JP4903585B2

JP4903585B2 - 急性冠症候群用に改善された診断方法

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Publication number: JP4903585B2
Application number: JP2006550208A
Authority: JP
Inventors: チン、チウ−ピン; ペテルソン、キム
Original assignee: ツルンユリオピスト
Priority date: 2004-01-28
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: US20120264139A1; ES2314624T3; CN1934449A; US20110014631A1; US7824876B2; CA2549066A1; EP1709448B1; WO2005073727A1; US20070111254A1; DE602005010548D1; JP2007519913A; EP1709448A1; ATE412181T1; CA2549066C

Description

本発明は、主要塩基性タンパク質の前駆体（proform）（プロＭＢＰ）と複合体を形成していない妊娠関連血漿タンパクＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）と定義される遊離ＰＡＰＰ−Ａの試料中での定量的測定のためのバイオアフィニティーアッセイに関する。さらに、本発明は、遊離ＰＡＰＰ−Ａをマーカーとして使用することによる、ヒトにおける急性冠症候群の診断方法に関する。

本発明の背景を説明するために本明細書で用いる刊行物および他の資料、特に、慣例に関するさらなる詳細を提供するための事例は、引用により、本明細書に組み込まれる。

妊娠関連血漿タンパクＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）は、１９７０年代初期に、ヒトの妊娠後期の血清に見られる高分子量の構成成分として初めて同定された（１）。血清中の濃度は、妊娠とともに分娩日まで増加する（２）。ＰＡＰＰ−Ａは、当初、ホモ四量体（１、３）として特徴付けられたが、後に、妊娠中の循環ＰＡＰＰ−Ａは、好酸球主要塩基性タンパク質の前駆体（プロＭＢＰ）とのジスルフィド結合を含む５００−ｋＤａのヘテロ四量体の２：２複合体（ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰと示される）であることが示された（４）。しかしながら、妊娠血清または血漿は、微量（＜１％）の複合化されていないＰＡＰＰ−Ａも含むことが報告されている（５）。

ＰＡＰＰ−ＡおよびプロＭＢＰは、ともに、妊娠中、胎盤において産生されるが、主には異なる細胞型で産生される。インサイチュハイブリダイゼーションにより、ＰＡＰＰ−Ａの大部分は、合胞体栄養細胞層内で合成され、プロＭＢＰはすべて絨毛外（extravillous）栄養膜細胞層で合成されることが明らかにされた（６）。クローン化ｃＤＮＡの解析により、ＰＡＰＰ−Ａサブユニットは１５４７個の残基のポリペプチドであることが示されている（７）。これは、伸長された亜鉛結合性モチーフ、３個のＬｉｎ−ノッチ（notch）リピートおよび５個のショートコンセンサスリピートを含む（８）。

プロＭＢＰは、９０個の残基の強酸性プロピース（propiece）および１１７個の残基のＭＢＰ強塩基性成熟体を含むグリコシル化されたプロテオグリカンである（９、１０）。後者は、好酸球顆粒に存在する細胞傷害性タンパク質である（１１）。これは、好酸球から脱顆粒によって放出され、これらの細胞のエフェクター機能において多様な役割を果たす（１２）。好酸球内で、成熟ＭＢＰは、プロＭＢＰのタンパク質分解処理によって生成されるが、ＭＢＰが、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のプロＭＢＰから生成され得ることを示す証拠はない。ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体におけるプロＭＢＰの役割に関して、プロＭＢＰが、インビトロでＰＡＰＰ−Ａのプロテアーゼ阻害剤として作用することを示す研究がある（５，１３）。ＰＡＰＰ−Ａに加え、プロＭＢＰもまた、アンギオテンシノゲンまたは補体Ｃ３ｄｇのいずれかと共有結合による複合体を形成する（１４）。しかし、他の複合体におけるプロＭＢＰの機能は、まだわかっていない。

最近、ＰＡＰＰ−Ａは、インビトロで、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク（ＩＧＦＢＰ）−４およびＩＧＦＢＰ−５に特異的なプロテアーゼであることがわかった（１５、１６）。注目すべきことに、ＩＧＦＢＰ−４の開裂はＩＧＦ依存的であるが、ＩＧＦＢＰ−５の開裂はＩＧＦ非依存的である。しかしながら、ＰＡＰＰ−Ａのインビボでの生理学的機能は、確認する余地がある。インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、主に１型ＩＧＦレセプターにより媒介される、多種多様な生物学的系での細胞の分化および増殖の促進に重要な役割を果たす。ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩの生物学的活性は、ＩＧＦに結合し、ＩＧＦのレセプターへの結合をブロックする６個の相同な高親和性ＩＧＦ結合タンパクによって調節される（１７）。ＩＧＦＢＰ−４および−５のＰＡＰＰ−Ａによる開裂は、結合したＩＧＦの遊離を引き起こし、それにより、ＩＧＦ膜レセプターとの相互作用に生体利用可能なＩＧＦが増加する。

臨床的に、ＰＡＰＰ−Ａの血清レベルの低下は、ダウン症（ＤＳ）児の妊娠と関連がある（１８）。マーカーとして、ＰＡＰＰ−Ａは、現在、妊娠第一期におけるＤＳのスクリーニングに一般的に使用されている（１９）。ごく最近になって、ＰＡＰＰ−Ａは、アテローム動脈硬化の（冠状動脈および頚動脈の）不安定プラーク内に存在すること（２０、２１）、およびその循環レベルは、急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者において上昇していること（２０、２２）が示された。さらに、血液循環中のＰＡＰＰ−Ａの存在は、冠状動脈疾患を有する患者に独立して前兆の階層化を行なうもの（independent prognostic stratifier）である（２３）。これまで、該プラークにおけるＰＡＰＰ−Ａの役割についてはあまり知られていない。それにもかかわらず、ＡＣＳにおいて観察されるＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解によるＩＧＦのバイオアベイラビリティーの増大は、冠状動脈のアテローム性動脈硬化および再狭窄の両方の進行に重要な役割を果たしていることが示唆されている（２０、２４）。

技術的には、血液循環中のＰＡＰＰ−Ａの可測性は、ＰＡＰＰ−Ａの分子構造と密接に関連する。妊婦の血中に見られるＰＡＰＰ−Ａの分子構造が、ＡＣＳ患者の血中に見られるものと同じであるか否かは特に重要である。これまで、この重要な問題を扱った報告はない。また、これらの両方の状況におけるＰＡＰＰ−Ａ測定のためにこれまで使用されているアッセイはすべて、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のＰＡＰＰ−Ａサブユニットに特異的な抗体に基づくものである（２０、２５、２６、２７）。方法論的観点から、この事実により、妊娠中における循環ＰＡＰＰ−Ａを、ＡＣＳにおけるものと区別できない。

ここに、初めて、本発明者らは、妊娠中における循環ＰＡＰＰ−Ａ分子がＡＣＳにおけるものとは異なることを示すデータを提供する。この所見は、血液循環中のアテローム性動脈硬化関連ＰＡＰＰ−Ａのより早期でより特異的な検出のための、重要な臨床的意義を有する。

