JP5093965B2 - 骨粗鬆症治療用Ｒｈｉｚｏｍａ Ｄｒｙｎａｒｉａｅエキス及びその抽出法 - Google Patents

Description

本発明はRhizoma Drynariaeエキス（Extract）（RDE）、より詳しくは、骨粗鬆症治療用RDE、およびその製造方法および骨粗鬆症治療における用途に関する。本発明はまた、エキスによって骨粗鬆症を治療する方法に関する。

Rhizoma DrynariaeはDrynaria fortunei（Kunze）J.SmまたはD. baronii（Chist）Dielsの根茎(rhizome)であり、それは骨折の治療に長年使用されている（中薬大辞典(Zhong Yao Da Ci Dian)（伝統的な中国医学についての辞典(Lexicon of Traditional Chinese Medicine)）、1658〜1660頁、上海人民出版社、上海、1979）。Ma Ke-Chang他はラット骨粗鬆症モデルに対するRhizoma Drynariaeの影響を研究し、結果はRhizoma Drynariaeエキスがグルチコルチコイド誘発骨損失を部分的に抑えることを示していた（Ma Ke-Chang他、中医整骨(Zhong Yi Zheng Gu)（接骨(Bone Setting)）1992, 4, 3）、しかし、そこでの活性成分はわかっていない。更に、Zhou Tong-Shui他は骨の負傷を治療するためのRhizoma Drynariaeの有効成分がナリンギン(naringin)およびその類似体であると報告した（Zhou Tong-Shui他、中草薬(Zhong Cao Yao)（中国の本草薬(Chinese Herbal Medicine)）1994, 25, 249）。そして彼らはRhizoma Drynariaeの生草(crude plant)で分析も行った（Zhou Tong-Shui他、中草薬科大学学報(Zhong Guo Yao Ke Da Xue Xue Bao)（中国薬科大学の雑誌）1996, 27, (9), 540）、しかし、彼らは上記活性成分とそれの骨粗鬆症への効果との間の関係を示さなかった。

Wu Ying-Pi他は、ナリンギンの単一成分だけを得ることを目的に、Citrus grandis Osbeck var. tomentosa Hortからナリンギンを抽出するための方法を開示した（Wu Ying-Pi他、中草薬(Zhong Cao Yao), 1988, 19, 452）。従って、かかる方法は他の医薬材料に適用できるかどうかはわからない。

本発明の目的は骨粗鬆症の治療に利用可能である、Rhizoma Drynariaeエキス（以後、RDEとも称する）を提供することである。

本発明の他の目的はRDEを含む組成物およびそれの骨粗鬆症治療のための用途を提供することである。

別の目的はRDEの製造方法を提供することである。

本発明の更なる目的は骨粗鬆症治療用のナリンギンを含む組成物およびその組成物による骨粗鬆症治療方法を提供することである。

本発明の技術的態様は次の通りである：

１．エキスの重量に対する全フラボノイドの含有率が30%以上であり、かつそれのナリンギンの含有率が全フラボノイドの重量に対して30%以上100%未満である、Rhizoma Drynariaeからのエキス。

２．全フラボノイドの含有率が50%以上である、１のエキス。

３．ナリンギンの含有率が90%以下である、２のエキス。

４．エキス１を含む医薬組成物。

５．骨粗鬆症の治療に使用される、４の組成物。

６．骨粗鬆症治療用医薬品の製造における、エキス１の使用。

７．骨粗鬆症を治療するための、エキス１の使用。

８．
１）Rhizoma Drynariaeを水、アルコールまたはそれらの混合物によって抽出し；
２）抽出物(extractant)を樹脂によって吸着させ；そして
３）抽出物を吸収している樹脂を、水、アルコールまたはそれらの混合物によって溶離させる
ことを含む、エキス１の製法。

９．抽出が水によって行われる、８の製法。

１０．抽出がアルコール／水混合物によって行われる、８の製法。

１１．アルコール／水混合物中のアルコール含分が40〜90%(w/w)である、８または１０の製法。

１２．アルコールがメタノールおよびエタノールから選ばれる、８、１０または１１の製法。

１３．アルコールがエタノールである、１２の製法。

１４．樹脂がマクロポア(macropore)の吸着用樹脂である、１３の製法。

１５．前記樹脂が、抽出物の吸着後に、アルコールまたはアルコール／水混合物による溶離(elution)の前に、水で洗浄される、８または１４の製法。

１６．抽出がアルコール／水混合物によって行われる、１５の製法。

１７．アルコール／水混合物中のアルコールの含分が40〜90%(w/w)である、１５または１６の製法。

１８．アルコールがメタノールおよびエタノールから選ばれる、１５、１６または１７の製法。

１９．アルコールがエタノールである、１８の製法。

（発明の詳細）
本発明についての以下の記述においては、パーセントは特に指定されていない限り重量パーセントを表わす。

本発明においては、Rhizoma Drynariaeは、ウラボシ科Polypodiaceae S.F.Gary、ハマカウラボシ属Drynaria（Bory）J.Smからの植物、たとえばDrynaria fortunei（Kunze）J.Sm、D. baronii（Chist）Diels、D. sinica Diels、およびD. Delavayi Chirst、他、またはシノブ属Davallia SmからのDavallia mariesii Moore ex Bak、等々、からの根茎または全草(total plant)であってもよい。本発明においては、Rhizoma Drynariaeとして使用される植物は単一種または上記の通り複数種の混合物からであってもよく、そして限定されない。

