JP5028595B2 - 試料成分の分離方法及び分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料に含まれる組成の判別や化学構造解析のために行われる分析前処理としての試料成分の分離方法及びこの分離方法を用いた分析方法に関する。

一般に多くの工業製品は混合物で構成されている。製品クレームや工業製品製造トラブルには微小異物が混入するケースが多く、混入起源を探るために、主成分及びそれ以外の成分を同定し、十分に把握しておく必要がある。

また、最近では食品の偽装が社会問題となっており、食品が表示通りの構成物となっているか、古い成分の混入はないか、或いは、産地は正しいのかということを十分に科学的な知見で知る必要性が発生している。

これらのニーズに対して、これまで、多くの分析手法によって評価が行われてきた。

混合物の分析方法としては、目的とする試料を溶媒に溶かしたものを液体クロマトグラフィー（ＬＣ）やガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にかける手法が広く用いられている（非特許文献１）。これらはカラムの中を通過する溶液やガスが内部に充填された物質や壁との相互作用を経ていく際の物質による相互作用の違いを利用して検出器までの到達時間が変化することを利用するものである。その検出には可視光や紫外線領域の吸光度や屈折率の変化を検知するものや、導電率を検知するものがある。また、ＧＣでは熱伝導度や水素炎中での燃焼によるプラズマ電子を検出するものがある。さらに、質量分析（ＭＳ）を組み合わせたＬＣ−ＭＳやＧＣ−ＭＳが汎用的に用いられている。これらの分析は条件をうまく設定すると非常に高い分離能が得られ、また、高感度に分析することが可能である。
津田孝雄著「クロマトグラフィー」丸善１９９５年

しかし、全く未知の成分を含む混合物に対しては、各種溶媒への溶解性のスクリーニングや、微量成分の確認に至る前に行う主成分の構造確認を別途行う必要があり、手間のかかる作業である。したがって、全く未知の成分を多く含む食品などにＬＣ−ＭＳやＧＣ−ＭＳを適用するには困難を伴う。また、これらの手法は高感度であるため、本来分析に必要とする試料量は少なくてすむはずであるが、溶解性のスクリーニングや分析前処理を行っている間に予想外に多くの試料を必要とする場合もある。さらに、分離、測定条件を決定するためにも膨大な時間を費やす可能性がある。その上、溶解しない組成物が混入している場合には、それらを分離する処理が必要になる。

一方、赤外分光やラマン分光に代表される分光学的分析法はＬＣ−ＭＳやＧＣ−ＭＳに比べて分析感度は低いものの分析試料の主要構成成分を簡便に分析でき、溶媒への溶解性なども気にする必要がない上に、顕微システムを用いると微量試料を非破壊で分析することが可能である。しかし、このような分光学的分析法で混合物の構成物の分析を行う場合には個々のスペクトルパターンを頭の中に入れておく必要があり、長い経験が必要となっている。また、主成分のシグナルに隠されて他の構成物の成分が検出されない可能性が高く、また、検出感度が足りない場合も考えられ、主成分以外の化学構造を決定するのは容易ではない。

また、分光学的分析法やＬＣ、ＧＣなどの分離分析法の両者の分析手法を組み合わせるという考え方もあり、主成分とその他の構成物を総合的に分析できる可能性がある。しかし、分析にかなりの時間を要し、最終的に試料がなくなってしまうことになる。

このほかの分析手法として、電子線マイクロアナライザー分析が知られているが、この方法においても、主成分以外の化学構造を決定するのは容易ではない。

以上のような課題を解決するため、問題となる試料の数種の構成成分を定性的に簡便に分析し、さらに、それぞれの構成物の微量成分まで新たな分析前処理を行うことなく構造解析できる方策が望まれている。

そこで、本発明は、混合物に含まれる組成の判別や化学構造解析のために行われる分析前処理として、構成成分を簡便に分離することのできる、試料成分の分離方法を提供することを目的とする。

以上のような実状に鑑み、鋭意検討の結果、プレート上に試料又は試料の一部を置き、その上にカバーグラス等のカバープレートをかぶせ、そのすき間に溶媒を注入すると、溶媒が次第に気化し、試料から溶媒に溶け出した成分が、その成分ごとにプレート上の異なった部位に析出することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の試料成分の分離方法は、プレートとカバープレートの隙間に配置した試料溶液の溶媒を気化させ、前記カバープレートの周縁部に試料成分を析出させることを特徴とする。

