JP5199067B2 - 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、認識するエピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体を利用し、検体中の目的とする抗原を簡単な操作で、感度よく測定することのできる免疫凝集反応試薬キット、及び抗原の測定方法に関する。

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、各種内分泌疾患の臨床診断等において極めて重要であり、従来種々の免疫測定法が知られている。

その中でも、抗体を感作させた担体からなる免疫凝集反応試薬を用いた検体中の抗原の測定方法として、被検物質中の抗原と該免疫凝集反応試薬を反応させ、この抗原−抗体反応により生成した凝集塊について、該試薬添加後の吸光度変化量として測定し、同様に操作した既知濃度の標準血清の吸光度変化量と比較して目的の抗原濃度を求める測定方法が知られている。

抗体をラテックス等の担体に感作する場合、それぞれの抗体を別々の担体に感作し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合し一つの免疫凝集反応試薬としていた（特許文献１：特公平３−４０３４１号公報）。

しかし、前記の混合した免疫凝集反応試薬では、抗原中においてエピトープの数が少ない場合や、抗原中に異なるエピトープが近接しているため立体障害等で抗体との反応効率が悪い場合は、十分量のラテックス凝集塊を生成せず、そのため目的とする吸光度が得られず再現性が悪く精度よく測定できない場合があった。

このような場合、競合法の反応原理を利用し測定試薬を提供する場合があるが、競合法は一般的に測定範囲が狭く、低濃度側及び高濃度側での再現性が悪く精度よく測定する試薬として好ましくはない。

一方、アルコール中毒患者を同定するための方法として、炭水化物（糖鎖）欠失トランスフェリン（略語：ＣＤＴ）を測定する方法が注目されている。アシアロ、モノシアロ及びジシアロトランスフェリンは、炭水化物（糖鎖）欠失トランスフェリン（略語：ＣＤＴ）と呼ばれている。ＣＤＴは、アルコール消費、特に慢性アルコール消費を検出およびモニターするための有効なマーカーであることが見出されている。

ＣＤＴの免疫学的検査法としてＷＯ９６／２６４４４（特許文献２）および Heil et al, Anaesthesist, 43, 447-453, (1994)（非特許文献１）等が報告されている。これらの手法では、希釈血清サンプルをアニオン性イオン交換樹脂に通し、正常なトランスフェリンイソ型を樹脂に保持させる一方、ＣＤＴ分画の通過を可能にしている。この溶出液のＣＤＴ含量は、免疫比濁法 (immunoturbidimetric assay)等によって測定される。その他、高速液体クロマト法によりＣＤＴを定量する方法もＷＯ９５／０４９３２（特許文献３）により知られている。

前記アルコール中毒患者の従来の検査手法の全ては、イオン交換樹脂或いは高速液体クロマト法を適用する等比較的複雑な手順に基づくものであった。

一方、Makhloufらは、ＣＤＴのみを直接測定するために、ＣＤＴに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。彼らは、トランスフェリンの糖鎖が結合している４１３番目と６１１番目のアスパラギンを中心として前後６個のアミノ酸の合成ペプチドを免疫原として抗体を作製し、その抗体をＣＤＴ測定のための免疫測定法に応用することを考えた（ＷＯ９３／０６１３３：特許文献４）。

これに対して、ER.Trimbleらは、Makhloufらの手法による、合成ペプチドを免疫原として作製したモノクローナル抗体はＣＤＴには反応しなかったことからそのエピトープはトランスフェリン分子内に隠匿されており検出に応用できないと述べた（Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998) ：非特許文献２）。

一方、特開２００４−０５１６３３（特許文献５）には、ＣＤＴと水溶液中で選択的に結合し、ＣＤＴを固相に結合させる必要がない抗体に関して記載されている。該抗体は、遺伝子組み換え手法により得たリコンビナント非糖化トランスフェリンを免疫原に使用し、或いは、酵素による脱糖化反応して非糖化トランスフェリンとしたものを免疫原として使用して、得た抗体である。即ち、人為的に作製したＣＤＴを免疫原に使用して得られた抗体である。

