JP4996579B2

JP4996579B2 - 生体分子固定化のための方法

Info

Publication number: JP4996579B2
Application number: JP2008279246A
Authority: JP
Inventors: チアツァオユ; ウェンヤンイ; シャオチェンコ; シャンフンツイ; ユアンリャオシュー
Original assignee: フォワードエレクトロニクスカンパニーリミテッド
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: TWI391485B; US20090111713A1; TW200918667A; JP2009139366A

Description

本発明は、生体分子固定化のための方法に、および、より具体的には、製造時間を低減および製造の安定性を向上できる、生体分子固定化のための方法に関する。

現在、多数の研究者が、医学分析に用いられるバイオセンサーの開発に尽力している。バイオセンサーは、固定化された生体分子および、固定化された生体分子と生体試料との間の相互作用後のシグナル変化を測定するためのシグナルトランスデューサから構成される。

一般的に、生体試料の測定に用いられる固定化生体分子は、結合特異性および強い親和性を示さなければならない。一般的に用いられる固定化生体分子は、抗体、抗原、酵素、核酸、組織または細胞である。さらに、シグナルトランスデューサの設計傾向は、電界効果トランジスタ、光ファイバーセンサー、圧電性結晶検出器、弾性表面波センサーなどといった多様性を指向する。固定化生体分子がバイオセンサーに必要であるため、生体分子固定化のための方法は、バイオセンサーの分野において重要な技術の一つである。

図１Ａから１Ｂを参照して、生体分子固定化のための従来法が示される。図１Ａに示す通り、表面改質が、金属薄膜１１１を有する基材１１の表面上で行われ、表面改質層１２を形成する。ここで、従来の表面改質法が金属薄膜１１１において表面プラズモン共鳴スペクトル法と使用される。金属薄膜１１１は金薄膜である。図１Ａに示す通り、ＣＯＯＨ基の表面改質層１２を形成する目的で、有機薄膜を無機金属薄膜と結合するために、従来の浸漬が実施され、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ＭＵＡ）の硫黄の電子対と金属原子の外側の空のオービタルとの間に安定な配位結合を形成する。最後に、図１Ｂに示す通り、表面改質層１２のＣＯＯＨ基が生体分子１３と、カップリング活性化剤、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で結合され、生体分子固定化を実現する。

しかし、１１−ＭＵＡは液体アルコールにしか溶けない。そのため、１１−ＭＵＡを液体アルコールと混合し、およびその後に長期の浸漬を行う必要がある。その結果、浸漬法は、時間がかかる工程であること、および実験不安定性が高いこと、および均一性が低いことという短所を有する。さらに、表面グラフト密度は容易に調節されない。

本発明の目的は、製造時間を低減、製造の安定性を向上、および結合した分子の密度を効率的に調節するために、生体分子固定化のための方法を提供することである。さらに、その方法は、バイオセンサーの感度を効率的に高めるためにバイオセンサーに使用されうる。

その目的を達成するために、本発明は、基材を供給；基材の一表面上にカルボキシ基の表面改質層を形成、ここで表面改質層の形成のための工程はプラズマ表面改質を含む；および多数の生体分子を供給しおよび生体分子を表面改質層と結合することを含む、生体分子固定化のための方法を提供する。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、基材は限定されず、およびシリコン基材でありうる。さらに、基材はその一表面上に金属薄膜を有することができ、および表面改質層は金属薄膜の表面上に形成される。したがって、生体分子固定化は、金属薄膜の表面プラズモン共鳴スペクトル法による検出を行う、ファイバーバイオセンサーの検知範囲に実施されうる。ここでは、金属薄膜は金薄膜または銀薄膜でありうる。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、プラズマ表面改質は低温プラズマによって実施される。プラズマ表面改質は基材の表面上でだけ作用するため、基材の性質は維持されうる。さらに、プラズマ表面改質は乾式であり、およびそれによって、従来の浸漬法と比較して、迅速および簡便な処理およびわずかな環境汚染という長所を有する。さらに、プラズマの反応温度は通常は２００℃未満であり、およびそれによって、高温が基材の性質の変化を生じることが防がれうる。その上に、プラズマ表面改質は、化学組成を自由に設計、架橋の質を調節、製造の安定性を向上、および結合した分子の密度を効率的に調節できる。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、プラズマ表面改質はプラズマ重合によって実施されうる。プラズマ重合においては、プラズマ重合のためのモノマーを低温プラズマに混合し、プラズマ内の高エネルギー電子をモノマーに衝突させ、およびモノマーをさまざまな活性種に分裂させ、および複雑な化学反応を通じて重合した薄膜が基材の表面上に沈着し、その結果、基材の一表面上にＣＯＯＨ基の表面改質層を形成する。結果として、表面改質層は厚みの薄さ、高い均一性、低い孔隙率、基材上の高い接着性および被覆率の特性を示す。ここでは、プラズマ表面改質のためのモノマーはアルコール化合物でありうる。好ましくは、プラズマ表面改質のためのモノマーはイソプロパノールである。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、表面改質層を形成するための工程は、グラフト重合をさらに含みうる。詳細には、表面改質層を形成するための工程は、プラズマ表面改質によって表面活性層を形成；および続いて、表面活性層においてグラフト重合を実施して、基材の一表面上に表面改質層を完成することを含みうる。ここでは、プラズマ表面改質はプラズマ重合によって実施でき、およびプラズマ重合のためのモノマーはアルケニルシラザン化合物でありうる。好ましくは、プラズマ重合のためのモノマーはヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳＡＺ）である。グラフト重合はアルケン酸化合物をグラフト重合のためのモノマーとして使用しうる。ＵＶ光下で、表面活性層およびモノマーの間のグラフト重合が実施されうる。好ましくは、グラフト重合のためのモノマーはアクリル酸である。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、生体分子は、バイオセンサーに使用される抗体、抗原、酵素、組織または細胞でありうる。

