。それぞれ約５〜３０ｍｇの組織サンプルを、８４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州マディソン所在）を含む組織・細胞溶解液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州マディソン所在）中で音波処理（ＢＡＮＤＥＬＩＮ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ、ドイツ連邦共和国ベルリン所在）によりホモジナイズした。その後、溶解産物を−８０℃に保存した。ｂＤＮＡアッセイを実施するために、冷凍した溶解産物を室温で融解し、ハンチンチンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（Ｒ）Ｅｘｐｌｏｒｅキットを使用して製造業者の指示書に従って定量した。各組織サンプルについて、ハンチンチン／ＧＡＰＤＨ比（標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベル）を、４つの測定値の平均として計算した。その後、群（処理）の平均を得るためにこれらの比を平均した。非コンジュゲート型のｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１９９７は、標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベルをＰＢＳ対照群に比べて３３％低減し、コレステロールコンジュゲート型のｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１９９８は、標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベルをＰＢＳ対照群に比べて２６％低減した。どちらの低減も統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙの事後分析を用いた分散分析）。これらの結果は、線条体内のＡＬ−ＤＰ−１９９７およびＡＬ−ＤＰ−１９９８が、ＨＤ ｍＲＮＡのレベルをｉｎ ｖｉｖｏで下方調節するのに有効であることを実証している。

同一の枠組みの実験を用いて、ＡＬ−ＤＰ−５９９７およびＡＬ−ＤＰ−６０００もまた、ラットにおいて７日間にわたる１．３ｍｇ（１．１ｍＭで０．５ｕＬ／時）の線条体内注入の後にＨＤ ｍＲＮＡのレベルをｉｎ ｖｉｖｏで下方調節するのに有効であることが分かった。ＡＬ−ＤＰ−５９９７およびＡＬ−ＤＰ−６０００は、線条体組織中の標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ対照群に対してそれぞれ３４％および３６％低減した。さらに、ＡＬ−ＤＰ−５９９７およびＡＬ−ＤＰ−６０００は、皮質組織中の標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベルそれぞれを２２％および２６％低減した。これらの結果は、上記の非コンジュゲート型のｓｉＲＮＡが、線条体内への注入後に、線条体内だけでなく、ハンチントン病でニューロンの喪失が起きる別の主な脳領域でありかつ注入部位からさらに遠くに位置する皮質中において、ＨＤ ｍＲＮＡレベルを下方調節することを実証している。

マウスでは、７５ｕｇのＡＬ−ＤＰ−１９９８、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ビヒクル対照）を、２０分間の線条体内注入によって投与した。体重およそ２０〜２５ｇのオスのＢａｌｂ／ｃマウスに、線条体を標的として被験物質の片側性の注射を行った（ブレグマに対し、前後方向＋０．５ｍｍ、内外側方向＋２．０ｍｍ；頭骨表面に対し背腹方向３．５ｍｍ）。被験物質（１．１ｍＭ）は、予め充填済みのポンプ制御されたハミルトン製マイクロシリンジを３３ゲージの注射針に接続したものを使用して、０．２５ｕＬ／分で注射した（１つの被験物質当たり動物４匹）。注射のおよそ７２時間後に、動物を屠殺し、脳を摘出し、注入部位を含む同側の線条体を解離させて急速冷凍した。ラットの組織サンプルについて上述したように、マウス組織サンプルを溶解させ、ハンチンチンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを定量した。各組織サンプルについて、ハンチンチン／ＧＡＰＤＨ比（標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベル）を、４つの測定値の平均として計算した。その後、群（処理）の平均を得るためにこれらの比を平均した。コレステロールコンジュゲート型のｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−１９９８は、標準化ハンチンチンｍＲＮＡレベルをＰＢＳ対照群に比べて３３％低減し、これは統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙの事後分析を用いた分散分析）。これらの結果は、ＡＬ−ＤＰ−１９９８がＨＤ ｍＲＮＡレベルをｉｎ ｖｉｖｏで下方調節するのに有効であることをさらに確認するものである。さらに、これらの結果は、ＡＬ−ＤＰ−１９９８の線条体内への合計用量を７５ｕｇの低用量として、ＨＤ ｍＲＮＡレベルの有意な下方調節がもたらされたことを実証している。

表２のｄｓＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞における内在性ヒトＨＤ ｍＲＮＡの発現に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図。 選択されたｄｓＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞における内在性ヒトＨＤタンパク質形成の低減における活性を示す図。 選択されたｄｓＲＮＡの、脳脊髄液（ＣＳＦ）中３７℃における安定性を示す図。 ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−５９９７、ＡＬ−ＤＰ−６０００、ＡＬ−ＤＰ−６００１およびＡＬ−ＤＰ−７１００の、ラットＣＳＦ中での長期安定性を示す図。

Claims (21)

1. 細胞内のヒトＨＤ遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは互いに相補的な少なくとも２つの配列を含んでなり、センス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、ＨＤをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含んでなる第２の配列を含み、前記相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、前記ｄｓＲＮＡは、ＨＤ遺伝子を発現している細胞と接触させると、前記ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制することを特徴とし、前記第１の配列は、配列番号７９２、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６および８８８から成る群から選択され、前記第２の配列は、配列番号７９３、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８８９から成る群から選択される、ｄｓＲＮＡ。
2. 前記ｄｓＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
3. 前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
4. 前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含んでなるヌクレオチドの群から選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
5. 前記第１の配列は配列番号７９２であり、前記第２の配列は配列番号７９３である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
6. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７９３のうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
7. 前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、および５’ホスホロチオエート基を含んでなる少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
8. 前記アンチセンス鎖は、３’末端に少なくとも１つの５−ブロモ−２’−デオキシウリジンを含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
9. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７９３を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
10. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７９３からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
11. 前記センス鎖は、配列番号７９２を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
12. 前記センス鎖は、配列番号７９２からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
13. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７９３を含み、前記センス鎖は、配列番号７９２を含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
14. 前記アンチセンス鎖は、配列番号７９３からなり、前記センス鎖は、配列番号７９２からなる、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
15. 前記ｄｓＲＮＡは、コレステロール部分を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
16. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
17. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、生体内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物。
18. インビトロにて細胞内のＨＤ遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記方法は、
    （ａ）前記細胞内に、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程、ならびに、
    （ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、ＨＤ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、前記細胞のＨＤ遺伝子の発現を抑制する工程、
    を包含する方法。
19. ハンチントン病を治療、予防、または管理するための組成物であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを治療上または予防上有効な量にて含む、組成物。
20. 細胞内のＨＤ遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、前記ベクターは、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された調節配列を含んでなり、前記ｄｓＲＮＡの鎖のうち１つは、ＨＤをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的であり、前記ｄｓＲＮＡは長さが３０塩基対未満であり、前記ｄｓＲＮＡは、ＨＤ遺伝子を発現している細胞と接触させると、ＨＤ遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制することを特徴とし、前記第１の配列は、配列番号７９２、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６および８８８から成る群から選択され、前記第２の配列は、配列番号７９３、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８８９から成る群から選択される、ベクター。
21. 請求項２０に記載のベクターを含む細胞。

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