本発明の目的は、急性冠症候群のリスクのある個体を初期段階で診断する、より高感度で特異的な方法を提供することである。特に、本発明の目的は、心筋トロポニンＩに基づく一般に使用されているアッセイおよびマーカーとしての全ＰＡＰＰ−Ａの使用に基づく提案されているアッセイよりも優れた診断方法を成し得ることである。

したがって、ある側面によれば、本発明は、試料中の遊離ＰＡＰＰ−Ａの定量的測定のためのバイオアフィニティーアッセイに関し、該遊離ＰＡＰＰ−Ａは、主要塩基性タンパク質の前駆体（プロＭＢＰ）と複合体を形成していない妊娠関連血漿タンパクＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）と定義される。本発明によれば、遊離ＰＡＰＰ−Ａは、
ｉ）全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａの測定値の算出された差として、または
ｉｉ）遊離ＰＡＰＰ−Ａのみを測定する直接バイオアフィニティーアッセイにより、
のいずれかによって測定される。

別の側面によれば、本発明は、遊離ＰＡＰＰ−Ａそれ自体、または比
遊離ＰＡＰＰ−Ａ／全ＰＡＰＰ−Ａ、
遊離ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａ、もしくは
プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａ／全ＰＡＰＰ−Ａ
のいずれかをマーカーとして使用することによる、ヒトの急性冠症候群の診断方法に関する。

第３の側面によれば、本発明は、遊離ＰＡＰＰ−Ａに結合するが、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａには結合しない結合剤に関する。

用語「遊離ＰＡＰＰ−Ａ」は、主要塩基性タンパク質の前駆体（プロＭＢＰ）と複合体を形成していない任意のＰＡＰＰ−Ａを含むと解釈されるものとする。したがって、「遊離ＰＡＰＰ−Ａ」は、完全に遊離したＰＡＰＰ−ＡおよびプロＭＢＰを除く任意の物質に結合したＰＡＰＰ−Ａを含む。

用語「結合剤」は、特に、抗体およびその断片（任意で、遺伝子操作されている）ならびにアプタマーおよびタンパク質足場派生結合剤（protein scaffold derived binders）（たとえば、アフィボディまたはフルオロボディなど）を含むと解釈されるものとする。しかしながら、用語「結合剤」は、前記の例に限定されない。バイオアフィニティーアッセイに有用な任意の結合剤が、この定義により包含されるものと理解されるべきである。

好ましい一実施態様によれば、遊離ＰＡＰＰ−Ａは、全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａの測定値の算出された差として測定される。

この選択肢は、たとえば、２つの独立したアッセイの使用により行なうことができ、この場合、試料の１つのアリコートを全ＰＡＰＰ−Ａに結合する結合剤に曝露し、結合剤を検出して全ＰＡＰＰ−Ａを得る。試料のもう１つのアリコートをプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａのみに結合する結合剤に曝露する。結合剤を検出してプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを得る。最後に、遊離ＰＡＰＰ−Ａの量を全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａの測定値の差として算出する。その２つのアッセイは、競合的アッセイ、またはより好ましくは非競合的サンドイッチアッセイであり得、この場合、特異的結合剤は、捕捉結合剤または検出用（標識化された）結合剤のいずれかである。

あるいは、遊離ＰＡＰＰ−Ａ、およびプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａは、１つの単独の二重検体アッセイにて測定され得る。試料は、全ＰＡＰＰ−Ａに結合する捕捉結合剤、および異なる標識で標識化された２種類の検出用結合剤に曝露され得、その結果、第１の標識で標識化された第１の検出用結合剤が、ＰＡＰＰ−Ａ分子のいずれかに存在するエピトープに指向され、このとき、第１の標識のシグナルが全ＰＡＰＰ−Ａを得るために使用される。第２の標識で標識化された第２の検出用結合剤は、該分子のプロＭＢＰサブユニット内のエピトープに指向され、このとき、第２の標識シグナルが、排他的にプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを得るために使用される。

表現「分子のプロＭＢＰサブユニット内のエピトープ」は、前記プロＭＢＰサブユニット内にのみあるエピトープ、ならびに一部がプロＭＢＰサブユニット内に位置し、一部がＰＡＰＰ−Ａ分子の別の部分に位置するエピトープを含むものと理解されるものとする。したがって、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａは、一部がプロＭＢＰサブユニット内に位置し、一部がＰＡＰＰ−Ａ分子の別の部分に位置するエピトープとのみ反応する結合剤によっても特異的に測定され得る。

別の好ましい実施態様によれば、遊離ＰＡＰＰ−Ａは、遊離ＰＡＰＰ−Ａのみを測定する直接バイオアフィニティーアッセイによって測定される。これは、１つの選択肢によれば、試料を抗体（Ｆａｂおよび単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含む）または遊離ＰＡＰＰ−Ａに結合するが、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａには結合しない他の結合剤に曝露し、該抗体または他の結合剤を検出して遊離ＰＡＰＰ−Ａを得ることにより行なわれ得る。かかる抗体または他の結合剤は、たとえば、プロＭＢＰに結合していない分子においてのみ利用可能なＰＡＰＰ−Ａのエピトープ（たとえば、アミノ酸３８１〜６５２の領域）に対して生成させ得る。遊離ＰＡＰＰ−Ａに特異的なポリクローナル抗体は、ウサギおよびヒツジなどの宿主動物を遊離ＰＡＰＰ−Ａおよび免疫アジュバントで免疫処置することにより生成させ得る。一方、遊離ＰＡＰＰ−Ａに特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術および同じ免疫原（このとき、免疫を与える宿主動物は、通常マウスである）を使用することにより得ることができる。加えて、遊離ＰＡＰＰ−Ａに特異的な抗体またはその断片（たとえば、Ｆａｂおよび単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））は、合成または天然の抗体ライブラリーのいずれかに由来するファージ提示法を用いて生成させ得る。遊離ＰＡＰＰ−Ａは、ＡＣＳプラークから、プロＭＢＰを含まない妊娠ＰＡＰＰ−Ａから、またはＰＡＰＰ−ＡコードＤＮＡ配列の組換え発現から入手可能である。

あるいは、遊離ＰＡＰＰ−Ａのみを測定するバイオアフィニティーアッセイは、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを、全ＰＡＰＰ−Ａに結合する抗体または他の結合剤に試料を曝露するバイオアフィニティー反応に関与させないことにより行なわれ得る。この目的の達成のためには、２つのアプローチがある。一方は、すでに図８のＢに示した吸着の使用に関し、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａは、ｍａｂＡ１１による吸着によって前工程において除去され、これにより、次の遊離ＰＡＰＰ−Ａの測定が可能となった。他方は、ブロッキングストラテジーの使用に関し、この場合、ある特定のＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的抗体または他の結合剤のそのエピトープへの接近が、プロＭＢＰ反応性抗体／他の結合剤（特定の基によって誘導体化されている、またはされていないのいずれか）の結合によりブロックされる。ブロッキングは、前工程で、または該アッセイと同時に起こり得る。このようにして、遊離ＰＡＰＰ−Ａは、同様に効果的に測定され得る。