本発明者らは集中的な研究を行って、Rhizoma Drynariaeからの特殊エキスまたは単一化合物ナリンギンが骨粗鬆症改善の活性を有することを解明した。骨粗鬆症に対して活性を有するエキスの中では、全フラボノイドの含有率は常に30%より大きく、そしてフラボノイド中のナリンギンの含有率は30%より大きい。化合物ナリンギン自体も骨粗鬆症改善の活性を有するが、その効率は上記の活性エキスより低い。

本発明においては、RDEの中に含有される全フラボノイドは30%（重量%）以上、好ましくは、40%以上、より好ましくは、45%以上、そして最も好ましくは、50%以上、である。30%から100%までの範囲にあることができる。全フラボノイドの含有率についての上限は存在しないけれども、プロセスとコストの選択の釣合いを考慮すると、全フラボノイドの含有率が50%以上である限りは、本発明の目的は十分に達成できる。含有率が90%より高い場合には、それはコストがより高くなるばかりでなく、特別の手順も必要となる。従って、最も好ましい全フラボノイド含有率は50%〜90%の範囲である。

本方法によれば、本発明のRDEはポリフェノール化合物も含む。骨粗鬆症に対するポリフェノール化合物についての証拠は存在しないが、本発明のエキスは好ましいことにポリフェノールを含有してもよく、ポリフェノールが抗酸化の活性を有するので、ポリフェノール化合物は本エキスを製剤に使用する場合の助けとなる。ポリフェノールの含有率は様々なプロセスに依存して変動するであろうが、含有率は通常10%〜50%の範囲である。

本発明においては、ナリンギン含有率は全フラボノイドに対して、30%以上、好ましくは40%以上、そして最も好ましくは、50%以上、であるべきであるが、ナリンギンは全フラボノイドの唯一のフラボノイドであるべきではなく、好ましくは、90%以下、そしてより好ましくは80%以下、であるべきである。

本発明者らはRhizoma Drynariae（上記定義通り）の含フラボノイドエキスを抽出した。実験および臨床試験の結果は本発明の方法によって製造されたRhizoma Drynariaeエキスが骨粗鬆症に対して信頼性のある効果を有することを示した。

本エキスの抗骨粗鬆症の活性がナリンギンだけに起因するのではなく、ナリンギンとの相乗効果を有するであろう幾つかのその他成分にも起因しているということはどの既知理論によっても証明されてはいないが、妥当性がある。本発明の限定下では、かかる成分はナリンギンと一緒に存在し、そして抗骨粗鬆症の活性を示す。

Rhizoma Drynariaeエキスの製法は以下に説明する。

代表的な製法は次の工程を含む：
[生薬粉砕(crude drug pulverizing)]→水／アルコール煎出(decoction)→樹脂吸着→（水洗）→アルコール／水溶離→後加工(post procession)

この方法の中で、Rhizoma Drynariaeを粉砕する手法は当業者には普通のプロセスであり、そして制限されない。粉末の粒状度が粗すぎると、活性成分は十分に抽出されない；粒状度が細かすぎると、煎出後の抽出溶液の分離が困難であろう。このようなことは当業者の経験によって容易に決定することができ、そして制限されないであろう。

有効成分を抽出するためには、水および／またはアルコールによる浸漬抽出(soaking extraction)が採用されてもよい。しかしながら、有効成分は完全には浸出されないであろうので、加熱抽出(heat extraction)が好ましく、加熱温度は室温から抽出用溶剤の沸点までの範囲であろう。

加熱抽出における温度は抽出用溶剤の沸点（還流）で好ましく行われる。

生薬が水によって抽出される場合には、抽出は100℃で0.5〜3時間行われ、そして2〜4回繰り返され、その間の、水の容量は毎回、生薬の重量の5〜20倍である。抽出がアルコールまたはアルコール水溶液によって還流温度で行われる場合には、生薬は0.5〜3時間で抽出されそして2〜4回繰り返され、その間の、溶剤の容量は毎回、生薬の重量の5〜20倍である。アルコールはメタノールまたはエタノールであり、そしてエタノールが安全性の観点から好ましい。採用されたときには、エタノールの濃度は好ましくは20〜90%の範囲にある。そして、上記のデータは全てが単なる参考である。それは当業者の経験に基づいて変更可能であり、そしてかかる変更は本発明の範囲を越えないことが理解されるはずである。

