JP4711381B2 - 新規なヒト肝臓癌細胞株、この細胞を取得する方法およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、新規なヒト肝臓癌細胞に関する。本発明はまた、このような肝臓癌細胞を取得するための方法、ならびに診断適用、治療適用および予防的な適用におけるその使用に関する。

Ｂ型肝炎は、世界中で広範に広がっている感染性疾患である。そのウイルス（ＨＢＶと略される）は、高い宿主特異性を有するＤＮＡを有する小型ウイルスである。実際、ヒトおよび高等霊長類しかこのウイルスに感染せず、そのため、この感染のインビボ研究モデルは、強く制限される。しかし、ヘパドナウイルスの全体的複製サイクルの研究（インビトロおよびインビボ）を可能にする、「アヒル（ｄｕｃｋ）」モデルが存在する。しかし、このヘパドナウイルス（ＨＢＶウイルスに近いが）は、いくらか異なる生物学を有する。さらに、アヒルの代謝的挙動は、ヒトの代謝的挙動とは簡単にくらべることはできない。

ＨＢＶはさらに、肝臓に対して強力な指向性を示し、実質性細胞を優先的に標的する。また、他のウイルスと異なり、分化した肝細胞のみが感染され得る。

肝臓癌に由来する細胞株によって、複製機構の理解において急速な進歩が可能になった。この株は広範に用いられ、ＨｅｐＧ２の名称で呼ばれる。誘導されたクローンＨｅｐＧ２ ２．２．１５は、ウイルスを増殖し、かつ積極的に複製するかなりの能力を保有しているという利点を有する。しかし、この複製はトランスフェクションによるウイルスＤＮＡの細胞への導入後にのみ可能である。ＨＢＶによるこの株の自然な感染は不可能であると証明されている。さらに、この株の世代に起因して、その細胞の核型は広範に改変され、それによって、この株はヒトの肝細胞を模倣するには不完全なモデルとなる。結局、これらの細胞の分化能力はかなり限定されたままである。

他の多少分化した細胞株が提唱されている。特には、株Ｈｅｐ３Ｂにおいて（この株は、ＨｅｐＧ２株とはわずかに異なり、そして後者と同じ限界を有する）が言及されてもよい。全ての株感染試験によって、有効性に関して、マイナスまたは期待はずれであることが証明された。

ＨＢＶ感染の機構を研究するために、初代培養におけるヒト肝細胞のモデルを開発した。このモデルはヒト肝細胞に関与するのにおいて、そしてウイルスサイクル全体に対するアクセスを可能にするのにおいて非常に有用である。しかし、操作することは困難、かつ冗漫であり、そして生検フラグメントを獲得することはますます困難、かつ思うに任せない。

この分野における本発明者らの仕事によって、ヒト肝臓癌細胞株であって、活発に増殖するが、寄生生物および／またはウイルス、特にはＨＢＶによって感染されることができる細胞株を、特定の条件下で細胞選択を実行することによって取得することができたことが記録された。

従って、本発明は、寄生生物および／またはウイルスによって感染されることができる新しいヒト肝臓細胞株、ならびにこれらの細胞株に由来する細胞、またはこれらの細胞のエレメントを提供することを目的とする。

本発明はまた、このような細胞株を選択するためのプロセスに関連する。

本発明の課題はまた、診断、治療および予防の適用におけるこれらの細胞株の使用である。

本発明によれば、ヒト肝臓癌細胞株は、寄生生物および／またはウイルスによって天然に感染され得；この寄生生物（例えば、リーシュマニア属のプラスモジウムまたは寄生生物）は、肝指向性であってもなくてもよく；そしてフラビウイルス科およびヘパドナウイルス科のウイルスのファミリー、好ましくはＨＢＶおよびＨＣＶのレセプターを発現する、ことを特徴とする。

従って、これらの新しい細胞株によって、寄生生物および／またはウイルスのサイクル、特には、ＨＢＶのウイルスサイクル（ウイルスの自然な感染段階から複製および／または増殖まで）の完全な研究が可能になる。これに関して、熱帯熱マラリア原虫によって感染され得るヒト肝臓癌細胞株は、現在存在しない（すなわち、この肝指向性寄生生物の成熟型（繁殖体）の発達を支持できるヒト肝臓癌細胞株はない）ということが観察される。さらに、その増殖能力に起因して、これらの株は、操作が非常に容易である。

本発明の別の態様に従って、これらの株は、進化した分化のレベルに到達できる。

特には、本発明による細胞株から生じる細胞が肝臓の分化の段階、すなわち、肝細胞および／または胆管細胞のような肝臓を構成する細胞に近い形態に達することを可能にする。これは、特には、

−実質性細胞の柵状織の形成、
−機能的な毛細胆管の形成であって、細胞レベルでの、胆管極（ｂｉｌｉａｒｙ ｐｏｌｅ）の再構成を伴う形成、
を伴う。

本出願全体にわたって、肝臓細胞の構造的組織化の代表的な概念に対して言及がなされる。これらの概念、特には、胆管極は、本明細書の以降にある実施例１の「結果（ｒｅｓｕｌｔｓ）」の段落の序文で説明されている。本発明による細胞株に由来する細胞が、肝臓細胞の構造的組織化を、事実上完全に模倣し、かつその機能を再生できるという概念は驚くべきことである。実際に、本発明による細胞株の細胞によって形成された毛細胆管は機能的であり、すなわち、その解毒の役割を果たすことができる。この機能的な分化はさらに、高度に進行し、本発明によるヒト肝臓癌細胞株の細胞は、肝細胞の機能的特徴、すなわち、
−原形質タンパク質、特には、アルブミンおよびトランスフェリンの産生、
−解毒機能であって、特には、以下：
・ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａおよび／もしくはＣＹＰ１ＡのようなシトクロムＰ４５０の種々の形態の発現、ならびに第ＩＩ相解毒酵素、特にはＧＳＴαの種々の形態の発現
・胆汁酸塩の抱合、
・尿素の排泄
−エネルギー調節機能：
・グリコーゲンの形態での糖の貯蔵および解糖によるグルコースの産生、特には、アルドラーゼＢの発現および／または糖新生、
−脂質の代謝を発現し得る。

細胞が分化のレベルに達することができ、これによってこれらの細胞が正常なヒト肝細胞の機能（特には、第Ｉ相および第ＩＩ相の無毒化機能（ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ１ＡおよびＧＳＴα））の全てを事実上発現できるような細胞を生成できるヒト肝臓癌細胞はないということが、興味深く注目される。

予期されなかった態様によると、本発明による細胞株に由来する細胞は、多能性細胞の特性、特には、常在性幹細胞および／または卵円形幹細胞の特性を保有し、すなわち肝細胞、胆管、膵臓および／または腸管に向かって分化し得る。

この常在性幹細胞は、肝臓細胞であって、肝臓の大規模な破壊の間に、破壊された部分を再生するように活発に増殖し得る。これらの細胞は肝細胞、または胆管系列に向かって発達し得る（図１）。さらに、これらの常在性幹細胞はまた、時には、卵円形細胞とも呼ばれ、膵臓細胞、腸細胞および／または肝臓細胞のような異なる細胞型に分化する能力を有する。

本発明による細胞株の別の利点は、それらが活発に増殖する能力に依存する。従って、増殖相では、細胞集団は約２４時間で２倍になる。

本発明は、特には、２００１年４月５日に、ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５に対して、第Ｉ−２６５２号として提出された細胞株に関する。

この細胞株（ＨｅｐａＲＧと呼ばれる）は、同時に、本発明による細胞株の特徴の全てを有する細胞株の例である。これは、寄生生物、ウイルスによって天然に感染され得、これは、上記の形態学的特徴を有し、そして肝細胞の生物学的機能の全てを保有する。これは、肝細胞の実質的に完全なモデルであると考えられる。

本発明による細胞株由来の細胞、または細胞のエレメント、ならびに特には、膜、レセプターおよび／またはこの膜由来の抗原、細胞質、核、遺伝子および／または遺伝子産物、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ペプチドもまた本発明の範囲内に包含される。

さらに、本発明は、このような細胞株を取得および選択するための方法を提供することを目的とする。

この方法は、特には、ヒト肝臓癌細胞株を選択するためのプロセスを包含し、
−培養培地中での細胞増殖期であって、この培養培地は、非毒性濃度で少なくとも１つのコルチコステロイドを持続的に含み、このコルチコステロイドは、正常なヒト肝細胞の分化、特にはその至適の分化を促進する、細胞増殖期、
−次いで、分化を誘導するのに十分な量のＤＭＳＯの添加によって、この同じ培地中で細胞の分化期である、コンフルエンスに達する工程、
を包含し、このプロセスは、所望の場合、数回、好ましくは３回反復される。

この細胞選択プロセスは、本発明に従う細胞株の特性を維持するために不可欠である。実際、この選択プロセスは、高い細胞死亡率を誘導する。以下の実施例３は、コルチコステロイドとＤＭＳＯとの間の必須の協同作用を実証する。

「正常なヒト肝細胞の分化を促進する非毒性濃度（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」という句は、正常なヒト肝細胞の培養物へのその添加の間に、この細胞の分化が、実施例１の「結果」の段落の序言に記載された形態学的状態および機能的状態に向かうことを促進する、このコルチコステロイドの濃度をいうために用いられる。この濃度は非毒性であり、すなわち、その添加は、約１０％を上回る細胞死亡率をもたらさない。

さらに、「分化を誘導するのに十分な量（ｑｕａｎｔｉｔｙ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という用語は、正常なヒト肝細胞の培養物の分化を誘導するのに必要なＤＭＳＯの量をいうために用いられる。

優先的なプロセスは、肝臓癌培養物において通常用いられるプロセスと対照的に、培地中に持続的に、高濃度で存在するコルチコステロイドを含むということが、興味深く注目される。驚くべきことに、このコルチコステロイドの存在は、細胞株の増殖を決して妨げない。

この選択プロセスによって、本発明に従って細胞株を得るためのプロセスを開発することが可能になった。このプロセスには、悪性肝細胞癌型の固形腫瘍の生検の段階、タンパク質分解性酵素を用いる細胞集団の単離の段階および上記に詳細に記載した選択プロセスを用いるこの細胞株の選択の段階を包含する。

