JP5031163B2

JP5031163B2 - 寄生性原虫類の蔓延から生ずる疾患の処置のためのトリアジノン化合物

Info

Publication number: JP5031163B2
Application number: JP2001541510A
Authority: JP
Inventors: グライフ，ギゼラ
Original assignee: バイエル・アニマル・ヘルス・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2020-11-21
Also published as: HUP0203534A2; HUP0203534A3; HU226379B1; EP1246624A2; AU783437B2; CN101632676A; JP2003515563A; US20090181040A1; CN1407893A; NZ519327A; DK1246624T3; CA2394188A1; WO2001039778A2; EP1246624B1; WO2001039778A3; DE50010648D1; BR0015996A; ES2243323T3; CA2394188C; AU1524401A

Description

【０００１】
本発明は、胎児死亡を生ずるか又は神経疾患を起こす寄生虫に感染している動物を、特に予防的に処置するためのトリアジノン化合物に関する。特に、本発明は、胎児死亡を生ずるか又は神経疾患を起こす球虫類のような寄生性原虫類の処置に適したトリアジノン化合物に関する。極めて特定的には、本発明はネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）感染の処置に適したトリアジノン化合物に関する。
【０００２】
トリアジンジオン類、例えばジクロズリル及びトリアジントリオン類、例えばトルトラズリルのようなトリアジノン化合物は、広範囲の原虫類により引き起こされる疾患に対して広範囲の哺乳類、昆虫及び魚類を処置するために用いられた；米国特許第４，６３１，２１８；４，９３３，３４１；４，９３５，４２３；５，１１４，９３８；５，１４１，９３８；５，１８８，８３２、５，１９６，５６２、５，２５６，６３１及び５，４６４，８３７号あるいは他にＥＰＡ１７０３１６を参照されたい。これらの化合物に感受性の原虫類には鳥類、哺乳類及び昆虫の内蔵に感染する寄生虫が含まれ、下痢、活力不足、吐き気及び嘔吐の形態で現れる。一般にトリアジノン類の作用様式は、腸壁細胞及び内蔵壁細胞中に存在する寄生虫の中間段階（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｔａｇｅ）を攻撃し、それにより寄生虫の小胞体、核の回りの領域及びミトコンドリアを増大させることにある。これはおそらく核が分裂する能力を妨げ、それによりシゾント(schizonts)及びミクロガモント（ｍｉｃｒｏｇａｍｏｎｔｓ）が小さいままであり、それぞれ少数のメロゾイト及び小配偶子を形成するのみとなる。最終的結果は、これらのより後期寄生虫段階（ｌａｔｅｒｐａｒａｓｉｔｉｃｓｔａｇｅｓ）が新しい哺乳類細胞に入り込む能力を失い、それによって宿主における寄生虫の増殖が有効に防がれることである。
【０００３】
７０年代以来、動物において神経疾患を引き起こし及び／又は胎児死亡を生ずると考えられてきたある種の原虫類は特に重要である。これらの原虫類のいくつかの単離及び試験管内培養の成功は難しいことが証明された。例えば脳液及び脊髄液が成功裏に単離されたのは８０年代後期になって初めてである。神経疾患が脳に感染する寄生虫によって引き起こされ得、胎児死亡を生ずる疾患が胎児−感染性寄生虫によって引き起こされ得ることに疑いがなくなるとすぐに、損害を与える副作用を引き起こすことなく血液脳関門及び胎盤関門を横切ることができる有効な抗原虫薬が必要となった。非常に少数の薬のみが動物の血液脳関門又は胎盤関門を横切ることができる。寄生虫の脳感染を有効に処置するために血液脳関門及び／又は胎盤関門を横切ることができる先行技術の薬の多くは損害を与える副作用を有し、従って高い危険性の心構えなしで用いることはできない。従ってそのような神経疾患及び胎児死亡を生ずる疾患の有効な処置を構成する有効な薬は今日まで承認されたことがない。下記は寄生虫によって引き起こされる疾患の短い記述である。
【０００４】
ネオスポラ・カニヌム（Ｎｅｏｓｐｏｒａｃａｎｉｎｕｍ）は１９８４年にＢＪＥＲＫＡＳｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓによりノルウェー犬において最初に記載された原虫類の群からの新しい寄生虫であり、犬及び牛と別に、羊、やぎ及び馬においも見いだされた（ＤｕｂｅｙａｎｄＲｏｍｍｅｌ１９９２，ＤｕｂｅｙａｎｄＬｉｎｄｓａｙ１９９３）。犬及び牛と別に、きつね、猫、羊及びマウスも実験的感染に成功した。ネオスポラ・カニヌムの固有宿主はおそらく犬であるが（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒｅｔａｌ．１９９８）、完全な生活史への詳細な研究はまだ得られない。
【０００５】
