JP4992071B2

JP4992071B2 - 眼球組織への生理活性薬剤導入のための組成物及び装置

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Publication number: JP4992071B2
Application number: JP2005221346A
Authority: JP
Inventors: 祥三園田; 泰二坂本
Original assignee: 国立大学法人鹿児島大学
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: JP2007031411A

Description

本発明は超音波エネルギーを利用した眼球組織への生理活性薬剤の導入のための組成物及び装置に関する。

疾患に関わる遺伝子情報が解明され、それを治療に応用する遺伝子治療に注目が集まっている。遺伝子治療は、細胞障害を伴うことなく目的遺伝子が標的細胞に取り込まれ、目的遺伝子が蛋白合成を行う必要がある。また、遺伝子治療以外でも、薬物を標的細胞や標的部位にのみ運び（デリバー）作用させることで、薬物治療の効率を上げ、正常細胞への副作用を軽減しようとするドラッグデリバリーにも大変注目が集まっている。

一方、視覚は日常生活において重要な感覚であり、平均寿命の延長に伴って遺伝子眼疾患、難治性疾患も増加の一途をたどり社会的な問題となっている。

眼球組織（図７）（特に網膜、虹彩、水晶体等の眼球内部組織）は外部と交通のない組織であるため、生理活性薬剤を安全かつ効率的に投与することは従来不可能であった。

眼科における遺伝子治療の分野では、動物を用いたウイルスベクターによる遺伝子導入で網膜変性症などの遺伝性疾患の症状を改善できることがわかり、治療への期待は大きい。しかし、ウイルスベクターは目的遺伝子と同時にベクターの遺伝子も組み込まれるため、安全性の面で人への臨床応用となると問題も多くあたらな方法を模索している現状である。

眼科におけるドラッグデリバリーに関しては、すでに臨床応用が始まっているが単純に投与薬物を標的細胞近くに供給しゆっくりと除放すると言う形にとどまっている。

遺伝子導入法の１つとしてソノポレーション法が知られている。この方法は、細胞に超音波を照射すると細胞膜に可逆性の小さな孔が出現し、その孔を介して様々な物質が細胞内に取り込まれるという現象を利用したものであり、近年関心が集まっている（特許文献１）。しかしながら、眼球は脆弱な組織であるため既存のソノポレーション法では侵襲が大きすぎるため、眼球組織に対する臨床的応用は進んでいない。

特開２００４−１８２７２８号公報

本発明は、超音波エネルギーを利用した眼球組織への遺伝子、薬物、その他種々の物質（本明細書で「生理活性薬剤」又は単に「薬剤」と称することがある）の導入に適した組成物を提供することを目的とする。

本発明はまた、超音波照射によって生理活性薬剤を細胞内に導入するために、眼球において安全に超音波照射可能な装置を開発することを目的とする。これまでに超音波による生理活性薬剤の導入を行うために実験室レベルで利用可能な超音波照射装置は存在しているが、眼球及び眼周囲組織へ与えるダメージが大きいため、実用的な利用には向かず改良が必要である。

ここで「安全に超音波照射可能な装置」とは以下の項目の少なくとも１つを満たすものであることが好ましい。１．眼球という臓器の形状及び特性に最適化した超音波照射装置であること。２．眼球を構成する細胞（特に網膜や視神経）は、感覚細胞というセンサーのようなデリケートな細胞であるために、細胞障害性には特に配慮した装置であること。３．超音波照射部だけではなく、投与されるべき生理活性薬剤を標的部位に効率的に供給することができる構造を併せ持つこと。４．照射部における超音波の周波数、エネルギーは単一のものではなく、眼球の各部位においても異なるために、種々の因子の出力を調整する事ができる装置であること。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）眼球組織に生理活性薬剤を導入するための組成物であって、導入されるべき生理活性薬剤と微小気泡含有小球体とを含有することを特徴とする眼球組織への生理活性薬剤導入用組成物。

（２）前記生理活性薬剤が、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプルヘリックスフォーミングオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、ヌクレオチドベクター、ウイルスベクターおよびプラスミドからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする（１）記載の組成物。

（３）眼球内部組織への生理活性薬剤の導入のための超音波照射装置であって、
眼球内部組織に挿入されて標的部位に超音波を照射する、超音波発生部を備えた超音波照射部と、
前記超音波照射部を冷却するための冷却手段とを備えた前記装置。
（４）前記冷却手段が、灌流液を前記超音波照射部の外表面上を流れるように灌流させる手段である、（３）記載の装置。

（５）前記超音波照射部が、太さが１．５ｍｍ以下、長さが３０ｍｍ以上である略棒状の形状である（３）又は（４）記載の装置。
（６）生理活性薬剤を標的部位に供給するための供給手段を更に備えた（３）〜（５）の何れか記載の装置。

（７）標的部位を観察するための観察手段を更に備えた（３）〜（６）の何れか記載の装置。
（８）生理活性薬剤を標的部位に供給するための供給手段と、標的部位を観察するための観察手段とを更に備え、
前記供給手段に含まれ、標的部位に向けられる部材と、前記観察手段に含まれ、標的部位に向けられる部材とが、各部材の先端部が前記超音波照射部の先端部に位置するように前記超音波照射部の内部に配設されている（３）〜（５）の何れか記載の装置。