優先的に用いられるタンパク質分解性酵素は、トリプシンおよび／またはコラゲナーゼである。

本発明はまた、肝指向性の寄生生物および／またはウイルスを用いて肝臓細胞を感染するためのプロセスを提唱する。このプロセスは、
−上述の選択プロセスを用いる選択期、
−培養培地を用いて、この細胞を肝細胞に近い形態に到達させる分化期であって、この培養培地は、非毒性濃度で少なくとも１つのコルチコステロイドを含み、このコルチコステロイドは、分化を誘導するのに十分な量のＤＭＳＯの添加によって、正常なヒト肝細胞の至適の分化を促進する分化期、
−培養培地中におけるこの肝細胞のインキュベーションによる感染期であって、この培養培地は、非毒性濃度で少なくとも１つのコルチコステロイドを含み、このコルチコステロイドは、正常なヒト肝細胞の至適の分化を促進し、この培養培地にこの感染源が添加される感染期、を包含する。

肝指向性寄生生物は、プラスモジウムおよびウイルス（ＨＢＶ、またはＨＣＶ）であってもよい。

可能な感染源は、ＨｅｐＧ２細胞の上清および／または患者の血清である。

選択、獲得および感染のプロセスのために用いられる培養培地は、好ましくは、正常なヒト肝細胞の生存を促進するのに十分な量で、インスリンを、好ましくは２．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、特には５μｇ／ｍｌの範囲で含む。

このインスリンによって、細胞の生存度をかなり改善することができるようになる。

さらに、これらの培養培地のコルチコステロイドは好ましくは、ヒドロコルチゾンヘミスクシナートおよびデキサメタゾンである。分化の他の誘導因子は、特には、レチノイン酸および／またはその合成アナログ、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンが用いられてもよい。

「合成アナログ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」という用語は、非天然起源のコルチコステロイドおよびレチノイドのアナログのことをいうために用いられる。

このコルチコステロイドの濃度は、１０^-7Ｍ〜１０^-4Ｍ、好ましくは、ヒドロコルチゾンヘミスクシナートについては約５・１０^-5Ｍおよびデキサメタゾンについては約１０^-6Ｍである。最終的に、ＤＭＳＯ濃度は、後者が培養培地に添加される場合、１％〜４％、好ましくは約２％である。

本発明はまた、本発明による細胞株のトランスフェクションのためのプロセスに関する。このプロセスは、ＨＢＶウイルスおよび／またはＨＣＶウイルスの遺伝物質の完全な配列および／または一部を含むベクターを用いる。これはまた、示差的に発現された遺伝子の高流速スクリーニングのためのプロセスに関連する。このプロセスは本発明による細胞株および／または細胞および／または細胞の一部から作製されたチップ型ツールを用い、好ましくは、これらの遺伝子は、分子および／またはウイルスおよび／または寄生生物に対する曝露である、培養条件の影響下で示差的に発現される。

チップ型ツールの例は、本明細書中以降において実施例７に示される。これは、ｃＤＮＡチップであって、その構築によって、示差的に発現された遺伝子の高流速スクリーニングが可能になる。

本発明は最終的には、異なる培養培地の使用を包含する。この培地によって、本発明による細胞株の取得、維持、増殖、選択、分化、トランスフェクション、感染が可能になる。この使用は、特には、非毒性濃度で少なくとも１つのコルチコステロイド、優先的にはヒドロコルチゾンヘミスクシナートを持続的に含む培養培地の使用であって、このコルチコステロイドが、正常なヒト肝細胞の至適の分化を促進して、本発明による細胞集団株および／または細胞の安定性を維持する、使用；ならびに培養培地の使用であって、この培養培地は、非毒性濃度で少なくとも１つのコルチコステロイド、優先的にはヒドロコルチゾンヘミスクシナートを持続的に含み、このコルチコステロイドは、本発明に記載の細胞株に由来する細胞の分化を誘導するのに十分な量のＤＭＳＯの添加によって、正常なヒト肝細胞の至適の分化を促進する、使用；ならびに培養培地の使用であって、この培地が、上述の濃度の少なくとも１つのコルチコステロイドおよび胆管型分化を誘導するのに十分な濃度、好ましくは、２．５〜５ｍＭ、特には約３．７５ｍＭの濃度の絡酸ナトリウムを持続的に含む、使用を包含する。。

既に示したとおり、本発明による細胞株は、明白に別個の経路に向かって発達し得る。この分化経路は、培養培地の選択によって強く影響される。肝経路、胆管経路および膵臓経路への発達は実施例４に例示される。

本発明によるヒト肝臓癌細胞株は、その高い分化能力、かなりの機能性および操作の容易さを考慮すれば多くの適用の対象である。

第一の有用な適用は、本発明による細胞株および／またはこの細胞株に由来する細胞の使用であって、新しい医薬および／または栄養性構成要素および／または環境汚染物質の評価を意図する、代謝試験および／または毒性試験のための、使用に相当する。

実際に、本発明による細胞株は、特には、無毒化に関して、正常なヒト肝細胞を模倣する、現在最高のモデルである。

特には、本発明による細胞株によって、急性肝細胞不全症の一次的な処置のための体外型バイオリアクターの製造が可能になる。本発明はまた、本発明による細胞株の使用であって、新しいワクチンおよび／または抗ウイルス分子のスクリーニングおよび／または製造のための、特には、ウイルス周期の１つに対して活性な分子のスクリーニングのための；フラビウイルス科およびヘパドナウイルス科のウイルスのファミリーに属するウイルスに対する、特には、ＨＢＶおよびＨＣＶおよび／またはそれらの細胞膜レセプターに対する、抗体の製造のための；ウイルス中和および／またはワクチン組成物試験であって、本発明による細胞株の感染および／またはトランスフェクション後に得られた少なくともウイルス粒子および／またはポリペプチドを、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／または賦形剤および／またはアジュバントと組み合わせて含む試験を実行するための、使用を包含する。

本発明による細胞株は、消毒用化合物の殺ウイルス能を確認する目的のために、有利に用いられる。

本発明はまた、設備、家屋および／または地表を浄化するための消毒用化合物の殺ウイルス能を評価するための新しい方法であって、
−ウイルスをこの設備、家屋および／または地表と接触させる工程、
−この消毒用化合物を用いてこの設備、家屋および／または地表を消毒する工程、
−次に、本発明の細胞に対する、この消毒から生き残ったウイルスによる汚染を包含する方法を提唱する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例に示される。それらは、例示の目的であるが、ＣＮＣＭに寄託された、細胞株Ｉ−２６５２（ＨｅｐａＲｇと呼ばれる）に関連する。これらの実施例においては、図１〜１３に対して言及されており、この図１〜１３はそれぞれ、以下を示す。

図１は、肝臓の恒常性に関与する異なる細胞タイプの図示的提示である。
図２は、肝臓の図示的断面であって、肝臓を構成する異なる細胞の構造的組織化を明確に示す。
図３は、ＨｅｐａＲＧ株の増殖曲線である。
図４は、ＨｅｐａＲＧ細胞の、異なる分化段階での位相差顕微鏡写真である。
図５は、ＨｅｐａＲＧ細胞の電子顕微鏡写真である。
図６は、ＨｅｐａＲＧ株の代表的な偽二倍体（ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｌｏｉｄ）分裂中期の、ＲＨＧ型染色による核型である。
図７は、２つの肝臓生検、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐａＲＧ細胞におけるｍＲＮＡの発現のノーザンブロット解析である。
図８は、活性誘導因子ＣＹＰ１Ａ（フェナセチンデエチラーゼ）（ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ ｄｅｅｔｈｙｌａｓｅ）およびＣＹＰ３Ａ４（ニフェジピンオキシダーゼ）の影響である。
図９は、ＨｅｐａＲＧ細胞における肝臓ｍＲＮＡのレベルに対するコルチコイドおよびＤＭＳＯの影響である。
図１０は、細胞の伝染能力に影響する異なる因子の影響である。
図１１は、ＨＢＶによるＨｅｐａＲＧ細胞の感染の影響である。
図１２および図１３は、胆管および膵臓の分化である。
図１４および図１５は、インターフェロンαの有無における、ＨＣＶを担持する患者の血清を用いたＨｅｐａＲＧ細胞の感染能である。
図１６は、インターフェロンαによる、ＨＣＶの複製または阻害の動態である。
図１７は、リーシュマニア属の寄生生物による感染の動態である。
図１８および図１９は、 リーシュマニア属の寄生生物による感染のプロトコールの最適化である。

（実施例１：肝臓癌細胞株の単離）
（１．材料および方法）
悪性肝細胞癌およびウイルス性Ｃ型肝炎に罹患した患者から採取した肝臓腫瘍から細胞を単離した。全体的な手順は、フランスの法律および規制に従って実行され、そして国家倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ）によって、かつ内密に承認された。

サンプルを、細かいシートに切断し、次いで、ＨＥＰＥＳに基づく緩衝溶液［（ｐＨ７．７；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ］を用いてリンスして、０．０７５％のＣａＣｌ₂を添加された（３７℃で穏やかに撹拌しながら添加）同じ緩衝溶液中に希釈した、０．０２５％のコラゲナーゼＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を用いた２回の洗浄後、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌのインスリン、２ｍＭ／ｍｌのＬ−グルタミンおよび５・１０^-7Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートを補充されたウイリアムのＥ培地中にこの細胞を再懸濁する。次いで、この細胞懸濁物をプラスチック支持体上の異なるウェルに分配する。数週間後、細胞増殖は、培養物を生じるのに十分である。その集団は、不均一であるが、細胞は高度に分化しており、肝細胞型の形態を有する。最も均一な細胞集団を有するウェルを、トリプシンで分離し、次いで再分配する。３世代後、細胞をアリコートに分け、次いで、１０％のＤＭＳＯを添加した培養培地中で凍結させて、液体窒素中で保存した。融解後、肝細胞型の形態を有する細胞の割合が最大であるウェルを選択する。この細胞を、その単離のために用いた培養培地中でおよび／または細胞選択を完了するために用いた分化培地中で培養する。

細胞株において、より頻繁な肝細胞の分化を獲得するために、第一の選択に由来するＨｅｐａＲＧ細胞を、５μｇ／ｍｌのインスリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナート、２ｍＭ／ｍｌのＬグルタミンおよび１０％のＦＣＳを添加されたウイリアムのＥ培地中で培養する。

この細胞を、１０〜１５日毎に、１／５希釈で継代させる。分化段階は、２つの段階で起こる。
−細胞を２週間、増殖培地中で維持し、１週の終わりにコンフルエンスに達させる、
−次いで、それらの細胞を、分化培地（前述の培養培地であって、２％ＤＭＳＯを添加した培地に相当する）中で、さらに２週間維持して、培地を２〜３日ごとに補充する。