また、前記試料溶液は、前記プレートと前記カバープレートの隙間に試料を配置し溶媒を導入して得られたものであることを特徴とする。

また、前記カバープレートの一端側から前記溶媒を導入することを特徴とする。

また、前記プレート上に配置した前記試料の上に前記カバープレートを載置することで前記カバープレートに傾斜をつけ、前記プレートと前記カバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して前記溶媒を導入することを特徴とする。

また、前記試料溶液は、予め調製したものを前記プレートと前記カバープレートの隙間に導入したものであることを特徴とする。

また、前記カバープレートの一端側から前記試料溶液を導入することを特徴とする。

また、前記プレート上に配置したスペーサの上に前記カバープレートを載置することで前記カバープレートに傾斜をつけ、前記プレートと前記カバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して前記試料溶液を導入することを特徴とする。

本発明の試料成分の分析方法は、本発明の試料成分の分離方法を用いて前記カバープレートの周縁部に析出させた試料成分を、前記プレート上で析出した状態のままマイクロプローブを使用して分析することを特徴とする。

本発明の試料成分の分離方法及び分析方法によれば、混合物に含まれる組成の判別や化学構造解析のために行われる分析前処理として、構成成分を簡便に分離することができる。その結果、簡便にそれぞれの構成成分の化学構造或いは微量成分の化学構造を決定することができる。また、これによって、一般の工業製品製造におけるトラブル解析や食品混入異物の解析を深く行うことができ、これらの原因究明に役立てることができる。また、交通事故災害や犯罪等において、微量な遺留物の解析を深く行うことができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の試料成分の分離方法は、プレートとカバープレートの隙間に配置した試料溶液の溶媒を気化させ、前記カバープレートの周縁部に試料成分を析出させるものである。

ここで用いられるプレートとしては、試料溶液が載置される面が平坦なものであれば特定のものに限定されない。例えば、ガラス、シリコンウエハー、ＺｎＳｅ、ステンレスなどの金属からなるものを用いることができる。また、大きさは一辺が１ｃｍ〜１０ｃｍ程度のものが取り扱いの上からも適している。さらに、プレートには溝などの加工が施されていてもかまわない。なお、後述するように、分離した試料成分をそのままマイクロプローブを使用して分析する場合には、その分析プローブに対して透明な材料からなるプレートを用いるのが好ましい。例えば、赤外分光とラマン分光を併用する場合には、シリコンウエハーに金などの金属を蒸着又はスパッタしたものが好適に用いられる。

プレートとカバープレートの隙間に試料溶液を配置するためには、例えば、まず、プレート上に固形の試料を置き、この試料の上にカバープレートを載置することによって、プレートとカバープレートの隙間に試料を配置する。そして、このプレートとカバープレートの隙間に溶媒を導入することで、試料を溶媒に溶解させればよい。このとき、カバープレートの一端側から溶媒を導入することで、試料成分が分離しやすくなる。なお、プレート上に置く試料の大きさは特に制限はないが、カバープレートの面よりも小さいものが望ましい。

さらに、プレート上に配置した試料の上にカバープレートを載置してカバープレートに傾斜をつけ、プレートとカバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して溶媒を導入することで、試料成分の分離が良好となる。この場合、カバープレートの中心から少しずれた位置に試料が位置するカバープレートを配置し、カバープレートが斜めになるようにするとよい。また、配置されたカバープレートとプレートとの最大隙間が１ｍｍ以下、好ましくは０．１〜０．８ｍｍの範囲に入るように試料の厚さを調整することで、毛細現象を確実に利用することができる。

なお、ここで用いられるカバープレートとしては、試料溶液が接する面が平坦なものであれば特定のものに限定されないが、透明で試料の様子や試料溶液の挙動が観察できるものが望ましい。例えば、光学顕微鏡観察に用いられるカバーグラスが好適に用いられる。大きさは、プレートよりも小さいものが取り扱い上の面から好適である。また、カバープレートには加工が施されていても構わない。例えば、カバープレートの種類やコーティングを変化させてやることで、その後の試料溶液の移動速度を変化させることができる。

溶媒を導入する際には、カバープレートとプレートの間の最大隙間の部位付近から０．１〜１ｍｍくらい離れたプレート上に、シリンジから溶媒を滴下することによって、容易に溶媒を導入することができる。好ましくは、シリンジの先端をプレート面から０．３〜１．１ｍｍ程度上部に配置し、シリンジ押し出し部にスプリング等を入れゆっくり一滴ずつ滴下できるようにする。この状態で滴下すると、プレート上に落ちた溶媒の液滴は、プレートとカバープレートのすき間の中に毛管現象によって吸い込まれていく。吸い込まれた液滴はカバープレートの下に留まる。好ましくは、滴下する液滴の数を順次増やしていき、試料が溶媒に浸るような状態にする。そして、カバープレート全体に溶媒が行きわたるようにした後に、滴下を終了する。