（９）眼球表面組織への生理活性薬剤の導入のための超音波照射装置であって、
眼球表面組織の標的部位に超音波を照射する、超音波発生部を備えた超音波照射部と、
前記超音波照射部に配設された、瞼が前記超音波照射部の先端部に接触することを阻止するための瞼接触阻止部材とを備えた前記装置。

（１０）前記瞼接触阻止部材が超音波照射方向に向けて先広がり状に形成された部材である（９）記載の装置。
（１１）前記瞼接触阻止部材の全部又は一部が実質的に透視可能な材料で構成されているか、又は、前記瞼接触阻止部材の一部に開口部が設けられている（９）又は（１０）記載の装置。

（１２）前記超音波照射部を冷却するための冷却手段を更に備えた（９）〜（１１）の何れか記載の装置。
（１３）前記冷却手段が、灌流液を前記超音波照射部の外表面上を流れるように灌流させる手段である、（９）〜（１２）の何れか記載の装置。
（１４）生理活性薬剤を標的部位に供給するための供給手段を更に備えた（９）〜（１３）の何れか記載の装置。

本発明に係る組成物を用いれば、ソノポレーション法により生理活性薬剤を効率的に眼球組織に導入することが可能である。

本発明に係る超音波照射装置を用いてソノポレーション法を行えば、眼球組織の各部位（眼球表面組織又は眼球内部組織）への生理活性薬剤の導入を効率的かつ安全に行うことができる。

本発明において眼球組織に導入されるべき生理活性薬剤としては生理活性を有するものであれば特に限定されず、生理活性を有する核酸、タンパク質（ペプチドを含む）、糖、その他の化合物などの合成又は天然の生理活性化合物が挙げられる。なかでも、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプルヘリックスフォーミングオリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、オリゴヌクレオチドプローブ、ヌクレオチドベクター、ウイルスベクターおよびプラスミドからなる群より選択される少なくとも１種の生理活性薬剤が好ましく、とりわけ、生理活性薬剤を有する遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡが特に好ましい。その他の生理活性薬剤としては、消炎剤（例えばコルチコステロイド）、免疫抑制剤（例えばサイクロスポリン、タクロリムス）、種々の光感受性物質、血管新生を促進又は抑制する活性を有する成分（例えばＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦに対するオリゴタイプｓｉＲＮＡ）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＮＦκＢデコイなどが挙げられるがこれらには限定されない。

プラスミドＤＮＡにコードされる遺伝子の生理活性は、特に限定されないが、例えば、眼における疾患に対応する遺伝子、すなわち、眼における疾患に対して拮抗的に作用する遺伝子や疾患における欠如を補足する遺伝子が用いられる。このような遺伝子としては、例えば、サイトカイン、成長因子、抗体または抗体断片、サイトカインまたは成長因子に対するレセプター、増殖防止または増殖抑制作用を有するタンパク質、酵素、脈関係抑制剤、血栓誘発物質、および凝集抑制剤、フィブリン溶解作用を有するタンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌性抗原および寄生動物性抗原、腫瘍抗原、血液循環に効果を有するタンパク質、ペプチドホルモン、ならびにリボザイムおよびアンチセンスＲＮＡのようなリボ核酸からなる群より選択される薬理活性化合物をコードする遺伝子等が挙げられる。

本発明に用いられる微小気泡含有小球体としては、例えば、不溶性ガスであるパーフルオロカーボンを含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体が挙げられる。微小気泡含有小球体は弾性、圧縮性があり、水より密度が低く、生体組織と体液の間で音響インピーダンスの不均衡を生じる。よってこのような性質により超音波を効率良く反射する。また、微小気泡含有小球体はキャビテーションのためのエネルギー閾値を低下させる。キャビテーションにおいて、超音波エネルギーはミクロ領域に濃縮され、キャビテーションは安全性には影響がない小さな衝撃波を引き起こし薬剤の細胞透過性を増加させる。キャビテーションは微小気泡含有小球体を破壊し、微小気泡含有小球体に付着あるいは封入されていた生理活性薬剤が放出される。こうして、超音波照射により、生理活性薬剤が細胞に導入され得る。

パーフルオロカーボンを含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体としては、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標名、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）が特に好ましく用いられる。Ｏｐｔｉｓｏｎは従来から超音波診断用造影剤として使用されており、その安全性が確認されている。

本発明の生理活性薬剤導入用組成物は、上述の生理活性薬剤と微小気泡含有小球体とを混合することにより得ることができる。混合割合は特に限定されないが、例えば、生理活性薬剤に対して微小気泡含有小球体が１〜９０重量％、好ましくは５〜５０重量％、より好ましくは７〜３０重量％、最も好ましくは１０〜２０重量％となるような割合である。本発明の組成物中では生理活性薬剤は微小気泡含有小球体の気泡の近傍に存在するか、表面に存在するか、或いは気泡内部に封入されているものと考えられる。

本発明において薬剤導入の標的となる眼球組織としては、より具体的には、網膜、強膜、虹彩、水晶体、ぶどう膜、視神経等の眼球内部組織や、角膜、結膜等の眼球表面組織が挙げられる。なかでも眼球深部組織である網膜及び強膜は、従来、薬剤の送達が特に困難であるとされてきたが、本発明によればこれらの組織にも非侵襲的に薬剤を送達することができる。

本発明の組成物を用いた角膜組織への薬剤導入方法としては、例えば、本発明の組成物を角膜実質内に注射したのち超音波照射を行う方法が挙げられる。網膜、強膜等の眼球深部組織への薬剤導入方法としては、例えば、本発明の組成物を硝子体内に注射したのち超音波照射を行う方法が挙げられる。