望むならば、得られた抽出物はまず濾過され、それから樹脂によって吸着されてもよく、その樹脂はマクロポアの吸着用樹脂、たとえば、D₁₀₁樹脂（天津の南海大学樹脂工場によって製造された）、AB-8樹脂（天津ボーン−ゲル(Bone-gel）工場によって製造された）、WLD樹脂（四川省(Sichuan Province)の中医学研究所(Chinese Traditional Medicine Institute)によって製造された）、およびCAD-40樹脂（Huabei製薬(Huabei Pharmaceuticals)によって製造された）、など、であってもよい。本発明の方法は樹脂のモデルによって制限されない。樹脂吸着の詳細はCN1072089Aに記載されており、そして本発明において参照することによってその一部として組み込まれる。

本発明者らの探求によれば、WLD樹脂は上記樹脂の中で最も高い吸着能力を有し、そして溶離されるのにより容易である。それで、吸着剤としてWLD樹脂を使用することが好ましい。樹脂対生薬の量の比は0.5〜2：1（w/w）の範囲であり、好ましくは0.5〜1.5：1、最も好ましくは約1：1であり、それは当業者によって十分に決定できる。比が0.5：1より小さい場合には、不完全に吸着することになろう。それが1.5：1より大きいときには、吸着フラボノイドがそれほど増えないので、経済的不利益を生じるであろう。

吸着用樹脂を使用する場合には、この分野の常識によれば、樹脂は使用前に既知の方法によって前処理されるべきであり、たとえば、樹脂は下記のように前処理される：
カラムに樹脂を充填し、
カラムをエタノール−濃塩酸（1：1）で洗浄することを、流出液が等容積の水で希釈されたときに明澄になるまで、行い、それから、
カラムを、樹脂カラムの体積の10倍の温水（約80℃）でフラッシュし、その後で、
カラムを、樹脂カラムと等体積の2%水酸化ナトリウムで洗浄し、そして最後に
水で洗浄することを、流出液が中性になるまで、行う。

次いで、樹脂をゆるめる(loose)ために水で逆さ洗浄し(reverse-rinsed)、それから、溶離すべき溶液を装填する。

吸収中に、流量は完全吸着を確保するようにコントロールされるべきである。一般に、大規模製造時には、100kgの樹脂を充填されたカラム（φ360mm）が使用される一方で、流量が10〜20 L-min^-1に調節されれば吸着は完全であることが確保されるであろう。かかる場合に、流量が20 L-min^-1より大きくなると、完全に吸着することが難しくなり、収率が低下するであろう；10 L-min^-1より小さくなると、生産性を増大させるのに不利である。

吸着後、樹脂はエタノールやメタノールのようなアルコールによって溶離されてもよく、エタノールが健康の観点から好ましい。エタノールが使用される場合には、その濃度は好ましくは50〜95%であり、そして最も好ましくはエタノールの再利用化を考慮すると70%（±約5%であってよい）である。

溶離する間、生薬に対するアルコールの量の比率は2〜10の範囲にあるであろう。比率が2より小さくなると、溶離は不完全であり、10より大きくなると、溶離成分が更には増加しないであろうから経済的に不利である。製造業の観点から、2〜5倍が好ましい。

溶離後、溶出物は集められそして再利用のためのエタノールの除去後に濃縮される。最後に、噴霧乾燥、凍結乾燥または通常乾燥および粉砕を経て褐色または琥珀色の粉末が得られる。粉末は精製されて又は直接に適切な調製物たとえばカプセル、ピル、錠剤、顆粒剤、溶液または注射剤の中に充填されることができる。

残留物の相対密度は噴霧乾燥前に1.10〜1.18に調節され、そして減圧乾燥前には1.3〜1.4に調節される。乾燥後、生成物は更なる加工を容易にするために微細粉末に粉砕されてもよい。噴霧乾燥および減圧乾燥は通例の乾燥技術であり、そして制限されない。

上記のように本発明のRhizoma Drynariaeエキスは通例の調製手順によって、カプセル、ピル、錠剤、顆粒剤、溶液または注射剤のような臨床用途に適するどの製剤に調製されてもよい。製剤の各タイプの投与量は処方物の組成、患者の状態、および臨床条件に依存して変動するであろう。一般に、RDE中の全フラボノイド含有率が50%である場合には、経口投与量は患者当り1〜4回で0.5〜5.0g／日であってもよい。

本発明のRhizoma Drynariaeエキスは骨粗鬆症改善に顕著な活性を有する。下記実施例は本発明を例証するために提供されており、どのようにも本発明を制限するものではない。

（実施例）
RDE中のフラボノイドはホウ水素化カリウム（KBH₄）呈色反応によって定性識別される。そして溶離終点は薄層クロマトグラフィー（TLC）によって決定される。そして全フラボノイドの定量分析には紫外（UV）分光分析が適用される。ナリンギンを定量分析するには高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）が適用される。

ホウ水素化カリウム呈色反応：
約5 mLのサンプル溶液を含有する試験管にKBH₄（約5mg）を添加し、そして振盪し、その中に数滴の塩酸を添加して鮮紅色(cherry red)または赤味がかった紫色(fuchsia)の外観を見せれば、ジヒドロフラボノイドの存在（感度55μg/mL）を示す。そうでなくて、鮮紅色または赤味がかった紫色を見せなければ、それは陰性である。