現在市販されているＣＤＴ測定試薬には、カラム法ではウサギポリクローナル抗体が使用されているため、ＣＤＴの測定には検体への鉄飽和とカラムによるＣＤＴの分離が必要であり、操作が煩雑であった。また、高速液体クロマト法によるＣＤＴの測定は１検体あたりに要する時間が長く、多検体処理には不向きであった。

近年、ＣＤＴ（糖鎖欠損トランスフェリン）を測定するために、検体の前処理（検体の鉄飽和及びカラム分離）を必要としない試薬が提供されたが（非特許文献：D.Kraul et al, Clinical Chemistry, vol.51, No.6 96 B-149 (2005) (2005 AACC Annual meeting 要旨集) ）、測定原理が競合法で、測定範囲が狭く、低濃度側及び高濃度側での再現性が悪く精度よく測定する試薬としては好ましくはない。

また、上記のＣＤＴ測定試薬は、専用試薬のため適用可能な分析装置が限られており、汎用の自動分析装置に適用し難い。

特公平３−４０３４１号公報 ＷＯ９６／２６４４４ ＷＯ９５／０４９３２ ＷＯ９３／０６１３３ 特開２００４−０５１６３３ Heil et al, Anaesthesist, 43, 447-453, (1994) Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998) D.Kraul et al, Clinical Chemistry, vol.51, No.6 96 B-149 (2005) (2005 AACC Annual meeting 要旨集)

本発明者らは、鋭意研究の結果、未変性で天然のＣＤＴを調製し、該ＣＤＴの構造を認識するモノクローナル抗ＣＤＴ抗体を複数種類取得した。しかしながら、前記従来の免疫凝集試薬による測定法を適用した場合には、凝集反応はうまく行われないことを確認した。即ち、それぞれのモノクローナル抗ＣＤＴ抗体を別々の担体に感作し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合し一つの免疫凝集反応試薬として用いて、検体に対して免疫凝集反応を行わせても、凝集反応はうまく行われなかった。

そこで、本発明は、検体の前処理を必要とせず、経済的コストの低下につながる汎用の自動分析装置でも測定可能であり、測定精度の向上や測定範囲の拡大を目指した免疫凝集反応による抗原の測定方法と該測定方法に用いた免疫凝集反応試薬キットを提供することを課題とする。さらに本発明は、前記課題に加えて、検体中のＣＤＴに対して、効率のよい免疫凝集反応によりＣＤＴ量の測定を行うことができる免疫凝集反応試薬キット、該免疫凝集反応試薬キットに用いられるモノクローナル抗ＣＤＴ抗体、該免疫凝集反応試薬キットを用いたＣＤＴの測定方法を提供することを課題とする。

また、免疫凝集反応試薬キットに用いられる抗体として、体液中のＣＤＴを前処理することなく測定できることが望ましく、そのためには天然のＣＤＴの構造を認識する抗体を取得する必要がある。

一方、上述したように糖鎖欠失部位の近傍の領域は、ER.Trimbleらの報告（非特許文献２）からも理解されるように、ＣＤＴ分子内に隠匿されている可能性があり、トランスフェリン分子内のジスルフィド結合数の多さからも強固な立体構造を形成しており、糖鎖欠失部位の近傍のエピトープを認識する抗体の取得は困難であると想定される。

また、免疫抗原として人為的に作製したＣＤＴは、天然のＣＤＴとは大きく異なるという問題がある。例えば、前記特許文献４の遺伝子組換え体の場合、ジスルフィド結合を含むためタンパク質の立体構造が不完全になり易く、また、酵素による脱糖化物の場合、調製の際に変性処理が必要である。さらに遺伝子組換え体と脱糖化物はアミノ酸の置換を生じるという問題がある。

また、体液中から天然のＣＤＴを精製するための方法として、一般的には抗トランスフェリン抗体が結合したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが使用される。この方法はカラム中の抗トランスフェリン抗体にトランスフェリンを結合させた後に、この抗原抗体複合体を酸性条件で変性させることによりＣＤＴを含むトランスフェリンを溶出させて精製する方法である。しかしながら、該方法により得られるＣＤＴは変性している可能性が高いので、免疫原としては好ましくない。