本発明を、以下の非限定的な実施例により説明する。

材料および方法
試薬
４−［２−（４−イソチオシアナートフェニル）エチニル］−２，６−ビス｛［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノ］メチル｝ピリジンのＩＴＣ−ＴＥＫＥＳＥｕ³⁺蛍光キレートおよびビオチンイソチオシアネート（ＢＩＴＣ）は、Innotrac Diagnostics Oyから入手した。ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファーおよび洗浄溶液は、既報のとおりに調製した（２８）。０．０１％変性マウスＩｇＧおよび０．０２％天然マウスＩｇＧを加えたアッセイバッファーを、改変アッセイバッファーと呼ぶ。低蛍光１２ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ微量滴定ストリップ（紫外線により消光）は、ＮＵＮＣから購入した。ストレプトアビジンがコートされた単一ウェルおよびストリップは、Innotrac Diagnostics Oyから入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Intergenから購入した。ＮＡＰ−５^TMおよびＮＡＰ−１０^TMカラムは、Pharmacia Biotech製であった。使用した他の化学薬品はすべて、分析用（analytical）グレードのものであった。

ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体に特異的な、ｍａｂＢ１、２、３、４、５および６で示す６種類のモノクローナル抗体は、国家血清研究所（State Serum Institute）（デンマーク）のMichael Christiansen博士の厚意により提供された。同様にＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体に特異的な、ｍａｂＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１で示す他の１１種類のモノクローナル抗体は、HyTest Oy（フィンランド）のMaria Severina博士の厚意により提供された。

較正液を、濾過した（０．２２μｍ孔径フィルターにより）１０例の妊娠第三期の血清のプールを、６０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌおよび０．５ｇ／ＬＮａＮ３を含有するバッファー中に希釈することにより調製し、妊娠第三期のプールした血清由来ＷＨＯＩＲＰ７８／６１０に対して妊娠関連タンパク質に関して較正した（ＷＨＯ International Laboratory for Biological Standards、国家血清研究所、コペンハーゲン、デンマーク）。ＰＡＰＰ−ＡおよびプロＭＢＰのレベルは、１リットルあたりのミリ単位で示した。較正液は、使用まで−２０℃で保存した。

血清試料
ＡＣＳの８例の患者（年齢５７±５歳の男性４例および年齢８１±３歳の女性４例）は、ＳＴ部分の上昇に伴って長期の胸痛を有し、ＣＫＭＢおよびｃＴｎＩのレベルが異常に増加した。これらの患者から、ツルク大学中央病院（Turku University Central Hospital）の心臓科への入院時、その後、１、２、４、６、２４、４８および７２時間に血清試料を採取した。さらに、２例の妊娠第一期の血清試料（在胎齢：第９〜１１週）を本調査に含めた。血清試料はすべて、インフォームドコンセントを得て入手した。したがった手順は、１９７５のヘルシンキ宣言（１９９６年に改正）に準じた。すべての試料は、測定前に、−２０℃（妊娠試料）または−７０℃（ＡＣＳ試料）で保存した。

ランタニドキレートおよびビオチンによる抗体の標識
本来、蛍光ユウロピウムキレートは、抗体を標識するために使用されていた（２９）。標識反応は、既報のとおりに行なった（２５）。簡単には、抗体を、一晩（１６〜２０時間）室温で、１００倍モル過剰のキレートにより、５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中で標識した。標識化された抗体を、過剰の遊離キレートおよび凝集タンパク質からＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（Pharmacia Biotech、スウェーデン）（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬＮａＮ３を２５ｍＬ／時で操作）にて分離した。０．４５ｍＬの画分を回収した。標識化された抗体を含有する画分をプールし、標識の程度をユウロピウム較正溶液により測定した。抗体の標識程度は、ＩｇＧ１分子あたり５〜１５のＥｕ³⁺キレートであった。

抗体のビオチン化を、５０倍モル過剰のビオチン−イソチオシアネートを用い、５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中、室温で３時間行なった。ビオチン化抗体を遊離のビオチン化試薬から、反応混合物をＮＡＰ−５^TMおよびＮＡＰ−１０^TMカラム（Amersham Biosciences AB）に通すこと（溶離液として５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬＮａＮ３を使用）により分離した。ＢＳＡを１ｇ／Ｌの最終濃度まで添加し、溶液を０．２２μｍ孔径フィルターにより濾過し、４℃で保存した。

エピトープマッピング
ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体に対するすべての抗体を捕捉抗体または検出抗体としてそれぞれ使用して、対で試験した。一段階サンドイッチアッセイ形式を、１００ｍＩＵ／ＬＰＡＰＰ−Ａ較正液およびブランク溶液とともに使用した。使用した手順は前に記載されたものと同様とした（３０）。簡単には、１０μＬのＰＡＰＰ−Ａ較正液またはブランク溶液および２０μＬのアッセイバッファー中の１００ｎｇのＥＣ³⁺標識抗体を、三連で、０．４μｇの抗体を直接コートしたウェルに添加した。続いて、３７℃で１０分間および６０分間、振とうしながら（900 rpm、iEMS Incubator/Shaker, Labsystems Oy、フィンランド）インキュベーションを行なった。その後、ウェルを６回洗浄し、乾燥熱風流で５分間乾燥し、次いで、蛍光を、Ｖｉｃｔｏｒ^TM １４２０多重標識（multilabel）計測器（Perkin-Elmer Life Sciences, Wallac Oy、フィンランド）により測定した。

イムノアッセイ
本研究では、２つのイムノアッセイを使用した。一方をアッセイＴとし、ビオチン化ｍａｂＡ１およびユウロピウム標識ｍａｂＢ４により構成する。他方は、アッセイＣとし、ビオチン化ｍａｂＡ１およびユウロピウム標識ｍａｂＡ１１で構成する。これらを、ｉＥＭＳＩｎｃｕｂａｔｏｒ／Ｓｈａｋｅｒを用いて従来のマイクロプレートアッセイ形式にて行なった。両アッセイでは、まず、１ウェルあたり５０μＬのＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー中で３００ｎｇのビオチン化ｍａｂＡｌを６０分間室温にて、ゆっくり振とうしながらインキュベートすることにより、ストレプトアビジンコートマイクロタイターウェルの表面上にビオチン化ｍａｂＡ１を固定化した。未結合ビオチン化抗体を、ウェルを洗浄することに除去した。次いで、アッセイＴでは、１０μＬの較正液または試料および２０μｌの改変アッセイバッファー中２００ｎｇのＥＵ³⁺標識ｍａｂＢ４を各ウェルに添加した。ウェルを３０分間３７℃で、ゆっくり振とうしながらインキュベートし、６回洗浄した。その後、ウェルを５分間乾燥し、時間分解ユウロピウム蛍光を、乾燥表面からＶｉｃｔｏｒ^TM １４２０多重標識計測器により直接測定した。未知試料の濃度は、その蛍光シグナルを、対数変換したデータに対するスプラインアルゴリズム（spline algorithm）の使用と共にＭｕｌｔｉＣａｌｃイムノアッセイプログラム（Perkin-Elmer Life Sciences, Wallac Oy、フィンランド）により較正液のウェルから導いた較正曲線に対して較正することにより得た。アッセイＣでは、１０μＬの較正液または試料および２０μｌの改変アッセイバッファーを各ウェルに添加した。ウェルを３０分間３７℃で、ゆっくり振とうしながらインキュベートし、２回洗浄した。その後、３０μＬの改変アッセイバッファー中の３００ｎｇのＥＵ³⁺標識ｍａｂＡ１１を各ウェルに添加し、ウェルを３０分間３７℃で、ゆっくり振とうしながらインキュベートし、６回洗浄した。以後の工程は、アッセイＴの場合と同様とした。

