JP4811251B2 - 細胞電気生理センサ - Google Patents

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関する。

電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかしながら、パッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットの先端部を１個の小さな細胞に高い精度で挿入するという技術を必要としており、この作業には熟練した作業者が不可欠であり、高いスループットを必要とする測定には適切な方法でない。

これに対して、近年、微細加工技術を利用した平板型プローブを用いた測定技術の開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要とせず、減圧を行うだけで自動的に細胞を固定して測定を行うことができるというものであり、自動化システムとして適している。

このような方法として、ガラスなどの平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、測定電極で電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

また、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置について開示されている（例えば、特許文献２参照）。
特表２００２−５１８６７８号公報 特表２００３−５２７５８１号公報

しかしながら前記従来の構成においては、最適な測定電極およびその詳細な構造については明示されていなかった。この測定電極と貫通孔を有する平板を有するプレートをウエルと接着する際には、測定電極などの電極パターンが形成された電極部分が突起となり、プレートとウエルが完全に密着せずに微小な空隙を形成する場合があった。これによって、接着の信頼性が低下し、気泡の発生や液漏れなどの課題が生じていた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、ウエルプレートと気密性に優れた接合構造を実現し、これによって気泡の発生や液漏れを抑制することによって高精度に測定することができる細胞電気生理センサの提供を目的とするものである。

本発明の細胞電気生理センサは、ウエルプレートと、第一の貫通孔と測定電極と配線電極を有したプレートと、この第一の貫通孔の内部に第二の貫通孔を設けたダイアフラムを有したセンサチップと、空洞を有した流路プレートとが当接された細胞電気生理センサであり、プレートの一方の開口部にはウエルプレートの一方の開口部が合致するように当接し、プレートの他方の開口部には流路プレートの空洞が合致するように当接するとともに、プレートの一方の開口部側には測定電極および配線電極の表出面とプレートの表面を同一面に構成したものである。

本発明の細胞電気生理センサは、測定電極および配線電極の表面とプレートの表面を同一面とすることにより、測定電極および配線電極が突起となることを抑制することによって接合面の信頼性を高めることができ、これによって気泡の発生や液漏れを抑制できることから高精度に測定できる細胞電気生理センサを実現することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図、図２は図１の要部拡大断面図であり、図３はプレートの斜視図である。

図１および図２において、１は樹脂よりなるウエルプレートであり、ウエルプレート１は両面に第一の開口部２および第二の開口部３を有するとともに、第一の開口部２が第二の開口部３よりも大きくしたテーパー形状としている。このようなテーパー形状とすることによって、マイクロピペットから投入した細胞をセンサチップ１０の第二の貫通孔１２へ導きやすくすることができる。

さらに、前記第二の開口部３には樹脂よりなるプレート４を当接しており、このプレート４は第一の貫通孔５を有している。さらに、前記第四の開口部７には樹脂よりなる空洞８を有した流路プレート９を当接しており、この流路プレート９は第一の貫通孔５の第四の開口部７に連結するように空洞８を配置している。

そして、前記プレート４の第一の貫通孔５にはセンサチップ１０を固着している。このセンサチップ１０は材質がシリコンであって、ダイアフラム１１と、このダイアフラム１１に第二の貫通孔１２を形成している。例えば、本実施の形態１におけるセンサチップ１０の外径は７００μｍφ、内径を４００μｍ、高さを４００μｍとし、ダイアフラム１１の厚みは１０〜５０μｍが好ましい。そして、この第二の貫通孔１２の直径は５μｍ以下が望ましく、細胞を保持するために最適な大きさの貫通孔形状としている。また、このセンサチップ１０はシリコンを用いていることから、微細エッチングプロセスなどの半導体プロセスを用いてシリコンウエハから多数個を一括して高精度に作製することができる。

