JP4845737B2 - 細胞培養システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養の分野に関する。本発明は、一般に細胞、特に植物細胞を増殖させるための新しい培養システムを提供する。この装置は使い捨て可能で、大規模で効率的であり得るので、その使用により、様々な種類の用途において製造コストが大きく低減する。

従来の培養システムは一般に、培養内容物を通気及び混合する手段（エアースパージャー、インペラー）を有する硬い容器（ガラス又はステンレス鋼）で構成されている。これらのシステムは複雑であり、その大規模製造がｉｎ ｓｉｔｕで滅菌したステンレス綱容器に基づいているので、無菌バイオプロセスに関連する通常の機器及び補助設備は非常に高価である。６０％を超える製造コストは、固定費：発酵機器の高い資本経費、減価償却費、利息及び設備支出によるものである。収率が低く、且つ各培養サイクル後にバイオリアクターを洗浄及び滅菌する必要があるので、ランニングコストも高い。

植物細胞培養の特定の産業上の用途では、撹拌槽又はエアリフトリアクターなどよく知られている異なる培養システムが使用されている。植物代謝物を商品化する多くの努力にもかかわらず、商業的成功を収めたものはほとんどなかった。

１つの理由は、乾燥重量の最大２０％の、植物まるごとよりも高い含有量の所望の化合物（ロズマリン酸、シコニンなど）が得られる可能性があるにもかかわらず、生産性が低いことである。低い生産性をもたらす主な制約により、細菌と比べて増殖速度が低いままである（０．７ｄａｙ^−１，ｍｉｎ未満 ２０ｈの倍加時間）。工業用発酵槽でバッチ培養を用いることは、植物細胞培養を非常に高コストな設備で１年当り１０〜２０運転以下で運転することを意味する。これは、工業生産の障害が、生物学的なものよりも経済的なものであることを示している。

これらの問題を克服し、製造コストを低減させるために、ステンレス綱発酵槽の代わりに様々な使い捨てプラスチック袋を使用することに基づいた新しい技術が最近現れた。プラスチックは低コスト材料であり、さらにこれらによって時間及びコストのかかる機器の洗浄、滅菌、確認及びメンテナンスがなくなるため、滅菌済みの使い捨てプラスチック袋を用いたこれらの新しいシステムは、設備投資を減らすので期待ができる。これはまた、プロセスをより柔軟にし、袋は滅菌されて供給されるので当業者ではない人々によって操作が可能になる。

こうした使い捨て装置では、異なる通気／混合システムが提案されている。Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｉｎｇｈ Ｖ、米国特許第６，１９０，９１３号）は、袋を動かして波状的な運動をその中に含まれている液体に誘導するロッキングメカニズムに配置した膨張した袋を用いたシステムを開発している。こうした機械撹拌では高容量の培養に達するために複雑な機器が必要となるため、ロッキングメカニズムはタンクのサイズを制限する。

別の提案は、機械システムで撹拌した又は全く撹拌しないガス透過性プラスチック袋を使用することである。米国特許第５，０５７，４２９号では、動物細胞に向かって酸素及び栄養素を拡散させるためにガス透過性袋を回転又は振盪させる。静的なガス透過性袋も米国特許第５，２２５，３４６号に記載されている。主に、一方では、外部撹拌装置のスケールアップに困難があり、他方では、培地を数リットル含む静的な袋中の細胞への酸素供給が不十分なことによる問題があるため、これまでこうした培養システムの産業開発はなかった。

リアクターは、播種及び培地試料を取り出す能力をもつヘッドプレートを備えたタンク中のガスを注入したプラスチック袋で構成されていてよい。Ｏｓｍｏｔｅｃ社によって製造されている使い捨ての円錐形プラスチック袋は小規模使用（数リットル）のものであり、吸気口を通して通気のために気泡を用いる。米国特許第６，４３２，６９８号はまた、その中ではプラスチック材料製である点を除けばエアリフトバイオリアクターに近い、ガスを混合及び供給するために気泡を発生させるガスバブラーを備えた、微生物又は細胞を培養するための使い捨てバイオリアクターについて記載している。