多種の細胞、例えばマクロファージ、好中球、線維芽細胞、血管の内皮細胞、筋細胞、腎細管の上皮細胞、肝細胞及び神経細胞がネオスポラ・カニヌムのための宿主細胞として働くことができる。しかしながら、タキゾイト（ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅｓ）を介する繁殖は好ましくは筋肉及び神経細胞のような細胞小器官において起こる。従って、自然の感染に続く病理学的症状が支配的であるのはこれらの組織においてである。５〜６週令であり、且つその期間に及んで自然に感染している犬はかくして神経根炎の故の過敏性の兆候及び増進する後肢のびっこを有する疾患症状を示す。さらに神経系において、主に脳及び脊髄において組織病理学的異常が見いだされる。ここでは、広範囲の非−化膿性炎症、グリアの増殖ならびに単核細胞（マクロファージ、リンパ球、いくつかのプラスマ細胞）、いくつかの場合には又、好酸球及び好中球の血管周囲浸潤が支配する。裸眼で筋系における壊死性−変性性変化さえ見ることができる。気付くことは、多少顕著な萎縮の他に、長くて色の薄い縦縞である。これは特に後肢に当てはまる。組織学的には、変化は少しの壊死及び非−化膿性小胞炎を伴う顕著な筋細胞炎（ｍｙｏｃｙｔｉｓ）を構成する。これらの変化は前肢の筋系、横隔膜及び舌の筋系においてもあまり顕著でない形態で観察される。これらの症状を有する５〜１２週令の犬は安楽死させねばならない（Ｄｕｂｅｙｅｔａｌ．１９８８）。ネオスポラ感染は繰り返される経胎盤伝達により次の世代に伝達される。疾患は決して必ずしも一腹の動物のすべてに影響を与えるわけではない。妊娠２１日に６個の雌犬に実験的に感染させると、１個の雌犬は３個の生存子犬を産んだが、他の５個はＮ．カニヌム−陽性胎児を流産した。生きて産まれた３個の子犬において寄生虫は検出され得なかった（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．１９９５）。
【０００６】
牛における今までで最初の記述はＴｈｉｌｓｔｅｄａｎｄＤｕｂｅｙ（１９８９）によるニューメキシコからの流産した胎児の脳組織におけるものであった。さらに牛からの単離が合衆国（Ｃｏｎｒａｄｅｔａｌ．１９９３，Ｂａｒｒｅｔａｌ．１９９３，Ｍａｒｓｈｅｔａｌ．１９９５）、日本（Ｙａｍａｎｅｅｔａｌ．１９９６）及びスウェーデン（Ｓｔｅｎｌｕｎｄｅｔａｌ．１９９６）で行われた。カリフォルニア及びオーストラリアで、ネオスポラ・カニヌム感染は牛の群れにおける胎児死亡に関する主な原因であると考えられている（Ｂａｒｒｅｔａｌ．１９９０）。
【０００７】
多分、ほとんどのネオスポラ−感染牛は３〜９月令の時に流産する。これらの胎児において、実質的数で見いだされるのは主にタチゾイトである。今まで、産まれた牛においては嚢子が立証されたのみである。感染した牛は出産後（ｐｏｓｔ−ｐａｒｔｕｍ）遅くとも３〜１７日に死亡する。疾患症状は犬におけるものに類似している。運動失調が観察され、関節反射が大きく減退し、後肢の、いくつかの場合には四肢全部のびっこが観察される。組織学的知見は犬におけるものと類似している：非−化膿性髄膜炎及び脊髄炎が支配的である。犬及び他の動物においてそうであると同様に、脳において、特に血管周囲領域において単核細胞が浸潤し、壊死が見いだされた。寄生虫、特にタキゾイト又はタキゾイトを有する偽嚢（ｐｓｅｕｄｏｃｙｓｔｓ）は特に−しかしほとんどの場合に少数で、神経組織における、まれな場合にはまた、筋細胞における病巣として見いだされる。顕著なのは、そしてトキソプラスマと明白に対照的なのは、ネオスポラが母から子孫に繰り返し伝達され得ることである。これは犬及び牛において立証された（Ｂｊｅｒｋａｓｅｔａｌ．１９８４，ＤｕｂｅｙａｎｄＲｏｍｍｅｌ１９９２，Ｄｕｂｅｙｅｔａｌ．１９８８）。
【０００８】
犬及び牛からのＮ．カニヌム単離物の間の比較はこれまで、形態学的超微細構造のレベルでも、タンパク質分析のレベルでも、続くｒＲＮＡ又はＩＴＳＩ配列の分子−生物学的配列整列のレベルでも、相違を明らかにしなかった（ＨｏｌｍｄａｈｌａｎｄＭａｔｔｓｓｏｎ１９９６）。
分布及び経済的重要性
１９８４年にＮ．カニヌムが発見されて以来、それは世界中で同定されてきた（ＲｅｖｉｅｗＤｕｂｅｙ／Ｌｉｎｄｓａｙ）。カリフォルニアの場合、Ｎ．カニヌムによって引き起こされる牛における胎児死亡の割合は特に高いと見積もられる。４６８個の流産した胎児の中で、４５．５％がネオスポラ・カニヌム感染によるものであった（ＤｕｂｅｙａｎｄＬｉｎｄｓａｙ１９９３）。スイスでは流産した胎児の２９％の脳においてネオスポラ−特異的ＤＮＡが検出された；従って年間の損失は１千２０万スイスフラン（Ｇｏｔｔｓｔｅｉｎ／Ｂｅｒｎ）及びオーストラリアでは１億ドル（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｓｙｄｎｅｙ）と見積もられる。カリフォルニアでは、疾患率は１２月から２月の冬の間にピークがある。ニュージーランドに関して類似の知見が得られた（Ｔｈｏｒｎｔｏｎｅｔａｌ．１９９１）。ここでは、Ｎ．カニヌムにより引き起こされる流産のほとんどが５月から７月に報告された。Ｎ．カニヌム感染を、特に予防的に処置する有効な方法はこれまで開示されたことがない。
【０００９】
ウマ原虫性脊髄脳炎（ＥＰＭ）はストレス下にある若い馬（例えばサラブレッド競走馬及び純血種の馬術馬（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｈｏｒｓｅｓ））において主に見いだされる神経学的疾患であり、従って乗馬経済（ｅｑｕｅｓｔｒｉａｎｅｃｏｎｏｍｙ）に実質的な財政上の影響を有する疾患である。７０年代に疾患として最初に同定されたＥＰＭは、ＥＰＭ馬から１９９１年もの遅くに培養され、サルコシスチス・ニューロナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓｎｅｕｒｏｎａ）と命名された。１９９７年に、現在ネオスポラ・フゲシ（Ｎｅｏｓｐｏｒａｈｕｇｅｓｉ）と呼ばれているネオスポラ種がＥＰＭ馬の脳から単離された。従って現在、ＥＰＭはこの新しく同定された生物によってのみか、サルコシスチス・ニューロナによってのみか、あるいはこれらの生物の組合わせによって引き起こされ得ることが提案されている。最も多くの場合、ＥＰＭは非対称運動失調、虚弱及び痙性を生ずる。疾患は神経学的状態を模してい得る。疾患は超急性又は慢性の形態で起こり得る。