JP5070995B2 - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、対物レンズの焦点面を光軸方向に一定に保持する自動合焦装置を備えた共焦点顕微鏡装置に関する。

顕微鏡の対物レンズをアクチュエータで駆動することで、自動的な合焦制御を実行する自動焦点装置が従来から知られている。この装置では、顕微鏡の対物レンズの焦点位置からのずれを検出し、そのずれの検出信号に応じて圧電素子等のアクチュエータにより対物レンズを移動させ、合焦させている（特許文献１参照）。このような自動焦点装置は、金属顕微鏡など、表面観察を行う場合に観察対象物の表面への自動合焦を可能とするものである。

しかし、生物顕微鏡では、カバーガラスの内側に置かれた細胞等の観察対象物を観察するという特殊性があり、カバーガラスの内側に置かれた細胞等の観察対象物への自動合焦が必要となる。特に、対物レンズとして油浸レンズを使用する場合には、カバーガラスと油との境界で光の反射が起こらず、カバーガラスの表面への合焦が不可能となるため、必須となる。

この要求に対応して、従来技術の第１として、単一ビームの検焦光により細胞などの試料を乗せるカバーガラスの表面または裏面に反射光を生じさせ、所定の光学系を用いて反射光から非点収差を作り出し、非点収差の変化から焦点位置を検出するものがある。

また、従来技術の第２として、検焦ビームを試料に当て、試料の表面での反射光を受光素子近傍のピンホールによる共焦点方式で検出し、反射光の強度から焦点面を検出するものがある。

このような共焦点共焦点顕微鏡装置の先行技術としては下記のような特許文献が知られている。

特開２００２−０６２４８０号公報

第１の従来技術の場合、検焦光の単一ビームがカバーガラスの表面または裏面に集光した場合、すなわち対物レンズの焦点がカバーガラスの表面または裏面に合った場合、非点収差がほぼ０となり、この値が試料観察をする際の対物レンズの位置の基準となる。

しかし、検焦光の焦点がカバーガラス表面または裏面に合った場合、検焦光のビーム径が極小に集光され、ガラス面の状態の影響を受けやすくなる。例えば、前記集光点のガラス面におけるゴミ、傷や試料の存在、面の歪みや傾き場合、非点収差が０ではなく、不安定になり、観察の基準位置が変化してしまう。

第２の従来技術の場合、検焦光の単一ビームを試料面に集光して計測する方式であるため、同様に「不安定」の問題が生じるので、検焦光のスキャン範囲をライン状に広げる方法を用いている。しかし、スキャン範囲が１次元のラインであるため、根本的な解決法ではなく、また、そのために合焦速度が低下するという問題がある。

本発明は上記従来技術の課題を解決するためになされたもので、高い安定性の自動合焦機能を有する共焦点顕微鏡装置を提供することを目的としている。

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
ニポウディスク方式共焦点スキャナと蛍光顕微鏡からなる共焦点顕微鏡装置において、
ニポウディスクのピンホールを通過した複数の照射ビームに対する、試料を保持するカバーガラスの裏面又は表面からの反射光を前記ニポウディスクのピンホール通過後に検出する検出光学系と、
この検出光学系により得られる前記反射光の光量に基づいて、前記蛍光顕微鏡の対物レンズの焦点を前記カバーガラスの裏面又は表面を基準とする合焦位置に合わせる合焦手段とを備えたことを特徴とする。

請求項２記載の発明は、
請求項１記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記反射光の光源として、励起光及びそれによって励起された試料から発生する蛍光よりも波長の長いレーザ光を出力する検焦光源と、
この検焦光源を前記励起光に混合して、前記共焦点スキャナに入射する混合手段と、
を備えたことを特徴とする。

請求項３記載の発明は、
請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記合焦手段は、前記対物レンズの焦点を前記カバーガラスの表面又は裏面から所定量だけ深くすることで、前記対物レンズの焦点を前記合焦位置に位置づけることを特徴とする。

本発明の創薬スクリーニング装置によれば、ニポウディスク方式共焦点スキャナと蛍光顕微鏡からなる共焦点顕微鏡装置において、試料を照射する励起光のうち、前記試料を保持するカバーガラスの裏面又は表面からの反射光をニポウディスクのピンホール通過後に検出する検出光学系と、この検出光学系により得られる前記反射光の光量に基づいて、前記蛍光顕微鏡の対物レンズの焦点を前記カバーガラスの裏面又は表面を基準とする合焦位置に合わせる合焦手段とを備えたことによって、ピンホール通過後の複数の照射ビームによりカバーガラスの裏面又は表面の形状の影響が平均化されるので、高い安定性の自動合焦機能を有する共焦点顕微鏡装置を提供することができる。