ゲル濾過クロマトグラフィー
これは、０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌおよび０．０２％ＮａＮ３を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で、０．０４ｍＬ／分の流速で平衡化および溶出したＳｕｐｅｒｏｓｅ^TM ６（３．２×３００ｍｍ）精密カラムＰＣ３．２／３０（Pharmacia Biotechnology、スウェーデン）にて行なった。５０μｌの試料（溶出バッファーで２倍に希釈し、０．２２μｍ孔径フィルターにより濾過した血清）をロードした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターし、０．６ｍｌの初期溶出後、１００μＬずつ画分を回収した。全実行時間は７５分であった。カラムは、１０℃でＰｈａｒｍａｃｉａＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia Biotechnology、スウェーデン）にて操作し、下記のタンパク質：サイログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリチン（４８１ｋＤａ）、免疫グロブリンＧ（１６０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）およびリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）で較正した。妊娠第一期の血清検体およびＡＣＳ血清試料は、ともに、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。

正常血清試料からのＰＡＰＰ−Ａの吸着
これは、ストレプトアビジンコート微量滴定ウェルおよびビオチン化ｍａｂＡ１またはビオチン化Ａ１１を使用して行なった。３０μｌの血清試料を、３００ｎｇのｂｉｏＡ１または４００ｎｇのｂｉｏ−ｍａｂＡ１１を既に表面上に固定化した各ウェルに添加した。ｂｉｏＡ１の場合、室温で１時間、ゆっくり振とうしながらインキュベーションを行なった。その後、各ウェルから採取した１０μｌの処置血清を、ＰＡＰＰ−Ａ測定用の前記イムノアッセイに適用した。ｂｉｏ−Ａ１１の場合、室温で１時間、ゆっくり振とうしながらインキュベーションを行ない、次いで、血清試料を別のコートウェルに移し、１時間インキュベーションした。その後、移し変え（transfer）工程およびインキュベーションを、３回目のインキュベーションを行なうまで繰り返した。

最後に、１０μｌの処置血清を、ＰＡＰＰ−Ａ測定のために前記イムノアッセイに適用した。

統計学的解析
統計学的解析を、ＳｔａｔＶｉｅｗ（SAS Institute, Cary, USA）を用いて行なった。

結果
１７種類のｍａｂにより規定される妊娠ＰＡＰＰ−Ａのエピトープマップ
図１に示す概略的なエピトープマップを、抗体の可能な２つの部位のすべての組合せから得たデータにしたがって作製した。各抗体の位置の関係を、ある１つの抗体の結合が、別の抗体の独立した結合を許容するか妨害するかに基づいて調べた。１７種類のｍａｂのうち、Ｂ１、２、３および４は、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のＰＡＰＰ−Ａサブユニットに対する結合に特異的であるが、Ｂ５およびＢ６は、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のプロＭＢＰサブユニットと反応性があることが以前に示されていた（５、３１）。ｍａｂＡｌ１は、ｍａｂＢ５およびＢ６を除くすべての他のｍａｂとサンドイッチ構造を形成することができ、これがＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のプロＭＢＰサブユニットと反応性があるはずであることを示す。ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体のＰＡＰＰ−Ａサブユニットと反応性がある残りの１４種類の抗体のうち、２つの抗体（Ａ１０およびＢ４）は、そのエピトープが他の抗体と共有されていなかった。

較正曲線
図２に示す２つのアッセイの較正曲線を、妊娠第三期の血清のプールに由来する標準材料を用いて得た。両曲線は、１．０ｍＩＵ／Ｌ〜３００ｍＩＵ／Ｌの範囲の濃度では線形であった。アッセイＴの場合、アッセイの不正確度は、１．０ｍＩＵ／Ｌ〜３００ｍＩＵ／Ｌの範囲で低く、アッセイ内（intra-assay）濃度ＣＶは１０未満であった。アッセイＣの場合、アッセイ不正確度は、１．０ｍＩＵ／Ｌで２０％を超え、３．０ｍＩＵ／Ｌ〜３００ｍＩＵ／Ｌの範囲では１５未満であった。より重要なことに、両較正曲線は互いに平行であり、これは、標準材料中のＰＡＰＰ−Ａが前記２つのアッセイによって等しく検出されることを示す。

妊娠ＰＡＰＰ−Ａの分子プロファイルおよび免疫反応性
妊娠第一期の血清試料を、サイズ排除クロマトグラフィーにより分画し、画分を２つのイムノアッセイにより解析した。妊娠ＰＡＰＰ−Ａは、２つのアッセイにより、サイログロブリン（６６９ｋＤａ）が溶出されたのと同じ位置で溶出された単一のピークとして現れた（図３に示す）。さらに、２つのアッセイにより得られた２つのピークは互いに完全に重複した。

アッセイＴにより測定したＰＡＰＰ−Ａ濃度は、アッセイＣにより測定したものよりも、やや高かった。

ＡＣＳ患者におけるＰＡＰＰ−Ａ
４例のＡＣＳの患者由来の段階血清試料中のＰＡＰＰ−Ａレベルを前記２つのアッセイにより測定した。アッセイＴを用いると、５．６８ｍＩＵ／Ｌ（２２）の参照レベルより高いＰＡＰＰ−Ａレベルが、４例の患者すべてにおいて、胸痛の発生後の異なる時点において観察された（図４に示す）。ＰＡＰＰ−Ａレベルの最大増加の程度は変化したが、ＰＡＰＰ−Ａレベルの著しい増加が、４例のＡＣＳ患者すべてにおいて、胸痛の発生後から２時間以内の早期に現れた。アッセイＣを用いると、これらの４例の患者において、ＰＡＰＰ−Ａのレベルの有意な増加は見られず、この場合、ＰＡＰＰ−Ａの濃度は、すべての血清試料について、４ｍＩＵ／Ｌ未満であった。結果は、血液循環中に存在するＡＣＳ特異的なＰＡＰＰ−Ａは、プロＭＢＰ反応性抗体によって検出され得ないことを示す。

ＡＣＳＰＡＰＰ−Ａの分子プロファイルおよび免疫反応性
著しく増加したレベルのＰＡＰＰ−Ａを伴う、別の４例のＡＣＳの患者から得た４例の血清試料をサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。画分をアッセイＴにより解析した。ＰＡＰＰ−Ａ免疫反応性の単一のピークが、アポフェリチン（４８１ｋＤａ）が見られた位置で溶出した（図５に示す）。４例のＡＣＳ血清試料の溶出パターンはすべて、ＰＡＰＰ−Ａの濃度とは無関係に同じであり、２つの妊娠試料（６６９ｋＤａ）から明白にシフトしていた。妊娠ＰＡＰＰ−ＡとＡＣＳＰＡＰＰ−Ａとの分子の大きさの差は図５に明白に示されており、より少量（２５μｌ）での画分容量で行なった場合の図６では、さらによりはっきりとなった。