本発明に記載の生体分子固定化のための方法では、生体分子は表面改質層と、カップリング活性化剤の存在下で結合されうる。カップリング活性化剤は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびその組み合わせから成る群から選択されうる。

このように、本発明は、製造時間を低減、製造の安定性を向上、環境汚染を低減、およびプラズマ表面改質によって結合した分子の密度を効率的に調節できる。さらに、本発明の表面改質層は、厚みの薄さ、高い均一性、低い孔隙率、基材上の高い接着性および被覆率の特性を示す。さらに、本発明の生体分子固定化のための方法は、高い精度および感度を有するバイオセンサーを提供する目的で、バイオセンサーの感度を効率的に高めるためにバイオセンサーに使用されうる。

本発明の他の目的、長所、および新規の特性は、付属の図面と併せて下記の詳細な説明からより明らかになる。

実施形態１
図２Ａから２Ｂを参照して、本実施形態の生体分子固定化のための方法が示される。

図２Ａに示す通り、一表面上に金属薄膜２１１を有する基材２１がまず供給される。本実施形態では、基材２１はシリコン基材であり、および金属薄膜２１１は金薄膜である。続いて、表面改質層２２が、プラズマ表面改質によって基材２１の金属薄膜２１１上に形成される。

本実施形態では、プラズマ表面改質はプラズマ重合によって実施され、およびプラズマ重合のためのモノマーとしてイソプロパノールを使用する。詳細には、イソプロパノールの原料気体が真空放電系に導入され、および原料気体がさまざまな分子種へ分裂され、続いて複雑な化学反応を通じて重合した薄膜が基材の表面上に沈着し、その結果、基材２１の一表面上にＣＯＯＨ基の表面改質層２２を形成する。ここでは、表面改質層２２は厚みの薄さ、高い均一性、低い孔隙率、基材上の高い接着性および被覆率の特性を示す。

最後に、図２Ｂに示す通り、生体分子固定化のルーチンを完成するために、多数の生体分子２３が供給され、および生体分子２３のアミノ基が表面改質層２２のＣＯＯＨ基と、カップリング活性化剤の存在下で結合する。本実施形態では、カップリング活性化剤はＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）である。

実施形態２
図３Ａから３Ｃを参照して、本実施形態の生体分子固定化のための方法が示される。

図３Ａに示す通り、一表面上に金属薄膜３１１を有する基材３１がまず供給される。本実施形態では、基材３１はシリコン基材であり、および金属薄膜３１１は金薄膜である。続いて、表面活性層３２'が、プラズマ表面改質によって基材３１の金属薄膜３１１上に形成される。本実施形態では、プラズマ表面改質はプラズマ重合によって実施される。プラズマ重合のための工程は、本実施形態がプラズマ重合のためのモノマーとしてヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳＡＺ）を用いることを除き、実施形態１と同一である。結果として、図３Ａに示す通り、表面活性層３２'が形成される。

次いで、図３Ｂに示す通り、ＣＯＯＨ基の表面改質層３２を基材３１の表面上に形成するために、ＵＶ光下で、グラフト重合のためのモノマーとしてアクリル酸が表面活性層３２'へ図３Ａに示す通りグラフト重合によって結合される。

最後に、図３Ｃに示す通り、生体分子固定化のルーチンを完成するために、多数の生体分子３３が供給され、および生体分子３３のアミノ基が表面改質層３２のＣＯＯＨ基と、カップリング活性化剤の存在下で結合する。本発明の実施形態で使用されるカップリング活性化剤はＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）である。

本発明は好ましい実施形態に関連して説明されているが、ここで請求される本発明の範囲を離れることなく、多数の他の可能な改変および変形を行うことができると理解される。

図１Ａから１Ｂは、生体分子固定化のための従来法の概略図を示す。図２Ａから２Ｂは、本発明の好ましい一実施形態の生体分子固定化のための方法の概略図を示す。図３Ａから３Ｃは、別の好ましい一実施形態の生体分子固定化のための方法の概略図を示す。

Claims

基材を供給する；
基材の一表面上にカルボキシル基の表面改質層を形成、ここで表面改質層の形成のための工程は、モノマーとしてアルキルシラザン化合物を使用するプラズマ重合およびモノマーとしてアルケン酸化合物を使用するグラフト重合を含み、前記グラフト重合は前記プラズマ重合の後に実施される；および
多数の生体分子を供給しおよび生体分子を表面改質層と結合する
：ことを含む、生体分子固定化のための方法。
生体分子が表面改質層と、カップリング活性化剤の存在下で結合される、請求項１で請求される方法。
カップリング活性化剤がＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドである、請求項２で請求される方法。
基材がその一表面上に金属薄膜を有し、および表面改質層が金属薄膜上に形成される、請求項１で請求される方法。
金属薄膜が金薄膜または銀薄膜である、請求項４で請求される方法。
プラズマ重合のために使用されるモノマーがヘキサメチルジシラザンである、請求項１で請求される方法。
グラフト重合がＵＶ光下で実施される、請求項１で請求される方法。
グラフト重合のために使用されるモノマーがアクリル酸化合物である、請求項１で請求される方法。