この状態で放置しておくと、溶媒は、カバープレートとプレート間の隙間が最も大きいところから、その対面方向に向かって押されながら移動し、同時にカバープレートの周縁部から気化していくのが観察される。その間に試料から溶出した成分が溶媒中をマランゴニ効果等によって移動し、最終的にカバープレート周縁部に析出していく。なお、溶媒に十分溶解しない成分は小さな粒子となって拡散していく場合があるが、その粒子のほとんどはカバープレート直下に留まる。

溶媒がすべて気化した状態でカバープレートをはずして析出成分を顕微鏡等で観察すると、例えば、滴状のものや被膜状のもの、又は滴状でもその大きさが異なるものなど、析出形態が異なるものが異なる部位に観察される。或いは、色が異なるものがプレート上の異なる部位に観察される。すなわち、プレート上において、カバープレートの周縁部の異なる部位に、試料成分が分離した状態で析出する。

なお、ここで用いられる溶媒としてはエタノール、メタノール、アセトン、ヘキサンなどの有機溶媒のほかに水が好適に用いられる。これらを混合してもよい。

これらのプレート上の異なる部分に分離して析出した試料成分のそれぞれについて、プレート上で析出した状態のまま顕微赤外やラマン分光などのマイクロプローブで分析すると、それぞれの分離した試料成分がどのような化学構造であるかを判別することができる。また、電子線マイクロアナライザーを用いたり、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）で分析したりした場合には、無機元素を中心とした個々の分離した成分にどのような元素が混在しているかを判定することができる。一方、飛行時間型のイオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）は表面の数ｎｍ程度の深さの有機成分や塩をｐｐｍレベルの高感度でフラグメントとして分析できる手法であるが、この分析手法を用いてプレート上で分離した試料成分の分析を行うこともできる。

このように、本発明の試料成分の分離方法を用いることで、同一試料に対して数種類の分析手法を組み合わせて適用でき、微量成分の化学構造解析や定性分析を極めて効率的に行うことができる。

上記で説明した本発明の試料成分の分離方法及び分析方法の一実施例について、分離方法の概念図を図１（ａ）に、分析方法の概念図を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）においては、プレート１の上に置かれた試料２の上にカバープレート３が載置され、プレート１とカバープレート３の隙間に溶媒４が導入された直後の様子が示されている。図１（ｂ）においては、カバープレート３を取り外した後に、プレート１上に析出した試料成分５を分光学的分析プローブ６で分析する様子が示されている。

なお、上記のようにプレートとカバープレートの隙間に試料を配置し溶媒を導入する代わりに、予め試料中の可溶成分を溶媒抽出して調製した試料溶液をプレートとカバープレートの隙間に導入しても上記と同様に試料成分を分離し、分析することができる。この場合は、不溶成分の割合が多い試料であっても、効率よく試料成分の分離、分析を行うことができる。

また、予め調製した試料溶液をプレートとカバープレートの隙間に導入する場合には、例えば、プレート上にスペーサを配置し、このスペーサの上にカバープレートを載置することでカバープレートに傾斜をつけ、プレートとカバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して試料溶液を導入するようにしてもよい。このようにすることで、試料成分の分離が良好となる。

つぎに、図２を参照しながら、本発明の試料成分の分離方法及び分析方法を行うための装置の構成例について説明する。

装置の前面を表す図２（ａ）、側面を表す図２（ｂ）において、１はプレートであり、試料２とカバープレート３が載置される。４は溶媒滴下用シリンジであり、プレート１とカバープレート３の最大隙間へ１滴ずつ溶媒を導入できるように配置されている。プレート１はステージ５上にエアーチャック６により固定されている。７はエアーチャック用ポンプである。また、ステージ５は、プレート１の位置をそれぞれＸ，Ｙ，Ｚ軸方向に移動させて微調整できるように、Ｘステージ８、Ｙステージ９、Ｚステージ10を備えている。

11はＣＣＤカメラであり、パーソナルコンピュータ12に接続している。そして、パーソナルコンピュータ12のディスプレイにＣＣＤカメラ11で撮影されたプレート１上の画像が映し出させるようになっている。13はプレート１上に照明光を照射する照射光源であり、14はプレート１とカバープレート３の隙間と溶媒滴下用シリンジ４の針先の位置関係を観察するための観察用望遠鏡である。