（細胞遺伝学的な解析）
ＨｅｐａＲＧ細胞の核型を、８継代後に解析した。最初に、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で２４〜４８時間、細胞を維持し、次いで、コルセミド（１０μｇ／ｍＬ）への４５分間の曝露によって分裂中期でブロックした。

次いで、細胞を低張性溶液（０．１ＭのＭｇＣｌ₂）を用いて処理し、カルノアの酢酸溶液を用いて固定して、ＲＨＧ染色によって染色体を明らかにした。

（２．結果）
（序言）
図２は、肝臓の図示的断面を示しており、これは、肝臓細胞の構造的組織化を明確に示す。特には、正常なヒト肝細胞癌は、以下の形態学的特徴を有する。
・これらの細胞は、ミトコンドリアおよび粗面小胞体小胞、円形および通常の中心核（極めて高密度な核小体を有する）のような器官に富むという事実に起因して、顆粒細胞質を伴う細胞である。
・これらの細胞は、代表的な柵状織に分類されかつ組織化され、ほとんどの場合、２〜４細胞の索から形成され、デスモゾーム型の構造を連結することおよび「ギャップ（Ｇａｐ）」型の構造を連絡することによって連結され、類洞がいずれかの側に隣接し、ここを血液が循環する。この柵状織への組織化によって、肝細胞を特徴付ける二重の極性（類洞の側の類洞極および肝細胞の接触面での胆管極）が決定される。

胆管極は、無毒化機能に関連し、そしてより特には、胆汁酸塩の排泄に関連する。これは、拡張された細胞間空隙であり、特徴的な複合接合部（密着結合に加えてデスモソーム）に近く、これが、一方では、特定のタンパク質の発現によって機能レベルで、他方では、多数の絨毛の形成によって形態学的レベルで、各々の細胞について特殊化した膜領域を区切る。

さらに、胆管細胞という用語は、胆管路および細管を構成する細胞をいう。後者によって、胆汁への排泄が可能になり、この胆汁酸塩は、肝細胞に由来し、かつ胆管極を介して実質性細胞の柵状織に沿って循環する。

（肝細胞の形態を有する細胞の選択）
ウェルに由来する細胞であって、肝細胞型の細胞の割合が高いことについて最初に選択された細胞を、５・１０^-7Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートを含有する培養培地中で維持する。それらの細胞の形態は、ますます不均一になり、肝細胞の形態とは離れることが注目される。

次いで、肝細胞型細胞の集団を見出すために、本発明に従って、以下の選択方法を用いる。
−分化培地を用いる。この分化培地は、５ｍｇ／Ｌのインスリンおよび１０％のＦＣＳのみを含有する基本培地から形成され、ここに、２％のＤＭＳＯおよび５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートが添加されている。一旦、コンフルエンスが十分確立されれば、この培地中で、ＨｅｐａＲＧ細胞を培養する。

その後２〜４日目に、非常に毒性である培地によって、細胞の９０％より多くの死亡が生じる。並行して、特定の生存細胞の形態がかなり変化する。

この処置の２週間後、細胞の死亡率は、ゼロになると思われ、そして特定の生存細胞は、同じ条件下で培養された、正常なヒト肝細胞と同じ形態を有する。

従って、分化した細胞は、他の細胞よりもＤＭＳＯに対して耐性であることが確認される。

この細胞を、一旦、ＤＭＳＯなしの培地中に入れれば、活性な増殖期に戻る。

選択プロセスを続ける。この分化培地における３回の選択段階後、ほとんどの細胞は、ＤＭＳＯに対して耐性になり、そして、一旦コンフルエンスに達すれば、再分化し得る。

集団の均一性はさらに、２つの他の選択プロトコールによって増大される。

本発明者らは、トリプシンを用いた処理が、最も分化した細胞を、多細胞培養物の形態で分離する傾向であるが、単離される分化細胞は少なくなるという事実を観察し、かつ利用した。より大きい凝集物の精製によって、分化し得る細胞の集団を富化することが可能になる。

コラゲナーゼの使用は、極めて異なる原理に基づく。コラゲナーゼを用いて実行された処理は、回収され、かつ再播種され得る、最も分化した細胞の選択的分離を包含する。

最終的に、この細胞株の表現型の安定性は、高濃度（５・１０^-5Ｍ）のヒドロコルチゾンヘミスクシナートの持続的な使用によってかなり促進される。

（形態学的改変：増殖から分化まで）
選択された細胞の予期されない特徴は、それらの細胞が、強力なコルチコイド濃縮物の存在下で増殖する能力に関与する。分離後、ほとんどの細胞は、２時間で支持体に付着して、増殖を始める。対数増殖期の間、この集団は２４時間で２倍になり、このとき細胞はコンフルエンスに達して、増殖が遅くなる。後者は、継代の後１０日でプラトーに達し、その後、細胞は、もはや分割できず、しかし数週間の間生存し続ける。

図３においては、１０代継代の間の、ヒドロコルチゾン（５・１０^-5Ｍ）の非存在下−■−、または存在下−◆−で培養した細胞を、４ｃｍ²のウェルあたり４０，０００細胞の密度で播種して、同じ培養培地で維持した。この細胞を、トリプシン処理によって収集し、手動でカウントした。

増殖期の間、ＨｅｐａＲＧ細胞は、上皮表現型（通常の構造的組織化はない）であって、肝細胞の形状とは異なる形状の均一な集団を形成する（図４Ａ、増殖条件下のＨｅｐａＲＧ細胞）。一旦コンフルエンスに達すれば、この細胞は、かなり形態学的な改変を被る。４週間で、顆粒肝型細胞の多数のコロニーが出現するが、末梢では、上皮細胞が、明瞭に視認できる（図４Ｂ、２０日間コンフルエンスで維持したＨｅｐａＲＧ細胞）。継代の２週間後のＤＭＳＯの添加によって、極めて完全な形態学的分化が誘導される。正常な肝細胞の初代培養において得られたものに匹敵する、細胞の柵状織への組織化（ここでは、小管型構造（図４Ｂにおいて黒い矢印で示される）が、認識され得る）。図４Ｃおよび４Ｄは、５日間コンフルエンスで維持され、次いで、１５日間２％のＤＭＳＯで処理されたＨｅｐａＲＧ細胞を示す（目盛り＝１００μｍ）。

いくつかの上皮細胞は、自由な空間を占有する（平坦な、通常の細胞、図４Ｃにおいて詳細に示され、図４ＤにおいてＥの文字で注記される）。特徴的な肝細胞の形態はまた、肝細胞の索の柵状織への組織化のレベルとして変換される。これは、ＤＭＳＯへの曝露の２週間の終わりに得られ、次いで顆粒細胞は、極めて強力に肝細胞に類似する（図４Ｃ、図４ＤにおいてＨの文字で注記される細胞）。これらの２週間の終わりに、さらなる有意な改変は気付かれない。

この条件によって、完全な肝細胞分化を得ることが可能になり、従って以下によって規定される。
−コルチコイド（５・１０⁵Ｍのヒドロコルチゾン）の存在下での１週間のコンフルエンス、
−次いで、ヒドロコルチゾンおよび２％のＤＭＳＯの存在下での２週間の分化。

驚くべきことに、柵状織から顆粒細胞集団を選択的に収集することによって、後者は、長期の静止状態の後でさえ、活性増殖期に復帰することおよびコンフルエンスに達すれば、もう一度２つの肝細胞および上皮細胞型を生じることが可能であるということが観察された。

電子顕微鏡的研究によって、細胞の構造的組織化が明らかになった。２つの隣接する細胞は、デスモソームによってお互いに強力に結合し（図５Ａ、低倍率の図）（ここでは、構造は毛細胆管に強く類似している）、そして接合部に代表的な複合体（「密着」結合（「ｔｉｇｈｔ」ｊｕｎｃｔｉｏｎ）＋デスモソーム）によって囲まれている。図５Ｂおよび５Ｃは、より大きい倍率の図を示す。この図は、コラーゲン顆粒の代表的な蓄積および毛細胆管型の構造を示す（目盛り＝２μｍ）。

図５Ａにおいて、１または２つの核小体を含む、特徴的な通常の、円形核をみることができる。細胞質中の多数のミトコンドリアは、２〜３のピークを示す、わずかに半球形の形状である。多数の細胞質顆粒であって、実際に、インビボで正常な肝臓において記載されるような「ロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）」へと組織化されたグリコーゲン粒子の蓄積である、細胞質顆粒を観察することがまた可能である（図５Ｂ）。

最終的に、予期せぬことに、この細胞株の細胞の核型は、サブ二倍体（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）である。以下の核型様式が推論された。４６＜２ｎ＞、ＸＸ、＋ｄｅｌ（７）（ｑ１１−ｑ２１）ｉｎｖ？（７）（ｑ２１ ｑ３６）、−ｄｅｒ（２２）ｔ（１２；２２）（ｐ１１；ｑ１１）。欠失位置および転位位置の決定を、インサイチュでハイブリダイゼーションによって実行した。試験した４０の有糸分裂のうち、６５％が４６の染色体を含む。細胞の１００％が、以下の異常を有する（図６）：
−トリソミー７をもたらす、過剰なかつ改変された第７染色体および
−モノソミー１２ｐをもたらすフラグメント１２ｐの損失を伴う転位ｔ（１２．２２）（図６）。

他の単離された異形を検出して、以下の表Ｉに報告する。

（実施例２：細胞株の機能的能力）
（１．材料および方法）
（ＲＮＡの抽出および解析）
Ｔｏｔａｌ ＳＶ ＲＮＡ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、細胞の総ＲＮＡを抽出し、１．５％アガロースゲル上で分離して、ノーザンブロットで解析する。メチレンブルーでの染色後、このフィルターに移したＲＮＡの量に対のチエックを実行した。Ｇｒｉｐｏｎら（１９９３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：５３４〜５４０）のプロトコールに従って、ハイブリダイゼーションを実行する。

（無毒化機能に関連する酵素活性）
Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏら（１９９３，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８：４０６〜４１４）によって開発されたプロトコールによって、酵素活性を確立した。