慢性の形態は多くの場合に開始時に潜行性であり、疾患における後期まで診断が困難であり、死に至り得る。最も穏やかな場合、唯一の臨床的兆候は病気が限定する腰肢のびっこ（ｉｌｌｄｅｆｉｎｅｄｈｉｐｌｉｍｂｌａｍｅｎｅｓｓ）又は小さい呼吸雑音であり得る。最も重症の場合、馬は嚥下できないか、又は立てない。現在、最も重症の場合には寄生虫、例えばＳ．ニューロナが脳に感染し、そこでそれがかなりの損傷を引き起こすことが知られている。臨床的兆候は寄生虫による直接の神経損傷（脳及び脊髄における）ならびにメロゾイト(merozoites)及びメロンテス（ｍｅｒｏｎｔｅｓ）に関連する炎症性細胞の浸潤の故の脳損傷、水腫及び中枢神経系（ＣＮＳ）における神経死により引き起こされる。現在ＥＰＭの抑制のための有効な予防はない。人間における使用に関して承認されている薬トリメトプリム及びスルホンアミドの組合わせが用いられた。しかしながら処置は高価であり、多くの繰り返し投薬が必要である。
【００１０】
球虫類の群に属するさらに別の寄生虫、トキソプラスマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）はしばらく前から既知であり、最初に猫の内蔵及び筋肉組織から単離された。この寄生虫の固有宿主は猫であり、それは長期間に及んでその生物を宿し得るが、接合子嚢は牛、羊、豚及び人間を含む他の動物に広がる。羊、牛及び人間の感染は胎児死亡を生ずる疾患及び主に中枢神経系を攻撃する先天的疾患を伴ってきた。最も最近には、それは胎児死亡及び感染した母からの子猫における、感染の前の妊娠中には血清陰性であった奇形も伴った。牛、羊、豚及び人間のような非−猫宿主は接合子嚢を作らないが、タチゾイト及びブラディゾイトが現れ、筋肉及び脳はこれにより侵入され得、タチゾイト及びブラディゾイトは神経学的症状及び胎児奇形を伴う胎児死亡である疾患の臨床的兆候を引き起こす。すべての猫の６０％がＴ．ゴンジイに関して血清学的に陽性であることが報告された。この場合も、トキソプラスマ症の処置、特に予防的処置は存在しない。
【００１１】
特にサルコシスチダエ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）科からの球虫類への感染の危険にさらされる動物を、許容され得ない副作用なしで処置する、特に予防的に処置するためのジクラズリル、トルトラズリル又はトルトラズリルスルホン（最近は新しい名前「ポナズリル」の下に既知である）のようなトリアジノン化合物の使用は、冒頭で挙げた文献を含む先行技術の文献に開示されていないか、又はそこに記載されていない。従って目的は、上記の寄生虫への感染の危険にさらされる動物のための有効な処置、特に予防的処置を提供することであった。
【００１２】
驚くべきことに今回、処置、特に予防的処置のためにトリアジノン類を用いることにより、寄生性原虫類への感染からの広範囲の保護が達成されることが見いだされた。
【００１３】
従って本発明は、製薬学的に活性な量のトリアジノン化合物を動物に適用することを特徴とする、神経学的疾患あるいは胎児死亡を生ずる疾患として現れる寄生虫病への感染の危険にさらされる動物を、特に予防的に処置する方法に関する。そのような動物は例えば馬、牛、猫、犬、豚、羊、鳥類、昆虫及び人間であるが、制限ではない。
【００１４】
感染又は疾患を引き起こす寄生虫はサルコシスチダエ科の球虫類であり、それは神経学的疾患又は胎児死亡を生ずる疾患として現れる。例えば、サルコシスチス種、ネオスポラ種及びトキソプラスマ種より成る群から、制限として分類するわけではない例を選ぶことができる。典型的には、サルコシスチダエはＳ．ニューロナ、Ｎ．フゲシ、Ｎ．カニヌム及びＴ．ゴンジイより成る群から、特にネオスポラ種の群から選ばれる。原虫類感染又は原虫性疾患にはＥＰＭ、ネオスポラ症及びトキソプラスマ症が含まれるが、それらに限られるわけではない。
【００１５】
本発明を行うと、本明細書に記載する原虫類により引き起こされる寄生虫感染もしくは疾患に対する動物の処置、特に予防的処置がそれらに伴う症状及び疾患の予防を生ずる。一般にこれらの疾患の症状にはびっこ、運動失調、麻痺、胎児死亡、虚弱新生児及び他の関連する障害が含まれる。典型的には、処置に約１〜３０日、好ましくは約１〜２０日、特に好ましくは１〜１０日そして特別に好ましくは１〜６日かかる。当然、処置、特に予防的処置のための処置案は、状況及び病原性寄生虫の種に依存して１日１回、１日２回又は１日数回、隔日１回あるいは実に週に１回であることができる。
【００１６】
好ましい投薬量は処置されるべき動物の体重のｋｇ当たり１〜５００ｍｇの活性化合物であり、特に好ましいのは１０〜２００ｍｇ／ｋｇの投薬量、そして特別に好ましいのは２０〜１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量である。
【００１７】
１つの特定の理論に縛られることは望まないが、本明細書に記載する処置、特に予防的処置の予想に反した成功は、トリアジノン化合物が血液脳関門又は胎盤関門を横切る能力の故であると思われる。本発明の化合物は容易に血液脳関門を横切り、且つ又胎盤中に入り込むことができ、脳において、及び脊髄内の脊髄液においてその場で原虫類を殺すと思われる。
【００１８】
これまで、動物における毒性又は突然変異原性のような許容され得ない副作用なく、これらの疾患に対して有効に保護するために、安価で容易に投与される薬は得られなかった。ここで下記の本文においてトリアジノン化合物を、特にトルトラズリル化合物に関して記載するが、制限としてではない。特許請求する本開示及び発明はさらに、トルトラズリル化合物の意味で有用な他のトリアジノン化合物を含む。
【００１９】
本発明に従って用いることができるトリアジントリオン類であるトルトラズリル類は式（Ｉ）
【００２０】
【化１】