照射される超音波の周波数、強度、照射時間などは送達すべき薬剤の種類、量、疾患の状態などの諸事情に応じて適宜選択できるため特に限定されないが、非限定的に例示するとすれば、周波数は０．１〜１０ＭＨｚ、好ましくは０．５〜５ＭＨｚ、より好ましくは０．７〜３ＭＨｚ、最も好ましくは０．８〜１．５ＭＨｚ（例えば１ＭＨｚ）であり、強度は好ましくは０．１〜１０ｗ／ｃｍ^２、より好ましくは０．７〜３ｗ／ｃｍ^２、最も好ましくは０．８〜１．５ｗ／ｃｍ^２（例えば１ｗ／ｃｍ^２）であり、ｄｕｔｙ比（一定時間あたりの超音波のｏｎ／ｏｆｆ割合）は好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２５〜７５％、最も好ましくは４０〜６０％（例えば５０％）であり、照射時間は好ましくは１〜９９９秒間、より好ましくは３０〜３００秒間、最も好ましくは６０〜１２０秒間である。例えば、網膜に対してルシフェラーゼプラスミドを導入する場合、周波数１ＭＨｚ，強度１ｗ／ｃｍ^２、照射時間１２０〜２４０秒、ｄｕｔｙ比５０％が最も効率に遺伝子導入できる条件である。

本発明の組成物の送達に使用し得る超音波照射装置の特に特に好ましい形態を以下に説明する。なお下記の超音波照射装置は上記組成物として調製された生理活性薬剤を送達するのに用いることができるだけでなく、他の形態の生理活性薬剤を送達するためにも使用することができる。

眼球は、その前方上方部に眉丘が存在し、内側には鼻骨が存在し、後方が眼窩骨によって囲まれたスペースに位置する約２．５ｃｍ程度の球状の臓器である。また、眼球の最前にある角膜は、上下のまぶた（眼瞼）におって覆われている（図７a）。言い換えると、入り口が狭くなった小さな袋の中に位置している臓器である。従って、眼球に超音波を照射するには、その標的部位に応じて超音波プローブの形状を変えることが好ましい。

例えば、水晶体、ぶどう膜、網膜、視神経、前房や硝子体腔（図７ｂ）といった眼球内部組織を標的部位する場合は眼内用超音波プローブ１が好ましく、角膜、強膜の一部、結膜、眼瞼、眼球周囲皮膚など（図７ａ）の眼球表面組織を主な標的部位とする場合は眼外用超音波プローブ２が好ましい。

上記２種類の超音波プローブは照射標的部位は異なるが、眼球という狭いエリアへの照射という点は共通である。両者に共通する構造としては、上記２種類の超音波プローブは共に、標的部位に超音波を照射する部材（本明細書において「超音波照射部」又は単に「照射部」と称する）１１，２１と、術者が超音波プローブを保持するための部材（本明細書において「支持部」と称する）１２，２２が挙げられる。また、超音波照射部の形状は通常は細長い形状であるから、超音波エネルギーを効率的に組織に伝えるためには、超音波発生部１０１、２０１は照射部の先端部に位置していることが好ましい。

照射する超音波エネルギーは０．５〜１０ＭＨｚ、２ｗ／ｃｍ^２以下であることが好ましい。この範囲であれば、超音波照射によって標的部位が高熱になることはまれである。しかし、照射部が組織を強く押しつけるように接触した場合には、同部位に熱が発生し組織障害を起こす可能性は考慮しておく必要がある。眼内用超音波プローブ及び眼外用超音波プローブともに照射部を冷却するための冷却手段を備えていることが好ましい。特に眼内用超音波プローブにおいては冷却手段を備える必要性が高い。

眼内用超音波プローブにおいて特に重要な点は、照射部の大きさである。硝子体腔、前房に照射部を挿入するには、眼球の外壁の一部である毛様体扁平部強膜や輪部角膜（図７ａ，ｂ）を穿刺した上で、超音波照射部１１を挿入する必要がある。同部位以外を穿刺すると穿刺にともなって網膜剥離などの合併症が起こるために、この部位にしか穿刺することができない。穿刺の幅は大きすぎると眼球が虚脱して組織が障害されるため、穿刺の幅は１．５ｍｍ以内にとどめなければならないのが通常である。従って照射部の太さ１６はその穿刺部を通ることが可能な大きさ、すなわち１．５ｍｍ以内であることが好ましい。照射部の長さ１７は、穿刺部から最も離れた場所に位置する視神経（図７ｂ）まで約２０ｍｍ程度であることから、最低３０〜４０ｍｍの長さであることが好ましい。

眼内用超音波プローブ１の照射部１１を硝子体腔や前房（図７ｂ）に挿入して、標的部位の状況を詳細に確認するためには、更に、標的部位を観察するための手段を備えたものであることが好ましい。かかる観察手段としては、例えば、眼内用超音波プローブに光源や内視鏡による観察システムを搭載することが好ましい。

眼外用超音波プローブ２の標的部位は表面組織であるから、眼内用１と異なり、穿刺する事なく標的部位に直接到達することができる。従って、超音波照射部の太さは照射先の大きさに適合するように適宜選択することができる。眼外用超音波プローブ２の照射標的部位は角膜や結膜（図７ａ）が主であること、及び、あまり大きすぎると標的以外の部位にも超音波があたることを考慮すると、照射部の太さ２６は３〜９ｍｍ程度であることが好ましい。また、標的部位の大きさに応じて選択可能な複数の種類の太さの超音波照射部を用意することが好ましい。