以下を試験した。
−フェナセチンのパラセタモールへの脱エチル化、
−３，５−ジメトキシ−カルボニル−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロ−フェニル）ピリジンへのニフェジピンの酸化、
−酒石酸デキストロルファンへのデキストロメトルファンの脱メチル化、
−ヒドロキシトルブタミドへのトルブタミドの水酸化、
−４−ヒドロキシメフェニトインへの４−メフェニトインの水酸化。

比較のために、以下の基質の存在下で２〜１６時間インキュベートした正常なヒト肝細胞の培養物上で、酵素活性をまた、決定した。
−２・１０^-4ｍｏｌ／Ｌのフェナセチン
−２・１０^-4ｍｏｌ／Ｌのニフェジピン
−２・１０^-4ｍｏｌ／Ｌのデキストロメトルファンおよびメフェニトイン
−１ｍｍｏｌ／Ｌのトルブタミド。

このアッセイは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で実行する。結果は、１時間あたり、かつＤＮＡ１μｇあたりで形成された代謝物のピコモルで表す。基質として１−クロロ−２，４−ジニトロ−ベンゼン（ＣＤＮＢ）（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、ｐＨ６．５および環境温度で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の活性を評価する。

（２．結果）
肝臓に特異的な異なるｍＲＮＡ、特には、血清のタンパク質（アルブミン、トランスフェリン）、解糖に関与する肝臓酵素（アルドラーゼＢ）および無毒化に関与する３つの特異的酵素（ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３ＡおよびＧＳＴａ）のような、肝臓に特異的な機能のタンパク質のｍＲＮＡの量の解析によって、細胞の分化のレベルをチエックした。これらのＲＮＡの全てが、成人の肝細胞によって発現される。

増殖期および分化期におけるそれらの発現レベルを比較した。さらに、ヒト肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞における対応する発現レベルとの比較を確立した。

図７は、２つの肝臓生検（ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐａＲＧ細胞）におけるメッセンジャーＲＮＡの発現のノーザンブロット解析である。この細胞を増殖条件下（ｐｒｏｌｉｆ）で、または１ヶ月のコンフルエンスのいずれかで維持した。培養の最後の１５日間、２％のＤＭＳＯを用いた細胞の処理は、以下のように示される。＋Ｄ。

特異的な肝臓ｍＲＮＡは、増殖の間に、細胞において、ほとんど検出されないか、または全く検出されなかった。対照的に、それらは、その細胞において、高濃度のコルチコイドの存在下で２週間維持された、コンフルエンスで検出され得る。アルブミンおよびアルドステロンＢについては、強力に発現されるが、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４は、弱い発現のままである。柵状織への代表的な組織化を達成した細胞において、ＤＭＳＯに対する曝露は、後者の２つの酵素の発現の増大に相当する転写物の増大を生じ、これによってそれらの発現レベルは、生検から得られる細胞において観察された発現レベルと事実上、等しくなるということがまた観察される。

参照として用いられたＨｅｐＧ２株の細胞において並行して実行した研究によって、研究した５つの特異的機能のうち３つだけが、これらの細胞において、ほんのわずかに発現されるか、または発現されないということが明らかになる。さらに、ＨｅｐＧ２に対するＤＭＳＯの作用は、これらの特定の機能の発現（特には、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ）を阻害するように思われる。

これらの解析によって、ＨｅｐａＲＧ株のもともとの特徴が実証される。

次いで、無毒化の第Ｉ相および第ＩＩ相に相当する、これらの異なる酵素の活性を測定した。他の細胞株は、これらの酵素を弱く発現するか、多くの場合遅いか、またはやはり特定の誘導因子に応答しない。

これらの異なる酵素の活性は、ＤＭＳＯで処理したコンフルエントなＨｅｐａＲＧ細胞上で測定された。この活性を、ヒト肝細胞の初代培養物の活性と、そしてＨｅｐＧ２株およびＨＢＧ株のＢＣ２クローンの活性と比較した。この結果を、以下の表ＩＩに示す。

この表の検査によって、ＨｅｐａＲＧ細胞が、デキストロメトルファンデメチラーゼ（その活性は、わずかに低い）以外は、正常なヒト肝細胞によって発現されたレベルに事実上等価なレベルで、無毒化機能に関連する酵素活性を保有することが示される。フェナセチンデエチラーゼおよびニフェジピンオキシダーゼの活性は、他の株を用いて得られた活性よりも大きい。この活性は、正常なヒト肝細胞で観察されたものより低いが、同じ程度の大きさ内に収まっている（図８、この活性は、処理の７２時間後に測定され、そして、処理されていない細胞（コントロール細胞に相当する）に対する、処理された細胞の比として表される）。

（実施例３：完全な分化のためのコルチコイドとＤＭＳＯとの間に必要な協同作用）
実験を実行して、完全な分化を誘導するために両方の薬剤が必要であるか否かを確認した。

（１．分化の影響）
コルチコイドの存在下で常に維持されていた細胞に対するコルチコイドなしの影響を試験するために、実験の第一のシリーズを実行した。図９Ａにおいては、ＨｅｐａＲＧ細胞（第１３継代）を、ヒドロコルチゾンの持続的な存在において（増殖：ＨＮ）、またはヒドロコルチゾンの非存在において（増殖：ＨＯ）のいずれかで、さらに２継代保持した。次いで、ヒドロコルチゾンの非存在下で（ＨＯ）、またはヒドルコルチゾン５×１０^-5Ｍの存在下で（ＨＮ）、そして異なる濃度のＤＭＳＯの存在下で、３週間、それらの分化（ｄｉｆｆ．）を誘導させた。

コルチコイドの中断を、コンフルエンスで、すなわち、細胞がその分化を始める時点で、実行した。

２週間の培養後、ＤＭＳＯの非存在下において、アルブミンを除けば、特定の肝機能は検出されない（転写物なし）。２％のＤＭＳＯの添加は、その使用が不可能であるほど毒性である。１％のＤＭＳＯの添加は、毒性が低く、より進行した分化をなんら誘導しない。

実験の第二のシリーズによって、ＤＭＳＯの非存在に起因する影響を研究することが可能になった。

細胞をコルチコイドのみに曝露した場合、２〜３の転写物の（アルブミン、トランスフェリンおよびアルドラーゼＢの）存在は、非常に低レベルで検出される。培養培地に対する１〜２％のＤＭＳＯの添加によって、多数の転写物の急速な蓄積（特には、既に言及されているものであり、そしてＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａのものである）が生じる。

これによって、最大の分化に達するためには、コルチコイドとＤＭＳＯとの間の協同作用が必須であることが、実証される。最終的に、培養物の安定性は、少なくとも６週間にわたって確認された。

（２．増殖に対する影響：コルチコイドの持続的使用）
細胞を、コルチコイドなしの培養培地中で保持し、そして、２代（図９Ａ）および１０代（図９Ｂ）の継代後に、それが分化を実行する能力を試験する。

両方の場合とも、分化は観察されず、アルブミンのｍＲＮＡのみが検出される。２％のＤＭＳＯの添加は、非常に毒性であることが証明され、そして１％のＤＭＳＯの添加は、認知できる変化を生じない。

他方では、コンフルエンスでのコルチコイドのみの添加は、肝臓に特異的な異なる転写物の蓄積を生じる。しかし、この分化は、不完全である。なぜなら、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａの転写物は、１％または２％のＤＭＳＯの添加後でさえ、検出が困難であるからである（後者の用量は、コルチコイドなしの１０週後には高度に毒性であることが証明されている）。

最終的に、コルチコイドなしでは、細胞は徐々に増殖の改変を被る。接触阻害は、コンフルエンスのプラトーが、２倍の細胞密度（コルチコイドの存在下で持続的に維持された細胞で気付かれた）を有する程度まで、遅らされる（図３）。

この研究によって、ＤＭＳＯとコルチコイドとの間の協同作用の重要性が、増殖期（コルチコイドが、ＤＭＳＯの毒性を軽減することを可能にする）および分化期（ここでは、２つの薬剤の作用が、相補的である）の両方において、明確に示される。

（実施例４：ＨｅｐａＲＧ細胞が胆管および膵臓の分化の経路に向かって発達する能力）
（１．材料および方法）
ＨｅｐａＲＧ細胞を分離し、ウイリアムＥ培地において１／５に希釈し、これに５μｇ／ｍｌのインスリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナート、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを添加して、次いで、プラスチック支持体を備えるウェル中に再分配した。以下の４つの培養条件を行った。
・Ｂｌｏｕｉｎら（１９９５，Ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ，Ｅｘｐ．ｃｅｌｌ ｒｅｓ．，２１７：２２〜３３）によって記載されたプロトコールに従って、継代培養の翌日から培地の維持において３．７５ｍＭの酪酸ナトリウムを用いて、ＨｅｐａＲＧ細胞を処理した。次いで、培地を２〜３日ごとに補充する。
・３．７５ｍＭ酪酸ナトリウム、または２％ＤＭＳＯによって、継代培養５日後にＨｅｐａＲＧ細胞を処理した。５日間毎日、培地を補充した。
・３．７５ｍＭ酪酸ナトリウムによって、ＨｅｐａＲＧ細胞を、濃いコンフルエンスで処理した；この培地を２〜３日ごとに補充した。
・プラスチック支持体上に、またはラット始原胆管上皮細胞の単層上において、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ｉ−イノシトール（０．２ｍＭ）、葉酸（２０ｍＭ）、βメルカプトエタノール（１０^-4Ｍ）、トランスフェリン２００μｇ／ｍｌ、１２．５％ＦＣＳおよび１２．５％ウマ血清を補完した、ＭＥＭα培地中で、ＨｅｐａＲＧ細胞を播種した。特定の状況では、ＬＩＦ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、またはＧ−ＣＳＦのようなサイトカインをこの培地に添加した。この培地を２〜３日ごとに補充した。

（間接的な免疫組織化学）
ＰＢＳで洗浄後の細胞を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで緩衝化した４％パラホルムアルデヒドの溶液によって、ｐＨ７．４で、２０分間、４℃で、固定する。次いで、それらを解析の時点までＰＢＳ緩衝液中で保存する。

１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳを用いて、特定の部位を４５分間飽和する。次いでこのサンプルを、０．０５％サポニンを含有するＰＢＳ中で、常温で１時間、一次抗体と反応させる。０．０５％サポニンを含有するＰＢＳ中での３回の洗浄後、ペルオキシダーゼに結合した二次抗体とともに、このサンプルをインキュベートする。次いで、２回の洗浄を実行して、次いで０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ溶液中に含有される３，３’−ジアミノベンジジン（ｐＨ７．６、０．０１％Ｈ₂Ｏ₂、１１０容積）とともに、インキュベーションすることによって、ペルオキシダーゼ活性を明らかにする。

