JP4772671B2 - 遺伝子的に形質転換可能な植物組織の調製用の方法および装置 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

関連出願への相互参照
本出願は、本明細書中に引用によって援用される2003年6月16日に出願された米国仮出願第60/320,278号の利益を主張する。

連邦政府に後援を受けているリサーチまたは開発に関する記述
--

発明の背景
本発明は、遺伝子材料を植物細胞に挿入して、得られた植物を修飾する植物細胞形質転換に関し、特に、本発明は、そのような形質転換に使用可能な種子から胚組織を収集するための装置に関する。

植物の遺伝子形質転換を使用して、改善された収率、虫および病気耐性、除草剤耐性、および改善された栄養価を有する作物を開発することができる。そのような形質転換において、新たな遺伝子を、現存する植物細胞の染色体材料に導入する。高速度マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接的DNA摂取および、Agrobacterium媒介遺伝子形質転換を含めた遺伝子を植物組織に導入するための種々の方法が、開発されている。

一旦、遺伝子が植物細胞の染色体材料に首尾良く導入されると、新たな植物が繁殖するように、新たな遺伝する生殖細胞系組織が発達しなければならない（例えば、種子）。これを行う１つの方法は、新たな遺伝子を許容している細胞のみを選択し、これらの細胞のカルスを、新たな生存能力のある植物へと培養することによってである。単一の細胞から植物を成長させるのに要する時間は長い。

短縮された成長時間は、実施された植物胚芽の分裂組織を直接的に処理することによって入手できる。分裂組織は、種子または生殖細胞系組織を含む異なる植物構造を生産するために識別する細胞の形成植物組織である。多くの植物胚芽を処理してもよく、それらの植物のうちのどれが、新たな遺伝子情報を生殖細胞系組織に組み込んだかを決定するために、選択またはスクリーニング技術を後に使用してもよい。

本発明の譲受人に譲渡され、本明細書中に引用によって援用される米国特許6,384,301は、大豆胚芽の分裂組織細胞に対して、直接的に、Agrobacterium媒介遺伝子導入を用いる、大豆（グリシンマックス）を遺伝子的に形質転換する方法を記載する。この手順において、種子を浸漬して、発芽を開始する。発芽が始まった後、胚芽を種子から切除し、初生葉組織を除去して、大豆胚芽の分裂組織を暴露する。分裂組織は、植物の異なる部分を生じさせるのに識別する形成植物組織である。

種子は安価であるが、胚芽を切除し、遺伝子材料を胚芽に導入し、胚芽を培養するのに要する多大の労力は、最終的に生存不可能である組織に適用されるこの労力にもたらされ得る胚芽への損傷を減らすことを望ましくする。この理由のため、植物胚芽の切除は手動で行われる。

手動プロセスにおいて、表面を殺菌された種子は、手袋をした手で、一度につき１つずつ、無菌で取り扱われる。それらは、適用された力によって、種皮を押し出す様式に指向される。次いで、子葉を分離し除去して、種子胚芽を残す。胚葉を、一次分裂組織の領域近くで除去する。遺伝子導入のための、生存可能な胚芽の回収は、この手動方法によってでさえ、100%未満であり、高品質種子では、70%ほどしかない。

切除後の胚芽の細菌汚染は、有意な関心事である。胚芽の手動の切除によって、種子の残りからの種皮を早期に分離して、通常胚芽を保護する種皮上に見受けられる細菌による胚芽の汚染を予防することが可能である。

手動切除を行う当業者は、しばしば、切除時に、異常な胚芽を認識し、それらを捨て、実質的に下流収率を改善する。

手動切除の利点にも拘わらず、その種子からの各植物胚芽の個々の分離は、非常に重労働であり、典型的には多くの植物を処理して、２、３の成功する形質転換を得なければならない形質転換プロセスの拡大に対して障害となる。

必要なのは、形質転換の総コストを許容不能なほど増加せずに、形質転換可能な胚芽の安定供給を有意に増加することであり、後者は、胚芽への損傷または胚芽の細菌汚染が、大多数の生存不能な胚芽の無意味な培養を引き起こすならば生じるであろう。

発明の概要
本発明者らは、実用的でない機械的な分離を提供するかもしれないような、胚芽損傷および細菌汚染を十分に減らす種子からの形質転換可能な組織の切除のための自動化技術を開発している。機械的な切除機械を、任意の種子選別、改善された種子の水和、および胚芽の自動分離と組み合わせて、自動切除を実用的にする。特に種皮および胚芽の間のそのような自動化に起こりがちな細菌汚染を減らすためのさらなる技術を提供する。

次いで、具体的には、本発明は、植物種子を水和して、種子組織を柔軟にし、次いで、水和された種子を、別々の子葉、種皮および胚芽に分ける機械的分離器に通すことによって、形質転換可能な植物組織の自動調製を提供する。次いで、遺伝子材料を、別々の胚芽の細胞に導入する。

形質転換可能な植物組織の高容量自動切除を提供することが、本発明の１つの目的である。

機械的分離器は、水和された種子に剪断力を適用する反対の動く表面を提供し得る。

胚芽への過度な損傷なしに、種子要素を分離する単純な機械的分離器を提供することが、本発明のもう１つの目的である。水和された種子に対する剪断力は、種子を、それらの天然の分離点に沿って離して誘導する。

反対の動く表面は、異なる回転速度を有するローラーであってもよい。

従って、容易に製造される剪断表面を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

ローラーは共回転してもよい。

連続または半連続バッチプロセスに適合可能なメカニズムを提供することが、本発明のもう１つの目的である。

ローラーは、蛇行ローラー面を有し得る。

種子の外側の表面を包んで、それらを分離し、均等に剪断力を分配して、胚芽への損傷を減らす表面を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

ローラーは、外側の弾性表面を有し得る。

従って、改善されたグリップおよび種皮に対する減らされた圧力を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

