JP4680361B2 - 分離・回収方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体に由来する細胞等の特定成分を、選択性良く分離することができる分離材を用い、体液等の溶液中から、特定成分を効率良く選択的に分離し、回収することができる分離・回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療用材料の研究において、ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされ、こうした機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。例えば、特開昭５４−３６０２５号公報には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、ＭＰＣと略す)の製造方法と、得られる重合体が優れた生体適合性を有することが、特開平３−３９３０９号公報には、ＭＰＣとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着・凝集や血漿蛋白質の付着が起こりにくく、医療用材料として有用であることが、特開平９−１８３８１９号公報には、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する共重合体を用いた医療用材料が、特表平６−５０２２００号公報(ＷＯ９２／０７８８５)及び特表平７−５０２０５３号公報(ＷＯ９３／０１２２１)には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生体適合性が得られることが、それぞれ開示されている。
これらホスホリルコリン類似基を含む共重合体を利用した従来の材料は、いずれも血球細胞や血漿蛋白質等が材料表面に非特異的に吸着することを防止又は抑制するというホスホリルコリン類似基を含む共重合体の作用に基づくものであり、生体に由来する成分と材料表面との相互作用を極力抑える方向で研究が進められている。
ところで、ホスホリルコリン類似基を含む重合体を、生体由来等の特定成分を分離する材料に応用する研究についてはこれまで報告されていない。加えて、ホスホリルコリン類似基を含む重合体を応用することにより、生体由来等の特定成分を選択的に分離しうる作用が得られることも知られていない。
生体由来の成分は、用途によっては生理的な活性を保持したまま高純度で得ることが必要であり、そのような目的を達成しうる簡便な分離方法の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定成分を選択的に分離し、さらにその成分を回収することができる分離・回収方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のホスホリルコリン類似基を少なくとも表面に、特定範囲で有する材料において、該特定のホスホリルコリン類似基の割合等を制御することによって、生体に由来する細胞等の特定成分を選択的に分離する作用を示すことを見出し、更には分離した特定成分を容易に回収しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明によれば、式(１)で表される基を少なくとも表面に有する分離材を、特定成分を含む溶液に接触させ、溶液中に含まれる１種類又は複数の特定成分を選択的に分離・回収する方法であって、
前記分離材が、その表面をＸ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、式(１)で表される基に由来するリン元素の量Ｐと、炭素元素の量Ｃとの比(Ｐ／Ｃ)が０．００２〜０．３となる量の式(１)で表される基を有し、
前記特定成分が、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞からなる群より選択される１種又は２種以上の生体に由来する細胞、免疫グロブリン、又はダイオキシンもしくはその誘導体であることを特徴とする分離・回収方法が提供される。
【化３】
(式中、Ｒ 1 、Ｒ 2 及びＲ 3 は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる分離材は、上記式(１)で表される基を少なくとも表面に有する分離材であって、その表面をＸ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、式(１)で表される基に由来するリン元素の量Ｐと、表面全体における炭素元素の量Ｃとの比(Ｐ／Ｃ)が０．００２〜０．３となる量の式(１)で表される基を有する分離材である。分離材の選択的分離能を向上させるために、上記Ｐ／Ｃの範囲は０．０１〜０．２が好ましい。
ここで、分離材の表面をＸ線光電子分光分析によって測定する方法としては、後述する実施例に基づいて測定することができる。
【０００７】
式(１)中のＲ1、Ｒ2及びＲ3は、同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。
炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、フェニル基等が挙げられる。
炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。
【０００８】
式(１)で表される基としては、例えば、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体に由来する基、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体に由来する基等が挙げられる。
【化４】