（２．結果）
（ａ／胆管経路へ向かう分化（図１２））
（形態学的改変）
任意の処置およびコンフルエンス状態の前に、ＨｅｐａＲＧ細胞は、それほど均一ではない集団を構成し、ここでは多角形の細胞および細長い細胞が見出される（図１２）。

酪酸ナトリウムによる、ＨｅｐａＲＧ細胞のコンフルエンスにおける全ての処理条件のもとで、この細胞は、培養中の胆管細胞の特定の形態を有する（図１２）。この細胞は、拡大し、かつサイズが大きくなり、それらは、数個の核小体を含む卵円核を備える透明な細胞質を有する。細胞の輪郭は、一般にはっきり規定されていない。時には、脂質小滴が観察される。細胞を非常に濃いコンフルエンスで処理した場合、いくつかの細胞は死滅する。これらの細胞は、おそらく、肝細胞経路に向かって既に方向付けられた細胞に相当する。

酪酸塩の影響をまた、低密度でかつ活性な増殖期のＨｅｐａＲＧ細胞上で試験した。これらの細胞の特徴は、高用量の酪酸ナトリウムの存在下においてそれらの細胞が増殖する能力である（図１３Ａ）。

増殖期の間、ＨｅｐａＲＧ細胞は、上皮様の型の細胞の均一な集団を形成するが、コンフルエンスでは、それらは、胆管上皮細胞の外観を有する。

（表現型変化）
酪酸ナトリウムの存在下で観察された形態学的改変は、表現型の変化に相関している（Ｂｌｏｕｉｎら、１９９５）。本発明者らは、胆管経路に向かう分化の４つのマーカーを用いた。γ−グルタミルトランスフェラーゼ、インテグリンのα６鎖、ならびにサイトケラチン７および１９（これらは、細胞が肝細胞経路に向かう場合は、通常消失する）。肝経路に向かう分化について、本発明者らは、アルブミンの発現の増大およびインテグリンのα１鎖の発現の減少を探索した。

第一の例では、本発明者らは、分化していない増殖細胞を特徴付けた。ＨｅｐａＲＧ株の細胞は、以下の表現型：ｃ−キット（ｃ−ｋｉｔ）、サイトケラチン７および１９、インテグリンのα１鎖およびα６鎖、γ−グルタミルトランスフェラーゼおよびアルブミンの発現、を有し、このことは、これらの細胞が、卵円形細胞および／または幹細胞であることを示唆する（図１の図表を参照のこと）。

酪酸ナトリウムの存在下で細胞を培養した場合、それらは、より強力にγ−グルタミルトランスフェラーゼを発現し、インテグリンのα６鎖、ならびにサイトケラチン７および１９の発現を保持しており、このことは胆管経路に向かうそれらの方向付けを証明する。ＤＭＳＯ（肝細胞の分化を誘導する）の存在下でそれらを培養した場合、本発明者らは、サイトケラチン７および１９、インテグリンのα６鎖の発現の消失を観察する。それらは、インテグリンのα１鎖をより低いレベルで、そしてアルブミンを極めて強力に発現し、このことによってそれらの肝細胞分化が確認される。培養物中で不均一である（これらの高度に特徴的な表現型）細胞集団が、この経路の１つまたは他に向かうプラーク分化においてのみ見出される。

酪酸ナトリウムによって処理されるか、または処理されない細胞のインサイチュでのマーキング後に得られた結果を、以下の表ＩＩＩにまとめる。

（ｂ／膵臓経路に向かう分化（図１３Ｂ））
図１における図表によって例示されるとおり、肝臓の「卵円形（ｏｖａｌ）」幹細胞は、多能性である。上記で実証された、肝臓細胞へ分化し得ることとは別に、それらは、他の細胞型（腺房の膵臓細胞を含む）へ分化し得る能力を有する。本発明者らは、この分化能力が、ＨｅｐａＲＧ株の特徴の１つであるか否かを研究した。

細胞を、ＭＥＭα培養培地中に播種してかつ培養した場合、この細胞は、付着し、次いで、前球状構造へ縮まり、このことは、膵臓上皮細胞の３次元培養と形態学的に類似の複雑な小管の網目状構造の形成を示唆する（Ｋｅｅｒ−Ｃｏｎｔｅら、１９９６、Ｄｕｃｔａｌ ｃｙｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：ａ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｉｄｉｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：１１０８〜１１４１）。

（実施例５：ＨＢＶによる細胞株の感染）
（１．材料および方法）
（感染）
感染源は、優先的に、１００倍に濃縮されたクローン２．２．１５のＨｅｐＧ２細胞の上清によって、構成される。実際、この感染源は、枯渇することがなく、一定の品質であるという二重の利点を有する。

感染に用いられる細胞は、実施例１に規定される条件によって（５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの持続的な存在）培養されており、かつコンフルエンスで１週間維持され、次いで２％のＤＭＳＯを添加された同じ培地中で２週間維持されている細胞である。

これらの細胞を、４％のＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を添加された培養培地中で、１０倍に希釈された感染源とともに、３７℃で２０時間、インキュベートする。このＨＢＶ感染プロトコールの第二の部分は、Ｇｒｉｐｏｎら、１９９３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：５３４〜５４０によって確立された。

コントロールの培養物を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液中で希釈した４％のＰＥＧおよび２５％のＦＣＳとともにインキュベートした。

インキュベーションの終わりに、培養培地を用いて細胞を３回洗浄し、それらの細胞を用いるまで、２％のＤＭＳＯおよび５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの存在下で維持する。

このウイルスと、Ｂ型肝炎表面モノクローナル抗体（Ｓ３９〜１０）との、常温で１時間のインキュベートによって、感染の前に中和試験を実行した。

（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨｂｓＡｇ）の検出）
Ｂｉｏｒａｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｎａｌｉｓａ ＡｇＨＢｓ ｐｌｕｓ（登録商標））を用いて、培地中でＨＢｓ抗原を検出した。その結果を上清のｐｇ／ｍｌで表す。

（ウイルスＤＮＡの抽出および解析）
ウイルスＤＮＡ複製中間体を、全ての細胞溶解物において単離した。細胞をトリプシンでの分離後に回収し、次いで、プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）を添加した溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．５％のＳＤＳ、１０ｍｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）１０ｍｌのＮａＣｌ）を用いて３７℃で溶解した。１Ｍ ＮａＣｌを用いて、細胞ＤＮＡを、１２時間にわたって４℃で沈殿させる。次いで、ウイルスＤＮＡを含む上清を、抽出する。抗ＨＢｓポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いた免疫沈降によって、細胞上清から完全なウイルス粒子を単離する。ｔＲＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）およびプロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）を添加した溶解緩衝液中で、３７℃で１２時間の溶解後に、核酸を最終的に抽出する。

上記のプロトコールの全てにおいて、フェノール−クロロホルムを用いて、ＤＮＡを抽出して、イソプロパノールによって沈殿させる。

核酸は、１．５％アガロースゲル上でのサザンブロットによって解析する。分子量マーカーは、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡの制限フラグメントである（３１８２ｂｐおよび１５０４ｂｐ）。上記のＧｒｉｐｏｎらのプロトコールに従って、ハイブリダイゼーションを実行する。

（２．結果）
（感染の証拠）
感染後１０日間にわたって、細胞内のウイルスＤＮＡを解析する。

図１０Ａは、細胞の感染能に対するＰＥＧの影響を示す。これは、５％のＰＥＧの存在下（＋ＰＥＧ）、またはＰＥＧの非存在下（−ＰＥＧ）における、ＨｅｐａＲＧ細胞の感染後の細胞内ウイルスＤＮＡの出現の動態のサザンブロット分析である。弛緩環状（ｒｅｌａｘｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）（ＲＣ）ＤＮＡ型および共有結合性閉鎖環状（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）（ＣＣＣ）ＤＮＡ型の位置は、図の右側に示される。分子量マーカーの移動位置（Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムのフラグメント）は、この図の左側に示される。

ＰＥＧの存在下で、観察されたＤＮＡプロフィールは、接種材料中に存在するウイルス粒子について明らかになったプロフィールと同一である。

しかし、このシグナルは、感染の１０日後実際に検出不能になるまで徐々に消失していく。さらに、ウイルス複製の中間型は、これらの条件下では検出されない。他方では、細胞が、ＰＥＧの存在下で感染される場合、後者は明確に存在する。強力なシグナルが感染の直後に観察され、これは、ＰＥＧの非存在下で観察されるものと類似のプロフィールであった。これによって、細胞へのウイルス粒子の浸透が有効であることが証明される。２日目に、多くのウイルス粒子の排除に起因してシグナルが鮮明に低下するが、２ｋｂに向かって位置する微細なバンドが観察され得る。このバンドは、ＣＣＣ ＤＮＡ（共有結合性閉鎖環状ＤＮＡ）に相当する。中間の位置で検出されたシグナルは、初期のウイルスＤＮＡに相当し、１０日目まで徐々に増大していく。

並行して、ウイルスＲＮＡ蓄積の動態を確立する。図１０Ｂは、ＨｅｐａＲＧ細胞の感染後のこの動態のノーザンブロット解析であり、ＨｅｐＧ２細胞は、ウイルス感染の陰性コントロールとして用いられる。ＲＮＡのサイズは、この図の左側に示されている。

２．４ｋｂおよび３．５ｋｂのシグナルであって、ＨＢＶに特異的なＲＮＡの主要な種に相当するシグナルは、感染の２日後に生じて、感染した細胞にのみ蓄積する。

感染されることになるＨｅｐａＲＧ細胞の特異性を確認するため、２つの他の肝臓癌細胞株である、ＨｅｐＧ２およびＢＣ２の感染を、同一条件下で実行した。これらの２つの株を選択した理由は、これらの株が、分化することができるからである。それらの株が最大分化段階に達することを可能にする条件下で、そしてＨｅｐａＲＧ細胞について用いたのと同じ条件下で、それらの株を培養した。ウイルス粒子および５％のＰＥＧとともに約１２時間インキュベーションした後、生成された細胞内のウイルスＤＮＡおよびウイルスＲＮＡを分析する。感染の直後に、大量のウイルスＤＮＡが、全ての株において、そして上記のＨｅｐａＲＧおよびＢＣ２の全てにおいて検出される。トリプシン／ＥＤＴＡ処理が細胞の表面で吸着されたウイルス粒子を排除するという点で、観察されたＤＮＡは、細胞の内側に進入しているウイルス粒子に相当するはずである。このシグナルは、感染後２日でかなり低下する。他方では、感染後１８日で、ＨｅｐａＲＧ株のみが、ウイルス複製中間体に相当する型（すなわち、ｃｃｃＤＮＡ）およびウイルスＲＮＡ型を有する。これによって、ＨｅｐａＲＧ株のみが、感染され、そしてウイルスの複製を開始することができることが示される。