以下本発明の実施の形態について図面を用いて詳細に説明する。

図１は本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の一実施例を示す構成ブロック図である。共焦点スキャナ１００は顕微鏡２００に接続されており、レーザ光源２０から出射された平行励起光束Ｌ１ａはマイクロレンズアレイディスク（ＭＬディスクという）３により複数の個別の光束に集光される。分光特性を持つ平板ミラーからなる第１のダイクロイックミラー（ＤＭという）７を透過後、複数の光束のそれぞれが集光してニポウディスク４の個々のピンホールを通過し、顕微鏡２００の対物レンズ８により、ディッシュ、ウェルプレートなどの試料（細胞）保持器（以下保持器と記す）１に載置された試料２の１つに集光され、試料２の蛍光試薬を励起し、試料２から蛍光信号Ｌ２（図１の実線）が発生する。ここで、試料２上の焦点位置で各光束のそれぞれは１点に集光するが、光束全体からなる観測面は所定の広がりを持つ。ＭＬディスク３とニポウディスク４は連結部材５で機械的に連結された状態で、回転中心軸６の周りを回転する。この回転により、複数のピンホールからなる列を通過する光が試料面をスキャンする。

試料２の蛍光試薬が発した蛍光信号Ｌ２は対物レンズ８を通り、ニポウディスク４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号Ｌ２はＤＭ７で反射され、リレーレンズ９及びリレーレンズ１２を介して、カメラ３００上に共焦点光学像が結像される。リレーレンズ９と１２の間にあるバンドパスフィルタ１１は試料２からの蛍光Ｌ２のみを透過し、他の波長の光を遮断する分光特性を持つ。ダイクロイックミラー１０は励起光Ｌ１ａの波長のみを反射し、他の波長の光を透過する分光特性を持つ。

上述の構成では、ニポウディスク４のピンホールが並んでいる平面に対し、試料２上の被観察平面と、カメラ３００の受光面とは互いに光学的に共役な関係に配置してあるので、カメラ３００には試料２の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。したがって、試料２の共焦点画像をカメラ３００の受光面上に形成することができるため、多数の被検査試料をマトリックス上に並べた保持器１を顕微鏡２００と共焦点スキャナ１００に対して相対的に移動させることにより、試料全数の共焦点画像を高速に取り込むことができる。

以下、自動検焦（オートフォーカス）の機構について説明する。励起光束Ｌ１ａ（図１の鎖線）が保持器１の底面にあるカバーガラスに入射したとき、空気とガラスの屈折率の差によって入射光量の４％程度反射される。この励起光の反射光Ｌ１ｂがダイクロイックミラー７に達した時、殆どの部分は透過するが、一部反射される。ダイクロイックミラー７の分光特性の一例を図２のチャートに示す。この例では、励起光に波長４８８ｎｍのレーザを使用し、ダイクロイックミラー７は励起光の９５％を透過し、５％を反射する特性を持つ。

ダイクロイックミラー７によって反射された励起光Ｌ１ｂはリレーレンズ９を通過して、ダイクロイックミラー１０によって反射され、バンドパスフィルタ１３とリレーレンズ１４を通って、受光器１５に入射される。バンドパスフィルタ１３は励起光Ｌ１ｂの波長のみを透過し、他の波長を遮断する特性を持つ。

焦点調整部１６は、受光器１５から出力される検出信号を微分演算し、この微分値を所定の目標値と比較する。制御回路１７は（ＰＩＤ演算などにより）焦点調整部１６から出力される偏差信号に対応する制御信号を出力する。レンズアクチュエータ１８は制御回路１７から出力される信号により制御され、対物レンズ８をＺ方向（光軸方向）に移動させる。

上記において、ダイクロイックミラー１０、バンドパスフィルタ１３、リレーレンズ１４及び受光器１５は、試料２を照射する励起光Ｌ１ａのうち、試料２を保持するカバーガラスの裏面又は表面からの反射光Ｌ１ｂをニポウディスク４のピンホール通過後に検出する検出光学系１１０を構成する。

また、焦点調整部１６、制御回路１７及びレンズアクチュエータ１８は、この検出光学系１１０により得られる反射光Ｌ１ｂの光量に基づいて、蛍光顕微鏡２００の対物レンズ８の焦点をカバーガラスの裏面又は表面を基準とする合焦位置に合わせる合焦手段４００を構成する。

図３は対物レンズ８の焦点位置と受光器１５での受光光量の関係を示す説明図である。対物レンズ８の焦点がカバーガラス表面１ｂに合った時、反射光Ｌ１ｂが最も強くなる。焦点がずれれば、共焦点効果により、反射光Ｌ１ｂがニポウディスク４のピンホールを通過できず、反射光Ｌ１ｂが急激に減少する。そして、焦点がカバーガラスの裏面１ｃに合った時、反射光が再び強くなる。

このように、反射光量を測定することによって、対物レンズ８の焦点がカバーガラスの表裏面１ｂ又は１ｃに合ったことを検出することができる。したがって、反射光の光量を測定してカバーガラスの表面１ｂ又は裏面１ｃを検出し、図３のように表面１ｂ又は裏面１ｃから、対物レンズ８を一定量ｄ１又はｄ２移動して、試料２を観察する観察面とすることができる。調整部１６の目標値を０とすることにより、対物レンズ８を制御基準面（カバーガラスの表面１ｂまたは裏面１ｃ）へ制御することができるので、基準面から一定量ｄ１又はｄ２の移動は焦点調整部１６で与える目標値により設定することができる。