動く表面は、少なくとも２つの連続する組の反対のローラーを含み得る。

従って、収率を増加するために、一連の緩やかな種皮の分離を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

動く表面の分離は、種子のタイプによって調整され得る。また、動く表面の間の剪断の量は、種子のタイプによって調整され得る。

従って、種々の異なる種子タイプのプロセスに適当な機械を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

種子は、機械的分離器を通過する時に、液体で噴霧されてもよい。

そのような機械的分離器に起こりやすい細菌汚染を、不断の希釈または殺菌液体または消毒溶液によるそのような汚染の消毒によって減らすことが、本発明のもう１つの目的である。

液体は、ローラーに対して噴霧されて、ローラーの回転と反対の方向にローラーをぶつけてもよい。

付着した胚芽への損傷を最小化するローラーの清浄を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

種子の機械的分離器への容量または質量の流れを、所定の一定値に制御することができる。

従って、ローラーに入る種子の過剰な数によって生じ得る胚芽への損傷を最小化することが、本発明のもう１つの目的である。

種子を、色、サイズ、湿気、生殖質または密度のような所定の種子特徴に基づいて、機械的分離の前に、選別してもよい。

従って、種子の排除が比較的安価である段階で、種子のタイプの厳しい制御によって、機械的切除におけるヒト視覚視察の欠如を補うことが、本発明のもう１つの目的である。

種子を水和する工程は、種子をすすぎ、次いで、それらを少なくとも１時間保持し、引き続いて、種子を浸漬することを含み得る。

従って、胚芽への損傷を促進し得るような子葉の亀裂を減らす様式で、水和を提供することが、本発明のもう１つの目的である。

すすぎ、保持、および浸漬は、種子が導入される容器中で行ってもよく、ここに、該容器は、排液管および注入口を有し、該注入口は、第１のすすぎ液体容器、および該すすぎ液体容器と異なる第２の浸漬液体容器と通じており、注入口およびすすぎ液体容器および注入口および浸漬液体容器および排液管の間に弁位置を含み、該弁は、すすぎ、保持、および浸漬を自動的に制御するための電子タイマーと連絡する。

従って、過度な種子の取り扱いなしに、種子を水和するためのより複雑なスケジュールを可能にすることが、本発明のもう１つの目的である。異なる添加剤を、導入する容器の使用を可能にして、異なるすすぎおよび浸漬材料が、種子の水和において使用されることを可能にすることが、本発明のもう１つの目的である。

すすぎは、漂白または他の消毒溶液のような抗菌薬を含んでもよい。

従って、機械的切除の上流の細菌負荷、胚芽の汚染を引き起こし得る後者を減らすことが本発明のもう１つの目的である。

機械的分離の後、子葉、種皮、および胚芽を、分離機械に通して、胚芽を種皮および子葉から分離してもよい。

従って、機械的切除の利益を減らし得る、分離された種子材料を手動で仕分ける必要を排除することが、本発明のもう１つの目的である。

分離機械は、種皮に、堰の上を洗浄させ、胚芽および子葉を、堰の下に通すことを可能にする堰を含んでもよい。

従って、分離機械を出ていく液体および種子部分の混合物と、自然に働く分離システムを提供することが、本発明のもう１つの目的である。分離プロセスの初期に、胚芽から汚れた種皮を分離して、汚染のリスクを減らすことが、本発明のもう１つの目的である。

分離機械は、胚芽から子葉を分離するふるいを含み得る。

従って、胚芽を子葉から抽出するのに必要な手動の労力を減らすことが、本発明のもう１つの目的である。

方法は、機械的分離の後、胚芽を、液体媒体中で、所定の期間培養して、生存不可能な胚芽を選別する工程を含み得る。

従って、必要に応じて、過剰な栽培コストを負担せずに、機械的分離における、生存不可能な胚芽のより高い割合に対応し得るメカニズムを提供することが、本発明のもう１つの目的である。

これらの特定の目的および利点は、請求の範囲内にあるいくつかの具体例に対してのみ適用され得、従って、本発明の範囲を規定しない。

好ましい具体例の詳細な記載
さて、図１を参照すると、一般的には、本発明の機械化された方法10は、形質転換可能な植物組織が抽出される収穫された大豆または他の種子12を受け取る。種子12は、理想的には、そこから形質転換可能な材料を単離するのに適当な所定の内部湿気、例えば、大豆に対して8ないし14%の内部湿気にて収穫して、使用前に、安定した保存条件で保持する。

高度な細菌または真菌汚染を有する種子12aおよび何らかの理由で本発明によって生存可能な胚組織を生産することができない種子12aも除去するように意図された任意の選別工程14に、種子12を付してもよい。これらの後者の理由は、他の状況においては、反対できないものであり、生存可能な組織の最終的な収率のパラメーターおよび測定の変動によって、経験的に調整され得るであろう、種子の大きさまたは他の物理的特徴のようなパラメーターを含み得る。

好ましくは、選別工程14は機械的に行われ、所定のサイズ上下の種子12を排除する通常の種子仕分け技術、カメラおよび視覚システムのような市場ですぐに入手可能な高速光学仕分け器具を使用して、１以上の次の基準、色、サイズ、形状または密度から選択される種子12を拒否する光学仕分けを用いるサイズ選別を含み得る。選別方法の例は、サイズ仕分け後の自動スケールの使用を含み得、あるいは、この目的に適当な光学仕分け器は、Houston, TexasのSatake USA Inc.によって製造されたSatake Scan Master IIである。また、湿気含有量による選別を含む他の選別技術を使用してもよい。また、損傷された種皮を有する種子が、無傷の種皮を有する種子より早く吸収するようになると決定されているように、選別を水和後に行ってもよい。

選別工程14は、部分的には、先行技術の手動の切除を行う技術者による種子の無意識の選択を置き換え、機械的プロセスにおいて、胚芽の汚染に対してより大きい可能性を作り得る種子12に対する細菌および真菌負荷を減らすように意図される。任意の選別工程14は、切除前の種子12が安価であるため、比較的積極的であってもよい。