ウイルス粒子の生成物を、感染したＨｅｐａＲＧ細胞の上清中で探した。放射性免疫学によってＨＢｓ抗原をアッセイした。図１１Ａは、感染した細胞の上清におけるＡｇＨＢｓ分泌の動態を示す。上清をＨｅｐａＲＧ細胞（■）、ＨＢＧ ＢＣ２（■）およびＨｅｐＧ２（□）の感染後、１５日間収集した。

上清中において高いＨＢｓ抗原濃度を検出した。感染後９日間、抗原濃度は上昇し、次いで、高いレベルで維持された。他方では、ＨｅｐＧ２細胞およびＢＣ２細胞の上清において、抗原は感染の２日後においてのみ検出され、これは、ウイルス粒子が、細胞によって吸着され、次いで培地中に徐々に放出されたことを示す。

さらに、この培地中に存在する完全なウイルス粒子を、抗ＨＢｓ抗体との免疫沈降と、それに続く、沈降物中に存在するＤＮＡのサザンブロット解析によって評価した。図１１Ｂは、ＨＢＶによって感染されたＨｅｐａＲＧ細胞の上清中の細胞外ウイルスＤＮＡの出現動態のサザンブロット解析を示す。抗ＨＢｓ抗体を用いた完全なウイルス粒子の免疫沈降後、ウイルスＤＮＡを抽出して解析する。分子量マーカー（Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムのフラグメント）の移動位置は、この図の右側に示される。

感染の２日後に強力なシグナルが観察される。４日目に、シグナルはかなり低下するが、８日目までには再度、徐々に上昇して、培養期間を通じて維持される。この動態解析は、このウイルスの複製の方法には適切である。細胞に浸透したウイルス粒子の放出期間（２〜４日）後、このウイルスは、活発に複製を始める。観察されたプロフィールは、２日目に得られたプロフィールとはわずかに異なる。

（感染のインビトロ中和）
特定の抗Ｓモノクローナル抗体が、細胞の感染を中和し得るか否かを決定するために、種々の濃度の抗体とともにビリオンをインキュベートし、次いで細胞と接触させる。残りの感染を、ＨＢｓ抗原の長期分泌の関数として評価する。

図１１Ｃは、インビトロにおけるこのウイルス中和試験を示す。このウイルス粒子を、連続的に希釈したＨｂｓ抗原に対するモノクローナル抗体（抗体Ｓ３９〜１０）（■）、または無関係の抗体（■）ともにインキュベートして、ＨｅｐａＲＧ細胞上でその感染性を評価する。これらの細胞の感染のレベルを、感染の１０日後、感染した細胞の上清中のＨＢｓ抗原の分泌を測定することによって評価する。

この図においては、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度が、ウイルス感染をブロックするが、より低い濃度では部分的な阻害しか誘導しないことが見出され得る。５０％阻害は、０．０３μｇ／ｍＬの濃度に相当する。

（感染に対する分化程度の影響）
ＨｅｐａＲＧ細胞が感染される能力を、それらの分化程度の関数として研究した。実施例１および２に記載した方法を用いて、細胞分化プログラムを改変した。

異なる分化段階を誘導するために、コルチコイドのみの存在下で、次いでコルチコイドおよび種々の濃度のＤＭＳＯの存在下で、持続的に維持した細胞において、感染の第一のシリーズを実行した。

ウイルスＲＮＡ上で２週間後に行った解析によって、２つの主なウイルス転写物の蓄積と、分化のレベルとの間の相関が示される。

図１０Ｃは、ＨＢＶによる感染に対する肝細胞分化の影響を示す。これは、漸増する濃度のＤＭＳＯの存在下におけるＨｅｐａＲＧ細胞の感染後の細胞内ウイルスＲＮＡのノーザンブロット解析である。

この相関は、コンフルエンス（それらの分化の前）で感染され、次いでその分化を誘導するために至適条件下に置かれた細胞上で実行された一連の実験によって確認された。その結果を以下の表ＩＶに示す。

この表の試験によって、細胞がＤＭＳＯによる処理の前に感染された場合、測定されたＨＢｓ抗原の量は、低いということが示される。このことは、わずかに分化した細胞上で実行された感染は、強く分化された細胞上で実行された感染に比べてそれほど効果的ではないということを意味する。同様に、コルチコイドなしの培地中で（１０継代の間）維持し、次いでＤＭＳＯの有無において２週間培養した細胞上で実行された感染もまた、有効でなく、特には、ＤＭＳＯの作用から恩恵を被っていない細胞について、有効ではないことが証明される。

最終的に、活発に増殖している未分化の細胞で実行された感染の有効性を、増殖停止され、かつ十分に分化した細胞における感染の有効性と比較した。その結果を以下の表Ｖに示す。

この結果は、増殖期における細胞で実行した感染が、コルチコイドおよびＤＭＳＯの存在下でさえ、無効であることを示す。

（実施例６：化学的分子、または生物学的分子の抗ウイルス活性の評価のためのＨｅｐａＲＧ株の使用）
（１．材料および方法）
実施例１および５のプロトコールに従って、細胞を維持および感染させる。

３ＴＣによる抗ウイルス処理を、ＨｅｐａＲｇ細胞の感染後８日目から１５日目まで、培養培地中で最終濃度０．１μＭおよび１０μＭで、投与する。培地の完全な補充を、２日ごとに実行する。上清は−２０℃で、そして細胞ペレットは−８０℃で保管する。

市販のＥＬＩＳＡ試験ＥＴＩ−ＭＡＫ−３（登録商標）（ＳＯＲＩＮ）を用いて、培養上清中において、ウイルス抗原（ＨＢｓ）を検出した。

培養上清に存在するウイルスＤＮＡは、Ａｍｐｌｉｃｏｒ−Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（ＲＯＣＨＥ）によって決定および定量できる。結果を、１ｍｌあたりのウイルス粒子数（ウイルス粒子／ｍｌ）として表す。細胞内ウイルスＤＮＡの解析のために、トリプシンを用いて細胞を分離して、−８０℃で保管した。以前に記載されたプロトコールに従って、総ＤＮＡを、単離した（Ｚｏｕｌｉｍら、１９９８，Ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２９：１５１〜１６８）。

（２．結果）
ＨＢｓ抗原は、３ＴＣによる処理の８日後に培養上清中で検出され、その値は、どんな用量でも一定のままであり、非処理コントロールに等しい。

ＨＢＶによって感染され、かつ処理されていないコントロール細胞に対して、３ＴＣによる処理の８日後、ＨＢＶによって感染したＨｅｐａＲＧ細胞中に存在するウイルスＤＮＡの量の、用量依存性の低下が、以下の表ＶＩの結果によって示されるように、Ａｍｐｌｉｃｏｒ−Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）試験によって、実証される。

（実施例７：ＨＢＶを不活化し得る産物、例えばＪａｖｅｌ（ジャベル）水の殺菌（消毒）力の評価のためのＨｅｐａＲＧ株の使用）
（１．材料および方法）
（２．）
１．１． 実施例１のプロトコールに従って、ＨｅｐａＲＧ細胞を維持する。

１．２． 並行して感染を実行する。
ａ）ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞から、以前に記載されたように得られたネイティブな接種材料（その感染性は、実施例５の操作プロトコールによって実証される）を用いるか、
ｂ）または同じ接種材料を、試験されるべき不活化溶液（ここでは、Ｊａｖｅｌ水）と接触させる。

殺菌力は、産物の濃度および産物と接種材料との接触期間に依存する。本発明者らは、Ｊａｖｅｌ水を２つの濃度で試験した。１２°および２４°、ならびに２つの曝露期間：１５秒および３０秒（以下の段落で詳細に示されるとおり）。

Ｊａｖｅｌ水に対する接種材料のＨＢＶの曝露
−シリーズ１：Ｊａｖｅｌ １２° １５秒間
−シリーズ２：Ｊａｖｅｌ １２° ３０秒間
−シリーズ３：Ｊａｖｅｌ ２４° １５秒間
−シリーズ４：Ｊａｖｅｌ ２４° ３０秒間
−シリーズ５：ウイルス希釈に用いた蒸留Ｈ₂Ｏ：コントロールウイルス

２００μｌの純粋なウイルスストック、次いで、２００μｌのＪａｖｅｌ水を４ｍｌのチューブに注ぐ。１．６ｍｌのＰＢＳ（希釈１／１０）を添加することによって反応を停止させる。

過剰なＪａｖｅｌの排除
上記のウイルス調製物を、専用のチューブ（１シリーズあたり２つのチューブ）にデカントして、４℃で超遠心してＨＢＶをペレットに沈殿させる。

Ｊａｖｅｌ水を含有する上清を穏やかに流し去る。

各々の希釈について２つのチューブの少量の残留物を混合して、ホモジナイゼーションによってウイルスペレットを回収する。

各々のシリーズの多かれ少なかれ不活化されたウイルス懸濁物を、実施例５と同一の操作条件に従って、ＨｅｐａＲＧ細胞培養物中に接種する。

１．３． 感染を明らかにするために、タンパク質およびウイルスＲＮＡの両方を測定する。

ウイルスＡｇ（Ａｇ Ｈｂｓ）を、実施例５および６に詳細に示されるように、市販のＥＬＩＳＡ試験（例えば、ＳｏｒｉｎのＥＴＩ−ＭＡＫ−３（登録商標）、またはＢｉｏｒａｄのＭｏｎｏｌｉｓａ Ａｇ ＨＢｓ ｐｌｕｓ（登録商標）も）によって、探す。

培養上清中でＰＣＲを用いて、ウイルスＤＮＡを探し、そしてまたＡｍｐｌｉｃｏｒ−Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）試験（ＲＯＣＨＥ）によって定量することができる。この結果を、１ｍｌ当量あたりのウイルスゲノム（ウイルスゲノム／ｍｌ当量）として表す。細胞内ウイルスＤＮＡを解析するために、トリプシンを用いて細胞を分離して、−８０℃で保管する。以前に記載されたプロトコール（Ｚｏｕｌｉｍ，１９９８）に従って、総ＤＮＡを単離して、ＨＢＶに特異的なＤＮＡについての検索を実行する。