式(２)中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、式(１)と同じであり、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ5は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。
【０００９】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体としては、例えば、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、３−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、４−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、５−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、６−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリエチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリプロピルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリブチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリシクロヘキシルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリフェニルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート等が挙げられる。
中でも２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートが好ましく、さらにＭＰＣが入手性等の点でより好ましい。
【００１０】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示される公知の方法に準じて製造できる。
具体的には、環状リン化合物と２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレートとを、脱ハロゲン化水素剤のもとで反応させ、次いで、トリメチルアミンを反応させることにより、開環させて目的物を得る方法等が挙げられる。
【００１１】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体としては、(Ａ)式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体１０〜１００ｍｏｌ％、(Ｂ)疎水性単量体０〜９０ｍｏｌ％及び(Ｃ)親水性単量体０〜７０ｍｏｌ％からなる単量体組成物を重合してなる重合体が好ましく、特に、(Ａ)成分２０〜８０ｍｏｌ％、(Ｂ)成分２０〜６０ｍｏｌ％及び(Ｃ)成分０〜２０ｍｏｌ％からなる単量体組成物を重合してなる重合体が望ましい。(Ａ)成分が１０ｍｏｌ％未満の場合は、分離材としての性能を発現させることが困難であるので好ましくない。(Ｂ)成分を２０〜６０ｍｏｌ％の範囲で適宜配合することにより、分離材としての性能を安定して発現させることが容易となる。また、(Ｃ)成分を２０ｍｏｌ％以下配合することにより、得られる重合体の水溶液等に対する親和性を向上させることができる。
【００１２】
(Ｂ)成分としては、例えば、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、２−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、ラウリル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート；シクロヘキシル(メタ)アクリレート等の環状アルキル(メタ)アクリレート；ベンジル(メタ)アクリレート、フェノキシエチル(メタ)アクリレート等の芳香族(メタ)アクリレート；ポリプロピレングリコール(メタ)アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール(メタ)アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
【００１３】
(Ｃ)成分としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基、アミド基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ塩基、トリアルキルホスホニウム塩基及びポリオキシエチレン基からなる群より選ばれる親水性基を有する単量体等が挙げられる。具体的には、２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、２−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート、４−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等の水酸基含有(メタ)アクリレート；アクリル酸、メタクリル酸等のカルボン酸；スチレンスルホン酸、(メタ)アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−(メタ)アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体；(メタ)アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート等の含窒素単量体；ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
【００１４】