さて、図2を参照すると、任意の選別工程14を通った種子12bは、液体が種子12に導入されて、子葉および種皮を柔らかくして、次の切除工程18の間の胚芽の損傷の可能性を減らすことができる任意の水和工程16に進む。水和工程16は、好ましくは、自動的に行われるが、手動で行ってもよい。再び、図2を参照すると、好ましい具体例において、水和は、4リットル容量を有する殺菌水和容器20および種子12bの大きさより小さい一連の穴24によって穴を開けられた二重底22の使用を通して行われる。穴24は、出口ホース28および弁30を通して排液管32に通じる排液管チャンバー26に繋がる。

種子12を、二重底22の上に置き、平均種子12bより小さい穴36を有する保持プレート34を、種子12bの上に軽く置いて、それらが漂遊するのを防ぐ。容器20の上部の取り外し可能な蓋38は、２つの注入口40および42を供する。第１の注入口40は、弁44を介して、殺菌液体および200ppmのCloroxの溶液を含有するすすぎ容器46に通じる。第２の注入口42は、弁48を介して、米国特許6,384,301に記載のような豆発芽媒体(BGM)のような適当な植物組織培養媒体を含有する組織培養溶液容器50に通じる。また、組織培養媒体は、セホタキシミン（cefotaximine）、ブラボ（Bravo）、ベンレート（Benlate）、キャプタン（Captan）、およびカルベニシリン（Carbenicillin）のような抗菌薬を含有してもよい。他の殺菌剤、消毒剤、植物ホルモン、抗生物質、および過酸化水素を、所望により、組織培養溶液容器50で使用してもよい。両方の容器46および50中の液体を、室温にて保持する。

電子タイマー52は、弁44、30、および48の各々と通じており、最初に、切除プロセスの前に、所定の時間にて、弁30を閉じ、所定の時間、弁44を開いて、弁44が閉じられた後、すすぎ容器46からのすすぎ溶液で容器20を満たすようにプログラムする。弁30が開いて、出口ホース28を通って、容器20を空にする時に、すすぎ溶液を、3ないし10分間、適所に保持する。

種子12bのこの最初のすすぎによって、それらは湿気を吸収しはじめるが、過剰な液体の存在下で、子葉材料の不均等な拡大によって生じ得るような子葉の亀裂を引き起こすほど顕著ではない。また、すすぎは、表面汚染物質をさらに減らすように働く。亀裂を防ぐ他の方法は、湿った空気中でのプレインキュベーションまたは種子プライミングを含む。

少なくとも１時間後、好ましくは２時間後、タイマー52は、所定の時間、弁30を閉じ、弁48を開くように操作して、組織培養溶液容器50からの組織培養媒体で、容器20を満たす。組織培養媒体を、組織培養媒体が弁30を開くタイマー52によって空にされた後の8ないし13時間、チャンバー内で保持する。次いで、容器20を、空にせずに（弁30を閉じたまま保持するタイマー52）、15ないし30分間、すすぎ容器46からのすすぎ溶液で、（タイマー52によって操作される弁44を介して）再び満たし、ここに、過剰な溶液は、記載されるように、切除工程のための担体として使用するかあるいは（つまり、オーガーによる使用のために）排水する。種子12が、循環なしで組織培養媒体中に含有される時、エチレン阻害剤を使用してもよい。

また、蓄積せずに、液体が種子に噴霧されるあるいはエアレーター等を用いて、成長媒体を介して泡立つあるいは媒体が再循環されてもよい好気性方法を含めた水和の他の方法を、本発明では考える。また、注入口および出口の異なる組合せ、種子から液体を分離する異なる方法、異なる時間に対する異なる溶液等を有する容器の他の大きさおよび形状が、水和の目的を果たし得ると予測する。

さて、図1および3を参照すると、水和の後、種子12bの制御された供給を提供するように、オーガー供給56のホッパー54に、種子12bを、すすぎ液体と一緒に注ぎ、自動切除機械60の第１のホッパー58に、すすぎ液体と一緒に注ぐ。そのようなオーガー供給56は、当該分野でよく知られている。種子12bの供給の速度を、最初に、視察によって決定して、ローラーでの種子12bの凝集を減らし、胚芽への視覚的損傷を最小化する。最終的には、この供給速度は、可変速度を用い、胚芽生存能力を観察することによって、経験的に決定してもよい。オーガー供給56は、Whitewater, Wisconsinで製造されるAccu-Rate Feederであってもよい。オーガー供給56の代わりに、例えば、（スラリー中に保持された種子を有する）ポンプ、コンベヤーベルト、または当該分野でよく知られるような振動コンベヤーシステムを含む他の供給システムを使用してもよい。加えて、すすぎ液体は、供給器への投入前に、種子から分離することができる。また、この工程は、供給器を使用せずに、手動で行ってもよい。

さて、図3および13aを参照すると、オーガー供給56は、下記のように、ローラー62、66および70の回転の軸に対して垂直な水平軸に沿って種子12を排出する排出管57を供する。種子12は、排出管57から、ホッパー58を通って、排出管57の制限された大きさおよび円形開口によって、センターライン160に沿って集められたローラー62の間の隙間へと落ちる。

センターライン160近くでピークになる速度分布曲線162によって示される種子12のこの空間的集積は、ローラー62のエッジにて、種皮、胚芽および子葉の効率的な分離を供するように隙間を設けられたローラー62を、複数の種子12が通過する時に、種子12の衝突を引き起こし得る。

従って、図13bを参照すると、誘導バー164を、排出管57およびセンターライン160で、排出管57の軸に沿って、ホッパー58にわたり完全に延びるローラー62の間に置いてもよい。この誘導バー164は、新たな種子分布162'のピークを減らして、図13aに示されるように、誘導バーなしで得られた種子分布分散170'より小さい種子分布分散170を供する。