眼外用超音波プローブ２では、標的部位である角膜、結膜、強膜の一部（図７ｂ）等に照射を行おうとすると、まばたきによって上下眼瞼（図７ａ）が照射部の先端を圧迫するため正確な照射が行えない可能性がある。そこで、眼外用超音波プローブ２は更に、瞼がその先端部に接触することを阻止するための瞼接触阻止部材を備えていることが好ましい。瞼接触阻止部材は超音波照射方向に向けて先広がり状に形成された部材４であることが好ましい。

標的部位への効率的な生理活性薬剤の投与を達成するためには、超音波プローブ１，２は更に生理活性薬剤を標的部位（通常は超音波照射部の先端部の近傍）に生理活性薬剤を供給するための供給手段を備えていることが好ましい。眼内用超音波プローブでは、前述の通り、超音波照射部のサイズを小さくする要請があることから、該供給手段は超音波照射部の内部に配設されていることが好ましい。眼外用超音波プローブでは、照射部のサイズに大きな制限がないことから、該供給手段は照射部の外部に付設されてもよい。

通常は、超音波周波数、出力、出力時間、一定時間あたりの超音波のｏｎ／ｏｆｆ割合などは、コントロールユニット６（図６）を用いて制御される。また、超音波照射部は清潔域であるために、超音波照射の開始、灌流などをフットスイッチ６９で管理することが好ましい。フットスイッチ６９もまたコントロールユニット６に接続される。

本発明について一実施形態を挙げ、図面に基づいて以下に説明する。なお、本発明は以下に記述する実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載した技術思想の範囲において種々の変更が可能なのは言うまでもない。

図１は、超音波プローブ（図１ａ：眼内用、図１ｂ：眼外用）の斜視図である。
眼内用超音波プローブ１は、眼内に挿入される超音波照射部１１と術者が超音波照射部を操作するための支持部１２からなり、コントロールユニット６へつながるコード１３を有する。支持部１２は、灌流冷却を行うために灌流液を流通させるチューブに接続されるコネクタ１４を有している。

眼内用超音波プローブ１は、直径約２５ｍｍの眼球内（硝子体腔、前房）（図７ｂ）に挿入して用いられる。照射部１１は好ましくは、長さ１７が３０ｍｍ以上、例えば３０〜４０ｍｍ程度であり、太さ１６が１．５ｍｍ以下、例えば１〜１．５ｍｍ程度である略棒状（例えば円柱形）の形状である。支持部１２については、術者の好みに応じて適宜選択し得るが、照射部の操作性を考慮すれば、長さ１９が４０〜５０ｍｍ、太さ１８が１０ｍｍ以内の円柱型が適切である。

図２ａは眼内用超音波プローブ１の中心軸に沿った断面図を示す。図２ｂは眼内用超音波プローブ１の先端部を超音波照射方向から見た図である。図２ｃは眼内用超音波プローブ１の先端付近の図２ｂの破線に沿った矢印方向からの拡大断面図を示す。眼内用超音波プローブ１は、超音波発生部１０１以外に、ライトガイド１０６、内視鏡用レンズ１０２、画像転送用のイメージガイド１０５、種々の生理活性薬剤を投与するための供給路１０３を備えている。ライトガイド１０６、内視鏡用レンズ１０２、画像転送用のイメージガイド１０５、及びそれらに接続された内視鏡システムが、本発明における観察手段に相当する。種々の生理活性薬剤を投与するための供給路１０３、薬剤送達用チューブ１１０、及びそれらに接続された薬剤送達システムが、本発明における供給手段に相当する。薬剤送達システムとしてはシリンジ、ポンプ等が挙げられる。また、シリンジ等の薬剤送達システムと供給路１０３とはチューブ１１０を経ずに直接接続されてもよい。生理活性薬剤を投与するための供給路１０３は図２ｂの破線で示される面を通る断面上には現れないため、図２ａ及びｃでは供給路１０３は想像線で記載されている。超音波発生部１０１は直径０．７〜１ｍｍの大きさであることが好ましい。超音波発生部１０１の背部にはチューブ１０４が接続されており、チューブ１０４はコード１３を経由してコントロールユニット中の高周波数発信源に接続される。画像転送用のイメージガイド１０５の先端側には、イメージガイドとほぼ同径の円柱状の対物レンズ１０２が配置されている。イメージガイド１０５の外径は、好ましくは０．３ｍｍ程度である。材質は石英系光ファイバー、プラスチック系光ファイバーまたは多成分ガラス系光ファイバーなどが利用可能で特に限定されない。また対物レンズ１０２はロッドレンズの他、複数枚のレンズを組み合わせた光学レンズユニットであってもよい。供給路１０３は、所定の厚さを有する細径管であり生理活性薬剤を流通させることができる。照射部１１は外套１０９で覆われている。外套１０９はステンレスなどの耐蝕性をもつ素材から構成された管である。照明用の複数のライトガイド１０６はイメージガイド１０５、対物レンズ１０２、供給路１０３とともに、外套の隙間を埋めるように長軸方向に沿って配設される。ライトガイドの本数は特に限定するものではなく、素材は石英、プラスチックなど公知の素材から任意に選択できる。