本発明はかかる問題点を鑑みて、体液中のＣＤＴに対して反応しないような抗体を生ずる恐れのある、人為的に作製したＣＤＴを免疫原に使用することなく、天然のＣＤＴと選択的に結合し、しかも免疫凝集反応を利用した測定に適用できる抗ＣＤＴ抗体を提供することを目的とする。

前記した課題を解決するための本発明の免疫凝集反応試薬キットは、認識するエピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体が該抗体の種類毎に分けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を含む免疫凝集反応試薬であって、該二種類の感作された担体粒子は、目的の抗原を含む検体に対して同時に反応させた場合には凝集反応が弱く、特定の種類のモノクローナル抗体が感作された担体粒子の反応順序を特定した場合、凝集反応が増大する性質を有し、該二種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されていることを特徴とする。

本発明の抗原の測定方法は、前記の免疫凝集反応試薬キットを用意し、抗原を含むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反応液に他方の種類の試薬を反応させることにより、凝集を生じさせ、凝集の変化量を測定することを特徴とする。

本発明の免疫凝集反応試薬キットに使用されるモノクローナル抗体はマウス由来のものを用いることができる。本発明のキットは動物種に関係なく、認識するエピトープの異なる二種類以上のモノクローナル抗体を用いることができる。

また、認識するエピトープが異なるモノクローナル抗体は、二種類以上でも使用することができ、一方の試薬に、二種類以上のモノクローナル抗体が感作された担体粒子、或いはエピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体が、該抗体の種類毎に分けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を混合されたものを使用し、他方の試薬にさらに別のエピトープのモノクローナル抗体が感作されてなる担体粒子を含むものを使用してもよい。

本発明の抗原の測定方法、特に好適な抗原はＣＤＴである。ＣＤＴを測定する方法に用いられる特に好ましい免疫凝集試薬キットは、国際寄託当局である独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（受託日：平成１８年３月１４日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０８４４）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を最初に反応させる試薬とし、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ０７７（受託日：平成１８年３月１４日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０８４３）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を次に反応させる試薬として組み合わせたキットである。
上記ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３は、該国際寄託当局に平成１８年３月１４日にＦＥＲＭ Ｐ−２０８４４として原寄託され、該原寄託から平成１９年４月１６日にＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１６としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された。
上記ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７は、該国際寄託当局に平成１８年３月１４日にＦＥＲＭ Ｐ−２０８４３として原寄託され、該原寄託から平成１９年４月１６日にＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された。

該キットを用いた抗原の測定方法は、ＣＤＴを含むと疑われる検体に対して、ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１６）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体１を感作した担体粒子を含む試薬を反応させた後、その反応液にハイブリドーマＮＣＤＴ０７７（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を反応させることにより、凝集を生じさせ、凝集の変化量を測定することを特徴とする。前記反応液中のｐＨが６．８以上８．５以下であることが好ましい。

本発明の抗原の測定方法は、自動分析装置又は用手法の何れでも行うことができる。汎用の自動分析装置として、三試薬系の分析が可能な分析装置であれば本試薬キットの適用は可能である。例えば、日立製の自動分析装置の７０７０形や７１７０形等は三試薬系の分析が可能である。

本発明の免疫凝集反応試薬キットを構成する試薬に好適に使用できる担体は、通常の免疫凝集反応試薬に用いられる不溶性担体微粒子であればいずれも使用可能であるが、例示すれば、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどのラテックス等の有機高分子物質の微粒子、物理吸着用やカルボキシル基を介した化学結合用といった処理加工を施したラテックス、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの様な無機酸化物又は該無機酸化物等にシランカップリング処理等を施し、官能基を導入した無機粒子、金属コロイド粒子、ヒトＯ型血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒子、リポソーム等が挙げられるが、これらに限定するものではない。なかでもラテックス粒子は人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的処理しやすいこと、また非特異反応が起こりにくいことなどの点から特に好ましく用いられる。そのなかで、種々の変性ラテックスや磁性ラテックス等も必要に応じて使用できる。

上記担体の粒径も特に限定されるものではないが、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝集の判別のし易さ等の観点から平均粒径が０．０５μｍ以上１μｍ未満、好ましくは、０．１μｍ以上０．５μｍ未満、最も好ましくは、０．１μｍ以上０．２μｍ未満である担体粒子を用いることが好適である。