固体の流れを均等にする機械的再分布の同様の方法を、もし１以上のローラー対を利用するならば、連続した組のローラーの前または間で作成してもよい。

ローラー62、66および70は、種子12bを、胚芽12c、子葉12d、および種皮12eを分離するための本発明の切除工程18を行う自動切除機械60の一部である。切除操作は、清潔な室内で実施して、細菌および金型からの汚染を最小化してもよい。

自動切除機械60の第１のホッパー58は、種子12bを、各々が、相互に平行な水平軸に対して回転する一対の水平対向のローラー62に向ける。種子12は、これらのローラー62を通過して、第２のホッパー64および相互に平行な水平軸を有する第２の対の水平対向のローラー66によって受け取られる。種子12は、これらのローラー66の間を通り、第３のホッパー68および相互に平行な水平軸を有する続く第３の対の水平対向のローラー70によって受け取られる。

ローラー70の最後の組から、種子12は、さらに下記されるように、収集容器72に落ちる。ローラーの３つの別々のステージを使用することで、ほとんどの種子12の要素が収集容器72に到着する時間までに、完全に分離されることを確証する。

図3に示される左のローラー（つまり、ローラー62a、66aおよび70a)は、第１のモーターコントローラー78に付着した第１のモーター76によって駆動される重複タイミングベルト74aによって駆動されるように、調和して時計回りに回る。時計回りの方向は、ローラー対の間の種子12の下向きの進行を引き起こす。

同様に、図3に示される右のローラー（つまり、62b、66bおよび70b)を、重複タイミングベルト74bによって相互接続し、独立した第２のモーターコントローラー82を有する第２のモーター80によって回す。ここに、反時計回りの方向は、ローラー対の間の種子12の下向きの進行を引き起こす。

モーター80上にありおよびタイミングベルト74の歯と連動するスプロケット84は、左側のローラー62a、66a、および70aよりも、右側のローラー62b、66b、および70bに、異なる（より早い）回転速度を供するように、モーター76上の対応するスプロケット86より大きい。例えば、右側のローラーは約30rpmで回ることができ、左側のローラーは約90rpmで回ることができる。モーターコントローラー82および78を調整して、さらに、速度差を縮めることができる。従って、一対の両方のローラーと接触する種子12は、それらの外側の表面に対して作用する剪断力を経験する。

歯車伝動、直接駆動のサーボモーター等を含む、制御された速度でローラーを駆動する他の方法を使用してもよいことが理解されるであろう。また、ローラーを回す異なる速度を使用してもよいことも理解される。

さらに図3を参照すると、殺菌液体または消毒溶液源が、液体ライン87を通って、フローメーター88に付着して、圧力調節器90を介して、１組のスプレーヘッド92aから92gに接続されたマニフォールドへと測定されてもよい。さらに、液体は、表面に、消毒剤、エチレン阻害剤、抗生物質、および界面活性剤を含むがこれらに制限されるものではないさらなる材料を含有して、胚芽を表面殺菌または調整してもよい。スプレーヘッド92aは、ホッパー58を通って下向きに向けて、殺菌液体または消毒溶液の安定した洗浄を提供して、切除機械60を介して種子12を洗浄し、種子12を円滑にし、配向し、種皮12eから導入され得るいずれかの汚染を希釈する。液体の流れの速度および圧力を制御して、値を経験的に決定してもよい。

スプレーヘッド92eから92gは、ローラーにはり付いた種子材料を取り除き、さらに機械を介して種子をせき立てるのを助けるように、ローラーの回転の接線方向に対して向けられた、それぞれ、ローラー70a、66a、および62aの下面を噴霧する。同様に、スプレーノズル92cから92fは、ローラーの回転の接線方向に対して向けられた、それぞれローラー62b、66b、および70bの下面を噴霧する。

他の方法を使用して、この工程に液体を導入することができることが予測される。例は、分散マニフォールド、オーバーフロー堰、管等の使用を含むが、これらに限定されるものではない。

空気フィルター96からの無菌空気源を、弁98を介して、液体マニフォールドに接続して、バイオフィルムおよび細菌汚染の蓄積を防ぐための使用の間の水ラインを清浄してもよい。さらに、空気はラインを乾燥し、ラインに正圧を提供して、ラインの汚染のリスクを減らす。

さて、図4を参照すると、各ローラー62、66、および70は、蛇行長軸プロファイル108を表す略円筒形中心部分100を有する。円筒形中心部分100を、同心の長軸102に取り付ける。軸102を、慣用的な玉軸受け104によって、いずれかの端にて支えてもよく、一方の端では、図3に関して記載されるように、歯付きタイミングベルト74aまたは74bを受け取るように、スプロケット106を含む。円筒形中心部分100を、摩耗耐性があり、清浄可能かつ衛生可能な表面を供し、それでもなお、種子12bにわずかに合致し、種子12の改善された保持を供するぐらい柔軟であるネオプレン、Buna-N、クロロブチル、EPDM、バイトン等のような弾性材料で覆ってもよい。一瞬、図3を参照して、最も堅い外面を供するローラー対62aおよび62bならびに最も柔らかい外面を供するローラー対70aおよび70bによって、弾性材料の柔軟性を、より低いローラー対に対して増加してもよい。例えば、上部ローラーの弾性材料は、次の対のローラーのデュロメーター35、デュロメーター25および35、および下の対、両方のデュロメーター25であってもよい。異なる種子は、特定の隙間角度、幾何学、遠心、外側のプロファイル、直径、またはデュロメーターを必要とし得ることが理解される。

さて、図5を参照すると、各ローラー62a、66a、または70aの蛇行プロファイル108を、それらがローラーを通過する時、断面が種子12bの分離を促進し、種子12bの湾曲した外側周辺と適合するように湾曲された複数の接触面を供する、実質的に一定の幅の蛇行チャネル110を、それらの間に形成するように対向した対応するローラー66b、62b、および70bの対応する表面蛇行プロファイル108'と並べてもよい。ローラーの対の間の分離の設定は、軸受104の側方運動111によって達成することができ、中心部分のいずれかの端にて、すき間ゲージ113の挿入によって促進して、ローラーが実質的に平行であることを確証することができる。