これらの発明では、主な制約が２つある：高密度又は高容量の培養において、都合のよい混合及び通気を達成するためにより小さい気泡又は流体循環をリアクター全体にもたらす必要がある。この結果、複雑なバブリングシステム（ガスディフューザー、仕切られたタンク．．．）がもたらされ、これらは単純な使い捨ての技術と整合が取れない。さらに、小さな泡は感受性細胞に有害であり、細胞の壁付着を増大させ、且つ／又は培地から有効なガスを奪う（例えば植物細胞の場合はエチレン）。

バイオリアクター又は発酵槽の通気のために気泡を使用することはよく知られている。現在、ディフューザー注入マイクロバブルは、培地へのガス移動を改善させるのに使用されている。通気及び撹拌もガス流によって機械撹拌なしで行うバイオリアクターもよく知られており、現在専門家によってエアリフトバイオリアクターという名前が付けられている。例えば、米国特許−Ａ−４，６４９，１１７は、細胞培養及び発酵を実施するのに有用なエアリフトバイオリアクターの培養システムについて記載している。適当なガス流量は１０〜３００ｃｃ／ｍｉｎの範囲であり、ガスを穏やかに連続的に泡立たせており、泡サイズ又は我々の本発明のような単独の大泡の周期的な発生に関して言及していない。２つのチャンバー、すなわち増殖チャンバー及び混合チャンバーを使用している。

「大」と表したが３ｃｍ^３より小さい単独の泡の使用は、薬品、飲料又は油など様々な物質の混合及びブレンドで知られている。国際公開ＷＯ−Ａ−８５０３４５８は、生細胞の増殖及び培養に関与しない、ガス誘導混合及びブレンドのための方法及び装置について記載している。この方法は、１つ又はいくつかの給気口を通ってタンクに注入される所定の可変サイズ及び頻度の気泡に基づいている。目標は、全ブレンド及び混合時間を低減させることであり、それは我々の本発明のものではない。注入は単独の泡又はいくつかの単独の泡を得るために行い、泡サイズ及び空気量は経験的に決定し、泡は大き過ぎず（言及すると１立方インチ（２．５４ｃｍ^３））、特に直径がタンクのものに近い泡であってはならない。これは、泡サイズ及び空気量が生細胞の増殖にとって重要な我々の本発明とかなり異なる。国際公開ＷＯ−Ａ−８５０３４５８では、いくつかの給気口の場合、いくつかの単独の泡を円形の垂直環状フローパターンを有するように発生させている。国際公開ＷＯ−Ａ−８５０３４５８の発明は、開放又は半密閉タンクに使用されており、滅菌条件下での生細胞の培養に適合しない。

米国特許−Ａ−４，１３６，９７０では、液体を混合するために使用する泡のサイズ及び頻度を調節するための方法及び装置についても記載されている。これは、酸素供給及び生細胞の培養、泡サイズの最大化、並びに１．５ｃｍ^３よりも大きい泡に関与していない。米国特許−Ａ−４，１３６，９７０に記載されている方法は、血小板の計数に使用できるが、生細胞の培養及び増殖に関して決して適合、使用又は特許請求することはできない。

本発明の目的は、大規模な場合に効率的であり使いやすい、使い捨て装置によって低コストの細胞培養システムを提供することである。

本発明は、細胞がその中で単独の大きな気泡によって撹拌／通気されて培養される滅菌済みの柔軟性がある又はないプラスチック袋にある。

本発明では、単独の大きな気泡は、液体培地及び細胞で部分的に充填したカラムの底で断続的に発生される。大泡はカラムの断面をほぼ満たしているので、それが泡と円柱状タンクの側壁の間に細い空間を作り、泡が浮かび上がるに従ってそこを液体が流れ得る。気泡と接触して少しずつ流れるこの液体フィルムにより、細胞を傷つけることなく運転中に装置内のバルクの都合の良い混合及び通気が可能になる。

こうした混合／通気システムにより、酸素及び物質移動反応が薄い液体フィルムレベルで起こるので効率的なスケールアップが可能になる。さらに、このシステムは単純に設計されているので、資本コスト及び維持費が著しく低減される。