前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体は、前記(Ａ)成分だけからなる単量体組成物、前記(Ａ)成分及び(Ｂ)成分からなる単量体組成物、前記(Ａ)成分及び(Ｃ)成分からなる単量体組成物、あるいは前記(Ａ)成分、(Ｂ)成分及び(Ｃ)成分からなる単量体組成物を重合したものであればよく、通常のラジカル(共)重合により製造することができる。
この重合体の分子量は、重量平均分子量で、５０００〜５００００００の範囲が好ましく、選択的分離性能を向上させる上で、また各種溶媒に対する重合体の耐溶出性を向上させる上で、１０００００〜２００００００の範囲が特に好ましい。
【００１５】
本発明に用いる分離材の調製は、上記(Ｐ／Ｃ)比が特定範囲となるような方法であれば特に限定されない。例えば、上記式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体等の式(１)で表される基を有する単量体、若しくは上記式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体を用いて、基材の少なくとも表面に化学的に修飾させるか、若しくは基材の表面にコートして乾燥固定させる方法等により得ることができる。
【００１６】
前記基材の材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂；磁性粉、シリカ、アルミナ、ガラス等の無機物が挙げられる。基材の形態は、特に限定されず、例えば、粉体、粒子、ビーズ、フレーク形状物、シート、フィルム、プレート、ゲル、繊維状物、織布、布織布等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いる分離材を調製するにあたり、前記(Ｐ／Ｃ)の制御は、後述する分離対象物質である特定成分によって、使用するホスホリルコリン類似基含有単量体、該単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体の種類や、基材の種類及び形状等を適宜選択して行うことができる。
分離対象物質が、赤血球、白血球、血小板の血球細胞の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ブチルメタクリレート(ＢＭＡ)、ステアリルメタクリレート(ＳＭＡ)等の炭素数４〜１８のアルキル(メタ)アクリレート、カチオン性基含有単量体とを用い、ＭＰＣ／(疎水性基含有単量体＋カチオン性基含有単量体)のモル比が１０／９０〜１００／０、特に２０／８０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００１８】
分離対象物質が、リンパ球の分離の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に５０／５０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００１９】
分離対象物質が、ＩｇＧ等の免疫グロブリンの場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に３０／７０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２０】
分離対象物質が、株細胞及び初代培養細胞の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に４０／６０〜８５／１５となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２１】
分離対象物質が、ダイオキシン、その誘導体であるジベンゾフランの場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に１５／８５〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２２】
本発明の分離・回収方法は、上記分離材を、特定成分を含む溶液に接触させ、溶液中に含まれる１種類又は複数の特定成分を選択的に分離・回収する。特定成分を含む溶液と接触させる条件は、分離材表面に選択的に特定成分を付着させることができる条件を、分離対象物質である特定成分の種類等に応じて適宜選択することができる。更に特定成分を付着させた分離材は、洗浄又は溶剤で処理する方法等により、付着している特定成分を分離材表面から剥がして回収することができる。
【００２３】
特定成分を含む溶液としては、体液等が挙げられる。ここで、体液とは、動物体内の脈管又は組織・細胞の間を満たす全ての液体、及び体内から体外へ放出又は分泌される液体のことを指し、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、涙液、尿、脊髄液等が挙げられる。
体液以外の溶液としては、例えば、水溶液、有機溶媒を１種類あるいは複数種類含んだ溶液、水溶液と１種類あるいは複数種類の有機溶媒を混合した混合溶液等が挙げられる。具体的には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、生理的リン酸緩衝溶液、培地、アルコール、アセトン、クロロホルム、エーテル、トルエン、アセトニトリル又はこれらの２種以上の混合溶液等が挙げられる。なお、前記溶液には、体液を希釈したものも含まれる。
【００２４】
本発明において、分離対象とする特定成分は、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞からなる群より選択される１種又は２種以上の生体に由来する細胞、免疫グロブリン、又はダイオキシンもしくはその誘導体である。
【００２５】
前記血球細胞としては、赤血球、白血球、血小板又はこれらの混合物等が挙げられ、白血球としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球が挙げられる。リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞等が挙げられる。血小板としては、血小板の活性化度合い(凝集反応の進行度合い)は特に限定されず、未活性化及び活性化した血小板等が挙げられる。これらの血球細胞の中で特に好ましくは、種々の疾患に際してその数が増減する白血球等が挙げられる。