上記のような共焦点顕微鏡装置によれば、受光器１５から合焦基準面を定める際にカバーガラス表面（裏面）において多くの位置の情報を平均化した値を得ることができる。すなわち、単一ビームでなく観察面の全範囲からの反射光を用いるため、カバーガラスの表面（裏面）の形状の影響を平均化することとなるので、表裏面におけるゴミ、傷や試料の存在、面の歪みや傾き等の影響が受けにくくなる。したがって、高い安定性で対物レンズの焦点位置を検出することができる。

なお、対物レンズ８がドライ系の場合、カバーガラスの表面１ｂを利用し、液浸（解像度をあげるため、対物レンズ８とカバーガラスの表面１ｂの間を液で充填する）の場合はカバーガラスの裏面１ｃを合焦基準面として利用する。

また、上記の実施例では、受光量の微分値を目標値に制御したが、これに限らず、焦点調整部１６で受光量の最大値を検出して基準面（カバーガラスの裏面又は表面）を決定し、この基準面からのずれを目標値により設定してもよい。
また、検出光学系は図１のものに限られず、励起光の反射光を蛍光光から分離することができる任意の手段を用いることができる。

図４は図１の共焦点顕微鏡装置の一変形例で、焦点面検出光として、励起光とは別の波長を持つ検焦光を用いるものを示す構成ブロック図である。図１と同じ部分は同一の記号を付して重複する説明を省略する。

検焦光束Ｌ３ａは、一般に利用される励起光及び蛍光よりも長波長側（例えば波長７８０ｎｍ）にある赤外レーザ光源１２０を用いて発生する。ダイクロイックミラー１９は、励起光束Ｌ１ａを反射し、検焦光束Ｌ３ａを透過することにより、検焦光束Ｌ３ａを励起光束Ｌ１ａと混合して共焦点スキャナ１００に入射する。ダイクロイックミラー７０は例えば図５の分光特性を持つタイプとする。検焦光７８０ｎｍに対して透過と反射は５０：５０である。したがって、検焦光束Ｌ３ａ（図４の鎖線）の一部が保持器１の底面にあるカバーガラスで反射され、この検焦光の反射光Ｌ３ｂがダイクロイックミラー７０に達した時、５０％が反射される。その後は図１の場合の励起光の反射光Ｌ１ｂと同様の経路を通って、受光器１５に入射される。

ここで、ダイクロイックミラー１９は、この検焦光源を励起光に混合して、共焦点スキャナに入射する混合手段を構成する。

図４のような構成の焦点顕微鏡装置によれば、図１の構成では、励起光そのものを利用するため、ダイクロイックミラー７で反射される励起光が数％しかなく、受光器１５での光量が小さいのに対し、受光器１５で受ける検焦光量を約５倍強くすることができる。したがって、合焦動作がさらに安定化する。その他の点は図１の場合と同様である。

なお、混合手段はダイクロイックミラーに限られず、２つの光束を混合、合成することのできる任意の手段を用いることができる。

また、本発明は、上記実施例や変形例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の一実施例を示す構成ブロック図である。 ダイクロイックミラー７の分光特性の一例を示すチャートである。 対物レンズ８の焦点位置と受光器１５での受光光量の関係を示す説明図である 図１の共焦点顕微鏡装置の一変形例を示す構成ブロック図である ダイクロイックミラー７０の分光特性例を示すチャートである。

符号の説明

２ 試料
４ ニポウディスク
８ 対物レンズ
１９ 混合手段
２００ 蛍光顕微鏡
１００ ニポウディスク方式共焦点スキャナ
１１０ 検出光学系
１２０ 検焦光源
４００ 合焦手段
Ｌ１ａ 励起光
１ｃ 裏面
１ｂ 表面

Claims (3)

1. ニポウディスク方式共焦点スキャナと蛍光顕微鏡からなる共焦点顕微鏡装置において、
   ニポウディスクのピンホールを通過した複数の照射ビームに対する、試料を保持するカバーガラスの裏面又は表面からの反射光を前記ニポウディスクのピンホール通過後に検出する検出光学系と、
   この検出光学系により得られる前記反射光の光量に基づいて、前記蛍光顕微鏡の対物レンズの焦点を前記カバーガラスの裏面又は表面を基準とする合焦位置に合わせる合焦手段とを備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 前記反射光の光源として、励起光及びそれによって励起された試料から発生する蛍光よりも波長の長いレーザ光を出力する検焦光源と、
   この検焦光源を前記励起光に混合して、前記共焦点スキャナに入射する混合手段と、
   を備えたことを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡装置。
3. 前記合焦手段は、前記対物レンズの焦点を前記カバーガラスの表面又は裏面から所定量だけ深くすることで、前記対物レンズの焦点を前記合焦位置に位置づけることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡装置。

Images