【００２１】
［式中、
Ｒ¹はハロゲノアルキルチオ、ハロゲノアルキルスルフィニル又はハロゲノアルキルスルホニルであり、
Ｒ²は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルメルカプト、ハロゲン、ハロゲノアルキル又は場合により置換されていることができるスルファモイル基、例えばジアルキルスルファモイル基であり、
Ｒ³及びＲ⁴は同一もしくは異なることができ、水素、アルキル、アルケニル又はアルキニルを示し、ＸはＯ又はＳを示す］
を有し、ならびにそれらの生理学的に許容され得る塩である。
【００２２】
さらに、特に以下の、
Ｒ¹がハロゲノ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルチオ、ハロゲノ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルスルフィニル又はハロゲノ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルスルホニルを示し、
Ｒ²が水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルコキシ、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルコキシ−（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルメルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₄）ジアルキルアミノスルホニル又はハロゲノ−（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルを示し、
Ｒ³及びＲ⁴が同一もしくは異なることができ、水素（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルケニルを示し、ＸがＯ又はＳを示す
式（Ｉ）のトリアジントリオン類であるトルトラズリル類を本発明に従って用いることができることが見いだされた。
【００２３】
本発明に従ってやはり用いることができるトリアジンジオン類であるジクラズリル類は式（Ｉａ）
【００２４】
【化２】