（２．結果）
２．１． Ｊａｖｅｌ水なしのコントロール接種物によって、実施例５に詳細に記載のとおり、上清中のＡｇ ＨｂｓおよびウイルスＤＮＡの生成物、ならびに細胞中のＨＢＶのＤＮＡの特徴的なプロフィールを得ることが可能にされる。この感染は、純粋な、そして１／１０に希釈されたウイルスを用いて得られた。

２．２． 上記のように、異なる濃度のＪａｖｅｌ水に対して曝露された接種材料を考慮すれば、１２°のＪａｖｅｌ水を用いた１５秒または３０秒間の接触後、感染は生じないと考えられる。同じことが、このウイルスの１／１０希釈について、２４°のＪａｖｅｌ水（１５，３０５）にあてはまる。

（３．結論）
従って、ＨｅｐａＲＧ細胞に対する試験によって、医学外科学的なデバイスおよび装置によって院内感染に関与するこの主要な汚染ウイルスを不活化し得る、物理的な手順（加熱、照射）、または化学的な手順（界面活性剤／消毒溶液、またはガス：過酸化物、オゾンなど）を確証できるＨＢＶのインビトロ感染細胞モデルを提供することが、初めて可能になる。

本実施例において、単一の希釈物を試験した。進行中の実験によって、このモデルの感度および感染用量の対数（１０進法での対数として表される）を特定する。これによって、超遠心／ろ過／沈殿によるウイルスの濃度の容量を含む評価が可能になる。

（ＨｅｐａＲＧ株由来の「ｃＤＮＡ チップ」の構築）
この構築は、以下の段階を含む。
−２つの総ＲＮＡプールの調製、次いで、１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの次に２％ＤＭＳＯを含有する培地中での培養後の分化したＨｅｐａＲＧ株由来の細胞からの、一方でのポリＡ ＲＮＡの精製、ならびに他方での、継代培養後５日で採取した非分化細胞からの精製。
−逆転写による相補的ＤＮＡの調製。
−市販のキットを用いる抑制性サブトラクティブハイブリダイゼーションの実行。
−サブトラクティブライブラリーに存在するｃＤＮＡのクローニング。
−限られた数のｃＤＮＡの配列決定によるライブラリーの代表の試験。
−ベクター中に存在するユニバーサルプライマーを用いる、目的のｃＤＮＡ産物のＰＣＲ増幅。
−「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」型のプロセスの１つによるＰＣＲ産物の「スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）」。

従って、肝臓細胞の発現の機能的状況の代表的な１０００〜２０００の遺伝子の発現を、目的の種々の状況において研究することができる。

（実施例９：ＨｅｐａＲＧ株における熱帯熱マラリア原虫の肝臓型の接種および培養）
数年前、正常なヒト肝細胞の初代培養は、熱帯熱マラリア原虫の生存に好適な系を意味することおよび後者は、寄生生物の完全な肝臓サイクルを支持できることが実証された。対照的に、肝臓癌細胞における複製モデルは、現在のところ存在しない。

新規なＨｅｐａＲｇ肝臓癌細胞株は、寄生生物によるこれらの細胞の侵襲に関与する試験における観察に起因して、繁殖体の形成を伴う完全なサイクルの、重要な進歩を示し得る。

（材料および方法）
熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイトを、血液細胞（それ自体が寄生生物の赤血球型である生殖母細胞によって感染した）の摂取によって感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉの蚊から調製する。

感染性食餌の約２週間後、感染した唾液腺を無菌条件下で解体して、培養培地中に収集する。

これらの懸濁物（すなわち、培地１００ｍｌあたり１０対の唾液腺）を、ＨｅｐａＲＧ細胞の培養物に添加する。

侵入（ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ）のために用いた細胞を、実施例１に規定した条件（ヒドロコルチゾンヘミスクシナートの５・１０^-5Ｍの持続的な存在）に従って培養して、コンフルエンスで１週間維持し、次いで２％のＤＭＳＯを添加した同じ培地中で２週間維持した。

侵入の時点で、それらはコンフルエントであって、かつ実施例１〜４に記載のコルチコイド／ＤＭＳＯ処理によって完全に分化される。

曝露または接種期間は、約３〜４時間であり、そしてＤＭＳＯを欠く同じ培地において実行される。次いで、培養物に培地を添加して、２〜３日ごとに補充する。

（寄生生物の検出）
調製物をＰＢＳ中で洗浄し、次いで固定して、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色によって染色する。細胞内寄生生物は、細胞質に局在している。繁殖体の特徴的な形成が明確に生じる。これらの繁殖体は最初に、少数の核を有し、次いで大きく成長して、核の数がかなり増加し、これは完全な複製プロセスの具現を証明する。

（侵入プロトコールの最適化）
極めて脆弱な寄生生物である熱帯熱マラリア原虫は、ＤＭＳＯに対して高度に過敏であると考えられる。この結果は、より大きい有効性を示すが、これは、接種期間の間の培養培地からのＤＭＳＯの除去によって得られた。

（実施例１０：マウスへのｈｅｐａＲＧ細胞の注入）
インビボ研究モデルを得るために、ヌードマウスのような免疫不全実験動物にｈｅｐａＲＧ細胞を注入することが可能である。

マウスへのこの注入によって、ｈｅｐａＲＧ細胞の増殖および分化（大量の分化した細胞の形成を伴う）に好適な環境を見出すことが可能になる。ｈｅｐａＲＧ細胞の多能性の特徴を考慮すれば、これらの細胞は、細胞移植部位（肝臓細胞、膵臓細胞など）に依存して異なる分化を被る。従って、この注入によって、動物において、肝臓型または膵臓型の器官を再構築すること（この器官の変更を有する）が可能になる（Ｄａｎｄｒｙら、２００１，３３：９８１〜９８８、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の論文を参照のこと。

このモデルによって、動物の生物体全体におけるヒト肝細胞の機能の研究が可能になるだけでなく、動物モデルにおける肝指向性ウイルスおよび／または寄生生物によるヒト肝臓細胞の感染の研究も可能になる。

（実施例１１：ＨＣＶによる細胞株の感染）
（１．材料および方法）
（感染）
この感染源は、ＨＣＶに感染した患者の血清に由来する。現在、これが、利用可能なウイルスの唯一の供給源であり、今日まで、任意のウイルス生成モデルを開発することが可能でないことが公知である。５つの血清を試験した。２つの血清（２番および４番）由来のウイルスは、遺伝子型１ｂを有し、そして血清３番のウイルスは、遺伝子型３のウイルスである。遺伝子型特定は、用いた２つの血清（血清番号１番および５番に関する）では実行されなかった。

感染に用いた細胞を、実施例１に規定された条件（５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの持続的な存在）に従って培養して、コンフルエンスで１週間維持し、次いで２％のＤＭＳＯを添加した同じ培地中で２週間維持した。

ＦＣＳを欠き、必要に応じてＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養培地中で、１０倍に希釈した感染性供給源とともに、３７℃で４８時間、これらの細胞をインキュベートする。

コントロールとして、培養物を、同一の条件下で、ただしここではＨＶＣによって感染していない患者由来の血清を用いて、インキュベートした。

インキュベーションの終了時点で、細胞を、培養培地を用いて３回洗浄して、使用するまで、２％ＤＭＳＯおよび５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの存在下で維持する。

（細胞内および細胞外のウイルスＲＮＡの抽出および解析）
細胞内ウイルスＲＮＡの複製型を、全ての細胞溶解物において単離した。トリプシンを用いた分離後、細胞を回収し、次いでＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、総ＲＮＡを抽出する。種々のサンプルを正規化するために、光学密度によって、抽出された総ＲＮＡの量を推定する。臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲル上でリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ：２８Ｓおよび１８Ｓ）を可視化することによって、ＲＮＡの質および均一性を、検査する。Ｈｉｇｈ ＰｕｒｅウイルスＲＮＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、培養上清から、ウイルス粒子のＲＮＡを抽出する。

ウイルスのコスミドタンパク質をコードする領域の５’末端にハイブリダイズする特定のプライマーから、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＲＴ）によって、正の極性のウイルスＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。このオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＹＧＴＧＣＴＣＡＴ−３’）は、Ｍａｒｔｅｌｌら、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３７：３２７−３３２に記載されたもの（Ｃ−３４２と名付けられた）に由来する。次いで、ウイルスゲノムの５’非翻訳領域においてハイブリダイズする２つのプライマーを用い、「ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（ＰＣＲ）技術によって、このｃＤＮＡを増幅する。用いたプライマーは以下のとおりである。センスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＲＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＲＡＣＣＣＡＣ−３’）。これらは、Ｍｅｒｃｉｅｒら（１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７７ １〜９）によって着想されたもの（ＮＣＲ−３と命名された）に相当する。増幅産物（１９０ｂｐのアンプリコン）は、臭化エチジウムで染色された２％アガロースゲル上で可視化される。ＤＮＡの分子量マーカー（Ｍ）をまた、配置して、そのサイズによってアンプリコンの同一性を確認する。標準（Ｔ＋）中に存在するウイルスＲＮＡ（感染した患者に由来する、希釈された血清に相当する）を検出することによって、異なる段階の有効性が、常にコントロールされる。サンプルについて水を代用すること（Ｔ−）によって逆転写（ＲＴ）および増幅（ＰＣＲ）の段階において、いかなる汚染も存在しないことがまた系統的に確認される。

（２．結果）
（感染の証拠）
図１４は、試験した５つの血清由来のウイルスによるＨｅｐａＲＧ細胞の感染能の解析を示す。これは、ＰＥＧ ８０００の存在下での細胞の感染後、ＲＴ−ＰＣＲによる細胞外および細胞内区画の両方において、ウイルスＲＮＡの存在を探す工程を包含する。ウイルスＲＮＡは、感染後１２日で探される。アンプリコンの位置は、この図の右側に示される。ｒＲＮＡは、この図の下部におけるサンプルのホモジナイゼーション後に示され、ここでは、２８Ｓおよび１８ＳのＲＮＡの位置が右側に示される。