超音波プローブ１は灌流冷却用に灌流液の流路１０７を有する。流路１０７の開口部１０８は照射部１１と支持部１２の移行部に設けられている。流路１０７は支持部後方のコネクタ１４から枝分れを経て開口部１０８に至る（流路１０７の枝分れの様式についてはプローブ２における流路２０７と同様である。流路２０７についての明細書中の記述、並びに図３ａ及びｂを参照されたい）。コネクタ１４はコントールユニットの６４の部位に接続されて灌流装置と連接される。灌流液は灌流装置につながった灌流ボトルから供給され、流路１０７を経て開口部１０８から排出される。排出された灌流液は照射部１１の外表面上を流れて同部位を冷却する。効率的な冷却のためには更に、スリーブ５１を用いることが好ましい（スリーブについては後記参照）。流路１０７、開口部１０８、灌流装置、灌流ボトル、スリーブ５１等が本発明における冷却手段に相当する。

図３ａは眼外用超音波プローブ２の中心軸に沿った断面図である。図３ｂは図３ａの破線における矢印方向から見た断面図である。眼外用超音波プローブ２は、眼内用超音波プローブ１と同様に、照射部２１、支持部２２を有する。超音波発生部２０１、チューブ２０９、コード２３、灌流液の流路２０７、流路２０７の開口部２０８、コネクタ２４はそれぞれ、眼内用超音波プローブ１における超音波発生部１０１、チューブ１０４、コード１３、灌流液の流路１０７、流路１０７の開口部１０８、コネクタ１４に対応する。各部材の機能及び構成については眼内用超音波プローブ１の説明を参照されたい。流路２０７は支持部後方のコネクタ２４の近傍で２本に枝分れし、一方は支持部２２の長手方向に沿って開口部１０８に至るように形成されており、他方は分岐点から架橋流路２０７ａを経て支持部の中心軸に関して反対方向に迂回されたのち（図３ｂ）、支持部２２の長手方向に沿って開口部１０８に至るように形成されている（プローブ１における流路１０７についても同様である）。なお図３ａにおいて架橋流路２０７ａは中心軸を通る断面上に存在しないため、想像線で描く。眼外用超音波プローブ２の長手方向に沿って付設された生理活性薬剤の供給路２５は眼内用超音波プローブ１の供給路１０３に相当する（図３ａにおいて供給路２５は中心軸を通る断面上に存在しないため、想像線で描く）。ただし供給路２５は支持部２２の内側を通り、照射部２１の側壁部の外表面上を通るように付設されているという点で上記１０３と相違する。供給路２５が照射部２１の側壁部の外表面上を通るように付設されているのは、超音波を発信する面を大きく確保するためである。供給路２５は１９〜２６ゲージ程度の内径をもつ。供給路２５、薬剤送達用チューブ２０５、及び薬剤送達用チューブ２０５に接続された薬剤送達システムが、本発明における供給手段に相当する。薬剤送達システムとしてはシリンジ、ポンプ等が挙げられる。また、シリンジ等の薬剤送達システムと供給路２５とはチューブ２０５を経ずに直接接続されてもよい。眼外用超音波プローブ２では標的部位の肉眼による観察が可能であるから、内視鏡システム等の観察手段は必ずしも必要ない。

眼外用超音波プローブ２による照射標的部位は主に角膜や結膜、眼瞼（図７ａ）である。これらの組織は体表にあるため、眼内用超音波プローブ１のように小型である必要はない。術者が安定して超音波照射部を保持できること目的に、支持部２２は長さ２９が１０ｃｍ程度、太さ２８が１．５〜２ｃｍ程度の円柱形であることが好ましい。照射部の長さ２７は２〜３ｃｍ程度、太さ２６については、照射予定部位の大きさによって異なるが、角膜径を考慮すると３ｍｍ〜９ｍｍ程度の範囲であることが好ましい。より好ましくは、照射部の太さ２６が異なる複数の眼外用超音波プローブ（例えば照射部の太さ２６が３ｍｍ刻み３種類：３ｍｍ，６ｍｍ，９ｍｍのもの）を用意して適宜選択できるようにしておく。

眼外用超音波プローブ２を使用する際の問題点は、まばたきにより患者の瞼が照射部に接触して照射の位置ずれなどが起こる事である。そこで眼外用超音波プローブ２は更に、瞼がその先端部に接触することを阻止するための瞼接触阻止部材４を備えていることが好ましい。瞼接触阻止部材４は標的部位が存在する超音波照射方向に向けて先広がり状に形成された部材４であることが好ましい。図４ａは瞼接触阻止部材４の斜視図であり、図４ｂは同部材の中心軸を通る面による縦断面図である。瞼接触阻止部材４は図４aの上部方向から眼外用超音波プローブ２の先端部を挿入することにより、眼外用超音波プローブ２に略同軸的に装着される。瞼接触阻止部材４はコーン状になった壁部４１の全部又は一部が実質的に透視可能な材料（例えば透明なアクリル性樹脂）で構成されているか、又は、壁部４１の一部に開口部４４が設けられていることによって、術者が眼球表面を視認し得るものであることが好ましい。壁部４１の開放された側の縁端部を上下眼瞼（図７ａ）が挟む形となって、瞼が照射部に直接に接することが阻止される。壁部４１の開放された側の縁端部が構成する円は半径７ｍｍ程度であることが好ましい。この大きさである場合、壁部４１の縁端部を瞼の間に入れることが容易であり且つ外れ難いからである。