【００２５】
［式中、
Ｒ^1a、Ｒ^2a及びＲ^3aはそれぞれ互いに独立して水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルオキシ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルチオ又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルスルホニルを示し、
Ｒ^4a及びＲ^5aはそれぞれ互いに独立して水素、ハロゲン、トリフルオロメチル又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルを示し、
Ｒは水素、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、シクロ−Ｃ₃−Ｃ₆−アルキル又はフェニルを示し、それは場合によりハロゲン、トリフルオロメチル、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルオキシ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルチオもしくはＣ₁−Ｃ₆−アルキルスルホニルより成る群から互いに独立して選ばれる最高で３個の置換基を有することができる］
を有する。
【００２６】
好適に用いられる式（Ｉａ）の化合物は、
Ｒ^1a及びＲ^2aがそれぞれ互いに独立して水素、ハロゲン、トリフルオロメチル又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルを示し、
Ｒ^3aが水素を示し、
Ｒが水素、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、フェニル又はハロゲノフェニルを示し、
Ｒ^4a及びＲ^5aがそれぞれ互いに独立して水素、ハロゲン、トリフルオロメチル又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルを示す
化合物である。
【００２７】
特に好適に用いられる式（Ｉａ）の化合物は、
Ｒ^1aが４−ハロゲンを示し、
Ｒ^2a及びＲ^3aが水素を示し、
Ｒが水素又はメチルを示し、
Ｒ^4a及びＲ^5aがそれぞれ互いに独立して水素、ハロゲン又はトリフルオロメチルを示し、ここでＲ^4a及びＲ^5aはそれらが結合しているフェニル基の２−及び６−位にある
化合物である。
【００２８】
特に好適に用いられる化合物は、特定的に
【００２９】
【化３】

【００３０】
である。
【００３１】
化合物トルトラズリル及びポニズリルが特別に好適に用いられる。
【００３２】
さらに、
（ａ）式Ｉの化合物は式ＩＩ
【００３３】
【化４】

【００３４】
［式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＸは上記の意味を有する］
の化合物を式ＩＩＩ
【００３５】
【化５】

【００３６】
［式中、
Ｒ⁵はハロゲン原子、アルコキシ基又はアリールオキシ基を示す］
の置換カルボン酸イソシアナートと反応させ、得られる式ＩＶ
【００３７】
【化６】

【００３８】
［式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＸは上記の意味を有する］
の置換１，３，５−トリアジン誘導体を適宜単離し、適宜式Ｖ
Ａ−Ｚ（Ｖ）
［式中、
Ａはアルキル、アルケニル又はアルキニルを示し、
Ｚはハロゲンを示す］
の化合物と反応させると得られるか；
あるいは
（ｂ）式Ｉの化合物は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＸが上記の意味を有する式ＩＩの化合物を式ＶＩ
【００３９】
【化７】

【００４０】
［式中、
Ｒ⁶はアルキルを示す］
のビス（クロロカルボン酸）アミンと、適宜酸受容体の存在下で反応させると得られるか、
あるいは
（ｃ）置換基Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴ならびにＸが上記の意味を有し、Ｒ¹がハロゲノアルキルスルフィニル又はハロゲノアルキルスルホニルである式Ｉの化合物を得るために式
【００４１】
【化８】

【００４２】
［式中、
Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は上記の意味を有し、
Ｒ¹’はハロゲノアルキルチオである］
の化合物を適した量の適した酸化剤と反応させる
ことが見いだされた。
【００４３】
変法（ａ）において、Ｎ−［３−クロロ−４−（４’−トリフルオロメチルチオフェノキシ）−フェニル］−Ｎ’−メチルウレア及びクロロカルボニルイソシアナートを用いると、反応の経路を次式により表すことができる：
【００４４】
【化９】

【００４５】
変法（ｂ）において、Ｎ−［３−エトキシ−４−（４’−トリフルオロメチルチオフェノキシ）−フェニル］−チオウレア及びＮ−メチル−ビス−（クロロカルボン酸アミン）を出発材料として用いると、反応の経路を次式により示すことができる：
【００４６】
【化１０】

【００４７】
Ｒ¹がハロゲノアルキルチオを示し、ＸがＯを示し、且つ変法（ａ）又は（ｂ）に従って得られる式Ｉの化合物を変法（ｃ）に従って酸化し、対応するハロゲノアルキルスルフィニル又はハロゲノアルキルスルホニル誘導体を得ることができる。酸化剤として過酸化水素を用いると、該方法の経路を次式により示すことができる：
【００４８】
【化１１】

【００４９】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩにおいて、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁶又はＡ中で定義したアルキルは、好ましくは１〜６個、特に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状アルキルである。挙げることができる例は場合により置換されていることができるメチル、エチル、ｎ−及びｉ−プロピルならびにｎ−、ｉ−及びｔ−ブチルである。
【００５０】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩにおいて、Ｒ³、Ｒ⁴又はＡに関して定義したアルケニルは、好ましくは２〜６個、特に２〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状アルケニルを示す。挙げることができる例は場合により置換されていることができるエテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル及びブテン−３−イルである。
【００５１】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩにおいて、Ｒ³、Ｒ⁴又はＡに関して定義したアルキニルは、好ましくは２〜６個、特に２〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状アルキニルを示す。挙げることができる例は場合により置換されていることができるエチニル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イル及びブチン−３−イルである。
【００５２】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶＩＩにおいて、Ｒ²又はＲ⁵に関して定義したアルコキシは、好ましくは１〜６個、特に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状アルコキシを示す。挙げることができる例は場合により置換されていることができるメトキシ、エトキシ、ｎ−及びｉ−プロポキシならびにｎ−及びｉ−ブトキシである。
【００５３】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩにおいて、Ｒ²、Ｒ⁵又はＺに関して定義したハロゲンは好ましくはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素、特に塩素及び臭素を示す。
【００５４】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ及びＶＩＩにおいて、Ｒ¹に関して定義したハロゲノアルキルチオは、好ましくは１〜４個、特に１もしくは２個の炭素原子及び好ましくは１〜５個、特に１〜３個の同一もしくは異なるハロゲン原子を有し、ハロゲン原子は好ましくはフッ素、塩素及び臭素、特にフッ素及び塩素である。挙げることができる例はトリフルオロメチルチオ、クロロジフルオロメチルチオ、ブロモメチルチオ、２，２，２−トリフルオロエチルチオ及びペンタフルオロエチルチオである。
【００５５】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＶにおいて、Ｒ¹に関して定義したハロゲノアルキルスルフィニルは、好ましくは１〜４個、特に１もしくは２個の炭素原子及び好ましくは１〜５個、特に１〜３個の同一もしくは異なるハロゲン原子を有するハロゲノアルキニルスルフィニルを示し、ハロゲン原子は好ましくはフッ素、塩素及び臭素、特にフッ素及び塩素である。挙げることができる例はトリフルオロメチルスルフィニル、クロロジフルオロメチルスルフィニル、ブロモメチルスルフィニル、２，２，２−トリフルオロエチルスルフィニル及びペンタフルオロエチルスルフィニルである。
【００５６】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＶにおいて、Ｒ¹に関して定義したハロゲノアルキルスルホニルは、好ましくは１〜４個、特に１もしくは２個の炭素原子及び好ましくは１〜５個、特に１〜３個の同一もしくは異なるハロゲン原子を有するハロゲノアルキニルスルホニルを示し、ハロゲン原子は好ましくはフッ素、塩素及び臭素、特にフッ素及び塩素である。挙げることができる例はトリフルオロメチルスルホニル、クロロジフルオロメチルスルホニル、ブロモメチルスルホニル、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル及びペンタフルオロエチルスルホニルである。
【００５７】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＶにおいて、Ｒ²に関して定義した場合により置換されていることができるスルファモイルは、好ましくは以下の基の１つを示す：
【００５８】
【化１２】