前記株細胞及び初代培養細胞としては、由来の動物、由来の臓器及び形態は特に限定されず、繊維芽細胞、表皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞等が挙げられる。特に好ましくは、ティシュ・エンジニアリング(tissue engineering)等で利用可能な、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞等が挙げられる。
【００２７】
前記免疫グロブリン(抗体)は、以下の(１)〜(７)が例示できる。
(１)Ｃ反応性蛋白質(ＣＲＰ)、リューマチ因子(ＲＦ)、トランスフェリン等の血漿蛋白質又はこれら血漿蛋白質に対する抗体、
(２)卵胞ホルモン、黄体ホルモン、男性ホルモン、インシュリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン等、更に好ましくは、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、トリヨードサイロニン(Ｔ３)、サイロキシン(Ｔ４)、チロキシン結合蛋白質(ＴＢＧ)、サイログロブリン、インスリン、エストリオール(Ｅ３)、絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(ＨＰＬ)等のホルモンに対する抗体、
(３)癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、β２−マイクログロブリン、α−フェトプロテイン(ＡＦＰ)等の腫瘍関連物質に対する抗体、
(４)ＨＢＳ抗体、ＨＢｅ抗体等のウィルス肝炎の抗体、
(５)ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等のウィルス、抗エイズ抗体等の各種生体成分に対する抗体、
(６)フェノバルビタール、アセトアミノフェン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体、
(７)酵素に対する抗体。
ただし、前記抗体はＦａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ)'２フラグメント、又は還元型抗体であってもよい。前記(１)〜(７)のうち、特に好ましくは、種々の疾患に際してその量が増減し、診断あるいは治療にも利用することが可能である抗体が挙げられる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明に用いる分離材は、少なくとも表面に、特定のホスホリルコリン類似構造を有する基を、リン元素と炭素元素との割合を特定とする範囲で含まれるので、広範囲に及ぶ特定成分を選択的に分離することができ、本発明の方法では、この分離材を用いるので、特定成分を選択的に分離・回収することが可能である。すなわち、目的とする特定成分を選択的に効率よく、他の成分から分離することで、目的成分以外の成分の混入を極力抑えることができ、さらに分離した成分を回収することで、回収した成分を別の用途に応用することが可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、例中の分離材表面のＸ線光電子分光分析による測定は、以下の方法に基づいて行った。
＜分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定方法＞
Ｘ線光電子分光分析機(商品名「ＥＳＣＡ−３３００」、島津製作所社製)を用いて、分離材表面に対して、Ｘ線の照射角が９０°のときの、各元素のスペクトルを測定し、リン元素及び炭素元素の各ピーク面積を求め、以下の式によりリン元素の量Ｐ／炭素元素の量Ｃ(Ｐ／Ｃ)を算出した。
Ｐ／Ｃ＝Ａｐ／Ａｃ
ただし、Ａｐ：リン元素のピーク面積、Ａｃ：炭素元素のピーク面積とする。
【００３０】
合成例１
ＭＰＣ ３５．７ｇ及びｎ−ブチルメタクリレート(以下、ＢＭＡと略記する)４．３ｇ(単量体組成モル比：ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０)をエタノール１６０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃に昇温し、アゾビスイソブチロニトリル０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。得られた重合液を３リットルのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末２９．６ｇを得た。得られた粉末をＧＰＣにより評価したところ、重量平均分子量は１５３０００であった。この粉末を共重合体(Ａ)とする。
【００３１】
合成例２〜４
単量体の種類、組成比及び溶媒種を表１に示すとおりに代えた以外は、合成例１と同様の操作により粉末を得、分子量を測定した。結果を表１に示す。なお、合成例２で調製した粉末を共重合体(Ｂ)、合成例３で調製した粉末を共重合体(Ｃ)、合成例４で調製した粉末を共重合体(Ｄ)とする。また、表１中のＳＭＡはステアリルメタクリレート、ＱＡは２−ヒドロキシ−３−メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドを示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例１：白血球の分離
＜分離材の調製＞