正常被験体におけるＰＡＰＰ−Ａ
正常被験体（ｎ＝１３０、年齢５０〜６９歳）における血清ＰＡＰＰ−Ａレベルは、７．６ｍＩＵ／Ｌ未満であり、平均値は３．０ｍＩＵ／Ｌであった。正常被験体において見られたかかるレベルの循環ＰＡＰＰ−Ａは、アッセイＴだけでなくアッセイＣでも検出された。

図７のＡは、正常被験体において見られる低レベルの循環ＰＡＰＰ−Ａが、アッセイＴでもアッセイＣでも検出可能であったことを示す。また、吸着処理を使用し、ＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的抗体Ａ１（図７のＡ）またはプロＭＢＰ特異的抗体Ａ１１（図８のＡ）のいずれかにより、ＰＡＰＰ−Ａを正常血清から除去することができた。

ＡＣＳ被験体におけるＰＡＰＰ−Ａ
ＡＣＳ患者におけるＰＡＰＰ−Ａは、２つのカテゴリー、すなわち、プロＭＢＰ複合体形成形態とプロＭＢＰ非複合体形成形態に分類され得、これらの形態が一緒になって、アッセイＴによって検出される全ＰＡＰＰ−Ａを構成する。プロＭＢＰ複合体形成形態は、基礎レベルのＰＡＰＰ−Ａを構成し、アッセイＣによって特異的に検出され得る。プロＭＢＰ非複合体形成形態は、ＡＣＳに関連し、前記の両方のアッセイもしくは二重標識アッセイもしくはブロックアッセイ、または特に遊離ＰＡＰＰ−Ａ特異的アッセイの使用により得られるデルタ値によって特異的に測定され得る。

図７のＢは、ＡＣＳ患者におけるＰＡＰＰ−Ａ（プロＭＢＰ複合体形成形態と非複合体形成形態の両方）はアッセイＴによって測定することができ、一方、プロＭＢＰ複合体形成形態（ＡＣＳ無関係）は、アッセイＣによって測定することができたことを示す。ｍａｂＡ１による吸着では、プロＭＢＰ複合体形成形態と非複合体形成形態の両方が効果的に取り出せた（図７のＢ）が、ｍａｂＡ１１による吸着では、プロＭＢＰ複合体形成形態のみが除去され（図８のＢ）、それにより、非複合体形成形態、すなわち遊離ＰＡＰＰ−Ａが検出されることが可能になった。

ＡＣＳ血清試料由来および妊娠血清試料由来の画分の解析により、アッセイＣにより検出された優性なシグナルが、実際、プロＭＢＰとの複合体であることが知られている妊娠ＰＡＰＰ−Ａのものと一致したことがわかる（図９参照）。

正常被験体における基礎ＰＡＰＰ−Ａレベルの分布
アッセイＣで測定されたＰＡＰＰ−Ａ濃度は、１３０例の正常高齢男性において、ＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的抗体のみを用いるアッセイＴで測定されたものと相関することがわかった（Ｙ＝０．６１３１＋０．５９６６９Ｘ、Ｒ＝０．６３、Ｐ＜０．００１）。図１０は、２つのアッセイでそれぞれ測定した血清ＰＡＰＰ−Ａ濃度のデータ分布特性および正常加齢集団に関するデルタ値のデータ分布特性の箱髭図を示す。これとは別に、ヒストグラムは、デルタ値の分布がほとんど非対称（skewed）でなく、０．１の尖度（kurtosis）値を有するが、ＰＡＰＰ−Ａ濃度の分布は、中心が左に寄っており（positively skewed）、ずっと大きな尖度値（それぞれ３．４７および１．５８）を有することを示す。ガウス分布との一致性（compatibility）により、デルタ値に対する適当な判定限界が導かれる。

デルタ値の臨床的有用性
デルタ値は、原理的には、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａのみを反映する。したがって、基礎ＰＡＰＰ−Ａレベルの影響を受けない。基礎ＰＡＰＰ−Ａレベルは患者によって異なり得、このことは、ＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的抗体のみを用いるアッセイにより得られる測定値の結果に支障をきたす原因となり得る（偽陰性および偽陽性）。

起こり得る偽陰性の問題に取り組むため、本発明者らは、亜群の２９例のＡＣＳ患者（ｃＴｎＩは、これらの患者すべてで上昇していた）由来の段階血清試料を、２つのアッセイで解析した。判定限界を、ＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的抗体のみを用いるアッセイによる正常被験体のＰＡＰＰ−Ａ濃度から誘導した参照上限値の９７．５％（５．６８ｍＩＵ／Ｌ）とした場合、すべての患者はＰＡＰＰ−Ａ陰性であった。しかしながら、判定限界を、デルタ値を基準にして平均＋３ＳＤとした場合、２９例の患者のうち２０例がＰＡＰＰ−Ａ陽性に変わることがわかった。図１１は、２つの判定限界の使用を比較したいくつかの例を示す。

全ＰＡＰＰ−ＡまたはプロＭＢＰと複合体状態のＰＡＰＰ−Ａまたは遊離ＰＡＰＰ−Ａを測定するための抗体の組合せ
現在入手可能な抗体の考えられ得るすべての２つの部位の組合せを、妊娠由来ＰＡＰＰ−Ａおよびアテローム動脈硬化プラーク（アテローム性動脈硬化由来またはプラーク由来ＰＡＰＰ−Ａとも呼ぶ）から得たＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａを用いて特徴付けた。表１に示すように、３種類のアッセイまたは抗体の組合せを見出した。第１に、全ＰＡＰＰ−Ａ用の抗体の組合せで、妊娠由来ＰＡＰＰ−ＡおよびＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａの両方に高度に特異的なシグナルが生成され、これらのアッセイが、妊娠由来ＰＡＰＰ−ＡおよびＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａの測定に等しく好適であることを意味する。第２に、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰのみを認識する抗体の組合せで、妊娠由来ＰＡＰＰ−Ａで高度に特異的なシグナルが生成されたが、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａでは生成されず、これらのアッセイが、妊娠関連ＰＡＰＰ−Ａの測定にのみに好適であることを意味する。第３の型の抗体の組合せ（たとえば、３Ｃ８／７Ａ６など）では、妊娠由来ＰＡＰＰ−Ａで特異性の低いシグナルが生成されたが、優先的に遊離または非複合体形成形態のＰＡＰＰ−Ａを構成するＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａで高度に特異的なシグナルが生成された。非妊娠状態の非ＡＣＳ個体におけるＰＡＰＰ−Ａの分子形態は、妊娠中において見られる形態（すなわちＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ）と類似するため、このようなアッセイは、好ましくは、ＡＣＳ関連またはアテローム性動脈硬化関連ＰＡＰＰ−Ａの特異的な測定に好適である。