図6を参照すると、軸受104は、図5に示されるように、そのうちの１つが自動切除機械60および横移動111を可能にするように、フレーム内の拡大された穴114に取り付けられた他のもののフレーム(示されず)に、回転の軸となるように取り付けられた耳を有するピローブロック112上で保持してもよい。ローラー分離または直径を変更して、種子12の異なるタイプを提供してもよく、最も狭い蛇行チャネル110を供するローラー対62aおよび62bおよび最も広範な蛇行チャネルを供するローラー対70aおよび70bを有する下方のローラー対に対して増加してもよい。

子葉を刺し、それらを一緒に押圧し得るディスク、ピンのついたローラー等を含めた、ローラー以外の種子12を切除する他の方法が考えられる。

さて、図7を参照すると、(図1の)分離工程117の初期段階において、収集容器72は、ノズル92からおよびある程度水和工程16の間に使用されるすすぎ液体からも生成される清浄液体または消毒溶液116で充填する。収集容器72の上方端近くの開口118は、液体116が収集容器72の表面近くを漂遊する上に堰120を供する。発明者らは特定の理論によって縛られることを望まないが、種皮12eが切除工程18の間、空気を取り込み、従って、堰120上を漂遊して、子葉12dおよび胚芽12c（後者は収集容器72の底に定着する）から分離されると考えられる。無菌液体または消毒剤の洗浄における種皮12eの早期分離は、胚芽12cの細菌または真菌汚染を有意に減少させ、後の分離工程において、種皮12eが胚芽12cを捕らえるまたは分離ふるいを詰まらせることを防ぐと考えられる。

さて、図8を参照して、側面に約1/4インチの四角い開口を有する傾斜金網128(Tyler数６ふるい)を供する水のふるい126の手段によって、胚芽12cを子葉12dから分離してもよい。例えば、金属またはプラスチックの穴のあいたシート、大まかに編まれたおよび編まれていない織物、ネット、グリッド等を含めた他の機能的に同様の材料を、金網の代わりに使用してもよい。

無菌液体または消毒溶液中の子葉12dおよび胚芽12cの混合物を、傾斜金網128の上方端にて導入して、胚芽12cが金網128を通過する地点にて、一般的には、傾斜の下へと洗浄することができる一方で、子葉12dは、その端まで金網128に続き、排出ポート132を通して放出されるように、金網128に傾斜をつける。別々の排液管ポート134を、胚芽12cに供してもよい。

代替の具体例において、図9に示されるように、子葉12dおよび胚芽12cを、無菌液体または消毒溶液中に沈められ、金網底128を有するトレイに導入してもよい。トレイを、胚芽12cが外側の溶液へと金網128を通過するように、水平方向140で往復させてもよい。トレイ129は、外側の容器131から除去し、胚芽12cを回収してもよい。

さて、図14を参照すると、代替の具体例において、円筒形壁に上フランジ174を供するように図9のトレイ129を調整して、それが円筒形タンク176の上唇の上に乗るようにしてもよい。以前のように、トレイの底を、金網128と適合させる。金網128を、子葉および種皮を遮断するが、胚芽は通ることができるような大きさにする。

(トレイ129がタンク176中にある時)トレイ129内に置かれた種子が、金網128上にある液体内に沈むように、円筒形タンク176を、液体レベル186まで、液体で充填する。しぶきを防ぐために、トレイ129を覆うタンク176の上に、蓋188を合わせる。

トレイがタンク176の位置にある時、水平かつ半径方向に延びるスポーク194が付着するところからの中心192を有するエアレーターアセンブリ190を、トレイ129の下に置く。中心192は、パルスタイマー202によって制御される弁200を通して、高圧空気の源を受け取る空気管196への接続を供する。

図16を参照すると、中心192は、垂直の空気管212に対して適合する下方軸受214によって、垂直の空気管212に付着し、密閉された略円筒形逆さカップであってもよい。軸受214によって、中心192は、垂直軸に対して自由に回転することができる。中心に付着したスポーク194は、一方の端にて、中心192（従って、垂直の空気管212）の内部と通じていて、その反対の端にて差し込まれた空の管である。スポーク194は、気泡210の脱出を可能にする一連の上向きに面した穴216および少なくとも１つの横向きに開いた穴218を有する。他のスポーク194の他の同様に配向された穴によって補強されるこの横向きに開いた穴218は、円運動で、スポーク194を動かす脱出する気泡210の反応力下で、回転運動を供して、金網128の底に作用する空気の均一な分配を確証する。

パルスタイマー202は、撹拌時間206および静置時間208に供する波形204を受け取る。これらの時間206および208の各々のこの持続時間は、エアレーターアセンブリ190からの気泡210の放出によって濁った液体によって動かされるように、トレイ129中の液体の強力な撹拌の代替期間を供するように、自由に調整してよい。

撹拌時間206の間の空気の放出は、金網128から、子葉、種皮、および胚芽(図14には示されず)を持ち上げるといったものである。静置時間208の間、異なる速度にて液体を通って落ちる傾向のある種皮および子葉によって遮断されていない金網128を胚芽が通過し得るように、持ち上げられた材料は、再び、液体を通って下がる。

タンク176は、制御弁184を有する182に対する出口において終了する漏斗型の底180を有する。金網128を選択的に通過する胚芽は、漏斗型の底180によって受け取られ、弁184によって制御されるように、出口を通って、182へと放出されてもよい。

図15を参照すると、空気ジェットアセンブリ190'は、別法として、十分な容量の気泡210を導入して、必要な撹拌を供するように、吊り輪または他の形態であってもよい。泡の代わりに、液体自体を、空気ジェットアセンブリ190'の代わりに、羽根車または他のポンプシステムを用いて押し出してもよい。