このように、この装置では、ＣＣＤカメラ11で撮影された画像と観察用望遠鏡14からの像を確認しながら、Ｘステージ８、Ｙステージ９、Ｚステージ10でプレート１の位置を調整して、溶媒滴下用シリンジ11から溶媒を滴下することで、プレート１とカバープレート３の最大隙間から簡便かつ確実に溶媒を導入できるように構成されている。

以下、より具体的に本発明の試料成分の分離方法及び分析方法について説明する。なお、本発明は種々の変形実施が可能であり、以下の実施例に限定されるものではない。

健康補助食品として市販されているカプセル状の「ブルーベリーエキス」を割ると、中から粘度の高い液状物が出てきた。その様子を図３に示す。この液状物を試料とし、図２に示す構成の装置を用いて、分離操作を行った。

表面に金を蒸着したシリコンウエハーからなるプレート上に試料を直径０．５ｍｍ程度の大きさに取り分け、放置して固めた。その様子を図４に示す。この試料の上にカバープレートとしてカバーガラスを傾斜した状態で載置した。そして、プレートとカバーガラスの最大隙間の部位付近から０．５ｍｍくらい離れたプレート上に、シリンジからエタノールを滴下した。このとき、シリンジの先端をプレート面から０．７ｍｍ程度上部に配置した。そして、カバープレート全体に溶媒が行きわたった時点で滴下を終了した。

その後、溶媒はカバープレートの周縁部から気化し、カバーガラス周縁部に試料成分が析出した。このとき、カバーガラス周縁部の異なる位置には、異なる形態の析出物が見られた。プレート上に析出した構成物のうち、特徴的な３箇所の写真を図５に示す。

そして、プレート上の析出物をプレート上に析出した状態のまま、マイクロプローブを用いて分析した。

図６に、プレート上の異なった位置に析出した成分を、赤外分光分析した結果を示す。不飽和度の違う２種のトリグリセリドが検出された。商品の成分表示から、マツの実油及びミツロウであると考えられた。また、紫色に着色した部分を分析したところ、アントシアニンとグリセリンが認められた。

図７に、ラマン分光分析を行った結果を示す。マツの実油の部分からカロテノイドが検出された。また、紫色に着色した部分を分析したところ、アントシアニンとグリセリンが認められた。

また、蛍光Ｘ線分析を行ったところ、アントシアニンが含まれる部位から鉄元素が検出された。カロテノイドが認められた部位には塩素が存在しており、他にカリウムとビタミンＢ₁由来と思われる硫黄が検出された。

以上より、本発明の試料成分の分離方法及び分析方法によれば、商品の成分表示にあるほぼすべての主要成分を検出できることが確認された。

本発明の試料成分の分離方法及び分析方法の一実施例を示す概念図である。 本発明の試料成分の分離方法及び分析方法を行うための装置の構成例を示す模式図である。 実施例１において用いた試料の写真である。 実施例１における固化させた試料の写真である。 実施例１におけるプレート上の析出物の写真である。 実施例１における赤外吸収スペクトルのチャートである。 実施例１におけるラマン散乱スペクトルのチャートである。

Claims (8)

1. プレートとカバープレートの隙間に配置した試料溶液の溶媒を気化させ、前記カバープレートの周縁部に試料成分を析出させることを特徴とする試料成分の分離方法。
2. 前記試料溶液は、前記プレートと前記カバープレートの隙間に試料を配置し溶媒を導入して得られたものであることを特徴とする請求項１記載の試料成分の分離方法。
3. 前記カバープレートの一端側から前記溶媒を導入することを特徴とする請求項２記載の試料成分の分離方法。
4. 前記プレート上に配置した前記試料の上に前記カバープレートを載置することで前記カバープレートに傾斜をつけ、前記プレートと前記カバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して前記溶媒を導入することを特徴とする請求項３記載の試料成分の分離方法。
5. 前記試料溶液は、予め調製したものを前記プレートと前記カバープレートの隙間に導入したものであることを特徴とする請求項１記載の試料成分の分離方法。
6. 前記カバープレートの一端側から前記試料溶液を導入することを特徴とする請求項５記載の試料成分の分離方法。
7. 前記プレート上に配置したスペーサの上に前記カバープレートを載置することで前記カバープレートに傾斜をつけ、前記プレートと前記カバープレートの最大隙間付近から毛細現象を利用して前記試料溶液を導入することを特徴とする請求項６記載の試料成分の分離方法。
8. 前記請求項１〜７のいずれか１項記載の試料成分の分離方法を用いて前記カバープレートの周縁部に析出させた試料成分を、前記プレート上で析出した状態のままマイクロプローブを使用して分析することを特徴とする試料成分の分析方法。