要するに、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体として存在する基礎レベルＰＡＰＰ−Ａは、多くの場合、試料間で変動する。ＡＣＳ患者において、病変関連ＰＡＰＰ−Ａは、複合体アッセイでなく、むしろ全アッセイによってのみ検出される。他方において、基礎レベルＰＡＰＰ−Ａは両方のアッセイにより検出され得る。この事実は、ＰＡＰＰ−Ａの基礎レベルの個々の変化の変動に由来する影響を排除する遊離ＰＡＰＰ−Ａまたはデルタ値（これは、間接的に遊離ＰＡＰＰ−Ａを反映する）の使用の根拠をなす。遊離ＰＡＰＰ−Ａまたはデルタ値を基準に構成される判定限界は、したがって、単に全ＰＡＰＰ−Ａ濃度を基準としたものよりも合理的であり、血液循環中のＡＣＳＰＡＰＰ−Ａの正確な測定を可能にする。

考察
本発明者らは、妊娠中における循環ＰＡＰＰ−Ａが、ＡＣＳにおけるものとは異なることを示した。第１に、本発明者らは、ＰＡＰＰ−ＡサブユニットまたはプロＭＢＰサブユニットのいずれかに対する抗体をトレーサーとして等しく測定できることから、妊娠ＰＡＰＰ−ＡがプロＭＢＰとの複合体であることを確認している。第２に、本発明者らはＰＡＰＰ−Ａサブユニットに対する抗体によってのみ測定され得ることにより、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａは、プロＭＢＰと複合体を形成しないという証拠を示す。これはまた、２種類の他のプロＭＢＰ反応性抗体、すなわち、ｍａｂＢ５およびＢ６を用いるアッセイによっても確認された（データ示さず）。第３に、本発明者らの結果により、妊娠関連ＰＡＰＰ−Ａが、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａと比べて分子の大きさが大きいことが示され、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａが妊娠関連ＰＡＰＰ−Ａと異なることをさらに明白に示す。

モノクローナル抗体Ａ１１により認識されるエピトープを検出不可能にする理由は２つある。第１に、エピトープを有するサブユニットの欠如または分子構造の変化を引き起こす修飾のいずれかによってエピトープを喪失することである。第２に、エピトープが、別の巨大分子の物質へのエピトープの共有結合またはＡＣＳ血清試料中にのみ存在する干渉性因子のいずれかによって抗体の結合からブロックされることである。正常な回収（recovery）結果（データ示さず）は、ＡＣＳ血清試料内での妊娠ＰＡＰＰ−Ａの急上昇によって得られたため、ＡＣＳ試料中の干渉性物質（interferant）の存在の可能性が解明され得る。さらに、ＡＣＳＰＡＰＰ−Ａが妊娠ＰＡＰＰ−Ａよりも分子の大きさが明らかに小さいという知見により、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体の修飾（さらなる物質との架橋を含む）は、ほとんどあり得ないと考えられる。したがって、血液循環中のＡＣＳＰＡＰＰ−Ａは、プロＭＢＰと複合体を形成していないことは明らかである。

平均すると、血液循環中に存在するＡＣＳＰＡＰＰ−Ａは、およそ２０ｍＩＵ／Ｌであり（２２、２３）、これは約６μｇ／Ｌに相当する（２６）。かかる低濃度のため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット解析によって血液試料から直接ＡＣＳＰＡＰＰ−Ａを検出するのは困難である。したがって、高感度かつ高い特異性を伴う他の検出手法が、関連する研究調査に必要である。ランタニドキレートの時間分解蛍光測定法は、現在存在する最も感度のよい検出技術の１つである（２７）。この技術および特異的な抗体を用い、全ＰＡＰＰ−ＡおよびプロＭＢＰとのＰＡＰＰ−Ａ複合体用の２つのイムノアッセイを構築した。予期したとおり、これらのアッセイの優れた感度により、全ＰＡＰＰ−ＡおよびプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを直接血液試料から検出することが可能になった。

妊娠中、９９％を超える血液循環中のＰＡＰＰ−Ａが、プロＭＢＰとのジスルフィド結合を含有した５００ｋＤａの２：２の複合体として存在し、ＰＡＰＰ−Ａの１％未満が二量体として存在する（５）。ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体では、ＰＡＰＰ−Ａは、単一のジスルフィド結合によって二量体化され、プロＭＢＰは、２つのジスルフィド結合によって二量体化され、各ＰＡＰＰ−Ａサブユニットが２つのジスルフィド結合によってプロＭＢＰサブユニットと連結される（３２）。最近の研究により、ＰＡＰＰ−Ａの触媒活性のプロＭＢＰ阻害には共有結合が必要であることが示されたが、該複合体の形成に関する詳細な機序は、依然としてほとんどわかっていない。

これまで、遊離の形態のプロＭＢＰは血液循環中に見い出されなかったが、報告によると、プロＭＢＰの血清レベルは、全妊娠期間を通してモル基準でＰＡＰＰ−Ａのものより４〜１０倍高かった（１４）。妊娠中における、残りの循環プロＭＢＰは、２つの他の型の複合体、すなわち、プロＭＢＰとアンギオテンシノゲンとのジスルフィド結合を含有した２：２の複合体、およびプロＭＢＰとアンギオテンシノゲンと補体Ｃ３ｄｇとの２：２：２の複合体で存在する（１４）。この研究では、トレーサーとしてプロＭＢＰ特異的抗体の使用を伴うアッセイに、二段階形式を使用した。この形式によるアッセイでは、妊娠血清中に存在する他のプロＭＢＰ複合体のユウロピウム標識プロＭＢＰ特異的抗体との反応が効果的に阻止され、それにより、ＰＡＰＰ−Ａ−／プロＭＢＰ複合体の特異的な測定が可能となった。

妊娠時以外では、ＰＡＰＰ−Ａは、種々の培養ヒト細胞、たとえば、線維芽細胞、骨芽細胞（１５）、卵巣顆粒膜細胞（３３）、子宮内膜間質細胞（１３）および冠状動脈血管平滑筋細胞（３４）などから分泌されることがわかった。さらに、免疫組織化学検査およびインサイチュハイブリダイゼーションを用いると、ＰＡＰＰ−Ａ発現が、卵巣（３５）、血管プラーク（２０）および治癒中のヒトの皮膚（３６）においてインビボで確認された。しかしながら、ヒト線維芽細胞ならし培地から、および組換え発現から単離されたＰＡＰＰ−Ａは、４００ｋＤａの二量体として現れることが示されただけである（５、１５）。

培養ならし培地内で前記細胞によって分泌されるＰＡＰＰ−Ａは、タンパク質分解活性を有することが示されている。これらすべての供給源からインビトロで産生されるＰＡＰＰ−Ａは、おそらく、二量体として存在すると考えられる。しかしながら、インビトロでの観察結果をインビボ状況にあてはめることは、理にかなっていない。単独でプロテアーゼ活性を有することを、ＰＡＰＰ−Ａが遊離形態として存在するという証拠として用いることはできない。妊娠中、９９％を超えるＰＡＰＰ−Ａが複合体形態で存在するが、妊娠血清および精製された妊娠ＰＡＰＰ−Ａは、プロテアーゼ活性を有することが示されている（５、１５、３７）。妊娠血清または妊娠ＰＡＰＰ−Ａのプロテアーゼ活性が測定可能な理由は、１％未満の非阻害ＰＡＰＰ−Ａ二量体の存在、またはおそらく不完全に阻害された２：１のＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体に起因する（５）。