トレイ129内で液体の勢いの良い沸騰を供するのに十分な空気は、種皮、子葉および胚芽の改善された分離を供するだけでなく、いくつかの切除をも供し得る。

図10を参照して、さらにもう１つの代替の具体例において、ドラム135を、容器141中に保持された液体中に、部分的に、大体1/3ないし1/2浸漬してもよい。ドラム135は、その外側の円筒形周辺に付着した金網128を有し、溶液へと子葉12dおよび胚芽12cと一緒に充填し、矢印142によって示されるように回転して、子葉12dを保持するドラム135から胚芽12cを排出してもよい。

胚芽分離の他の方法も使用し得ることが予測される。例えば、手動または自動ふるいを使用してもよい。手動のふるいは、液体中に浸漬されたふるいトレイを用いて、トレイをそっとふることによって行うことができる。

図11を参照すると、代替の分離方法において、子葉12dおよび胚芽12cを、胚芽12cの漂遊および胚芽12cの胚芽12cの上澄みをすくい取るまたは注ぐことによって分離してもよい子葉12dおよび種皮12eの沈みを生じるように選択された所定の密度のショ糖溶液146に導入してもよい。ショ糖溶液は、約30ないし40%、好ましくは37パーセントであるべきだが、10ないし70%の濃度もいくつかの分離を供するであろう。数分後、胚芽12cは容器の表面まで上昇する。ショ糖を、例えば、プロピレングリコールまたはFicolのような他の生物学的に中性な化合物と置き換えてもよい。

これらのプロセスの各々に対して、除去された胚芽は完璧ではないかもしれないが、実験によると、はっきりとしない形状の（obscured）分裂組織は、なおも移植可能である。形質転換可能な組織が、除去された初生葉または無傷の初生葉あるいは部分的な子葉12dを有する胚芽12cを含むため、この分離は完璧である必要はない。

図1および12を参照すると、一旦胚芽12cを収集すると、それらを無菌液体または他の溶液中ですすぎ、次いで、例えば、大豆においては、本発明の譲渡人に譲渡され、本明細書中に引用によって援用される2002年5月7日に発行された米国特許第6,384,301号に記載の超音波処理、または本発明の譲渡人に譲渡され、本明細書中に引用によって援用される1992年9月22日に発行された米国特許第5,914,451号に記載の粒子送達といった種々の技術のうちの１つを用いて、遺伝子導入工程155において、所望の遺伝子によって植菌してもよい。単子葉植物は、1997年1月7日に発行された米国特許第5,591,616号、または本明細書中に引用によって援用される1995年3月9日に公開されたPCT出願WO95/06722に記載の方法を用いて、形質転換することができる。綿は、全て本明細書中に引用によって援用される1998年12月8日に発行された米国特許第5,846,797号または1991年4月2日に発行された米国特許第5,004,863号に記載の方法を用いて、形質転換することができる。

所望により、図1のプロセスブロック156で示されるように、超音波処理または他の遺伝子導入工程155の後、移植された胚芽150を、15ないし30日間、液体培養液152中に入れて、どの胚芽12cがまだ生存能力があるかを同定してもよい。また、この培養によって、寒天ブロック154中の生存能力のある胚芽の適切な植え付けまたは選択のための液体培地におけるさらなる培養のための、胚芽12cの根および茎頂の同定がより簡単になる。この生死判別試験まで、手仕事の量はごくわずかであり、従って、生存能力のない胚芽を、比較的低コストにて、除去することができる。また、生存の可能性は、固体または半固体ならびに液体培地上でテストすることができる。

次いで、証明された生存能力のある胚芽12cを、上記引用の米国特許第6,384,301号記載の方法に従って、移植された遺伝子を首尾良く受け取った胚芽を同定するのに役立てるために、化合物または環境条件によって処理してもよいような、寒天ブロック154上で成長させる。

上記の技術は、形質転換可能な組織を種子から由来することができるいずれの植物に対しても適当であってもよく、特に、大豆、キャノーラ、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ならびに、野菜、綿、トウモロコシ、米および小麦のような商業的関心のある他の植物のような脂肪種子植物の種子に特に有用である。

一般的には、図1の工程の各々は、他とは独立して使用してもよい。本発明が、本明細書中に含有される具体例および説明に限定されないが、続く請求の範囲の範囲内にある具体例の部分および異なる具体例の要素の組合せを含めたそれらの具体例の修飾された形態を含むことが、特に意図される。

図1は：選別、水和、切除、分離、および生死判別試験を含み得るような本発明の主要な工程を示すフローチャートである。 図2は、種子水和の自動制御を可能とする図1の水和工程において使用される装置の模式図である。 図3は、剪断運動によって種子部分を分離する一連の向かいあったローラーを供する図1の切除工程において使用される装置の簡略化した図である。 図4は、図3上のデバイスのうちの１つのローラーの透視図である。 図5は、ゲージを用いるローラーの分離の設定を示す図4の線5-5に沿った図3の一対のローラーの断面図である。 図6は、ローラーが詰まるのを防ぎ、プロセスフローを方向付けるように向けられた液体スプレーを示す図3の一対の向かい合ったローラーの部分的拡大図である。 図7は、子葉および胚芽から種皮を分離するような、図3の最終ローラーの後の収集容器中の堰の正面断面図である。 図8は、ふるいを用いて、胚芽から子葉および残りの種皮を分離する図7の堰に続き得る分離デバイスの正面断面図である。 図9は、往復シフトプラットホームを用いる分離デバイスの代替具体例の図8と同様の図である。 図10は、外側の周辺ふるいを有する回転ドラムを使用する代替の分離デバイスを示す図8および9のものと同様の図である。 図11は、ショ糖溶液の所定密度が種子の残りの部分から胚芽を分離するショ糖分離システムの正面断面図である。 図12は、胚芽がAgrobacteriumで処理され、培養前に、液体培地において生死判別試験で処理される植菌工程のフロー図である。 図13aおよび13bは、オーガーフィーダーから図3の装置への種子の経路の簡略化された正面図であり、該正面図は、より均一な種子分配を供するように使用される散布バーあるなしでの種子分配のプロットに重ねられる。 図14は、空気撹拌を用いる図8ないし10の分離デバイスの代替の具体例である。 図15は、図14のデバイスの空気撹拌のためのノズルアセンブリの第１の具体例である。 図16は、図14のデバイスの空気撹拌のためのノズルアセンブリの第２の具体例である。