この使い捨て装置は、カラムを形成するためにそれらの縁に沿って密封した滅菌可能で柔軟なプラスチックシートからできている。こうした使い捨てのシステムにより、柔軟なプロセスが可能になり、従来のステンレス綱装置のように洗浄、滅菌、メンテナンス又は確認が必要ないので無駄時間が減少する。

本発明は使い捨てであり、大規模な場合に効率的なので、産業上の利用において製造コストを低減させるための優れた代替システムである。

この培養システムは、懸濁又は異なる担体システムに固定した植物、動物、昆虫又は微生物の培養に適用できる。このプロセスは、代謝産物のような種々の分子（新たなもの又は生体内変換によるもの）又は組換えタンパク質の産生を可能にし、或いはバッチ、流加又は連続培養、並びに当業者にとって明らかな任意の他の使用によって胚形成植物細胞系を増大させる。

本発明は、細胞培養物の通気／撹拌（効率的な酸素供給をもたらす）のためにバイオリアクター自体のものと可能な限り近い直径を有する、周期的に生成される（それらを得るためのプロセスが何であっても）極めて大きな単独の泡の使用にある。重要なのは培地が大泡とバイオリアクターの内壁の間を極めて薄いフィルムとして流れ出ることである。

基本的な設計では、図１に示すように、バイオリアクター（又はリアクター）は、内部を作り出すために、例えば、それらの縁（２）に沿って密封したプラスチックシートなどの材料でできた少なくとも１個のタンク（１）を含む、異なる部分から構成されている。このタンクは定置型である。

本発明の好ましい実施形態では、タンクは、小さな実験室オートクレーブ中で又は当技術分野でよく知られている任意の他の手段によって滅菌できるように、その密封及びオートクレーブ可能な特性のために軟質ポリプロピレンでできている。しかし、数ある中でパイレックス（登録商標）、ステンレス綱、半硬質、硬質又は成型プラスチックなど他の種類の材料も適しており、γ線放射など当業者に周知の任意の方法によって滅菌することができる。

本発明の好ましい実施形態では、柔軟な生体適合性耐水性材料は、例えば、熱衝撃シーラーを用いてそれらの縁（２）に沿って溶封している。しかし、それだけには限らないが、超音波又は電磁波溶着を含む当技術分野でよく知られている方法に基づいて他の密封技術も使用してよい。他の種類のプラスチックは、例えば射出成型など異なる方法で製造することができる。

本発明では、図１に示すように、リアクターは円柱状であってよく、或いは楕円形の断面を有していてよく、２０リットルの容積の場合、高さが２ｍでその直径が１２ｃｍであってよい。

本発明に基づいて、より小さい又はより大きい容量を使用してもよい。例えば、リアクターの直径は、５ｃｍ程度でもよく、４０ｃｍ以上に達してもよい。リアクターの高さは、使用者の要求及び選択した直径によって異なっていてよい。

リアクターはまた、異なる形状であってよいが、その形状の高さはその幅の少なくとも５倍であることが好ましい。これは、例えば平行六面体であってよい。タンク（１）の寸法及び形状は、使用者の要求に合うように様々であってよい。しかし、円柱状のカラム形状が好ましい。懸濁液中で細胞を培養しているときに、混合が起こらないデッドスペースの発生を防止することが重要である。デッドスペースは優先的に隅に現れ、それで個々の細胞よりも素早く沈降する、高密度の凝集体を形成する傾向がある細胞（植物細胞など）を用いる場合、主に丸底を作ることが好ましい。

タンクがプラスチックなど柔軟な物質でできている場合、前記タンクを硬い外側容器に入れてタンクの形状及び重みを支えることが推奨される。この硬い容器は、ポリカーボネートなど任意の材料でできていてよいが、この材料は、主にその硬さ及び強度特性（厚さ及び／又は配合によって推定する）に関して選択することになる。この外側容器は、プラスチック袋も半透明の場合、培養物（３）の観察を容易にするために、或いは例えば光独立栄養細胞を育てている場合、光透過率を改善するために半透明であってよい。外側容器の寸法及び形状は、上記で論じたタンクの寸法及び形状に基づいて設計することが好ましい。