TLC：
対照溶液としては、メタノール中の0.5mg/mLの濃度のナリンギン標準が使用される。中国薬局方(Pharmacopoeia Sinica)（1995）付録VI Bに従ってのTIC法に基づいて、対照溶液および試験溶液の各4μLが一つのシリカゲル−Gプレートの上に適用され、その後にベンゼン−酢酸エチル−ギ酸−水（1：12：2.5：3）の混合液の上層によって溶離される。溶離後、プレートを取り出しそして自然乾燥し、塩化アルミニウム（AlCl₃）溶液を吹き付け、そして最後に365nmのUV光の下で測定する。試験サンプルはプレートの対応部位においては対照の色と同じ色の蛍光しみを示す。

全フラボノイドのUV分光測光定量分析：
この分析は中国薬局方（1995）付録V AにおけるUV分光測光法に基づく。

対照溶液の調製: 105℃で恒量になるまで乾燥した10mgのヘスペリジン(Hesperidin)標準を正確に秤量し、そしてメスフラスコ（100mL）内のメタノール（100mL）の中に溶解する（最終濃度: 0.1mg/mL）。

標準曲線: 0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、および5.00mLの標準溶液を正確にピペットで計り取り、そして、それぞれ25mLの体積になるまでメタノールで希釈する。ブランク対照としてメタノールを使用する。UV検出を付録V Aに従って行い、そして吸光度を284±1 nmで測定する。濃度をX軸にそして吸光度をY軸して較正曲線(calibration curve)をプロットする。

試料溶液調製: 正確に秤量された試験試料（0.25g）を三角フラスコの中でメタノール（50mL）の中に溶解し、30分間超音波抽出し、そして冷却後にメスフラスコ（100mL）に移す。そして三角フラスコをメタノールで洗浄し、そして洗液もメスフラスコに移す。そして、この溶液をメタノールで100mLに希釈し、それから濾過する。次いで濾液を集め、そして正確に1mLの体積の濾液をクロマトグラフカラム（60メッシュの篩を通過した0.5gのポリアミドが固定相として充填されている）に適用する。それから、カラムをメタノールによって約0.4mL／分の流量で溶離する。約25mLの溶出液を集め、そしてメタノールで100mLの体積に希釈する。

測定: 中国薬局方（1995）付録V Aに示されたUV分光測定法に従って、試料溶液の吸光度を検出し、それから標準曲線から全フラボノイド濃度を読み取る。

機器および試薬: 紫外線分光分析、モデルUV-260（日本の島津製作所）、ヘスペリジン標準（国立医薬バイオ製品管理研究所(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products)から）。

ナリンギンのHPLC測定
この試験は中国薬局方（1995）付録VI DのHPLC法に基づいている。

クロマトグラフィー条件: 固定相としてC-18−アルキルシラン結合シリカゲルを使用し、移動相としてメタノール−36%酢酸−水の混合液（35：4：65）を使用して、283mmの波長を検出する。理論段数はナリンギンのピークから算出され、そして3000以上であるべきである。

対照溶液の調製: 105℃で恒重になるまで乾燥されたナリンギン標準を正確に秤量し、そしてメタノールの中に溶解し、そしてメタノールで希釈して最終濃度50μg/mLにする。

試料溶液の調製: 生成物（約0.2g）を正確に秤量し、そして150mLの三角フラスコに入れ、そこに60mLのメタノールを加える。30分間の超音波抽出後、溶液を取り出し、そして室温に冷却する。その後、試料溶液を100mL容量ボトルの中に移す。三角フラスコをメタノールで洗浄し、そしてメタノールをボトルの中に入れて合わせる。この得られた溶液をメタノールで100mLまで希釈し、振盪して均一にし、そして濾過する。次いで、濾液を集め、ピペットで2mLの濾液を正確に計り取り25ｍL容量ボトルに入れ、そしてその容量までメタノールで希釈して試料溶液を得る。

測定: 対照溶液（10μL）および試料溶液（10μL）をそれぞれ分析のためにHPLCシステムの中に注入する。

機器および試薬: HPLC: LC-6A（日本の島津製作所）；UV検出器: SPD-6AV；データプロセッサー（C-R4A）、データ記録計の鋭敏度(sensibility)0.16AUFS；クロマトグラフカラム: シムパック(Shimpack)C₁₈カラム（CLC-ODS 150×6.0 mm内径、5μm）；保護カラム: YMG C₁₈カラム（10×4.6 mm内径、10μm）；スーパー遠心機(supercentrifuge): TGL-16G（上海医療分析機器工場(Shanghai Medical Analytical Instruments Factory)）；超音波洗浄機: SB 3200（上海Bi'nengxin超音波カンパニー・リミテッド）。

ナリンギンの標準は国立医薬バイオ製品管理研究所から得られる。上記スペクトル条件下では、本標準の中に含有されたナリンギンは規格化された方法によって98%より大きいと算出されている（図１参照）。本実験条件下では、ナリンギンのピークは約15.26分の保持時間で現われる。