次に、図３を用いてプレート４の構成について説明する。なお、図１の断面図は図３のＡ−Ａ部における断面図である。

図３において、このプレート４には、第一の測定電極１４、配線電極１５、第二の測定電極１６、電極取り出し部１７を設けており、これらの電極１４，１５，１６によってセンサチップ１０で発生する細胞の電気的指標、例えば電位、電流などを電極取り出し部１７によって測定することができる。そして、ここで重要なことは、少なくとも第一の測定電極１４および配線電極１５の表面とプレート４のウエルプレート１と当接する面は同一面で構成しているということである。これによって、ウエルプレート１とプレート４を微小な気泡または空隙の発生を抑制した細胞電気生理センサを実現することができる。従来の構成では平面性において凹凸があり、この凹凸のあるプレート４とウエルプレート１を溶着すると気泡あるいは空隙が発生し、高精度に測定できる細胞電気生理センサの生産性を低下させていた。

また、ウエルプレート１、プレート４、流路プレート９はすべて樹脂で構成されており、好ましくは熱可塑性樹脂である。これらの材料は熱溶着などの手段を用いることによって特に接着剤を使用することなく互いに強固に接合できることから生産性に優れる。そして、好ましくは、これらの熱可塑性樹脂はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、オレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせであって、これらの材料は熱溶着によって接合を行いやすい。さらに好ましくは、これら熱可塑性樹脂が環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、ポリエチレン、またはこれらの少なくとも２種以上が共重合したコポリマーであることが望ましい。特にポリエチレンと環状オレフィンポリマーとを共重合させた環状オレフィンコポリマーは、優れた寸法安定性を有すること、成型が容易であること、酸・アルカリへの耐薬品性が高いことから本発明の製造工程もしくは使用環境に適した樹脂材料である。さらには環状オレフィンポリマーとポリエチレンの重合比を変動させることにより所望の熱特性が得られることから、製造工程に自由度をもたせることを可能にする。

なお、図１および図３には細胞電気生理センサのセンサチップ１０を複数形成した例を示しているが、このことは本発明を限定するものではない。

次に、図４を用いて本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について説明する。図４は電気生理活動を測定する方法について説明するための断面図である。

まず、図４に示すようにウエルプレート１の第一の開口部２側の空間に細胞外液１８ａを充填し、空洞８に細胞内液１８ｂを入口１９から出口２０にかけて吸引することで充填する。ここで、細胞外液１８ａとはたとえば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが４ｍＭ
程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞内液１８ｂとはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-
イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。この状態で、ウエルプレート１内に設置された第一の測定電極１４と空洞８内に設置された第二の測定電極１６間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは細胞内液１８ｂあるいは細胞外液１８ａが浸透し、第一の測定電極１４と第二の測定電極１６との間で電気回路が形成されるからである。

次に、ウエルプレート１側からマイクロピペットなどを用いて、被験体細胞２１を投入する。

なお、センサチップ１０は第一の貫通孔５の内部においてダイアフラム１１が空洞８に面するように配置しているが、ダイアフラム１１が第三の開口部６側へ近くなるように配置しても良い。このセンサチップ１０を設ける位置は測定する被験体細胞２１の性質によって適宜決定されるべきである。

その後、ウエルプレート１の入口１９あるいは出口２０の一方を減圧すると、被験体細胞２１は第二の貫通孔１２に引き付けられ、一個の被験体細胞２１がこの第二の貫通孔１２を塞ぐことによって、ウエルプレート１側と空洞８側の電気抵抗が十分に高い状態となる。この状態において被験体細胞２１の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合には、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度な測定が可能となる。

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。

図５から図１２は本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図である。

まず始めに、図２に示したセンサチップ１０を半導体プロセスを用いてあらかじめ作製しておく。このセンサチップ１０はフォトリソグラフィー、ドライエッチング等の半導体加工技術によって外径：７００μｍ、内径：４００μｍの寸法形状に加工し、厚みが１０μｍのダイアフラム１１と、このダイアフラム１１に直径が５μｍの第二の貫通孔１２を設けた構造となっている。

一方、図５に示したようにプレート４は、厚みが約１ｍｍであり、形成材料は環状オレフィンポリマーとポリエチレンの共重合体であるシクロオレフィンコポリマーを用いており、この樹脂は成型性と耐熱性と低溶出の観点から好ましい。

次に、第一の測定電極１４と配線電極１５を形成するために、厚みが１０μｍの銅箔を準備し、プレート４の一面に貼り付ける。この貼り付ける方法は接着剤を用いて接合しても良いし、熱圧着を用いて接合しても良い。