瞼接触阻止部材４は、超音波プローブの照射部が挿入される側の端部に、同部材の中心軸方向に突出するように形成され、中央に開口部を有する壁部４３を有している。壁部４３は、照射時に超音波照射部の先端を角膜や結膜に強く押しつけすぎないようにするストッパーの役割を担う。照射部２１と支持部２２との段差部分が壁部４３に当接することにより、眼外超音波プローブ２の照射部２１を図４ｂ上方向から挿入するときに、眼外超音波プローブ２が一定程度以上図４ｂ下方向に挿入されることが禁止される。例えば、支持部２２の太さが１．５〜２ｃｍであり、照射部２１の最大太さが９ｍｍである場合には、壁部４３により包囲される開口部の内径を１ｃｍとすることでその機能を持たせることができる。

超音波プローブ１，２ともに、使用時には、冷却のためにスリーブ５１を装着することが好ましい。スリーブ５１は図５に示す通り、内径の大きい部分５２と、内径の小さい部分５４と、両部分を接続する、内径が中心軸方向に沿って連続的に変化する移行部５３とを有する中空構造を有する。超音波照射部１１、２１は、内径の大きい部分５２の開放端から挿入されるから（図１参照）、超音波照射部１１、２１の挿入を容易にすることを目的として、図５に示すように、内径の大きい部分５２は移行部５３との接続部分から開放端方向に向けて内径が連続的に広がった形状であることが好ましい。超音波プローブ１，２にスリーブ５１が装着された場合、図５に示す通り、内径の大きい部分５２は支持部１２、２２に密着し、移行部５３は開口部１０８，２０８の灌流排出方向に間隙を構成し、内径の小さい部分５４の内壁面と照射部１１、２１の外壁面との間には僅かな隙間が形成される。そして、灌流液が流路１０７、２０７を経て開口部１０８，２０８より排出されると、内径の小さい部分５４の内壁面と照射部１１、２１の外壁面との間の僅かな隙間を経由して、灌流液が超音波照射方向に流れ出る構造になっている。この灌流液の流れによって、照射部の外表面が冷却され、さらに照射面にも冷却された液体が供給されるため、超音波照射部の予想外の発熱に対応する事ができる。スリーブ５１の内径の大きい部分５２は支持部１２、２２の外径と同一の内径を有する部分を含んでいることが好ましく、内径の小さい部分５４の内径は照射部１１、２１の外径よりも０．１〜１ｍｍ程度大きいことが好ましい。内径の小さい部分５４の中心軸に沿った長さは１〜２ｃｍ程度が好ましい。移行部５３の中心軸に沿った長さは５ｍｍ以内であることが好ましい。また、スリーブ５１は柔軟なシリコン製であることが好ましい。スリーブ５１をシリコン製にすることにより、標的部位に応じて照射部スリーブを適宜切除して長さを調整することが可能となる。

眼内用、眼外用超音波プローブ１，２とも好ましくは共通のコネクタ形状を備えたコード１３，２３の形状を有し、コード１３，２３はコントロールユニット６の接続口６５に接続される。コントロールユニット６の制御部６２において、超音波の周波数、エネルギー、照射時間、一定時間あたりの超音波のｏｎ／ｏｆｆ割合を制御できる。コントロールユニット６はまた、それらのパラメーター設定を表示するモニター６１を有する。また灌流冷却用の灌流液が貯留された灌流ボトルからの流路がコントロールユニット６の部位６４に接続され、コントロールユニット６内部の灌流装置で灌流圧をコントロールして、コネクタ１４，２４を経て流路１０７、２０７に灌流を供給する。超音波のｏｎ／ｏｆｆ、灌流量などはコントロールユニットに接続するフットスイッチ６９によって調整することができる。

またコントロールユニット６はその内部に内視鏡の光源、ＣＣＤカメラを備え、眼内用超音波プローブ１からの映像を取り込み，内視鏡へ光を供給することができるものであることが好ましい。また、外部出力端子から既存のテレビモニターに映像を映し出すことができるものであってもよい。

次に、眼内用超音波プローブ１を使用する場合の手順について説明する。理解の容易のために、網膜を標的部位とし、硝子体腔で超音波照射を行う場合を例に挙げて説明するが、下記の手順は原則として他の態様で本発明の装置を使用した場合にも当てはまる。

まず処置を始める前に、標的部位に適合した照射条件を、コントロールユニット６を用いて設定する。超音波プローブ１にスリーブ５１を装着し、灌流冷却システムが機能していることを確認する。供給路１０３は、精製水を一度通水し、正常であることを確認した上で、供給路１０３を空気で置換しておく。導入されるべき生理活性薬剤を含んだシリンジをチューブ１１０に装着し、ゆっくりとシリンジを進めて供給路１０３内の空気を押し出しておく、その後、角膜輪部から３．５ｍｍ離れた毛様体扁平部強膜を約１ｍｍ強穿刺（図７，８を参照）し、眼内用超音波プローブ１の照射部１１を挿入する。照射部を内視鏡モニターで観察しながら目的の部位まで進める。シリンジをゆっくりと押して必要量を眼内へ投与する。モニターで投与物が広がることを確認しながら、超音波照射を開始する。照射後、内視鏡で照射部、周囲組織に異常がないことを確認して超音波照射部を引き抜く。その後、強膜穿刺部を８−０程度の太さの糸で縫合して処置を終了する。