実施例に使用された試薬および溶剤は全て、分析上純粋な等級である。水は二重に蒸留されている。

100gのRhizoma Drynariaeを粉砕しそして1500mLの水の中で1時間煎じ、抽出物を取り出し、そして追加の1000mLの水を加えて再度煎じた。この２つの煎じ液を合わせ、そして濾過した。濾液を、120gのWLD樹脂を充填した予め処理したカラム（φ30mm）に4mL／分の流量で適用し、そして流出液収集の終点はKBH₄呈色反応によって決定された、すなわち、ジヒドロフラボノンの突然出現は流出液−樹脂における吸着の飽和を示した。吸着後、カラムを500mLの水で洗浄し、そして洗液は再循環させなかった。溶離は400mLの70%エタノールを用いて行われた。溶離の始点と終点はKBH₄呈色試験によって決定され、溶出液が集められ、そしてエタノールが再循環させられた。残留物を水浴上で蒸発させて粘稠ペーストにし、それを減圧乾燥して約1.88gのエキスを生じた。こうして得られたRDEはUV分光分析によって検出された55.08%の全フラボノイド含有率およびHPLCによって測定された36.6%（すなわち、ゼンフラボノイドの66.4%）のナリンギン含有率を有していた。

図２はRDE、ナリンギン、およびブランク対照の各溶液のUVスペクトルを示す（X軸は波長；Y軸は吸光度；１はナリンギン標準；２は本エキス；３はブランク）。UVスペクトルから、RDEとナリンギンとでは大きな差が観察できる。RDEは200nm付近に吸収ピークを有するが、ナリンギンはその波長ではショルダーピークを有するだけである。そして、最大吸収波長にも差がある。

エキスの高性能液体クロマトグラムは図３に示されており、そこでは、エキスの中に同時に存在する少なくとも一つの未知化合物がある（X軸は保持時間；Y軸は積分強度）。

還流および溶離用の溶剤に70%エタノールが使用されたこと以外は実施例１と同じようにした。1.69gのエキスが得られ、そこでは、全フラボノイド含有率が53.12%であった、そしてナリンギンはHPLCによって測定された32.5%である（全フラボノイドの61.2%）。

異なるプロセスによって抽出された幾つかの抽出溶液についてのTLCの比較は図４に示されており、そこでは、左側から右側へ、実施例１の抽出物およびエキス、本実施例の抽出物およびエキス、およびナリンギン、のクロマトグラムである。結果から、本発明者らはエキスが水またはアルコールによって無理なく実質的に同じに抽出されるということを理解できる。

WLD樹脂の代わりにAB-8樹脂が使用されたこと以外は実施例１と同じようにした。0.95gのエキスが、61.80%の全フラボノイド含有率をもって、得られた。図５は実施例３のエキスのHPLCを示す。

WLD樹脂の代わりにD₁₀₁樹脂が使用されたこと以外は実施例１と同じようにした。1.07gのエキスが、57.35%の全フラボノイド含有率をもって、得られた。図６は実施例４におけるエキスのHPLCを示す。

図３、４および５から、本発明者らは、吸着剤として様々なタイプの樹脂を使用したのにエキス中のフラボノイドの組成および含有比が概して同じであるということを理解できる。

10gのRhizoma Drynariae粉末が毎度使用されそしてそれぞれ5g、10g、20gおよび25gの樹脂が使用されたこと以外は、実施例１と同じようにした。それに応じて、0.16g、0.20g、0.27gおよび0.27gのエキスが得られたが、そこでの、全フラボノイド含有率はそれぞれ、53.88%、52.29%、42.65%および41.88%である。全フラボノイドの収量はそれぞれ、86.2mg、104.6mg、115.2mgおよび113.1mgであった、そして全フラボノイド比率はそれぞれ、0.86%、1.05%、1.15%および1.13%である。上記データは生薬対樹脂の重量比が1：2より大きいときには同じ量の生薬から抽出される全体のフラボノイドが殆ど増加しないということを示しており、それは樹脂が生薬の量の2倍であるときに吸着が完全であることを意味している。生薬対樹脂の重量比が1：1であるときには、吸着物の中の全フラボノイドは相対的により高い: エキスは完全吸着の90.8%の量を有し、全フラボノイド含有率が52.29%である。従って、約1：1の生薬対樹脂の比が好ましい。

40gの粉砕Rhizoma Drynariaeを1000mLの水で1時間煎出し（とろ火）、そして煎出物を濾過し、そして4等分した。4本のガラスカラム（φ20mm）に、予め処理したWLDマクロポア吸着用樹脂（10g）を充填した。煎出物の各部分をそれぞれ一つのカラムに、2mL／分、4mL／分、8mL／分および16mL／分の異なる流量で適用し、そして流出液の中にフラボノイドグリコシドが存在するか否かを試験するためにKBH₄呈色反応を適用した。結果は第１表に示されている。

流量のコントロールは完全吸着を確実にすると結論付けることができる。

300gの原料粉砕Rhizoma Drynariaeを実施例１と同じやり方で処理して濾液を得た。そして濾液を3等分し、各々をカラム（φ40mm、100gのWLD樹脂を充填）に適用し、それから異なる濃度のエタノールで溶離させた。溶出液を濃縮し、そして乾燥し、全フラボノイド含量をUV分光分析によって測定した。結果は第２表に示されている。