合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇを、エタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。次いで、ポリエチレンテレフタレート(以下、ＰＥＴと略記する)製のシートをφ１３ｍｍの大きさの円形に切り抜いた円形シートを、上記共重合体溶液中に静かに浸漬させてから引き上げ、そのまま室温で１時間乾燥させた。さらに、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で減圧下１６時間乾燥させることにより、ディスク形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表２に示す。
【００３４】
＜選択的分離操作＞
ウサギから採取した新鮮血１０ｍＬにハンクス緩衝液１０ｍＬを加えて１／２に希釈することで、血球成分を選択的に分離するために用いる希釈血を調製した。
次に、上記で調製したディスク形状の分離材を、２４穴プレートに１枚／ウェルずつセットし、３ｍＬのろ過滅菌した蒸留水を加えて１時間湿潤させた。アスピレータで蒸留水を除去し、３ｍＬのハンクス緩衝液を加えて溶媒置換した後、これを完全に除去した。
次いで、上記で調製した希釈血を、この２４穴プレートに７００μＬ／ウェルずつ加えて、２５℃で６時間静置した。続いて、２４穴プレートから分離材を取り出し、３７℃に加温したDulbecco−リン酸緩衝生理食塩水を満たしたシャーレ中に浸してリンスした。この操作を２回繰り返した。その後、シャーレに満たした１０％中性緩衝ホルマリン液中で５分間、さらに、２．５％グルタルアルデヒド水溶液中で１時間固定化処理した。取り出した分離材は蒸留水で十分に洗った後、２５℃で１０時間風乾し、さらに減圧下で１６時間乾燥させた。
以上の操作を行った分離材の表面を走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)で観察し、単位面積あたりの表面に付着している各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３５】
比較例１
実施例１で調製したディスク形状を有する分離材の代わりに、何も処理していないφ１３ｍｍのＰＥＴ製円形シートを用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択的分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３６】
実施例２：赤血球の分離
実施例１において、共重合体(Ａ)の代わりに合成例２により合成した共重合体(Ｂ)を用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３７】
実施例３：白血球の分離
実施例１において、共重合体(Ａ)の代わりに合成例３により合成した共重合体(Ｃ)を用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２の結果より、実施例１及び実施例３で調製した分離材は、希釈血中に含まれる赤血球、白血球、血小板のうち、白血球だけを選択的に分離材表面の約１割程度の範囲に付着させうることが確認できた。また実施例２で調製した分離材は、希釈血中に含まれる赤血球、白血球、血小板のうち、赤血球だけを選択的に分離材表面の６割以上の範囲に付着させうることが確認できた。これに対して、比較例１では、赤血球、白血球、血小板全ての血球成分の付着が確認され、特に血小板については、基材表面の半分を覆うという結果になった。
【００４０】
実施例４：リンパ球の分離及び回収
＜分離材の調製＞
平均粒径０．２ｍｍのガラスビーズ(ｉｕｃｈｉ社製)を、アセトン及びエタノールで順に洗浄した後、さらに、蒸留水で十分すすぎ、乾燥器内で６０℃まで昇温させ、そのままの温度で１６時間減圧乾燥させて前処理ビーズを調製した。
一方、合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。
次いで、上記前処理ビース５０ｇをポリプロピレン製の容器に入れ、上記共重合体溶液２０ｍＬを加えた後に密閉した。次に、３０分間容器ごと回転させることで内容物を攪拌した後、ロートを使ってビーズを濾別した。取り出したビーズをシャーレ上に広げてから乾燥器に入れ、徐々に５０℃まで温度を上げた後、そのままの温度で１０時間減圧下で乾燥することにより、ビーズ形状を有する分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表３に示す。
【００４１】
＜選択的分離操作＞
リンパ球懸濁液を以下の方法により調製した。市販のリンパ球分離試薬であるFicoll−Paque(ファルマシアバイオテク社製)を用い、手順書に従ってヒトから採取した血液からリンパ球を採取した。まず、Ficoll−Paqueを３ｍＬずつシリコン処理した試験管に取り分け、この上にハンクス溶液で１／２に希釈したヒト全血４ｍＬを静かに重層した。次いで、２０℃、１５５０ｒｐｍで４０分間遠心分離し、最上層部にある血漿を除去した。その後、ピペットでリンパ球層を丁寧に採取し、シリコン処理した試験管に移した。続いて、採取したリンパ球懸濁液の３倍量のハンクス溶液を加えて、ピペッティングにより静かに攪拌した。次いで２０℃、７００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去した。さらに、ハンクス溶液を加えて再懸濁させ、２０℃、７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。採取したリンパ球を、１０％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地(ＧＩＢＣＯ社製)で再懸濁することでリンパ球懸濁液を調製し、血球計算盤を用いて培地１．０ｍＬ中に含まれるリンパ球の数を測定した。さらに、リンパ球を活性化させる目的で１ｇ／Ｌのリポ多糖類(以下、ＬＰＳと略記する。ＳＩＧＭＡ社製)を１／１００量加えたリンパ球懸濁液を調製した。すなわち、ＬＰＳを加えていないリンパ球懸濁液(以下、ＬＰＳ−と略記する)とＬＰＳを加えたリンパ球懸濁液(以下、ＬＰＳ＋と略記する)の２種類のリンパ球懸濁液を調製した。