また、この方法は従来の硝子体手術に準じていることから、硝子体手術の併用療法などにも応用が可能である。例えば、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性の手術後の追加処置として、血管新生抑制因子などを超音波によって、網膜に導入することなどが可能である。

以上説明したように、本発明に係る超音波装置を使うと、眼組織に特異的に安全に遺伝子や薬物、蛋白を投与することが可能である。遺伝性の眼疾患に対しての新たな治療可能性がひらかれ、近年注目を集めている眼内への薬物送達（ドラッグデリバリー）にも応用可能であり、難治性の眼疾患の治療法の選択肢が増え、治療成績の向上が期待できる。

以下、本発明に係る眼球組織への生理活性薬剤導入用組成物について実施例により説明するが、本発明は実施例に記載された範囲には限定されない。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける遺伝子導入
ｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＯｐｔｉｓｏｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）とを５：１（重量比）の割合で混合した。ラット角膜上皮細胞（ＲＣ−１）を２４ウェルプレートに細胞数８×１０^４個／２４ウェルとなるように加え、各ウェルに上記混合物を０．６μｌ添加した。各ウェル中の試料をＭＥＭ培地により１０００μｌに調整した。

超音波照射装置としてはソニトロン２０００（商標名：ＲｉｃｈｍａｒＩｎｃ．）を使用した。超音波の周波数は１ＭＨｚ、強度は１Ｗ／ｃｍ^２、Ｄｕｔｙ比５０％、照射時間は６０秒とした。照射後４８時間ののち蛍光実体顕微鏡を用いてＧＦＰ陽性細胞を計数して導入効率を算出した。

比較のために、超音波照射しない系（ＵＳ（−））、超音波照射（周波数１ＭＨｚ，１Ｗ／ｃｍ^２、Ｄｕｔｙ比５０％、照射時間６０秒）するがＯｐｔｉｓｏｎを添加しない系（ＵＳ（＋））についても同様の実験を行った。

なお本明細書及び図面において、ＵＳとはｕｌｔｒａｓｏｎｉｃすなわち超音波を意味し、ＭＢとはｍｉｃｒｏｂａｂｂｌｅすなわち微小気泡含有小球体を意味する。

結果を図９に示す。Ｏｐｔｉｓｏｎの存在下で超音波照射照射を行った場合（ＵＳ（＋）、ＭＢ）に遺伝子導入効率が高まることが明らかとなった。

続いて、超音波照射強度と細胞障害の発生との関係を検討した。細胞傷害はＬＤＨアッセイを用いて評価した。９６ウェルプレートにおいて，２００μｌのＭＥＭ培地にラット角膜上皮細胞（ＲＣ−１）を４×１０^４個調整し、ＧＦＰ導入効率を測定したのと同じ方法で超音波を照射した。超音波照射強度を０．５，１，１．５，２Ｗ／ｃｍ^２と変化させて実験を行った。また対照群として、細胞膜が高度に障害される１％ＴＲＩＴＯＮＸを混合した群であるＴＲＩ群（ｈｉｇｈｔｃｏｎｔｏｒｏｌ群）と、超音波照射を行わず細胞と培地のみを添加した群であるｌｏｗｃｏｎｔｒｏｌ群を設けた。超音波照射から３時間後に測定に必要な試薬を加えて３０分反応させたのち、吸光度計を用いてＬＤＨ活性を測定した。

結果を図１０に示す。超音波エネルギーが比較的低い場合（０．５又は１Ｗ／ｃｍ^２）は、超音波エネルギーが比較的高い場合（１．５又は２Ｗ／ｃｍ^２）と比較して、細胞傷害の程度が有意に低かった。

角膜への遺伝子導入（ｉｎｖｉｖｏ）
実施例１で調製したのと同様の混合物を用いて白色家兎の角膜実質内へのＧＦＰ遺伝子の導入効率を測定した。超音波照射はソニトロン２０００（商標名：ＲｉｃｈｍａｒＩｎｃ．）を用いて行った。照射条件は周波数１ＭＨｚ，ｄｕｔｙ比５０％，照射時間１２０秒とし、照射強度を１，１．５，２Ｗ／ｃｍ^２と変化させた。

兎角膜中央部の実質浅層に３０Ｇ針をつかって、ｐＥＧＦＰプラスミド１０μｌ、生理食塩水２μｌの混合液１２μｌを注射した。マイクロバブル（ＭＢ）としてはＯｐｔｉｓｏｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）を使用した。ＭＢ併用群では、ＭＢの添加量はプラズミドの２０重量％とし、ｐＥＧＦＰプラスミド１０μｌ，ＭＢ２μｌ混合し、角膜へ注射を行った。角膜注射後に、直接角膜面にソニトロン２０００のプローブをあてて前述の条件で超音波照射を行った。

超音波照射を行ってから３日後に角膜を摘出し、蛍光実体顕微鏡を用いてＧＦＰ蛍光を観察した。Ｏｐｔｉｓｏｎを付加せず超音波照射単独で処置をした群では、わずかにＧＦＰ蛍光を認めるのみであったが、超音波照射とＯｐｔｉｓｏｎ付加とを併用した群では、超音波強度を上げるにつれてＧＦＰ蛍光陽性細胞が多く観察できた。照射条件が、周波数１ＭＨｚ，２Ｗ／ｃｍ^２，ｄｕｔｙ比５０％，照射時間１２０秒である場合のＯｐｔｉｓｏｎ付加の条件での角膜の蛍光実体顕微鏡の像を図１１に示す。ＧＦＰ蛍光が観察された領域は超音波を照射した領域と一致していた。