エタノールの濃度が溶離の効果に影響し約70%の濃度が好ましいということを結論付けることができる。

Rhizoma Drynariae（500g）の原料粉末を実施例１と同じやり方で処理して濾液を得た、次いで濾液をカラムに適用する（生薬対樹脂の重量比は1：1）。吸着後、樹脂を70%エタノールで生薬の1×、2×、3×、5×、7×および10×量（v/w）の容量にて溶離させ、溶出液を別々に集めた、そこからのエタノールは再循環された。次いで、別々に、全フラボノイドを測定した。結果は10倍量のエタノールによる溶離のときに溶離が完全であることを示しており、それは第３表に示されている。

第３表における結果は十分な量のエタノール（10倍）によって溶離されたときには全フラボノイドが完全に溶離されることができるということを示している。エタノールの量がRDの5倍であるときには、そこからの全フラボノイドは全フラボノイドの98%になる。

製剤例１、カプセル
実施例１と同じやり方で得たRDEの粉末180gに、70gの澱粉を加えた。この２つの成分を十分に混合し、それから1000個のカプセルに充填した。各カプセルは180mgの有効成分を含有している。

製剤例２、錠剤
実施例と同じやり方で得たRDEの粉末180gに、70gの澱粉を加えた。それから、この混合物を少量の水性CMC-Naと混練し、それからペレット化し、通常の仕方で乾燥し、その中には少量のステアリン酸マグネシウムを添加し十分に混合して1000個の錠剤を製造した。各錠剤は180mgの有効成分を含有していた。

製剤例３、注射可能処方物
実施例と同じやり方で得たRDEの粉末180gに、800mLの注射可能な蒸留水を加えた。得られた混合物を加熱して溶解し、それから微孔性濾過膜によって濾過し、4℃〜8℃で24時間貯蔵し、それから再び濾過し、医薬級のHCl水溶液（12N）およびNaOH水溶液（12N）によってpHを6.5にかつ等張(isotonic)に調節し、最後に、注射可能な蒸留水を1000mLになるまで加え、加熱によって滅菌し、そして濾過し、それからアンプルに分けた（アンプル当り5mL）。各アンプルは180mgの有効成分を含有していた。

試験例１．原発性骨粗鬆症(primary osteoporosis)に対する本発明のRDEの臨床試験
別に説明がない限り、次のような投与量および含量の医薬品を使用する。

本発明におけるエキス: 各カプセルが0.18gの有効成分を含有している製剤例１のカプセル。正の対照医薬品: 各カプセルが0.5μgの有効成分を含有しているα−D₃、（イスラエルのTEVA製薬(TEVA PHARMACEUTICALS)によって合成され、米中の、昆明ベーカーノートン製薬(Sino-US Kunming BARKER NORTON PHAMACEUTICA CO., LTD.)によって製造された）。

診断規準: 中国老人医学協会の骨粗鬆症特別委員会(Specialized Committee of Osteoporosis of Chinese Association of Geriatrics)によって確立された診断規準に従っての、原発性骨粗鬆症に対する包括的診断等級。（参照: 骨質疏鬆症(Gu-zhi-shu-song-zheng) [M]、第169〜171頁、LIU Zhonghou編、ケミカル・インダストリアル・プレス、広州、1992）。

上記の診断規準に従って、70症例の骨粗鬆症を無作為に、RDEによる治療グループと、α−D₃による対照グループに分けた。RDEは180mgを経口(per os)で日に3回(tid)、処置の2期間−6ヶ月の間投与される。そしてα−D₃は0.5μgを経口で日に2回(bid)、これも6ヵ月間投与される。

腰椎(lumbar)（L₂〜L₄）および上部大腿骨(top-femur)（大腿骨頚(collum femoris)、大腿骨の三角領域(trigonal area)、大腿骨の転子(trochanteric)）の骨密度をそれぞれ、ダブルエネルギーX線骨密度メーター(Double Energy X-ray Bone Density Meter)（LUNAR DPX-L骨密度計、米国）によってチェックする。単位はg/cm²である。そして、脛骨(tibia)の中央部分の骨密度をチェックするために超音波骨密度計(Ultrasonic Bone Densitometer)（モデル2000-SYS-220、イスラエルのMETRA Co.）を使用する。

２つのグループにおける処置前と処置後の骨密度の比較：
１．腰椎（L₂〜L₄）の、処置前と処置後の骨密度の結果は第４表に示されている：

骨密度は治療グループについては3ヶ月または6ヶ月処置後に増加したが、それは有意差ではない（P＞0.05）。対照グループには改善がない。２つのグループの間にはやはり有意差がない。