妊娠中、プロＭＢＰは、胎盤Ｘ（placental X）細胞内で合成されるが、ＰＡＰＰ−Ａは、主に、合胞体栄養細胞層内で合成される（６）。したがって、共有結合によるＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体は、分泌後、細胞外の区画において形成されるはずである。ＰＡＰＰ−Ａプロテアーゼ活性は、局所環境内でパラクリン作用によって調節されることが考えられる（１３）。妊娠時以外では、プロＭＢＰは、成熟好酸球ではなく成長中の好酸球にのみ存在することが示されている（３８）。しかし、最近、プロＭＢＰの免疫反応性もまた、インビトロで受精した患者由来のエストロゲン優性の（-dominent）卵胞液において検出され（３３）、プロＭＢＰの起源は、種々の卵巣細胞と関連し得る（３９）。さらに、β−ホルボール１２，１３−ジデカノエート（β−ＰＤＤ）処理により、培養ＰＡＰＰ−Ａ産生ヒト線維芽細胞からプロＭＢＰ発現が誘導され、細胞ならし培地中でのＰＡＰＰ−Ａプロテアーゼ活性の阻害がもたらされことが報告された（４０）。これはＰＡＰＰ−Ａプロテアーゼ活性が、インビボで自己分泌作用によっても調節され得ることを示唆する。しかし、このような複合体構造がプロＭＢＰの阻害性効果になぜ必要なのかという疑問は、依然、わかっていない。

これまで、アテローム性動脈硬化は、「管（plumbing）」の問題とみなされてきた。しかし、最近の研究により、炎症が、動脈病変の発症において枢要であることが示された（４１）。安定プラークとの比較では、破裂プラークは、多くの炎症細胞を含む（４２）。ＰＡＰＰ−Ａは、アテローム動脈硬化の不安定プラーク内に存在するが、安定プラーク内には存在しないことが示されている（２０）。その発現は、炎症細胞由来のサイトカイン（たとえば、ＴＮＦαなど）によって有意に増強され得る（４３）。ＰＡＰＰ−Ａは、おそらく、アテローム動脈硬化プラーク内の炎症反応に重要な役割を果たし、したがって、アテローム発生の進行に寄与する。最近、本発明者らは、原発性心臓病の終点の累積リスクが循環ＰＡＰＰ−Ａのレベルと明確に関連していることを報告している（２３）。その結果は、ＰＡＰＰ−Ａ（単独で、またはＩＧＦを介して）は、アテローム発生を促進する有害事象のメディエーターであるという見解を、少なくとも間接的に裏付ける。

血液循環中のＡＣＳ由来ＰＡＰＰ−ＡはプロＭＢＰとの複合体の状態ではないという本発明者らの知見は、重要な臨床的意義を有し得る。非ＡＣＳ個体では、さまざまなレベルのＰＡＰＰ−Ａが測定され得る（２２、２６、４４）。この免疫反応性の供給源はわかっていないが、精液、卵胞液、黄体、睾丸およびＰＡＰＰ−Ａ発現が報告されている他の器官／組織に由来するものであろう（４５）。８０例の非ＡＣＳ男性被験体（年齢５０〜６９歳）で測定されたＰＡＰＰ−Ａ濃度は、１．５１〜７．５９ｍＩＵ／Ｌまでと変化し、参照上限値の９７．５％は５．６８ｍＩＵ／Ｌであった（２２）。ＡＣＳ間のＰＡＰＰ−Ａ濃度の増加の程度は広くばらつくが、通常、３０ｍＩＵ／Ｌ未満である（２２、２３）。判定限界としての参照上限値の使用は、相当な割合のＡＣＳの患者が見逃され得ることを意味する。本発明者らは、以前に、１４例のＭＩ患者のうち５例においてＰＡＰＰ−Ａ値が、経時的に明白な動態的変化を示しているにもかかわらず、参照上限値未満であったことを報告した（２２）。理想的には、個々の基礎ＰＡＰＰ−Ａ濃度の差に影響されない判定限界を特定するのがよい。本明細書に示す本発明者らの予備的観察結果により、ＡＣＳのない基礎ＰＡＰＰ−Ａ値は、全ＰＡＰＰ−Ａに関するアッセイＴと、プロＭＢＰとの複合体状態のＰＡＰＰ−Ａに関するアッセイＣとにより、ほぼ等しく検出されることが明らかであり、ＰＡＰＰ−Ａの基礎免疫反応性が、ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体によって引き起こされることを示唆する。低レベル（＜４ｍＩＵ／Ｌ）のこの複合体形成形態のＰＡＰＰ−Ａは、ＭＩ患者においても検出されたが、急性状態における動態的変化は、まったくまたはほとんど示されなかった。明らかに、ＡＣＳと関連するＰＡＰＰ−Ａの形態は、プロＭＢＰとの複合体ではない。しかしながら、これまでＡＣＳに使用されているＰＡＰＰ−Ａアッセイは、プロＭＢＰとの複合体であるかそうでないかにかかわらず、全ＰＡＰＰ−Ａを測定する。これは、ＡＣＳにおけるＰＡＰＰ−Ａ評価の大きな制限となる。すでに示したように、ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａの測定の１つのアプローチは、全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰとの複合体状態のＰＡＰＰ−Ａの測定値の差（デルタ値）を算出することである。他の種々の選択肢は、表１に示す通り、好ましくは遊離ＰＡＰＰ−Ａのためのアッセイを使用するものである。本発明者らは、特に不安定アテローム動脈硬化プラークから放出される循環形態のＰＡＰＰ−Ａを測定するために設計したイムノアッセイは、心臓病リスクマーカーとして使用した場合、おそらく、ＰＡＰＰ−Ａの臨床的特異性および感度を改善すると予測する。

最後に、本発明者らの結果より、循環ＡＣＳ関連ＰＡＰＰ−Ａは循環妊娠関連ＰＡＰＰ−Ａと、プロＭＢＰと複合体を形成していないという点で異なるという初めての証拠を提供する。循環ＰＡＰＰ−Ａの以前の測定は、ＡＣＳの疑いを提示する患者における診断値および予後値を有することがあり得たため、これらの知見は、血液循環中のアテローム性動脈硬化関連血漿タンパクＡ（ＡＡＰＰ−Ａ）を正確に測定するためのアッセイの設計に重要な臨床的含意を有する。

本発明の方法は、ほんの一部を本明細書にて開示した種々の実施態様の形態に組み込まれ得ることは認識されるものである。当業者には他の実施態様が存在し、それが本発明の精神から逸脱しないことが自明である。したがって、記載した実施態様は例示であって、制限的なものとして解釈されるべきではない。