図１に示した基本的な設計では、少なくとも４本のチューブがタンクに接続されている。上端にある１本目は、過剰のガスを除去するために使用する（４）。タンクの底にある２本目（５）は、気泡（６）によって液体培地に空気を供給するために使用する。これらのチューブは、最も好ましい実施形態では、空中の汚染物を防ぐために例えば０．２２μｍフィルターなどのフィルター（７）と一緒に装備されている。給気口チューブは、チューブ中の液体のバックフラッシュを防ぐためにバルブを装備していてよい。さらに、タンクの上端に設置された１本の送込管（８）により、滅菌培地と接種物でバイオリアクターを充填することが可能になり、培養バルクの回収及び／又はサンプリングを行うために、底近くに設置された１本の排出管（９）が必要となるかもしれない。

好ましい実施形態では、チューブは半硬質であり、オートクレーブ可能なシリコーン製であるが、Ｃ−ｆｌｅｘ又はＰＶＣのような他のタイプのチューブも使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、チューブの内径は、より大きい１１ｍｍ直径である送込管を除いて８ｍｍである。チューブの長さは、本発明では約１から２メートルだが、要求を満たすために、使用者はこれらの寸法を調整してよい。

チューブは、ヒートシールなどの標準的な技術によってプラスチックシートに溶接された取込み口を介してタンクに接続することができる。本発明の好ましい実施形態では、図２に示すように、チューブは、ボルト（１１）とシーム（１２）を備えたオートクレーブ可能なパネルマウントユニオン（１０）とプラスチックシートの穴を介してタンクに接続されている。ボルトを締めてシームでプラスチックシートをしっかり挟むことによって不浸透性を得ることができる。パネルマウントユニオンの内径は、本発明の対応するチューブの内径と等しいが、必要に応じて寸法を調整することが可能である。

しかし、空気又はガスを循環させる任意の手段を本発明に適合させることができることを理解されたい。本発明において、培地の通気及び混合が大きなガス／空気の泡によって、好ましくは数秒毎に作り出され、タンクの直径によってその直径が決まる単独の大泡によって達成されることが重要である。したがって、本発明の好ましい混合及び通気の手段は、幅広いというよりも長い泡にある。しかし、このシステムは、泡が幅と同じ長さの場合にも機能する。

大泡の形状は、タンクの形状によって決まる。すなわち、泡とタンクの間の空間を最小、すなわち細胞を含む培地のフィルムに制限することが好ましい。培地が大泡とバイオリアクターの内壁の間の極めて薄いフィルムとして流れ出ることが好ましい。しかし、このシステムは、フィルムがより薄くなく、泡がタンクの幅の５０〜９９％、好ましくは６０〜９９％、より好ましくは９８．５％となる場合にも機能する。

大泡に関しては、それぞれの単独で且つ大きい泡の体積が少なくとも６５ｃｍ^３、より好ましくは少なくとも５００ｃｍ^３であることが理解されたい。例えば、直径が約２０ｃｍのリアクターでは、大泡の好ましい体積は、２６００〜４１００ｃｍ^３、或いはより好ましくは３０００〜４１００ｃｍ^３、或いはさらにより好ましくは３５００又は３７００〜４１００ｃｍ^３で異なっていてよい。

大泡を作り出すために、送込管に気泡発生器（１３）を接続している。図３に示すように、気泡発生器は、例えば、タイマー（１８）によって制御されており、ガスポンプ（１９）に接続されている電気ゲート（１７）である。このような構造では、タイマーによって電気的に制御されている電気ゲートは、給気口及びガスポンプに直接接続されている。定期的にタイマー（使用者によってプログラムされた）が電気ゲートに極めて短い期間電気信号を送る。この間に電気ゲートが開いており、ガスがポンプから供給されてバイオリアクターに導入される。高い流量のガスをカラムに極めて短い期間供給すると、単独の大泡が作り出され、それがカラムの断面のほとんどを満たす。本発明では、電気ゲートの断面は１５ｍｍであり、ガスポンプにおける気圧は０．５バールであり、０．１秒の電気信号を５秒毎に送り、それによって５秒毎に大泡を作り出している。使用者は、彼らの要求に応じてこれらのパラメーターを調整することができる。