また電子顕微鏡を用いて摘出角膜の細胞傷害の有無を観察した。図１２の左図が角膜の内皮側であり、同右図が上皮側である。いすれの像からも超音波照射による細胞傷害は観察されなかった。

網膜への遺伝子導入（ｉｎｖｉｖｏ）
Ｏｐｔｉｓｏｎ付加と超音波照射とを併用することによって網膜へ遺伝子導入可能か否かを調べるためにルシフェラーゼを用いたレポータージーンアッセイを行った。

まず、ルシフェラーゼプラスミド（ｐＣＭＶ−ＧＬ３）と、Ｏｐｔｉｓｏｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）と、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）とを２：１：２の割合（重量比）で混合した溶液を準備した。この溶液２０μＬを、顕微鏡下に３０ゲージの鋭針でラットの硝子体内へ注射し、ソニトロン２０００（商標名：ＲｉｃｈｍａｒＩｎｃ．）を用い、プローブを直接角膜にあて、経角膜的に網膜へ超音波照射を行った。照射条件は周波数１ＭＨｚ，２Ｗ／ｃｍ^２，ｄｕｔｙ比５０％，照射時間２４０秒とした。そして、網膜及び水晶体へのルシフェラーゼ遺伝子の導入効率を測定した。

超音波照射を行ってから２日後に眼球を摘出し、眼球を網膜・角膜・水晶体・胸膜・虹彩と５つに分離し、ホモジナイザーをつかって各組織をすりつぶしたのち、網膜（ｒｅｔｉｎａ）及び水晶体（ｌｅｎｓ）において、ルミノメーターでルシフェラーゼ量を定量（単位ＲＬＵ）した。組織による違いを補正するために、同時にホモジナイズ後の溶液中に含まれる蛋白定量を行った（補正後：ＲＬＵ／ｍｇ）。

また比較実験として、超音波照射を行わずルシフェラーゼプラスミドとＰＢＳを１：１の割合で混合した溶液を硝子体内へ注射した後、上記と同様の方法でルシフェラーゼを定量した（Ｐ＋ｎｏｎ−ＵＳ）。

結果を図１４に示す。本実験では超音波照射とＯｐｔｏｉｓｏｎ付加を併用することで効果的に網膜へルシフェラーゼ遺伝子の導入できた。またルシフェラーゼ遺伝子は、網膜に特異的に導入され、水晶体には殆ど導入されなかった。

細胞傷害の観察結果も電子顕微鏡、光学顕微鏡を用いて併せて行った。いずれの観察法においても、上記の条件では組織障害は認めなかった（図示せず）。

図１aは眼内用超音波プローブ１及びスリーブ５１の斜視図である。図１ｂは眼外用超音波プローブ１及びスリーブ５１の斜視図である。図２ａは眼内用超音波プローブ１の中心軸に沿った断面図である。図２ｂは眼内用超音波プローブ１の先端部を超音波照射方向から見た図である。図２ｃは眼内用超音波プローブ１の先端付近の図２ｂの破線に沿った矢印方向からの拡大断面図である。図３ａは眼外用超音波プローブ２の中心軸に沿った断面図である。図３ｂは図３ａの破線に沿った矢印方向からの断面図である。図４ａは瞼接触阻止部材４の斜視図である。図４ｂは同部材の中心軸を通る面による縦断面図である。図５ａはスリーブ５１の斜視図である。図５ｂはスリーブ５１を超音波プローブ１，２に装着したときの、断面図である。図６はコントロールユニット６の構成を模式的に示した概略図である。図７ａは眼球表面組織を示す図である。図７ｂは眼球組織の断面図である。図８は眼内用超音波プローブ１を毛様体扁平部強膜の穿刺部から挿入した状況を示す図である。超音波照射（ＵＳ）の有無及び微小気泡含有小球体（ＭＢ）の添加の有無と遺伝子の導入効率との関係を示す図である。超音波照射の強度と細胞障害の程度との関係を示す図である。角膜実質へＧＰＦ遺伝子を注入して超音波照射した後の、角膜の蛍光実体顕微鏡による像を示す写真である。角膜実質へＧＰＦ遺伝子を注入して超音波照射した後の、角膜の電子顕微鏡による像を示す写真である。硝子体へルシフェラーゼ遺伝子を注入して超音波照射した後の、網膜及び水晶体におけるルシフェラーゼ量を示す図である。

Claims

眼球内部組織への生理活性薬剤の導入のための超音波照射装置であって、
眼球内部組織に挿入されて標的部位に超音波を照射する、超音波発生部を備えた超音波照射部と、
前記超音波照射部を冷却するための冷却手段と、
生理活性薬剤を標的部位に供給するための供給手段と、
標的部位を観察するための観察手段と、
を備え、
前記供給手段に含まれ、標的部位に向けられる部材と、前記観察手段に含まれ、標的部位に向けられる部材とが、各部材の先端部が前記超音波照射部の先端部に位置するように前記超音波照射部の内部に配設されている前記装置。
前記冷却手段が、灌流液を前記超音波照射部の外表面上を流れるように灌流させる手段である、請求項１記載の装置。
前記超音波照射部が、太さが１．５ｍｍ以下、長さが３０ｍｍ以上である略棒状の形状である請求項１又は２記載の装置。