上記ビーズ形状の分離材５．０ｇをシリコン処理した試験管に入れ、ＬＰＳ−又はＬＰＳ＋を５．０ｍＬ加えてから、室温で２時間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。次いで、生理的リン酸緩衝溶液(以下、ＰＢＳと略記する)を５．０ｍＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。この洗浄操作を３回繰り返した。
洗浄操作後、試験管内の分離材が流出しないように注意しながら、残っているＰＢＳを完全に除去した。その後、素早くＰＢＳ５．０ｍＬを加えてから、攪拌子を用いてスターラー上で緩やかに１分間かき混ぜ、ビーズ表面に付着していたリンパ球をＰＢＳ中に分散させた。その後、上清からＰＢＳを採取し、血球計算盤を用いてＰＢＳ１．０ｍＬ中に含まれるリンパ球の数を測定し、添加したリンパ球数(Ｃ0)に対する回収したリンパ球数(ＣR)の割合を、回収率として下記式により算出し、結果を表３に示す。
回収率(％)＝(ＣR／Ｃ0)×１００
【００４２】
比較例２
分離材として、実施例４で調製した前処理ビーズを用いた以外は、実施例４と同様の方法で分離を行い、リンパ球の回収率を求めた。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
表３の結果より、実施例４で調製した分離材は、リンパ球を活性化させる目的でＬＰＳを加えたＬＰＳ＋と、加えていないＬＰＳ−のいずれの場合においても、約半分のリンパ球を分離した後、さらに回収可能であることが確認できた。一方、比較例２では、ＬＰＳ−の場合、約１割程度のリンパ球を分離・回収できたが、ＬＰＳ＋の場合では、一切の分離・回収ができなかった。すなわち、実施例４で使用した分離材は、リンパ球の活性化の程度に関わらず、選択的にリンパ球を分離・回収できる機能を有することが判った。
【００４５】
実施例５：免疫グロブリンの分離
＜分離材の調製＞
実施例４における分離材の調製において、共重合体(Ａ)の代わりに、合成例４により合成した共重合体(Ｄ)を使用した以外は、実施例４と同様の方法で分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表４に示す。
【００４６】
＜選択的分離操作＞
上記分離材５．０ｇをポリプロピレン製試験管に入れ、ＰＢＳを用いて１／２５６に希釈したウシ胎児血清(以下、ＦＣＳと略記する、ＧＩＢＣＯ社製)５．０ｍＬを加えて、室温で２時間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。次いで、ＰＢＳ５．０ｍＬを加え、室温で１０分間インキュベートした後、３０分間静置し、上清を静かに除いた。この洗浄操作を３回繰り返した。
洗浄操作後、２０倍濃度のＰＢＳ５．０ｍＬを加え、室温で２時間インキュベートすることで、分離材表面に付着した蛋白をＰＢＳ中に溶解させた。３０分間静置した後、上清を静かに分取し、これを検体とした。
次に、ポリスチレン製９６穴プレート(Ｎｕｎｃ社製)に、抗(ウシＩｇＧ)ウサギＩｇＧ((株)ヤガイ社製)、抗(ウシアルブミン)ウサギＩｇＧ((株)ヤガイ社製)又は抗(ウシファイブロネクチン)ウサギＩｇＧ(ＳＩＧＭＡ社製)を各々１００μＬ／ウェル注入し、室温で２時間インキュベートした。次いで、各抗体溶液を除去した後に、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
１／４に希釈したブロックエース溶液(雪印乳業(株)社製)２００μＬ／ウェルを加えて、室温で２時間インキュベートした。ウェル中にあるブロックエース溶液を除去した後、前記検体１００μＬ／ウェルを加えて室温で２時間インキュベートし、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
西洋ワサビ過酸化酵素(以下、ＨＲＰと略記する)を修飾した抗(ウサギＩｇＧ)ヤギＩｇＧ(ＳＩＧＭＡ社製)溶液１００μＬ／ウェルを注入し、室温で２時間インキュベートした。次いで、各抗体溶液を除去した後に、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
各ウェルに、ＨＲＰ発色溶液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、室温で２時間インキュベートした後、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ＨＲＰ発色溶液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、室温で１０分間インキュベートした。さらに、反応停止液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、反応を停止した。次いで、プレートリーダー(SPECTRA MAX250、モレキュラーデバイス社製)を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
予め作成しておいた検量線を使って、吸光度から検体中の各蛋白質量を求め、回収したアルブミン量に対する選択的に分離したＩｇＧ量の割合(Ｕｉ／Ｕａ)、及び回収したファイブロネクチン量に対する選択的に分離したＩｇＧ量の割合(Ｕｉ／Ｕｆ)をそれぞれ求めた。結果を表４に示す。
【００４７】
比較例３
分離材として、実施例４で調製した前処理ビーズを用いた以外は、実施例５と同様の方法で選択的分離を行い、その測定値からＵｉ／Ｕａ及びＵｉ／Ｕｆを求めた。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