また担体の使用量は、抗体や抗原の種類によって適宜決定すればよいが、担持効率や操作性の観点から、測定時の溶液中の担体粒子濃度が０．０２質量％以上０．２５質量％以下、好ましくは０．０２質量％以上０．１７質量％以下、最も好ましくは０．０４質量％以上０．１３質量％以下であることが好適である。本発明で使用するモノクローナル抗体の濃度は０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．０９ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．０７ｍｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ以上０．０７ｍｇ／ｍＬ以下とする。

測定に用いる緩衝液は、Ｔｒｉｓの他ｐＨ範囲が６．８から８．５である緩衝剤であれば用いることができ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等も使用することができる。

従来法である、認識するエピトープの種類の異なる抗体を種類毎に別々の担体に感作し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合した免疫凝集反応試薬を用いて免疫凝集反応を行わせても、抗原中においてエピトープの数が少ない場合や、異なるエピトープが近接しているため立体障害等の原因で、十分量のラテックス凝集塊を生成せず、そのため目的とする吸光度が得られないような場合でも、本発明の二種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されているキットを用い、抗原を含むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反応液に他方の種類の試薬を反応させることにより凝集を生じることができ、大きな吸光度変化を得ることができるので検体中の抗原の測定が可能となる。

陰イオン交換クロマトグラフィーによるＣＤＴ分画溶出プロファイルを示すグラフである。 図１の溶出プロファイルに示した各分画のSDS-PAGE及び等電点電気泳動の写真である。 抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡによる相関性試験を示すグラフである。 イ）２種のラテックス試薬を混合して用いた場合、ロ）先にラテックス試薬１を反応させ、次いでラテックス試薬２を反応させた場合、ハ）先にラテックス試薬２を反応させ、次いでラテックス試薬１を反応させた場合のＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。 ラテックスの粒径を変えた場合のＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。 反応液中のラテックス濃度を変えた場合のＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。 反応液中のモノクローナル抗体濃度を変えた場合のＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。 使用可能なｐＨの範囲についてＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。 精製ＣＤＴ分画による１２０ｍｇ／ｄＬまでの抗原過剰の測定結果についてＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。

次の実施例により本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
以下の実施例は、認識するエピトープが異なる二種類の抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を別々のラテックスにそれぞれ感作し、カラム等の検体の前処理が不要な汎用自動分析装置に適用可能な三試薬系のＣＤＴ測定試薬を構築して免疫測定を実施したものである。

［実施例１］：未変性で天然のＣＤＴ分画の調製
ＣＤＴ高値ヒト血清１０ｍＬに鉄飽和溶液（０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ２５０μＬと１０ｍＭ ＦｅＣｌ₃ １８０μＬ）を加え、４℃で一時間インキュベート後、脱脂溶液（１００ｇ／ｌ デキストラン硫酸 １００μＬと１Ｍ ＣａＣｌ₂ ５００μＬ）を加えた溶液の上清を回収した。さらにブルーセファロースカラム（Blue Sepharose 6 Fast Flow：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてアルブミンを除去し、次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Hi Trap Protein G HP：商品名：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてグロブリンを除去することにより、トランスフェリン以外のタンパク質を除去した後、陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて未変性のジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含むＣＤＴ分画を調製した。

図１は陰イオン交換クロマトグラフィーによるＣＤＴ分画溶出プロファイルを示すグラフである。図１における矢印Ａは波長２８０ｎｍの吸光度曲線を示す。矢印Ｂは波長４６０ｎｍの吸光度曲線を示す。図１の溶出プロファイルに示した各分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE gel：商品名、インビトロジェン株式会社製）及び等電点電気泳動についての銀染色とウエスタンブロットの写真を図２に示す。図２に示すようにトランスフェリンの糖鎖の量に応じた５種のアイソフォームとしてテトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェリンを未変性で高純度に調製することができたことがわかる。