２．大腿骨頚の、処置前と処置後の骨密度の結果は第５表に示されている：

治療グループ内で処置後と処置前を比較すると大腿骨頚の骨密度には有意な増加がある（P＜0.05、P＜0.01）。しかし、対照グループ内では有意差がない。

３．大腿骨の三角領域の、処置前と処置後の骨密度の結果は第６表に示されている：

治療グループ内で処置後と処置前を比較すると大腿骨の三角領域の骨密度には有意な増加がある（P＜0.05、P＜0.01）。大腿骨の三角領域の骨密度は3ヵ月処置後では有意差なしで増加した（P＞0.05）。そして、やはり、6ヶ月処置後では治療グループと対照グループの間で差がある（P＜0.05）。

４．大腿骨の転子の、処置前と処置後の骨密度の結果は第７表に示されている：

治療グループでは処置前と6ヶ月処置後の間に有意差がある（P＜0.01）。そして、6ヶ月処置後には治療グループと対照グループとの間に有意差がある（P＜0.01）。

５．２つのグループにおける処置前と処置後の超音波骨密度の結果は第８表に示されている：

治療グループの骨密度（超音波）の間の値の差および若者(young adults)と年配者(age matched)のそれらの値の差は有意に増加した（P＜0.01）。そして、スピードサウンド(speed sound)は治療グループ内での自己比較で有意に増加し（P＜0.01）、そして対照グループ内での自己比較でも有意に増加している（P＜0.05）。

試験例２．ラットにおける骨粗鬆症に対するRDEの実験的研究
ラットおけるトレチノイン誘発(Tretinoin-induced)骨粗鬆症および卵巣摘出(Ovariectomized)（OVX）骨粗鬆症の両方のモデル対する本発明のRDEの効果を観察する。

[材料と方法]
１．薬物
RDEは実施例１に従って製造した（エキス1グラム当りは66.67gの生薬に同等である）。RDEは投与前に蒸留水の中に0.47mg/mLの濃度に溶解された。そして投与は胃管(gastric tube)経由で行われた。トレチノインは重慶Huabang製薬(Chongqing Huabang Pharmaceuticals, Ltd.)によって製造されたものであり、そして蒸留水によって1.5%の濃度に懸濁された。対照薬物α−D₃は、イスラエルのTEVA製薬によって製造されたもので、そして使用の前に蒸留水の中に0.03μg/mLの濃度に溶解され、そして胃管経由で経口投与される。

２．実験動物
トレチノイン誘発骨粗鬆症ラット: 60体の雌ウィスター(Wistar)ラット、1.6週齢、平均体重234.85±15.32g。卵巣摘出ラット: 60体の雌ウィスターラット、12週齢、平均体重183.46±12.45g。動物は全て、中国陸軍医科大学校(Chinese Military Medical Academy)の実験動物センターから得た。

３．試薬と機器
骨生体力学レオメーター(Bone Biomechanics Rheometer)は英国のスチーブンス社(Stevens Company)によって製造された（モデルQTS-25）。X線骨密度計は米国ノーランド社(Norland Company)によって製造された（モデルXR-26）。その他のものは全て市場から得られる。

４．用量選択とグループ：
（１）トレチノイン誘発グループ: 60体のラットを無作為に6グループ（10ラット／グループ）に振り分ける。ブランクグループはPSS/d（生理食塩水）だけを受ける対照動物。モデルグループはトレチノインを70mg/kg/dで経口投与される；α−D₃グループはトレチノインとα−D₃の両方をそれぞれ、70mg/kg/dと0.002μg/kg/dで経口投与される；RDE低用量グループはトレチノインとRDEの両方をそれぞれ、70mg/kg/dと54mg/kg/dで経口投与される；RDE中用量グループはトレチノイン70mg/kg/dとRDE 108mg/kg/d；RDE高用量グループはトレチノイン70mg/kg/dとRDE 216mg/kg/d。
（２）卵巣摘出（OVX）ラットグループ: 60体のラットを無作為に6グループ（10ラット／グループ）に振り分ける。ブランクグループは正常ラットである。他の全てのグループは両側の卵巣を切除されている。モデルグループはPSSだけを受けた；α−D₃グループはα−D₃を0.002μg/kg/dで経口投与される；そしてRDEはそれぞれ、低用量、中用量および高用量のRDEグループに対応する、OVXラットに対して54、108、216 mg/kg/日の用量で経口投与される。

６．方法
各動物に投与される用量は各週の最後に記録された個々の体重から算出される。

トレチノイン誘発骨粗鬆症グループ: ブランクグループは実験の間中PSSを与えられた。他のグループは試験第1日目と表示される同じ日に処置を開始され、そしてトレチノインを日に1回、14日間経口投与され、その後にトレチノインの投与を停止された。ブランクグループとモデルグループは両方とも第15日目にPPSを与えられ、そして14日間にわたって経口によって、α−D₃グループはα−D₃を与えられ、RDEグループは対応用量のRDEを与えられる。最終投与は犠牲にされる前の第28日目に与えられる。骨密度と骨生体力学の検査は第29日目に行われる。

OVXラットグループ: ブランクグループとモデルグループは両方とも、同体積の蒸留水を経口によって与えられ、他の全てのグループは上記のやり方に従って12週間の処置を開始され、その後に、実験動物は犠牲にされ、そして骨密度と骨生体力学の検査が行われる。