Claims (67)

1. (a)所定の水和を有する植物種子を収集し;
   (b)植物種子を、機械的分離器を通過させて、種子を、別々の子葉、種皮および胚芽に分け、ここに該機械的分離器は、剪断力を種子に適用する相対的運動によって相隔たる表面を供し;次いで
   (c)分離された胚芽の細胞への遺伝子材料の導入を介して、分離された胚芽を形質転換する工程を含む形質転換可能な植物組織の大量製法。
2. 該機械的分離器が相隔たるローラーを供する請求項１記載の方法。
3. 該ローラーが異なる回転速度を有する請求項２記載の方法。
4. 種子のタイプによって、該ローラーの回転速度を調整する工程を含む請求項２記載の方法。
5. 該ローラーが共回転する請求項２記載の方法。
6. 該ローラーが蛇行回転面を有する請求項２記載の方法。
7. 該ローラーが、それらの表面摩擦を増加するように処理される請求項２記載の方法。
8. 該ローラーが外側の弾性表面を有する請求項２記載の方法。
9. 種子のタイプによって、該ローラーの分離を調整する工程を含む請求項２記載の方法。
10. 該機械的分離器が、反対側のローラーの少なくとも２つの連続する組を含む請求項１記載の方法。
11. ローラー対におけるローラー間の間隔が、種子が進行したローラー対ほど小さくなる請求項１０記載の方法。
12. 種子のタイプによって、相隔たる表面の間の剪断の量を調整する工程を含む請求項１記載の方法。
13. 機械的分離器を通過する時に、液体で種子に噴霧する工程を含む請求項１記載の方法。
14. 種子の噴霧が、水道に付着したスプレーノズルを使用し、使用後、消毒した空気で、水道を清浄する工程を含む請求項１３記載の方法。
15. 機械的分離器が相隔たるローラーを提供し、液体がローラーに対して噴霧されて、ローラーをローラーの回転と反対の方向にぶつける請求項１４記載の方法。
16. 機械的分離器への種子の体積流量を、実質的に所定の一定値に制御する工程を含む請求項１記載の方法。
17. 機械的分離器が、第１の軸に対して回転する一対の相隔たるローラーであり、機械的分離器への体積流量が、第１の軸に対して垂直である請求項１６記載の方法。
18. 種子の体積流量が、排出管を有するオーガーによって制御され、さらに、排出管からの種子の経路の中央に置かれた誘導バーを含んで、ローラーの間の開口に沿って種子を拡散する請求項１７記載の方法。
19. 工程(b)の前に、所定の種子特徴に基づいて種子を選別し、該選別から残った種子のみを機械的分離器に供するための選別機械に種子を通す選別工程を含む請求項１記載の方法。
20. 該所定の種子特徴が種皮の色である請求項１９記載の方法。
21. 該所定の種子特徴が種子の大きさである請求項１９記載の方法。
22. 該所定の種子特徴が種子の密度である請求項１９記載の方法。
23. 種皮が所定の時間濡らされ、過剰な液体が除かれた後のすすぎ、引き続いての;
    少なくとも１時間の保持時間、引き続いての;
    種子が少なくとも30分間、液体中に浸漬される浸漬;
    それにより、種子の子葉の亀裂が減少される工程を有する種子を水和する工程を含む請求項１記載の方法。
24. 種子のすすぎ、保持、および浸漬が、予め水和された種子が導入された容器中で実施され、該容器は排液管および注入口を有し、該注入口は、第１のすすぎ液体容器および該すすぎ液体容器と異なる第２の浸漬液体容器と通じており、注入口およびすすぎ液体容器ならびに注入口および浸漬液体容器および排液管の間に置かれた弁を含み、該弁は、すすぎ、保持、および浸漬を自動的に制御するための電子タイマーと連絡する請求項２３記載の方法。
25. 該すすぎが、抗菌薬を含むすすぎを使用する請求項２３記載の方法。
26. 該抗菌薬が漂白溶液である請求項２５記載の方法。
27. 浸漬工程における液体が発芽培地を含む請求項２３記載の方法。
28. 工程(b)の後および工程(c)の前に:
    子葉、種皮、および胚芽を分離機械に通して、種皮および子葉から胚芽を分離する工程を含む請求項１記載の方法。
29. 該分離機械が、液体の洗浄によって、種皮から離れて胚芽を保持する請求項２８記載の方法。
30. 該分離機械が、種皮を当該堰の上で洗浄させ、胚芽および子葉を堰の底に通す堰を含む請求項２９記載の方法。
31. 該分離機械が、子葉を胚芽から分離するふるいを含む請求項２８記載の方法。
32. さらに、工程(b)の後に、組織培養液中で、所定の時間、胚芽を培養して、生存不可能な胚芽を選別する工程を含む請求項１記載の方法。
33. さらに、非液体媒体中での選別後に残った胚芽を植える工程を含む請求項３２記載の方法。
34. 該種子が双子葉類である請求項１記載の方法。
35. 該種子が大豆である請求項３４記載の方法。
36. （ａ）植物種子を受け取るためのホッパー；
    （ｂ）種子を、別々の子葉、種皮および胚芽に分けるために、ホッパーから出てくる種子に力を適用する相隔たる動く表面を提供する切除器、ここに該動く表面は：蛇行ローラー面；外面摩擦面；または外側弾性面のうち１以上を含み；および
    （ｃ）胚芽を種皮および子葉から分離する分離器；および