なお、金属箔以外にも、めっき、あるいは蒸着などの薄膜プロセスを用いて形成しても良い。

そして、このときに用いた金属箔２２のプレート４と接触する面は、表面粗さ（Ｒｚ）＝２．０μｍ以上であることが望ましい。このことにより、溶融したプレート４へ金属箔２２が押し付けられた際の接触面積が増大し、金属箔２２とプレート４とを強固に接合することができるという効果が得られる。

なお、ここで用いた表面粗さ（Ｒｚ）とは、十点平均粗さと呼び、断面曲線から基準長さだけを抜き取った部分において、最高から５番目までの山頂の標高の平均値と、最深から５番目までの谷底の標高の平均値との差の値で定義される。

次に、図６に示すようにフォトリソグラフィーによって金属箔２２をエッチングによってパターニングを行い第一の測定電極１４、配線電極１５、電極取り出し部１７などの電極パターンを形成する。その後、図７に示すように、表面が平滑な金型などを用いて１５０〜２００℃の温度にて熱プレスを行うことによって、プレート４の表面と第一の測定電極１４、配線電極１５、電極取り出し部１７などの電極パターンの表面とが同一平面となるような構成とすることができる。これによって平坦な表面を有するプレート４を作製することができる。さらに、同一平面とした前記第一の測定電極１４および配線電極１５の表面粗さ（Ｒｚ）を０．８μｍ以下としておくことが好ましい。これによって、ウエルプレート１を接合したときの空隙、ピンホールなどの発生を抑制することができ、気密性に優れた接合界面を実現できる。特に、第一の測定電極１４は測定の安定性と気泡の発生を抑制することが重要である。

次に、図８に示したように金型あるいはドリルなどによって、直径が７００μｍの第一の貫通孔５を形成した後、銀と塩化銀を含んだ電極ペーストを準備し、この電極ペーストをディスペンサーなどを用いて所定の場所の第一の貫通孔５へ注入した後、熱硬化させることによって第二の測定電極１６を形成する。

そして、ウエルプレート１と流路プレート９は前記プレート４と同じ材料を用いて所定の寸法形状に設計した金型を用いて射出成型によって作製しておく。

次に、図９に示すように、まずプレート４とウエルプレート１の接合を行う。このときの接合方法としては、赤外線領域の波長を用いた赤外線レーザーによる溶着接合が好ましい。

このとき、プレート４の赤外線吸光度を、ウエルプレート１の赤外線吸光度より小さくすることにより、プレート４側から赤外線レーザーを用いて照射することでプレート４とウエルプレート１を接合することができる。このような溶着方法とすることによって、ウエルプレート１のみがプレート４と接触する面が溶融することになり、プレート４は溶融しないことからプレート４の寸法形状を高精度に保持したまま溶着できるという効果が得られる。

そして、第一の測定電極１４および配線電極１５の表面粗さ（Ｒｚ）を０．８μｍ以下としておくことによって、ウエルプレート１を接合したときの空隙、ピンホールなどの発生を抑制することができ、気密性に優れた接合界面を実現できる。

次に、図１０に示すようにセンサチップ１０を第一の貫通孔５の内部へ固定する。このときの固定方法としては、接着剤やＯリングを用いることができる。

最後に、流路プレート９の接合を行って図１に示したような細胞電気生理センサを作製することができる。この流路プレート９の接合においても、接合の方法としては赤外線レーザーによる熱溶着が好ましい。

このとき、プレート４と流路プレート９の界面に赤外線吸光度に優れた色素を介在させて赤外線レーザーを照射することによって、速やかに溶着を行うことが可能であり、プレート４と流路プレート９への熱ダメージを抑制することができる。これによって寸法精度に優れた細胞電気生理センサを作製することができる。これに用いる色素としては、商品名：クリアウエルド、Ｌｕｍｏｇｅｎなどを用いることができる。

なお、赤外線レーザーによる溶着を行う際には、第一の測定電極１４および配線電極１５の厚みが５μｍ以上であることが好ましい。このような構成とすることにより、赤外線レーザー照射時に発生しやすい断線が抑制され、不良率を低減する効果が得られる。