［実施例２］：ハイブリドーマの調製
前記実施例１で得られたジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含む分画をＣＤＴ抗原として用いた。該抗原を濃度０．５ｍｇ／ｍＬの抗原溶液に調製した。該抗原溶液５００μＬにアジュバンド５００μＬ（ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ：商品名、 ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｃｏ．製）を混和して乳化させ、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に免疫した。追加免疫として同様に調製したものを２週おきに３回繰り返した。その間免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から１４日後に１００μＬの抗原溶液を腹腔内に投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール４０００（商品名、メルク社製）の存在下で２分間反応させることにより融合させた。融合後、ＨＡＴ選択培地に懸濁して９６ウェルの培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ₂ インキュベーターで培養し、ハイブリドーマを調製した。

［実施例３］：ＣＤＴ分画に対する抗体産生ハイブリドーマの選抜
前記実施例２で得られたハイブリドーマについて、本発明の抗体産生ハイブリドーマの選抜はサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した抗マウス抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行いスクリーニング用のプレートとした。ハイブリドーマの増殖の認められたウェルの培養上清５０μＬをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例１に記載したＣＤＴ分画を室温で１時間反応させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。なお、該アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体は、抗トランスフェリンポリクローナル抗体（株式会社シバヤギ製）にアルカリフォスファターゼ（ロシュ社製）を過ヨウ素酸法で結合させることにより調製したものを使用した。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、該ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７及びＮＣＤＴ５０３を選抜した。

［実施例４］：ＣＤＴ分画に対する抗体産生ハイブリドーマのクローニング
前記実施例３で選抜した各ハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、樹立株を得た。得られたハイブリドーマＮＣＤＴ０７７は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託し（受託日：平成１８年３月１４日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０８４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５））、ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託した（受託日：平成１８年３月１４日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０８４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１６））。

［実施例５］：抗体の調製
前記実施例４で得られた各樹立株について、ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、モノクローナル抗体の大量産生のためマウス腹腔内にて増殖させた。こうして得られたマウス腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインＧカラム（ＧＥ社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。

［実施例６］： 抗体のサブクラスの決定
前記実施例３で得られたハイブリドーマＮＣＤＴ０７７の産生するモノクローナル抗ＣＤＴ抗体のサブクラスはＩｓｏｓｔｒｉｐ（登録商標、ロシュ社製）を使用して、ＩｇＧ２ａ（κ）と決定した。同様にしてハイブリドーマＮＣＤＴ５０３の産生するモノクローナル抗ＣＤＴ抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１（κ）と決定した。

［実施例７］：サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例５で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）についてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォーム５０μＬをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例３で調製したものと同じ）５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さを比較することで抗体の特異性を確認した。その結果を下記の表１に示す。

表１に示すようにハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体は溶液中の天然のＣＤＴ分画（アシアロトランスフェリンとジシアロトランスフェリン）に特異的に反応したが、ＣＤＴ以外のトランスフェリンであるテトラシアロトランスフェリンに対して反応しなかった。

［実施例８］：抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた相関性試験
前記実施例５で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）を用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で、健常者とアルコール中毒患者の血清合計３２検体を測定した。対照試験としてバイオラッド社製の試薬を用いて測定した。該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の％ＣＤＴを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後のＣＤＴの量を測定し、検体中のＣＤＴ濃度と％ＣＤＴ（総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合）を算出した。

前記サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定は９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、健常者とアルコール中毒患者の各血清５０μＬをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例３で調製したものと同じ）５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、対照試験測定値との相関性を確認した。その結果を図３に示す。

図３に示したように未変性で天然のＣＤＴ分画を免疫原にして得られた、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体は対照試験ＣＤＴ濃度と良好な相関を示した。したがって、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体は、検体中のＣＤＴ濃度に応じて吸光度が相関しているので、吸光度の値を測定することにより、検体中のＣＤＴ濃度を定量することができる。

［実施例９］：抗体の抗原認識部位の確認
前記実施例５で調製した各モノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）の反応性を次のようにして調べた。下記のＰ１−Ｐ６に示す６種類のアミノ酸配列のペプチドをＥＬＩＳＡプレートに結合させた後、１０μｇ／ｍＬに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Goat F(ab') Anti-Mouse Ig' s, Alkaline Phosphatase Conjugate AMI4405: 商品名、BIOSOURCE 社製）５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。