いかなるウイルスもない接種材料（ＨＣＶ−血清）の使用の間、培養上清中でも、細胞中でもウイルスＲＮＡは検出されない。ウイルス性のＣ型肝炎に罹患する女性患者から採取した肝臓腫瘍から選択された細胞株に由来するにも関わらず、ＨｅｐａＲＧ中では、検出可能なウイルス複製は残留していない。

ＲＴ−ＰＣＲによる半定量的検出技術によって、どの血清を用いようと（血清番号１番〜５番）、細胞内区画中だけでなく、培養上清中でもシグナルの存在を明らかにすることが可能になる。これらの結果によって、細胞によるビリオンの有効な分泌をもたらす、ＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＣＶの複製の確立が説明される。

ＨｅｐａＲＧ細胞の感染後にＨｅｐａＲＧ細胞において、ウイルス複製が確立されることを確認するため、抗ウイルスのインターフェロンαに対するＨＣＶ複製の感度を研究した。ウイルスを含有する血清番号４によって、ＰＥＧ ８０００の存在下で、４８時間にわたって細胞を接種した。ウイルス感染の陰性コントロールとして、いかなるＨＣＶも含まない血清を用いる。サイトカイン（Ｉｎｔｒｏｎａ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を、細胞の感染後、６日目の終わり〜１２日目に、５、５０、または５００Ｕ．Ｉ．／ｍｌの最終濃度で、培養培地に添加する。培地の完全な補充を２日ごとに実行する。動態解析のために、上清を−８０℃で保管する。

図１５は、細胞中および上清中で検出可能なウイルスＲＮＡの量に対して、感染源に対する細胞の曝露後１２日目におけるインターフェロンαの存在の頻度を示す。アンプリコンの位置は、この図の右側に示される。ｒＲＮＡは、この図の下部分においてサンプルのホモジナイゼーション後に示され、ここでは、２８Ｓおよび１８ＳのＲＮＡの位置が、右側に示される。低用量（５Ｕ．Ｉ．／ｍｌ）から開始して、細胞内シグナルの６０％を超える低下が、処置の６日後に検出され、そしてシグナルの完全な消失が細胞外培地中で得られる。

（ＨＣＶ複製の動態およびインターフェロンαによるその阻害）
ＨＣＶ複製の動態およびインターフェロンαによるＨＣＶ複製の阻害を確認して、図１６に示す。感染後６日目の終わりから、感染源に対する曝露（ｏ）後１２日まで、処理されていない参照培養物（ｖ）においておよびサイトカインが５Ｕ．Ｉ．／ｍｌ（その有効濃度は以前に確認された（図１５））で培地中に存在する培養物において、上清中のウイルスＲＮＡの存在を、並行して探した。

感染後２日目の終わりに（ｖ，２日目）採取したサンプルの解析によって、強力なシグナルが明らかになる。この現象は、細胞に最初に吸着されるか、または内在化されたウイルス接種材料からの放出に相当するはずである。次に、感染後４日目から（ｖ，２日目〜１２日目）検出された一定のシグナルは、ウイルスの活発な複製を意味しており、これは研究された期間にわたってビリオンの定常的な分泌をもたらす。インターフェロンαの存在下でインキュベートされた培養物で実行された動態の最初の部分は、抗ウイルスがない状態で実行された動態と同一である（２日目〜８日目のｖおよびｏを比較のこと）。これによって、処置の前にＨｅｐａＲＧ細胞において複製が十分確立されたことを確信することができる。対照的に、サイトカインとのインキュベーションの４日後、処理の終わりまで、細胞外ウイルスＲＮＡは検出されない（ｏ、１０日〜１２日）。従って、インビボで観察されたインターフェロンαの阻害性作用は、ＨＣＶによって感染されたＨｅｐａＲＧ細胞において、２日という最小処理期間後に、はっきりと再現される。

（実施例１２：リーシュマニア属の寄生生物による細胞株の感染）
リーシュマニア症は、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属の寄生生物による感染に続く疾患である。これらの感染の臨床的提示は、限局的な皮膚感染から、汎発性の感染（この時、感染した主要な器官は、リンパ節、骨髄、脾臓および肝臓である）までに及ぶ。リーシュマニアは、吸血性のｄｉｐｔｒｏｕｓ昆虫である吸血性スナバエによって鞭毛虫型で伝播されて、その宿主中で迅速に細胞内に入る。リーシュマニアを許容すると現在記載されている細胞は、単核の食細胞系の細胞である。最近、肝細胞感染試験によって、この細胞型の許容性が実証されたが、このことは、感染の生理病理学をさらによく理解し、かつ新しい治療標的を評価するために、研究の展望を切り開く。

（１．材料および方法）
（感染）
用いた前鞭毛期のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓおよびＬ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓは、患者から単離され、参照アイソザイム法によって同定され、液体窒素中で凍結保存された株である。接種材料を得るためには、ウサギ血液を添加されたＮｏｖｙ−ＭｃＮｅａｌ−Ｎｉｃｏｌｌｅグルコース培地中、続いて１０％ＦＣＳを添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中での少なくとも２つの連続する増幅期が必要である。

感染に用いた細胞を、実施例１に規定した条件（５・１０^-5Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの持続的な存在）に従って培養して、コンフルエンスで１週間維持し、次いで２％のＤＭＳＯを添加した同じ培地中で２週間維持した。

これらの細胞を、リーシュマニアの前鞭毛期とともに３７℃で１８時間インキュベートし、次いで培養培地で３回洗浄して、２％のＤＭＳＯおよび５Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシナートの存在下で維持する。

（細胞内寄生生物の検出）
光学顕微鏡によって、感染のチエックおよび定量を実行する。ウェルのトリプシン処理およびＰＢＳ中での２回の洗浄後、細胞を回収し、９０００ｒｐｍで１０分間、細胞遠心分離して、次いで固定してＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ染色で染色する。無鞭毛型形態である細胞内寄生生物は、細胞質に局在しており、３×６μｍの寸法であり、青みがかった細胞質、ならびに紫色の核およびキネトプラストを含むその構造のおかげで、容易に位置決めできる。感染した細胞の数および見出された寄生生物の総数を、平均４０００個の肝細胞を読み取って算出する。

（２．結果）
（感染の証拠）
図１７は、１細胞あたり２５個の寄生生物の感染比率について、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ株およびＬ．ｍａｊｏｒ株を用いて観察された感染の動態を示す。従って、この細胞は、肝指向性株（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）だけでなく、皮膚指向性株（Ｌ．ｍａｊｏｒ）を用いても感染され得る。１００細胞あたりのＬ．ｄｏｎｏｖａｎｉの無鞭毛型の数は、４０００個の細胞読み取りあたり７〜４５個からなり（０．１７５％〜１．１２５％）、これは、感染細胞割合が０．１〜０．５５％の間であることに相当する。Ｌ．ｍａｊｏｒの無鞭毛型の数は、４０００個の細胞読み取りあたり６〜３８個からなり（０．１５％〜０．７２５％）、これは、感染細胞割合が０．１〜０．３７５％の間であることに相当する。

（感染プロトコールの最適化）
第一の実験で、寄生生物の総数および感染した細胞の数に対する「培養期間（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ）」の影響を研究した。Ｌ．ｍａｊｏｒによって感染された細胞を用いて実行した、この研究の結果（感染比率＝１細胞あたり２５個の寄生生物）を、図１８に示す。

第二の実験は、細胞の感染のレベルに対する「接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）」の影響を研究する目的であった。Ｌ．ｍａｊｏｒは、１細胞あたり６、１２、２５、５０、１００および２００個という寄生生物の比でもって、細胞中に首尾よく接種された。７日目の培養物の結果を図１９に示しており、ここでは、１００個の細胞あたりの寄生生物の数が、４０００個の細胞読み取りについて、２〜２１８個（０．０５％〜５．４５％）に変化することが示されており、これは０．０５％〜１．６％に及ぶ、感染細胞割合に相当する。

まとめると、Ｌ．ｍａｊｏｒによる理想的な感染比は、１細胞あたり１００個の寄生生物であり、そして寄生生物感染定量は、４日目と７日目との間が最適であると考えられる。

肝臓の恒常性に関与する異なる細胞タイプの図示的提示。 肝臓の図示的断面であって、肝臓を構成する異なる細胞の構造的組織化を明確に示す。 ＨｅｐａＲＧ株の増殖曲線。 ＨｅｐａＲＧ細胞の、異なる分化段階での位相差顕微鏡写真。 ＨｅｐａＲＧ細胞の電子顕微鏡写真。 ＨｅｐａＲＧ株の代表的な偽二倍体（ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｌｏｉｄ）分裂中期の、ＲＨＧ型染色による核型。 ２つの肝臓生検、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐａＲＧ細胞におけるｍＲＮＡの発現のノーザンブロット解析。 活性誘導因子ＣＹＰ１Ａ（フェナセチンデエチラーゼ）（ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ ｄｅｅｔｈｙｌａｓｅ）およびＣＹＰ３Ａ４（ニフェジピンオキシダーゼ）の影響。 ＨｅｐａＲＧ細胞における肝臓ｍＲＮＡのレベルに対するコルチコイドおよびＤＭＳＯの影響。 細胞の伝染能力に影響する異なる因子の影響。 ＨＢＶによるＨｅｐａＲＧ細胞の感染の影響。 胆管および膵臓の分化。 胆管および膵臓の分化。 インターフェロンαの有無における、ＨＣＶを担持する患者の血清を用いたＨｅｐａＲＧ細胞の感染能。 インターフェロンαの有無における、ＨＣＶを担持する患者の血清を用いたＨｅｐａＲＧ細胞の伝染能力。 インターフェロンαによる、ＨＣＶの複製または阻害の動態。 リーシュマニア属の寄生生物による感染の動態。 リーシュマニア属の寄生生物による感染のプロトコールの最適化。 リーシュマニア属の寄生生物による感染のプロトコールの最適化。

Claims (4)

1. ２００１年４月５日に、ＣＮＣＭに対して、第Ｉ−２６５２号として寄託された、肝臓癌細胞株。
2. 新しい医薬および／または栄養性構成要素および／または環境汚染物質の評価を意図する、代謝試験および／又は毒性試験のための、請求項１に記載の細胞株の使用。
3. 急性肝細胞不全症の一次的な処置のための体外型バイオリアクターの製造のための、請求項１に記載の細胞株の使用。
4. 新しいワクチンおよび／または抗ウイルス分子のスクリーニング、特には、ウイルス周期の１つに対して活性な分子のスクリーニングのための、請求項１に記載の細胞株の使用。

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