【００５９】
式ＩＩＩにおいて、Ｒ⁵に関して定義したアリールオキシは、好ましくは単環式炭素環式アリールオキシ又は二環式炭素環式アリールオキシ、特にフェノキシを示す。
【００６０】
式ＩＩＩにおいて、Ｒ⁵の意味におけるアリールオキシは好ましくはフェノキシを示す。出発材料として用いられる式ＩＩの置換ウレアもしくはチオウレアのほとんどは今日まで未知であったが、それ自体既知の方法により、（ａ）不活性溶媒中で、０℃〜１００℃に温度において置換４−アミノジ−フェニルエーテルを対応する置換イソシアナート又はイソチオシアナートと反応させるか、あるいは逆の順序で（ｂ）同じ条件下でアンモニア又は置換アミン及び対応する置換イソシアナートジフェニルエーテル又は４−イソチオシアナートジフェニルエーテルを互いに反応させるか、あるいは（ｃ）ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド又はヘキサメチルリン酸トリアミドのような非プロトン性溶媒中で、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム及び他のような塩基の存在下に、２０℃〜１５０℃の温度で、置換４−ヒドロキシフェニル−ウレア又は−チオウレアを活性ハロゲン−置換芳香族化合物との縮合反応に供することにより、容易に製造することができる。
【００６１】
適した溶媒が選ばれた場合、反応生成物は一般に溶液を冷却すると結晶化する。しかしながら代わりに以下の参照文献：ＭｅｔｈｏｄｅｎｄｅｒＯｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ［Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）ＩＶｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＶｏｌｕｍｅＶＩＩＩ，ｐａｇｅｓ１５７−１５８に記載されている通り、アミンとイソシアナートからウレアを製造することもできる。
【００６２】
方法（ｂ）において本発明に従って用いることができる式ＶＩのビス（クロロカルボン酸）−アミンのいくつかは既知であり（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９７０，ｐａｇｅｓ５４２−５４３中の論文を参照されたい）、今日まで未知であったものは類似して環状ジアシルジスルフィドから、不活性有機溶媒、好ましくは四塩化炭素中における塩素化により製造することができる。
【００６３】
式ＩＩのウレアもしくはチオウレアの式ＩＩＩのカルボン酸イソシアナート（変法ａ）又は式ＶＩのビス（クロロ−カルボン酸）アミン（変法ｂ）との反応のために、ならびに式ＩＶの１，３，５−トリアジン誘導体の式Ａ−Ｚの化合物との反応のために用いることができる希釈剤は、これらの反応に対して不活性なすべての有機溶媒である。
【００６４】
それらには、ピリジンの他に好ましくは芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン及びキシレン、ハロゲン化芳香族炭化水素、例えばクロロベンゼン及びジクロロベンゼンならびにエーテル類、例えばテトラヒドロフラン及びジオキサンが含まれる。
【００６５】
反応の間に生成し得る塩酸は気体の形態で逃げるか、あるいは有機もしくは無機酸受容体により結合され得る。これらの酸受容体には好ましくは第３級有機塩基、例えばトリアルキルアミン類、例えばトリエチルアミン、芳香族Ｎ−複素（単−もしくは二）環式アミン類、例えば単−もしくは二環式ピリジンアザシクロアルキルアミン類、例えばジアザビシクロノネン、ジアザビシクロウンデセン及び他の多く、あるいは無機塩基、例えばアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属酸化物、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ土類金属酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物が含まれる。
【００６６】
上記の反応段階のための反応温度は広い限度内で変わることができる。一般に反応は約０℃〜約１５０℃、好ましくは約２０℃〜約１００℃において行われる。
【００６７】
大気圧下又は加圧下で上記の反応段階を行うことができる。一般にそれらは大気圧下で行われる。
【００６８】
Ｙが酸素を示す式（Ｉ）のトリフルオロメチルチオ化合物の、対応するスルフィニル又はスルホニル化合物を得るための変法（ｃ）に従う反応のために可能な酸化剤は、それぞれの場合にＨ₂Ｏ₂／氷酢酸、Ｈ₂Ｏ₂／無水酢酸、Ｈ₂Ｏ₂／メタノール、過酸、例えばｍ−クロロ過安息香酸ならびに又、クロム酸、過マンガン酸カリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）及び硝酸である。
【００６９】
式（Ｉａ）の化合物の製造はＥＰＡ１７０３１６及びＵＳ４，６３１，２７８に記載されている。これらの化合物はそこに記載されている方法により得られ得る。
【００７０】
得られる式（Ｉ）又は式（Ｉａ）の化合物を、例えば無機もしくは有機塩基との反応により、対応する付加塩に転換することができる。
【００７１】
本発明を行う場合、トリアジノン化合物を動物に投与するために所望の方法で調製することができる。これに関して好ましい経口的投与に適した調剤は、溶液、懸濁剤、錠剤、カプセル、ジェル剤、塗布剤、大型丸薬あるいは粉末、顆粒もしくはペレットの形態の調製物である。さらに別の投与の可能性は、非経口的、局所的、筋肉内及び粘膜内投与あるいは熟練者に既知の他の投与経路である。ポア−オン製品（ｐｏｕｒ−ｏｎｐｒｏｄｕｃｔ）の形態における局所的投与も好ましい。
【００７２】
特に有効な適用は、式（Ｉ）及び（Ｉａ）の活性化合物と寄生性原虫類に対する、特にネオスポラ種に対する生もしくは死菌ワクチンとの組合わせである。そのような場合には活性−増進効果を観察することもできる。
【００７３】
組成物及び調剤は、撹拌容器及び他の適した設備のような適した装置において成分を混合することにより調製される。
【００７４】
制限ではなくて例として示される以下の実施例により本発明をさらに詳細に記述する。
【００７５】
【実施例】
ネオスポラ・カニヌム感染
ネオスポラ・カニヌムの診断及びトキソプラスマ・ゴンジイに対する限界決定の基礎は臨床的、顕微鏡的、免疫組織化学的及び分子−生物学的パラメーターである。臨床的には、四肢の麻痺及び繰り返される経胎盤伝達が観察される。筋系及び神経組織において顕微鏡下でタチゾイト及び嚢子を見ることができる。顕著な壁厚の嚢子壁を有する嚢子が神経組織においてのみ少数みつかる。細胞培養中で生産されるタチゾイトを用いる間接的免疫蛍光試験（ＩＦＡＴ）において、１：２００からの力価が特異的であると考えられる。臨床的症状が存在したら、最高で１：２００００の力価が見いだされ得る。分子生物学によっては、ＩＴＳ１領域（インターナルトランスクライバースペーサー１（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｒｓｐａｃｅｒ１））の試験管内増幅によりネオスポラ・カニヌムを迅速且つ明確に同定することができる（ＨｏｌｍｄａｌｅａｎｄＭａｔｔｓｓｏｎ１９９６）。
試験官内試験システムの記述
ＶＥＲＯ宿主細胞の培養
ネオスポラ・カニヌムは絶対細胞内寄生虫（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒａｓｉｔｅ）である。標準化及び規定ができる条件下において寄生虫を繁殖させるための補助としてＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎細胞、ＡＴＣＣＮｏ．：ＣＣＬ８１Ｖｅｒｏ）を用いた。Ｖｅｒｏ細胞を以下の培地中で生育させた：８７％ＲＰＭＩ１６４８（ＩＣＮ，１２−６０２−５４）１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清、ＩＣＮ，２９−１０１−４９）１％２００ｍＭＬ−グルタミン（ＩＣＮ，１５−８０１−１３）１％重炭酸ナトリウム（ＩＣＮ，１６−８８３−４９）１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＩＣＮ，１６−７００−４９）。非感染培養を２５ｃｍ²（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂ７６９０３１）及び７５ｃｍ²（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂ７６９０５１）組織培養フラスコ中で保持し、継代培養した。Ｖｅｒｏ細胞を３７℃において、ＣＯ₂インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ）中で５％ＣＯ₂雰囲気下で、細胞単層が得られるまで生育させた。
ＥＤ細胞の培養
ＥＤ細胞（ウマ皮膚細胞、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ５７）を以下の培地中で生育させた：８７％ＥＭＥＭ（ＩＣＮ，１２−１０６−５４）１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清、ＩＣＮ，２９−１０１−４９）、１％２００ｍＭＬ−グルタミン（ＩＣＮ，１５−８０１−１３）、１％ＮＥＡ（非必須アミノ酸、Ｇｉｂｃｏ，１１１４０−０３５）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＩＣＮ，１６−７００−４９）。非感染培養を２５ｃｍ²（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂ７６９０３１）及び７５ｃｍ²（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂ７６９０５１）組織培養フラスコ中で保持し、継代培養した。ＥＤ細胞を３７℃において、インキュベーター（Ｈｅｒｅｕｓ）中でＣＯ₂雰囲気なしで、細胞単層が得られるまで生育させた。
細胞の継代培養