この種類の気泡発生器が好ましいが、カラム中に大きな気泡を作り出せる他の装置を使用してもよい。本発明では、使用したガスは空気であるが、細胞の要求、例えば光独立栄養植物細胞にはＣＯ_２、を満たすために、他のガスを単独で又は混合して又はバイオリアクターから再利用して使用することができる。

カラムの上端に泡が到達すると、それがどういうわけか破裂し、培地／細胞にはタンク（１）の壁で失われるものもある。この欠点を回避するために、本発明の実施形態では、タンクの上部は広げられており、例えば好ましい実施形態では、それは逆円錐の形であり、それにより培地／細胞が再びタンク内に戻り得る（図４で矢印２０によって表されている）。

運転中、蒸発が起こって、培地体積が低減し、培地中の異なる化合物が濃縮され、それが細胞にとって有害になり得る。これらの問題を回避するために、排気ガス用にコンデンサー又はガス供給用に加湿器などの装置を加えることが可能である。さらに、カラムにより多くの送込管及び／又は排出管を接続することが可能であり、例えば、酸、塩基、消泡剤又は誘発液剤を加えるのに有用となり得る。培養条件を制御及び／又は調節するために、（それだけには限らないが）温度計、ｐＨ計、ガス測定システム、細胞密度、圧力制御、及び質量制御など任意選択の装置をこの培養システムに加えることができる。例えば光独立栄養植物細胞の場合、バイオリアクターの周りに光発生装置を配置することも可能である。バイオリアクター中の温度調節は、（それだけには限らないが）適当な空調設備によって温度が制御されている部屋の中にバイオリアクターを置くこと、温度調節された水又は空気が循環しているジャケット付外側容器を用いること、或いは当業者に周知の任意の他の手段など、異なるシステムによって達成することができる。

本発明は、液体培地が、浮かび上がる気泡（６）とバイオリアクターの側壁の間を少しずつ流れることに基づいている（図１で矢印（１４）によって表されている）。これにより、渦（１５）がバルクを混合し、通気のために物質移動が容易に達成される気泡（６）と接触した薄い液体フィルム（１６）中で細胞が沈降するのを防ぐ。

既に記載のように気泡発生器をプログラミングすることによって使用者が泡の体積及び頻度を選択できるので、この培養システムは操作するのが容易である。

本発明のシステムは、例えば植物細胞、動物細胞などの生細胞、又は例えば酵母細胞などの微生物を培養するのに使用することができる。前記細胞は、例えば、バイオマス細胞、胚形成植物細胞、代謝産物、２次植物代謝物、及び／又は組換え分子を産生することができる。

以下の実施例は、本発明の範囲に含まれる産物の一部及びそれを製造する方法の例示である。決して本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明に関して修正及び変更形態を作ってもよい。すなわち、当業者は、この実施例の多くの変形形態が、種々の応用に対して本発明の化合物の天然に存在するレベルを合理的に調整するために広範囲の処方、成分、処理、及び混合物を包含することに気付くはずである。

（実施例：大豆細胞培養についての増殖の比較）
本発明の大豆細胞を増殖させる能力は、バッチ培養を用いて実証した。これは、より大きいスケールにおいても、エルレンマイヤーフラスコ又は撹拌槽バイオリアクターに匹敵する又はより優れている。

ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．の組織培養株を異なる栽培品種から２０ｇ．Ｌ^−１スクロース、７ｇ．Ｌ^−１寒天（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ Ｄｉｆｃｏ）及び１ｍｇ．Ｌ^−１ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で補充したＧａｍｂｏｒｇらの培地（１９６８年）上に起こした。ｐＨを５．８に調整してからオートクレーブにかける（１１５℃で３０分）。１株（１３４０６、ｃｖ．Ｍａｐｌｅ ａｒｒｏｗ）を液体培地（寒天及び３０ｇ．Ｌ^−１スクロースを含まない、組織培養に対するものと同じ培地）に移し、組織培養集団と同じ条件で２週間毎に２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（３ｇ．Ｌ^−１生重量と培地１００ｍＬ）に継代した。エルレンマイヤーフラスコは、１００ｒｐｍで軌道振盪機に配置した（振盪直径２０ｍｍ）。