    （ｄ）ホッパーによって受け取られる前に種子が保持される容器を含み、該容器は出口および注入口を有し、該注入口は、第１のすすぎ液体容器および該すすぎ液体容器と異なる第２の浸漬液体容器に通じており、注入口およびすすぎ液体容器ならびに注入口および浸漬液体容器および出口および排液管の間に置かれた弁手段を含み、該弁手段は、第１のすすぎ液体容器および浸漬液体容器から容器へ、ならびに容器から排液管への液体の流れを自動的に制御するための電子タイマーと連絡する種子を水和するものを含むことを特徴とする形質転換可能な植物組織の大量調製用の装置。
37. 該切除器が、種子に剪断力を適用する動く表面を提供する請求項３６記載の装置。
38. 該動く表面がローラーである請求項３６記載の装置。
39. 該ローラーが剪断力を提供するための異なる回転速度を有する請求項３８記載の装置。
40. 該ローラーが共回転する請求項３８記載の装置。
41. 該ローラーが蛇行ローラー面を有する請求項３８記載の装置。
42. 該ローラーが外側の摩擦面を有する請求項３８記載の装置。
43. ローラーが外側の弾性表面を有する請求項３８記載の装置。
44. 動く表面が、相対するローラーの組を連続して２つ以上含む請求項３６記載の装置。
45. ローラー対におけるローラー間の間隔が、種子が進行したローラー対ほど小さくなる請求項４４記載の装置。
46. 該ローラーが外側の弾性表面を有し、ローラーの連続する組の外側の該弾性表面が、種子がローラーの連続する組を通して進行するにつれて、より大きい柔軟性を有する請求項４４記載の装置。
47. 種子のタイプによって、動く表面の間隔を調整可能にする調整手段を含む請求項３６記載の装置。
48. 種子のタイプによって、動く表面の間の剪断の調整を可能にするモーター速度制御を含む請求項３６記載の装置。
49. 動く表面を通過する時、液体で種子を噴霧するように適合されたスプレーヘッドシステムを含む請求項３６記載の装置。
50. 該動く表面がローラーであり、ローラーに対して、液体を噴霧するように向けられたスプレーヘッドを有して、ローラーの回転と反対の方向にローラーをぶつけるスプレーヘッドシステムを含む請求項３６記載の装置。
51. 実質的に所定の一定の容量速度の種子の流れをホッパーに提供する種子コンベヤーを含む請求項３６記載の装置。
52. 切除器が、第１の軸に対して回転する一対の相隔たるローラーであり、種子コンベヤー上の切除器への種子の流れが、第１の軸に対して実質的に垂直である請求項５１記載の装置。
53. 該種子コンベヤーが排出管を有し、さらに、排出管からの種子の経路の中心にある誘導バーを含んで、ローラーの間の開口に沿って種子を拡散する請求項５２記載の装置。
54. 電子タイマーを操作して、
    過剰な液体が除かれた後に、所定の時間、種子を濡らし;
    少なくとも１時間濡らした後に、種子を保持し;次いで
    少なくとも30分間保持した後、種子を浸漬する請求項３６記載の装置。
55. 該すすぎ液体容器が抗菌薬を保持する請求項３６記載の装置。
56. 該抗菌薬が漂白溶液である請求項５５記載の装置。
57. 該浸漬液体容器が、発芽する媒体を含む請求項３６記載の装置。
58. 液体の源を含み、分離器が、液体の洗浄によって、胚芽および種皮を分離する請求項３６記載の装置。
59. 該液体が水である請求項５８記載の装置。
60. 該分離器が、種皮を当該堰の上で洗浄させ、胚芽および子葉を堰の底に通すことを可能にする堰を含む請求項５８記載の装置。
61. 該分離器が、胚芽から子葉を分離するふるいを提供する請求項３６記載の装置。
62. (a)植物種子を受け取るためのふるい底を有する第１の容器;
    (b)中に該第１の容器を受け取るような大きさの第２の容器;
    (c)該第２の容器が液体で満たされた時に、撹拌アセンブリーが、第１の溶液中の種子の回りの液体を撹拌して、種子を、別々の子葉、種皮および胚芽に分離し得るように、第１の容器下に第２の容器を置いた、撹拌アセンブリーを含む形質転換可能な植物組織の大量調製用の装置であって、該撹拌アセンブリーが空気ジェットである該装置。
63. 該ふるい底が、子葉および種皮の通過を遮断する間に、胚芽に該ふるい底を通過させるような大きさの請求項６１記載の装置。
64. さらに、一連の撹拌のパルスを提供して、種子の撹拌および定着の周期を提供する撹拌制御器を含む請求項６１記載の装置。
65. 該撹拌アセンブリーが、空気が除かれる複数の穴を有する固定管である請求項６１記載の装置。
66. 該撹拌アセンブリーが、複数の穴を有する管の可動組であり、該管から逃れる空気の力下で可動性である請求項６１記載の装置。
67. 機械的分離器に、種子のバッチを集団的に通過させて、種子の該バッチから、形質転換可能な植物組織の流れを単離し；次いで該形質転換可能な植物組織の細胞に、遺伝子材料を導入することによって、単離された形質転換可能な植物組織を形質転換する工程を含む種子のバッチから、形質転換可能な植物組織を自動的に単離するための方法であって、
    （ａ）所定の水和を有する植物種子を収集し；
    （ｂ）該植物種子を機械的分離器に通して、該種子を分離子葉、種皮および胚に分割し；ここに該機械的分離器は、剪断力を種子に適用する相対的運動によって相隔たる表面を供し、次いで
    （ｃ）遺伝子物質の分離された胚の細胞への導入を通じて、分離された胚を形質転換する；
    工程を含む形質転換可能な植物組織の大量調製方法である該方法。

Images