Ｐ１−Ｐ６のペプチド配列において下線部は、特許文献３又は特許文献４の抗体認識部位を示す。その結果を下記の表２に示す。
Ｐ１ ＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥ （配列番号１）
Ｐ２ ＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧ （配列番号２）
Ｐ３ ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ （配列番号３）
Ｐ４ ＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ （配列番号４）
Ｐ５ ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ （配列番号５）
Ｐ６ ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ （配列番号６）

表２によれば、各モノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）は、Ｐ１−Ｐ６（特許文献３又は特許文献４の抗体の認識部位を含むペプチド）に対して認識しないことがわかる。

次に前記実施例５で調製した抗体の抗原認識部位を調べるために、最初に抗原タンパク質の一次構造への反応性について次のようにして確認した。即ち、ＣＤＴ抗原をＥＬＩＳＡプレート（イモビライザーアミノ：商品名、ヌンク社製）に共有結合させた後、４Ｍ尿素による変性、０．１Ｍ ＤＴＴで還元処理を行ったウェルに１０μｇ／ｍＬに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例３で調製したものと同じ）５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質の一次構造を認識するかを確認した。その結果を下記の表３に示す。

表３に示すようにハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体は、ＣＤＴ抗原を変性・還元処理した一次構造に対して反応しないことがわかる。また、これらの抗体はＣＤＴ抗原の一次構造を認識しておらず、立体構造を認識していることがわかる。

［実施例１０］ 各モノクローナル抗体が認識するエピトープ相違の確認
前記実施例５で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）の抗原認識部位の違いを調べるために、各抗体を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。最初に９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した一方の抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μＬ加え，４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、５０倍に希釈したアルコール中毒者の血清５０μＬをウェルに加え，室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、他方の抗体をビオチン標識したものを５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン５０μＬを加え、室温で３０分反応させ、洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍのＯＤを測定した。その結果を表４に示す。

表４に示したモノクローナル抗体の組合せパターンによる反応結果によれば、同じモノクローナル抗体の組み合わせでは反応せず、異なるモノクローナル抗体の組み合わせでは反応がみられることが判る。

［実施例１１］：ラテックス試薬１、２の調製
粒径が０．１３μｍの１０％ラテックス溶液１００μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに分注し、感作緩衝液８２５μＬを加えて希釈した後、１０ｍｇ／ｍＬに調整した抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体１（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）を７５μＬ添加して直ちに撹拌混合し、冷所で２時間転倒混和して感作を行った。感作の後ブロッキング緩衝液を１００μＬ添加して２分間のソニケーションを行ってラテックスを分散させ、３７℃で１時間反応させてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、遠心して上清の未反応成分を除去し、沈渣に保存緩衝液１ｍＬを加えてソニケーションを行ってラテックスを分散させ、７００ｎｍの吸光度が０．８Ａｂｓとなるように希釈してラテックス試薬１を調製した。同様の操作で抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体２（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体）を感作させたラテックス試薬２を調製した。

＜感作緩衝液組成＞
１０ｍＭ ＴＥＳ ｐＨ７．５
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０９５質量％ アジ化ナトリウム

＜ブロッキング緩衝液組成＞
１０ｍＭ ＴＥＳ ｐＨ７．５
１０％ ウシ血清アルブミン
０．０９５質量％ アジ化ナトリウム

＜保存緩衝液組成＞
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
２０質量％ グリセロール
０．１質量％ ウシ血清アルブミン
０．０９５質量％ アジ化ナトリウム
［実施例１２］：ラテックス試薬の反応性
測定には、第１試薬、第２試薬、第３試薬からなる試薬系による測定が可能な日立７１７０型自動分析装置を使用し、第１試薬として下記組成の緩衝液を用い、第２試薬、第３試薬として前記実施例１１で調製したラテックス試薬１、２を下記のイ）ロ）ハ）の３種類の条件で使用して測定を行った。

具体的な操作方法としては、自動分析装置の反応セルに検体５μＬが分注され、その後下記組成の第１試薬１００μＬが分注され、さらに第２試薬５０μＬが分注されて検体中のＣＤＴと第２試薬のラテックス試薬が反応した。その後、下記組成の第３試薬５０μＬが分注されると、ＣＤＴとラテックス試薬の凝集塊が成長するため吸光度が増加するので、第３試薬添加直後からの吸光度の変化量を測定した。