２つの６枚平羽根インペラーを備えた１４Ｌ撹拌槽バイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、前述の通りに同じ培地並びに温度及びｐＨ条件で使用した。９Ｌの新鮮な培地を含むバイオリアクターを１１５℃で４０分オートクレーブした。１４日齢の大豆細胞を２つの１Ｌエルレンマイヤーフラスコ（培地５００ｍｌ）からろ過した。生重量３００ｇを、播種するために無菌的にバイオリアクターに接続されるべき特定の排気口を備えた滅菌タンク中の新鮮な培地１Ｌ中に入れた。撹拌機の速度を１００ｒｐｍに調整した。滅菌可能な酸素プローブ（Ｉｎｇｏｌｄ）を備えたバイオコントローラー及び質量流量計を用いて空気流量を増減させることによって溶解酸素を３０％に保持した。

硬い外側容器に入れた、（既に記載のように）大泡カラムと名付けた２５Ｌ細胞培養システムを、大豆細胞を含む新鮮な培地（３０ｇ／Ｌ生重量）２０Ｌで満たした。室温を２５℃に調節し、直径１２ｃｍの泡（高さ約１０ｃｍ）を５秒毎に発生させた（前述のように気泡発生器をプログラミングすることによって）。

増殖測定：ある一定の増殖期間に培養バルクの試料をフラスコ、撹拌槽バイオリアクター及び大泡カラムから取り、試料の体積を測定した。次いで細胞をろ過によって液体培地から取り出した。バイオマスの重さを計った（生重量）。このバイオマスのアリコート（約１ｇ）の重さを正確に計り２４時間１００℃で乾燥室に入れ、次いで再度正確に重さを計った（乾燥重量）。

この実施例から、細胞培養のための２０Ｌスケールのカラムが、フラスコに匹敵し撹拌槽リアクターよりも優れた優しい環境を細胞に与えることがわかる。この運転条件では細胞障害は制限され、物質及びガスの移動が効率的である。

既に述べたように、本発明は多くの利点を提供し、それは経済的利益の手掛かりである：
植物細胞を増殖させるのに優しい環境を与える
スケールアップが容易である
使い捨てである
操作が容易である

袋及び浮かび上がる泡によって作り出された現象を示す装置の側面図である。 プラスチック袋とチューブ接続の側面図である。 泡の発生並びに頻度及びサイズの制御に有用な空気圧及び電気回路の概略図である。 逆円錐の形のタンク上部の上端を示す図である。 液体培地１リットル当りの生重量で表した、フラスコ、撹拌槽リアクター及び細胞培養システム中の大豆細胞の増殖速度論を示す図である。 液体培地１リットル当りの乾燥重量で表した、フラスコ、撹拌槽リアクター及び細胞培養システム中の大豆細胞の増殖速度論を示す図である。

Claims (9)

1. 滅菌液体培地中で生細胞を培養するためのバイオリアクターであって、
   細胞及び滅菌液体培地を含む少なくとも１個の定置タンクと、
   容器の底に単独の大きな気泡を導入するための少なくとも１つの手段と
   を含み、
   単独の大泡の幅がタンク幅の９８．５〜９９％となるバイオリアクター。
2. 単独の大泡の体積が少なくとも６５ｃｍ^３である、請求項１に記載のバイオリアクター。
3. バイオリアクターが少なくとも大泡の体積及び頻度をプログラミングするための手段も含む、請求項１又は２に記載のバイオリアクター。
4. タンクが、柔軟性がある又はないプラスチック袋である、請求項１から３までに記載のバイオリアクター。
5. 定置タンクが硬い外側容器によって囲まれている、請求項１から４までに記載のバイオリアクター。
6. タンクの上部が広げられている、請求項１から５までに記載のバイオリアクター。
7. タンクが円柱状又は楕円形の断面を有している、請求項１から６までに記載のバイオリアクター。
8. 細胞が植物、動物細胞又は微生物である、請求項１から７までに記載のバイオリアクターの使用。
9. 細胞がバイオマス細胞、胚形成植物細胞、代謝産物、２次植物代謝物、及び／又は組換え分子を産生している、請求項１から７までに記載のバイオリアクターの使用。

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