７．測定
7.1．骨密度測定は各動物の第２〜第４の腰椎(lumbar spines)と右の大腿骨(thighbone)について行われる。

7.2．骨生体力学測定: 各動物の左大腿骨の３点曲げ試験が行われる；生体力学指数を測定するために負荷−変形曲線が記録される。実験パラメーター: スパン20mm、増量速度(loading velocity)10mm／分。骨構造力学パラメーター(bone structural mechanics parameters): 破壊負荷(breaking load)、弾性負荷(elastic load)、最大半径(maximum radius)、弾性半径(elastic radius)、最大エネルギー吸収(maximum energy absorption)；骨材料力学パラメーター(bone material biomechanics parameters): まず大腿骨区分慣性モーメント(Femoral Section Inertial Moment)を計算し、次いで、式に従ってコンピューターで最大ひずみ(maximum strain)、弾性ひずみ(maximum strain)、最大応力(maximum stress)、弾性応力(elastic stress)および弾性率(elastic modulus)を出した。
結果

１．各グループにおけるラットの骨密度（第９表および第１０表）

第９表および第１０表から、RDEグループおよびα−D₃グループの大腿骨骨密度はモデルグループに比べて増加したことが結論付けられる。そして、RDEグループとα−D₃グループの間には大腿骨骨密度の高い度合での有意差がある。

２．各グループにおけるラットの骨生体力学測定
2.1．骨構造力学指標(bone structural mechanics indicators)に対する影響は第１１表および第１２表を参照

上記の第１１表および第１２表から、結果はRDEグループおよびα−D₃グループにおける全ての骨構造力学指標がモデルグループに比べて有意に増加したことを示した。また、RDEグループとα−D₃グループを比較すると全ての骨構造力学指標について高い度合の有意差がある。そして、本発明者らはRDEグループにはいくらかの用量−効果相関を見ることができる。

2.2．骨材料力学指標に対する効果は第１３表および第１４表を参照。

第１３表および第１４表から、結果はRDEが骨粗鬆症モデルラットの骨最大応力、弾性応力、最大ひずみ、弾性ひずみおよび剛性係数(rigidity factor)を高めたことを示した。そしてRDEグループとα−D₃グループを比較するとそれら指標に有意差がある。

上記の結果から、本発明者らは、RDEが骨密度を高め、支持容量(bearing capacity)および耐衝撃容量を向上させて骨構造力学特性を改善し、そしてまた、幾何学的構成および内部物質の特性を改良するのに活性を有するということを見出すことができる。

本発明におけるRDEは骨粗鬆症患者の骨密度を高めるための、骨吸収を明瞭に抑制するための、および骨損失防止の、活性を有する。従って、骨粗鬆症を治療する目的が達成できる。

対照としての標準ナリンギンのHPLCクロマトグラフを示す。 標準ナリンギン、実施例１のエキスの溶液、およびブランク溶液、のUVクロマトグラフを示す。 実施例１のエキスのHPLCクロマトグラフを示す。 様々なプロセスからのエキスの溶液の、TLCクロマトグラフの比較を示す。 実施例３のエキスのHPLCクロマトグラフを示す。 実施例４のエキスのHPLCクロマトグラフを示す。

Claims (17)

1. エキスの重量に対する全フラボノイドの含有率が30%以上であり、かつそれのナリンギンの含有率が全フラボノイドの重量に対して30%以上90%以下である、Rhizoma Drynariaeからのエキス。
2. 全フラボノイドの含有率が50%以上である、請求項１のエキス。
3. 請求項１のエキスを含む医薬組成物。
4. 骨粗鬆症の治療に使用される、請求項３の組成物。
5. 骨粗鬆症治療用医薬品の製造における、請求項１のエキスの使用。
6. １）Rhizoma Drynariaeの、水、アルコールまたはそれらの混合物による抽出；
   ２）抽出物の、樹脂による吸着；そして
   ３）抽出物を吸収している樹脂の、水、アルコールまたはそれらの混合物による溶離
   を含む、請求項１のエキスの製法。
7. 抽出が水によって行われる、請求項６の製法。
8. 抽出がアルコール／水混合物によって行われる、請求項６の製法。
9. アルコール／水混合物中のアルコール含分が40〜90%（重量%）である、請求項６または８の製法。
10. アルコールがメタノールおよびエタノールから選ばれる、請求項６、８または９の製法。
11. アルコールがエタノールである、請求項１０の製法。
12. 樹脂がマクロポアの吸着用樹脂である、請求項１１の製法。
13. 前記樹脂が、抽出物の吸着後に、アルコールまたはアルコール／水混合物による溶離の前に、水で洗浄される、請求項６または１２の製法。
14. 溶離がアルコール／水混合物によって行われる、請求項１３の製法。
15. アルコール／水混合物中のアルコールの含分が40〜90%(w/w)である、請求項１３または１４の製法。
16. アルコールがメタノールおよびエタノールから選ばれる、請求項１３、１４または１５の製法。
17. アルコールがエタノールである、請求項１６の製法。

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