宿主細胞を継代培養し、すなわち培養が完全に密集した細胞叢を形成したら、新しい細胞培養容器に分配した。培地が１０％ＦＣＳを含有すると、これは通常１週当たり２回のことであった。最初に培地をデカンテーションして捨て、細胞叢を５ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡ（ＩＣＮ，１６−８９１−４９）で洗浄し、さらに５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡと一緒にＣＯ₂インキュベーター中で３７℃において、細胞が基質から離れるまで５〜１０分間インキュベーションした。トリプシン−ＥＤＴＡ細胞懸濁液をあらかじめ温められた１〜２ｍｌのＦＣＳと一緒に１５００ｒｐｍで５分間遠心した（Ｖａｒｉｆｕｇｅ３．０，Ｈｅｒａｅｕｓ）。上澄み液を捨て、ペレットを１５ｍｌの培地（９２％ＲＰＭＩ１６４０、５％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％重炭酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に溶解した。それぞれの組織培養フラスコに関して３個の新しいフラスコにそれぞれ５ｍｌの細胞懸濁液を接種し、すなわち分割比は１：３であった。
液体窒素中における細胞の低温保存
培養フラスコからの細胞をＣ５４１培地（５０％ＲＰＭＩ１６４０、４０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｍｅｒｃｋ９５７８）中又はＣ２培地（８６％ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＤＭＳＯ、２％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ストレプトマイシン／ペニシリン）中で凍結した。あらかじめ細胞を記載した通りに（上記を参照されたい）トリプシンで処理し、離れた細胞を遠心し、３ｍｌのＣ５４１凍結培地又はＣ２培地中に再懸濁させ、２ｍｌのクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中に移した。最終的保存は−１９６℃における液体窒素中であり、そこで細胞を無限に保つことができる。液体窒素中における最終的保存の前に、低温管を細胞系と一緒に１ｃｍの壁厚を有するＳｔｙｒｏｐｏｒボックス中で−８０℃にゆっくり冷却した。Ｓｔｙｒｏｐｏｒボックスは１分当たり１〜２℃の継続的冷却速度を可能にし、浸透圧によって細胞にそれらの細胞内水を失わせる。これは細胞の生存能力のために決定的に重要なことである。
低温保存された細胞の解凍
液体窒素からの低温管の解凍プロセスは３７℃の温度を有する水浴中で可能な限り迅速に行われた。細胞懸濁液を１０ｍｌの培地中にピペットで入れ、続いて２つの５０ｍｌ組織培養フラスコ中に均一に分割した。細胞培養条件は３７℃及び５％ＣＯ₂における条件であった。２４時間後、細胞培養培地を変え、低温培地（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍ）中に存在するＤＭＳＯを除去した。
細胞培養のネオスポラ・カニヌムへの感染
細胞培養の感染のために以下のネオスポラ・カニヌム単離物を用いた：ＮＣ−１（犬からの単離物（ｃａｎｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ）ＤＵＢＥＹ（１９８８）及びＮＣＳｗｅＢ−１／第９継代（牛からの単離物（ｂｏｖｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ）；ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅＵｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。用いられた感染材料は窒素保存（上記を参照されたい）からの感染した細胞培養又は感染した培養の精製されたタキゾイト（下記を参照されたい）であった。
Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いる細胞培養からのタキゾイトの単離
ネオスポラ・カニヌムを感染したＶＥＲＯもしくはＥＤ単層から無菌条件下で単離した。最初に感染した細胞培養をスパチュラ（ＴｅｃＮｏＭａｒａ，３０１０）を用いてフラスコの底から離し、２３−ゲージのカニューラ（Ｌｕｅｒ２３Ｇｘ１，０．６ｘ２５ｍｍ）を用いて１０ｍｌの使い捨てシリンジ中に採取した。この手順の間に、宿主細胞及びそこに含有される組織の嚢子は機械的に破壊された。続いて細胞懸濁液を１５００ｒｐｍで７分間遠心し（Ｖａｒｉｆｕｇｅ３．０，Ｈｅｒａｅｕｓ）、上澄み液を捨て、試料ペレットを正確に２．５ｍｌの生理学的リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ：１ｍＭＰＯ４、１２ｍＭＮａＣｌ、０．８７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。次の単離段階をＳｅｐｈａｄｅｘカラム（ＰＤ−１０^TM／ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５Ｍ，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，１７−０８５１）を用いて行った。カラムを最初に２５ｍｌのＰＢＳで平衡化し、試料容積を２．５ｍｌのＰＢＳ中において適用し、次いで５ｍｌのＰＢＳを用いて溶離を行った。タチゾイトはカラムを介して迅速に移動し、最初の３ｍｌの溶離物中に見いだされるが、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの高分子量の細胞破片及び膜の溶離は遅れる。望ましくない細胞小器官及び遊離の宿主細胞のＤＮＡを除去するために、試料を１５００ｒｐｍで７分間遠心し、上澄み液を捨て、ペレットを４０ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄した。
感染したネオスポラ・カニヌム細胞培養上における物質の試験
９６−ウェル平板（Ｆａｌｃｏｎ３８７２）において物質を試験し、それはこのシステムでは少量の出発材料（約１ｍｇ）しか必要でないからである。最初に、宿主細胞（Ｖｅｒｏ又はＥＤ）の細胞培養単層を細胞培養平板上で確立した。この目的のために、確立された非感染単層を有する２つの５０ｍｌ組織培養フラスコ（合計細胞培養面積５０ｃｍ²）が必要であった。この培養の細胞叢をＣＯ₂インキュベーター中で３７℃において５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，４５３００−０１９）を用いて離した。１０分間のインキュベーション期間の後、細胞のほとんどが離れた。約１ｍｌの温められた胎児ウシ血清が入れられた５０ｍｌの遠心管（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｂ７６９３３１）中に、５ｍｌのピペットを用いて細胞懸濁液を移した。１５００ｒｐｍにおける５分間の遠心（Ｖａｒｉｆｕｇｅ３．０，Ｈｅｒａｅｕｓ）の後、上澄み液を捨て、細胞ペレットを１００ｍｌのＲＰＭＩ培地（９５％ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％重炭酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に再懸濁させた。この細胞懸濁液の１５０μｌを９５−ウェル平板の各ウェル中にピペットで入れた。６個のマイクロウェル平版をコーティングするのに１００ｍｌの培地が十分である。コーティングされた細胞培養平板をインキュベーター中で３７℃において、５％ＣＯ₂中で２４時間培養した。次いでそれらを精製されたネオスポラ・カニヌムのタチゾイトにウェル当たり４８０００個のタチゾイトの濃度で感染させ、さらに３７℃及び５％ＣＯ₂において２４時間インキュベーションした。試験物質を１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に量り込み、物質の重量は０．５〜１．５ｍｇであった。次いで物質のｍｇ当たり１ｍｌのＤＭＳＯをピペットで加え、それは１ｘ１０^-3ｇ／ｍｌの希釈に相当した。残る希釈系列を行った処置培地は８７％ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％重炭酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシンから成った。最初のスクリーニングにおいて、１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ及び５０ｐｐｍの濃度を用いた。ネオスポラ・カニヌムへの感染から２４時間後に希釈調製物を１５０μｌ／ウェルの容積で細胞培養平板に移した。第１列では未処置の培地を用い、この列は感染標準及び非感染標準の両方を含有した。次いで細胞平板を３７℃及び５％ＣＯ₂において５日間インキュベーションした。この時間の間に、タチゾイトは宿主細胞内で増殖し、かくして単層の破壊を引き起こした。ある物質が完全に活性な場合、タチゾイトが破壊され、単層が保持される。タンパク質結合試験（生体染色（ｌｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇ））において無損傷の単層を検出することができる。用いることができる方法の１つは０．２５％ＣｒｙｓｔａｌＶｉｏｌｅｔ（ＳｉｇｍａＣ３８８６）を用いる染色である。染色の前に、試験平板を１００μｌのＰＢＳで洗浄し、１００μｌのメタノールを用いて固定した。処置の開始から４日後及び感染−後５日に、倒立顕微鏡下で２５ｘ１０の倍率において、以下のキー（ｋｅｙ）を用いて顕微鏡分析を行った：
評価視覚的外観
０＝効果なし単層は完全に破壊されている
１＝いくらかの効果単層は部分的に破壊され、寄生虫の巣が認められる
２＝完全な作用単層は破壊されず、タチゾイトは認められない
３＝細胞毒性細胞が死亡し、丸くなっている（ｒｏｕｎｄｅｄｕｐ
）
【００７６】
【表１】