下記のイ）の条件では第２試薬を用いずにラテックス試薬１および２を等量混合したものを第３試薬として１００μＬ添加した。第１試薬および測定試料は共に共通で、出力はＫ−ｆａｃｔｏｒ法による吸光度で行った。測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図４に示す。図４によれば、今回使用した抗体の組み合わせでは、下記のロ）の条件が最も感度良く測定できることが判る。

＜第１試薬組成＞
１０ｍＭ ＴＥＳ ｐＨ７．５
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０９５％ アジ化ナトリウム

＜測定試料＞
ヒト血清からイオン交換カラムにより精製したＣＤＴ分画を生理食塩水で希釈した０、３、６、１２および１８ｍｇ／ｄＬの溶液。
＜測定条件＞
イ）２種のラテックス試薬を混合して用いた場合
検体量 ５μＬ
第１試薬 １００μＬ
第２試薬 ０μＬ
第３試薬 １００μＬ ラテックス試薬１および２を等量混合したもの
測定波長 主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ
測光ポイント １９−３４

ロ）先にラテックス試薬１を反応させ、次いでラテックス試薬２を反応させた場合
検体量 ５μＬ
第１試薬 １００μＬ
第２試薬 ５０μＬ ラテックス試薬１
第３試薬 ５０μＬ ラテックス試薬２
測定波長 主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ
測光ポイント １９−３４

ハ）先にラテックス試薬２を反応させ、次いでラテックス試薬１を反応させた場合
検体量 ５μＬ
第１試薬 １００μＬ
第２試薬 ５０μＬ ラテックス試薬２
第３試薬 ５０μＬ ラテックス試薬１
測定波長 主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ
測光ポイント １９−３４

［実施例１３］：使用可能なラテックスの粒径の範囲
前記実施例１１と同様の感作方法で抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体２（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体）を粒径０．０９μｍ、０．１３μｍ、０．１５μｍ、０．２０μｍ、０．３４μｍ、０．４６μｍのラテックスに感作することにより粒径の異なるラテックス試薬を調製した。試薬の希釈倍率は前記実施例１１における粒径０．１３μｍの場合と同じ希釈倍率を他の粒径にも適用した。測定試料は生理食塩水で希釈した０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０ｍｇ／ｄＬのＣＤＴ溶液とし、調製した粒径の異なるラテックス試薬を前記実施例１２のロ）の条件で測定した。測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図５に示す。図５によれば０．０９μｍから０．４６μｍの間の粒径はＣＤＴ濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、該粒径範囲で使用可能であることが判る。

［実施例１４］：使用可能なラテックス濃度の範囲
前記実施例１１で調製したラテックス試薬２の濃度を変化させ、反応液中のラテックス濃度を０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０７％、０．１３％、０．１７％、０．２５％、０．５％とした場合の吸光度を前記実施例１２のロ）の条件および前記実施例１３の評価試料で測定した。測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図６に示す。図６は反応液中のラテックス濃度を変えた場合の感度を示すグラフである。図６によれば、吸反応液中のラテックス濃度が０．０１％では測定に十分な感度が得られず、０．５％では吸光度が減少したが、０．０２％から０．２５％の間ではＣＤＴ濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であることが判る。０．５％の吸光度の低下の理由は強い凝集のため主波長は０濃度で頭打ちし、副波長が濃度に応じて上昇するためと考えられる。

［実施例１５］：使用可能なモノクローナル抗体濃度の範囲
前記実施例１１と同様の感作方法で抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体２（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７産生抗体）の感作時濃度を変化させ、溶液中の抗体濃度として０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬとした場合の吸光度を前記実施例１２のロ）の条件および前記実施例１３の評価試料で測定した。測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図７に示す。図７によれば、反応液中の抗体濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬでは測定に十分な感度が得られなかったが、０．０３ｍｇ／ｍＬから０．０９ｍｇ／ｍＬの間ではＣＤＴ濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であることが判る。