また、第一の測定電極１４の少なくとも一部が銀と塩化銀の混合物で被覆されていることが望ましい。このような構成とすることにより、第一の測定電極１４と測定液１８の界面において発生する電気二重層容量が打ち消され、細胞の電気生理現象を高精度に測定することが可能となる。この第一の測定電極１４の製造方法を次に説明する。図７に示したプレート４に対して化学機械研磨を行うことによって金属面が選択的に研磨され、第一の測定電極１４の断面形状が図１１に示したような形状となる。この断面形状を有する第一の測定電極１４の凹部へ銀／塩化銀電極ペーストを塗布することにより、図１２に示したように第一の測定電極１４の少なくとも一部が銀／塩化銀電極２３によって被覆し、且つ第一の測定電極１４および配線電極１５の表面とプレート４の表面が同一面で構成したプレート４が形成可能となる。

また、図１３〜図１５は本実施の形態１における第一の測定電極１４の断面形状が異なった別の例の細胞電気生理センサの要部拡大断面図であり、図１３に示すように第一の測定電極１４の断面形状が逆台形形状としてプレート４に埋設することによってプレート４と第一の測定電極１４との平面性を高めるとともに、接合面の密着性を高めることができる。これらの形状はあらかじめ金属箔などをエッチングによって前処理加工しておき、第一の測定電極１４についてのみ図１３〜図１５に示したような形状に加工しておくことによって実現することができる。

さらに、図１４に示すように第一の測定電極１４の断面形状が円弧状としてプレート４に埋設することによって前記と同様の効果を得ることができる。さらに、図１５に示すように第一の測定電極１４の断面形状が矩形状としそのエッジ部を丸めたＲ形状としてプレート４に埋設することによってプレート４と第一の測定電極１４との平面性を高めるとともに、接合面の密着性を高めることができる。

以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサは、薬品のスクリーニング検査など医薬分野において有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図 同要部拡大断面図 同プレートの斜視図 同細胞電気生理センサの測定方法を説明するための要部拡大断面図 同製造方法を説明するための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同別の例の細胞電気生理センサの要部拡大断面図 同別の例の要部拡大断面図 同別の例の要部拡大断面図

１ ウエルプレート
２ 第一の開口部
３ 第二の開口部
４ プレート
５ 第一の貫通孔
６ 第三の開口部
７ 第四の開口部
８ 空洞
９ 流路プレート
１０ センサチップ
１１ ダイアフラム
１２ 第二の貫通孔
１４ 第一の測定電極
１５ 配線電極
１６ 第二の測定電極
１７ 電極取り出し部
１８ 測定液
１８ａ 細胞外液
１８ｂ 細胞内液
１９ 入口
２０ 出口
２１ 被験体細胞
２２ 金属箔
２３ 銀／塩化銀電極

Claims (8)

1. 開口部を有したウエルプレートと、第一の貫通孔と測定電極と配線電極を有したプレートと、このプレートの第一の貫通孔の内部に第二の貫通孔を設けたダイアフラムを有したセンサチップと、液体を貯留・流出入できる空洞を有した流路プレートとが当接された細胞電気生理センサであって、前記プレートの一方の開口部には前記ウエルプレートの一方の開口部が合致するように当接し、前記プレートの他方の開口部には前記流路プレートの空洞が合致するように当接するとともに、前記プレートの一方の開口部側には前記測定電極および配線電極の表出面と前記プレートの表面を同一面で構成した細胞電気生理センサ。
2. ウエルプレート、プレートおよび流路プレートを、環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、ポリエチレン、またはこれらの少なくとも２種以上が共重合したコポリマーとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. プレートの赤外線吸光度を、ウエルプレートの赤外線吸光度よりも小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. プレートと接合する測定電極および配線電極の表面粗さ（Ｒｚ）を、２．０μｍ以上とした請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
5. プレートと流路プレートの接合の界面にプレートと流路プレートの赤外線吸光度よりも大きくした色素を有した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. ウエルプレートと接合する測定電極および配線電極の表面粗さ（Ｒｚ）を０．８μｍ以下とした請求項５に記載の細胞電気生理センサ。
7. 測定電極および配線電極の厚みを５μｍ以上とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
8. 測定電極の表面の少なくとも一部が銀と塩化銀の混合物からなる電極で被覆した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。

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