【００７７】
＊１００ｍｌの溶液は：
２．５０ｇのトルトラズリル
３０．００ｇのトリエタノールアミン
８０．７０ｇのポリエチレングリコール
を含有し、
成分は簡単に混合される。
評価視覚的外観
０＝効果なし単層は完全に破壊されている
１＝いくらかの効果単層は部分的に破壊され、寄生虫の巣が認められる
２＝完全な作用単層は破壊されず、タチゾイトは認められない
３＝細胞毒性細胞が死亡し、丸くなっている
ＩＩ．生体内有効性
適切な生体内試験システムがまだ開発されるべき状態なので、物質の生体内有効性に関してはまだ非常に少ない情報しか得られない。実験的に感染したマウスにおいて、スルファジアジン（飲料水を介して投与された）のみが、処置が予防的に、すなわち感染前に開始された場合に有効であった。この場合、寄生虫学的意味における回復が起こらずに臨床的症状が予防された。もっと遅い処置の開始は成功しなかった（Ｂｊｅｒｋａｓｅｔａｌ．１９８４，Ｄｕｂｅｙｅｔａｌ．１９８８，ＬｉｎｄｓａｙａｎｄＤｕｂｅｙ１９８９，ＬｉｎｄｓａｙａｎｄＤｕｂｅｙ１９９０）。犬においては、スルファジアジン及びクリンダマイシンを用いる処置のみが、第２胃炎による最初の臨床的症状が観察される非常に初期に処置が開始されると、成功のチャンスを有する。
マウスにおける試験モデルの記述
Ｄｒ．ＳｉｍｏｎｅＥｐｅｒｏｎ＆Ｐｒｏｆ．ＢｒｕｎｏＧｏｔｔｓｔｅｉｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ＦａｃｕｌｔｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｅｒｎｅがＢＡＹＥＲＡＧにより実験を企画して実施するように委託された（Ｅｐｅｒｏｎｅｔａｌ．１９９９，ＰａｒａｓｉｔｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２１：２２５−２３６）。
マウス
雌のＷｔＣ５７ＢＬ／６−マウス、処置の時点における令：７１／２週。
ネオスポラ・カニヌムタチゾイト
ネオスポラ・カニヌムタチゾイトをＶＥＲＯ細胞を介して継代培養し、カラムクロマトグラフィーにより単離し、１００μｌ当たり２ｘ１０⁶個の寄生虫の濃度を有するアリコートを無菌ＰＢＳ中で調製した。ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅを用いる生体染色は、９７％の生存可能なタチゾイトを明らかにした。
予防に用いられる物質（表２）
純粋なトルトラズリル活性化合物を１０ｍｌのＨ₂Ｏ＋１００μｌのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ当たりに５０ｍｇを有する倍液として作り上げた。０．１ｍｌのこの溶液の適用当たりに０．５ｍｇの純粋な活性化合物が存在した。２０ｇのマウスにおいて、これは２５ｍｇ／ｋｇの使用濃度に相当する。物質を連続６日間、強制飼養（ｇａｖａｇｅ）によって経口的に投与し、それはマウス当たり１５０ｍｇの合計摂取に相当する。
【００７８】
トルトラズリル２．５％調製溶液（１００ｍｌの溶液は：２．５０ｇのトルトラズリル、３０．００ｇのトリエタノールアミン、８０．７０ｇのポリエチレングリコールを含有し；成分は簡単に混合される）：２．５％溶液の６．２５ｍｌを２５０ｍｌの水中で希釈し、連続６日間、飲料水を介してマウスに投与した。
感染
予防的処置の開始から４時間後、各マウスを１００μｌの無菌ＰＢＳ当たりに２ｘ１０⁶個の寄生虫段階（ｐａｒａｓｉｔｅｓｔａｇｅｓ）を用いて感染させた。
安楽死
感染−後１４日に、ＣＯ₂を用いて試験マウスを犠牲にした。評価の間、無作為な配列を保持するために（盲検評価）、それらに無作為に番号を付けた。血清を得るために、心筋層から血液を採取した。脳を注意深く切開し、半分をＰＣＲ分析用に−８０℃で保存した。残りを免疫組織学的研究（ＩＦＡＴ）のために４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。
結果
１．血清中のＩｇＧ（表３）
Ｅｐｅｒｏｎｅｔａｌ．，１９９９，ＰａｒａｓｉｔｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２１：２２５−２３６の方法に従い、ＥＬＩＳＡによって抗−Ｎ．カニヌム全免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を決定した。処置された群を非感染及び感染標準群と比較した。正の標準のマウスにＮ．カニヌムタチゾイトの粗抽出物を接種し、続いて１０⁶個のＮ．カニヌム段階に感染させた。寄生虫−特異的ＩｇＧ値はこのマウスにおいて特に高かった。
【００７９】
トルトラズリル（純粋な活性化合物）で処置されたマウスは、感染且つ未処置標準群におけるより低いネオスポラ・カニヌム−特異的ＩｇＧ抗体の濃度を明らかにした。この濃度はトルトラズリル２．５％調製溶液で処置されたマウス（非感染標準群を近似している）におけるより顕著に低かった。
２．ＰＣＲ分析（表４）
Ｅｐｅｒｏｎｅｔａｌ１９９９，ＰａｒａｓｉｔｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２１：２２５−２３６により記載されている通りに、感染マウスの脳からＤＮＡを単離し、ネオスポラ・カニヌム−特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。非感染マウスのすべてがＮ．カニヌム−特異的ＰＣＲ反応において陰性であった。感染標準マウスのすべてがＰＣＲ−陽性であった。トルトラズリル純粋活性化合物を用いて予防的に処置された群中の４／７のマウスがＰＣＲ−陰性であった。２．５％調製トルトラズリル溶液を用いて処置された群中のマウスのすべてがＰＣＲ陰性であった。
３．免疫蛍光試験（ＩＦＡＴ、表４）
パラホルムアルデヒド−固定脳試料をパラフィン中に埋め込み、脱水した。３つの連続的矢状切断を行った。１つの切片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、他の２つを以下の修正を行って免疫蛍光標識のために処理した（Ｅｐｅｒｏｎｅｔａｌ．，１９９９，ＰａｒａｓｉｔｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２１：２２５−２３６）：第１抗体がＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中において１：４００で希釈された全Ｎ．カニヌムタチゾイトに対するウサギポリクローナル抗体であった。第２抗体はＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ中における１：１００の濃度におけるヤギ−抗−ウサギＦＩＴＣ−標識抗体であった。
【００８０】
ヘマトキシリン−エオシン−染色された切片のすべての群において、少しの病巣又は異常な変化も観察されず、それが脳組織中の寄生虫の段階を標識するために特異的Ｎ．カニヌム抗体を用いる免疫標識を用いた理由である。評価のために切片全体を調べた。存在するいずれの段階の寄生虫も計数し、以下の得点を用いた：
得点（−）＝タチゾイトなし
得点（＋）＝１０個未満のタチゾイト
得点（＋＋）＝１０〜２００個のタチゾイト
得点（＋＋＋）＝２００個より多い寄生虫
得点（＋＋＋）は正の標準で見られたのみであった。正の標準はノック−アウト突然変異体（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔｍｕｔａｎｔ）（μＭＴマウス）であり、それは抗体を生産せず、感染−後３１日に感染のために死亡した。すべての非感染マウスはＩＦＡＴ試験において陰性であった。すべてのトルトラズリル−処置群はＩＦＡＴ試験において陰性であった。
【００８１】
【表２】

【００８２】
【表３】

【００８３】
【表４】

Claims

トルトラズリル又はポナズリルを有効成分として含有するネオスポラ・カニヌム（Ｎｅｏｓｐｏｒａｃａｎｉｎｕｍ）に対する動物の予防的処置のための組成物。