［実施例１６］：使用可能なｐＨの範囲
前記実施例１２で調製した第１試薬のほかにｐＨの異なる緩衝液を調製し、前記実施例１２のロ）の条件および前記実施例１３の評価試料で反応液中のｐＨと吸光度を測定した。測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図８に示す。図８によれば、ｐＨ６．５以下ではブランク反応の異常が見られ、ｐＨ９．６では測定に十分な感度が得られなかったが、ｐＨ６．８からｐＨ８．５の範囲ではＣＤＴ濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、該ｐＨ範囲で使用可能であることが判る。

［実施例１７］：測定試薬性能
前記実施例１２のロ）の条件で、２０回連続測定した生理食塩水の吸光度を、５ｍｇ／ｄＬのＣＤＴ溶液からＣＤＴ濃度に換算し、０濃度の平均値＋３ＳＤにより最小検出限界を算出した結果を表５に、４濃度の試料を１０回測定した場合の同時再現性を表６に、精製ＣＤＴ分画による１２０ｍｇ／ｄＬまでの抗原過剰の測定結果をＣＤＴ濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図９にそれぞれ示す。この方法により算出された最小検出限界は、想定される健常人検体に含まれるＣＤＴ濃度よりも十分に小さい数値であり、同時再現性、測定範囲等も測定試薬として十分な性能を有しているといえる。

本発明によりエピトープが近接し立体障害等で抗体との反応効率が悪い場合でも、目的物を効率的に測定することができる。同時に特異的な反応が行われるため、検体の前処理を必要としない簡便で高感度な免疫測定法に利用できる。本発明の測定方法は、ＣＤＴの測定に特に適している。

Claims (11)

1. 認識するエピトープが異なる二種類の抗ＣＤＴモノクローナル抗体が該抗体の種類毎に分けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を含む免疫凝集反応試薬キットであって、
   該二種類の感作された担体粒子は、目的のＣＤＴ抗原を含む検体に対して同時に反応させた場合には凝集反応が弱く、特定の種類の抗ＣＤＴモノクローナル抗体が感作された担体粒子の反応順序を特定した場合、凝集反応が増大する性質を有し、
   該二種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されており、
   該二種類の感作された担体粒子の一方は、ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１６）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を最初に反応させる試薬とし、該二種類の感作された担体粒子の他方は、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を次に反応させる試薬とし、両試薬は組み合わされていることを特徴とするＣＤＴを測定するための免疫凝集反応試薬キット。
2. 前記モノクローナル抗体が感作された担体粒子がラテックス粒子である請求項１記載の免疫凝集反応試薬キット。
3. 前記担体粒子の粒径が０．０５μｍ以上１μｍ未満である請求項１記載の免疫凝集反応試薬キット。
4. 請求項１に記載の免疫凝集反応試薬キットに用いられるハイブリドーマＮＣＤＴ０７７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５）の産生する抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体であって、次のＰ１−Ｐ６のペプチド領域に対して反応性を有しないか又は実質的に反応性を有しない抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体。
   Ｐ１： ＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥ
   Ｐ２： ＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧ
   Ｐ３： ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ
   Ｐ４： ＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ
   Ｐ５： ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ
   Ｐ６： ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ
5. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の免疫凝集反応試薬キットを用意し、
   ＣＤＴを含むと疑われる検体に対して、前記最初に反応させる試薬を反応させた後、その反応液に前記次に反応させる試薬を反応させることにより凝集を生じさせ、反応液中の凝集の変化量を測定することを特徴とするＣＤＴの測定方法。
6. 自動分析装置又は用手法により行う請求項５記載のＣＤＴの測定方法。
7. 前記反応液の担体粒子濃度が０．０２質量％以上０．２５質量％以下である請求項５記載のＣＤＴの測定方法
8. 前記反応液の抗ＣＤＴモノクローナル抗体濃度が０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．０９ｍｇ／ｍＬ以下である請求項５記載のＣＤＴの測定方法。
9. 前記反応液のｐＨが６．８以上８．５以下である請求項５記載のＣＤＴの測定方法。
10. 前記凝集の変化量は、吸光度の変化量である請求項５記載のＣＤＴの測定方法。
11. 請求項１に記載の免疫凝集反応試薬キットに用いられる抗ＣＤＴマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＮＣＤＴ０７７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８１５）。

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