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ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰ複合体の概略的なエピトープマップを示す。重なっている円は、サンドイッチ形成が可能でないことを示す。接触している（touching）円は、干渉性サンドイッチ形成を示す。離れている円は、独立したエピトープを示す。プロＭＢＰ上にのみアクセス可能なエピトープを示すｍａｂを太線の円で示し、一方、ＰＡＰＰ−Ａ上にアクセス可能なエピトープを示すｍａｂを細線の円で示す。２つのＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的モノクローナル抗体（Ａ１／Ｂ４）で構成されるアッセイＴ（アッセイＴ＝全ＰＡＰＰ−Ａに対するアッセイ）および検出用のプロＭＢＰサブユニット特異的モノクローナル抗体と捕捉用のＰＡＰＰ−Ａサブユニット特異的モノクローナル抗体（Ａ１／Ａ１１）とで構成されるアッセイＣ（アッセイＣ＝プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａに対するアッセイ）の較正曲線および不正確度プロファイルを示す。各濃度で４つの複製が使われた。黒印を伴う曲線は計測数に関し、白印を伴う曲線は濃度ＣＶに関する。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TM ６精密カラム（ＰＣ３．２／３０）における妊娠第一期血清試料のゲル濾過を示す。ＰＡＰＰ−Ａは、アッセイＴおよびアッセイＣによって検出された。ＰＡＰＰ−Ａ／プロＭＢＰは、サイログロブリン（６６９ｋＤａ）が溶出された位置で単一のピークとして溶出された。ＡＣＳの患者でのＰＡＰＰ−Ａの血清動態を示す。ＰＡＰＰ−Ａは、アッセイＴおよびアッセイＣによって検出された。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TM ６精密カラム（ＰＣ３．２／３０）における、４例のＡＣＳ血清試料と２例の妊娠第一期の血清試料とのゲル濾過による比較を示す。ＰＡＰＰ−ＡはアッセイＴによって検出された。ＡＣＳＰＡＰＰ−Ａは、アポフェリチン（４８１ｋＤａ）が溶出された位置で単一のピークとして溶出された。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TM ６精密カラム（ＰＣ３．２／３０）における、１例のＡＣＳ血清試料（黒印）と１例の妊娠第一期血清試料（白印）とのゲル濾過による比較を示す。ＰＡＰＰ−ＡはアッセイＴによって検出された。Ａは、ｍａｂＡ１での吸着処理の前後での３例の正常血清試料（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３で示す）中のＰＡＰＰ−Ａを示す。Ｂは、ｍａｂＡ１での吸着処理の前後での２例のＡＣＳ血清試料（ＡＣＳ１およびＡＣＳ２で示す）中のＰＡＰＰ−Ａを示す。Ａは、ｍａｂＡ１１での吸着処理の前後での３例の正常血清試料（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３で示す）中のＰＡＰＰ−Ａを示す。Ｂは、ｍａｂＡ１１での吸着処理の前後での２例のＡＣＳ血清試料（ＡＣＳ１およびＡＣＳ２で示す）中のＰＡＰＰ−Ａを示す。ＰＡＰＰ−ＡレベルはアッセイＴにより測定した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TM ６精密カラム（ＰＣ３．２／３０）における、４例のＡＣＳ血清試料（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４で示す）と妊娠第一期の血清試料とのゲル濾過を示す。分画をアッセイＣを用いて分析した。正常被験体におけるＰＡＰＰ−Ａ濃度およびデルタ値（アッセイＴおよびアッセイＣで得られたＰＡＰＰ−Ａ値間の差として定義）の分布を示す箱髭図を示す。プロット１、アッセイＴで測定されたＰＡＰＰ−Ａ濃度。プロット２、アッセイＣで測定されたＰＡＰＰ−Ａ濃度。プロット３、前記２つのアッセイで測定されたＰＡＰＰ−Ａ濃度から得られたデルタ値。箱は、２５〜７５パーセンタイルを示す。髭は、５および９５パーセンタイルを示す。９５パーセンタイルを超えるか、５パーセンタイル未満のすべての値は、独立して黒点でプロットする。横線は、中央値を示す。破線の（dashed）箱は、平均値を示す。全ＰＡＰＰ−Ａ濃度の使用（黒丸を伴う線）と比較したＡＣＳ患者におけるデルタ値の適用（白丸を伴う線）を示す。デルタ値および関連する判定限界は、全ＰＡＰＰ−Ａ濃度の参照上限値の９７．５％にしたがって正規化している。点線は、デルタ値および全ＰＡＰＰ−Ａ濃度の両方の判定限界を示す。

Claims

遊離ＰＡＰＰ−Ａをヒトの急性冠症候群の指標とする方法。
遊離ＰＡＰＰ−Ａが、
ｉ）全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａの測定値の算出された差として、または
ｉｉ）遊離ＰＡＰＰ−Ａのみを測定する直接バイオアフィニティーアッセイにより、
のいずれかによって測定される請求項１記載の方法。
遊離ＰＡＰＰ−Ａが、選択肢ｉ）にしたがって測定され、試料の１つのアリコートが全ＰＡＰＰ−Ａに結合する結合剤に曝露され、該結合剤が検出され、および該試料の別のアリコートがプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａのみに結合する結合剤に曝露され、該結合剤が検出される２つのアッセイが行われ、遊離ＰＡＰＰ−Ａの量が全ＰＡＰＰ−Ａの測定値とプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａの測定値の差として算出される請求項１記載の方法。
前記アッセイが非競合的サンドイッチアッセイである請求項３記載の方法。
前記結合剤が捕捉結合剤または標識化された結合剤である請求項４記載の方法。
遊離ＰＡＰＰ−Ａが、選択肢ｉ）にしたがい、１つの単独の二重検体アッセイであって、試料を全ＰＡＰＰ−Ａに結合する捕捉結合剤および異なる標識で標識化された２種類の検出用結合剤に曝露し、その結果、第１の標識で標識化された第１の検出用結合剤がＰＡＰＰ−Ａ分子のいずれかに存在するエピトープに指向され、第１の標識のシグナルが全ＰＡＰＰ−Ａを得るために使用される、また、第２の標識で標識化された第２の検出用結合剤が該分子のプロＭＢＰサブユニット内のエピトープに指向され、第２の標識のシグナルがプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを得るために使用されるアッセイとして測定される請求項２記載の方法。
遊離ＰＡＰＰ−Ａが、選択肢ｉｉ）にしたがい、試料を遊離ＰＡＰＰ−Ａに結合するがプロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａには結合しない結合剤に曝露することにより測定され、該結合剤に結合された遊離ＰＡＰＰ−Ａを検出する請求項２記載の方法。
遊離ＰＡＰＰ−Ａが、選択肢ｉｉ）にしたがい、プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａを全ＰＡＰＰ−Ａに結合する結合剤に試料を曝露するバイオアフィニティー反応に関与させないことによって測定される請求項２記載の方法。
プロＭＢＰと複合体を形成したＰＡＰＰ−Ａが遮断またはプレ吸着される請求項８記載の方法。
前記結合剤が、抗体、抗体断片またはアプタマーである請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。