表４の結果より、実施例５で調製した分離材は、アルブミンに対するＩｇＧの割合(Ｕｉ／Ｕａ)では、比較例３の分離材より７０倍以上の分離性能を示し、ファイブロネクチンに対するＩｇＧの割合(Ｕｉ／Ｕｆ)では、比較例３の３０倍以上の分離性能を示すことが判った。すなわち、実施例５の分離材を用いることで、他のアルブミンやファイブロネクチンの数十倍、ＩｇＧを選択的分離によって濃縮できることを意味している。以上の結果から、実施例５で使用した分離材は、選択的にＩｇＧを分離・回収できる機能を有していることが確認できた。
【００５０】
実施例６：株細胞の分離
＜分離材の調製＞
合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解した共重合体溶液に、低蛍光セルデスク(住友ベークライト社製)を室温で５分間浸漬した。溶液からセルデスクを取り出し、室温で１時間乾燥させた。さらに、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間減圧乾燥させ、セルデスク形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表５に示す。
【００５１】
＜選択的分離操作＞
φ９ｃｍのポリスチレンディッシュ中で、１０％ＦＣＳを含んだダルベッコ改変イーグルメディウム(ＤＭＥＭ、以下、培地と略記する)を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞(マウス胎児繊維芽細胞)及びＳＩＲＣ細胞(ウサギ角膜上皮細胞)をサブコンフルエント程度にまで培養した。これらの細胞を０．１％トリプシン溶液で処理して剥がし、遠心操作した後に培地にそれぞれ懸濁した。各懸濁液の細胞濃度を血球計算盤を用いて測定し、２０００個／ｍＬとなるように培地で希釈した。
２４穴プレートの各ウェルに、それぞれの細胞懸濁液０．５ｍＬを注入し、その中に上記セルデスク状の分離材を沈めた。次いで、２４時間炭酸ガスインキュベータ内で培養した後、分離材表面に接着した細胞の同定を行った。細胞の同定は、細胞内に発現している細胞骨格蛋白質であるビメンチンに対する特異抗体を用いる方法で行った。まず、細胞をメタノールで固定した後、抗ビメンチン抗体(コスモバイオ社製)を添加した。次に、洗浄処理を行い、ＦＩＴＣ標識抗(マウスＩｇＧ)抗体(ＳＩＧＭＡ社製)を用いてビメンチン陽性細胞を検出した。一方、全細胞数の測定はプロピジウムイオダイド(ＳＩＧＭＡ社製)を用いた核染色により行った。蛍光顕微鏡下で、ＦＩＴＣ観察用及びプロピジウムイオダイド観察用フィルターをそれぞれ用いて、同一画面を写真撮影し、全細胞数中に占めるＦＩＴＣ陽性細胞(ビメンチン陽性細胞：ＳＩＲＣ細胞)の割合から、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＳＩＲＣ細胞の接着率(％)を計算した。結果を表５に示す。
【００５２】
比較例４
セルデスク形状の分離材の代わりに、何も処理していない低蛍光セルデスクを用いた以外は、実施例６と同様の方法でそれぞれの細胞の接着率を計算した。結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】
表５の結果より、実施例６で調製した分離材は、表面にＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６％選択的に接着していることが判った。これに対して、比較例４では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＳＩＲＣ細胞がほぼ同じ割合で表面に接着していることが判った。以上より、実施例６で使用した分離材は、選択的にＮＩＨ３Ｔ３細胞を分離できる機能を有していることが確認できた。
【００５５】
実施例７：初代培養細胞の分離
＜分離材の調製＞
２４穴プレート(Ｎｕｎｃ社製)の各ウェルに、合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解した共重合体溶液１．０ｍＬずつを分注し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ウェル中の溶液を除去した後に、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間、減圧下で乾燥することにより、培養プレート形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表６に示す。
【００５６】
＜選択的分離操作＞
生後２４時間以内のラット胎児から皮膚の切片を採取し、０．０５％のコラゲナーゼを含むＤＭＥＭで処理した。得られた溶液をメッシュで濾過した後、遠心操作を行い、回収した細胞を５％のＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。細胞濃度を血球計算盤を用いて測定し、５０００個／ｍＬとなるように培地で希釈した。
上記培養プレート形状の分離材のウェル中に、上記で調製した細胞懸濁液０．５ｍＬずつを分注し、１６時間炭酸ガスインキュベータ内で培養した。その後、ウェル内を生理緩衝食塩水で洗浄し、位相差顕微鏡を用いて写真撮影を行った。細胞の形態を観察することで、繊維芽細胞及び表皮細胞の識別を行い、分離材表面への各細胞の接着率を計算した。結果を表６に示す。
【００５７】
比較例５
培養プレート形状の分離材の代わりに、何も処理していない２４穴プレートを用いた以外は、実施例７と同様の方法でそれぞれの細胞の接着率を計算した。結果を表６に示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
表６の結果より、実施例７で調製した分離材は、生体組織から採取した繊維芽細胞と表皮細胞を含む懸濁液から、繊維芽細胞だけを９２％選択的に接着分離できることが判った。これに対して、比較例５では、繊維芽細胞及び表皮細胞がほぼ同じ割合で表面に接着していることが判った。以上より、実施例７で使用した分離材は、選択的に繊維芽細胞を分離できる機能を有していることが確認できた。
【００６０】
実施例８：初代培養細胞の回収
＜選択的分離操作＞
実施例７で調製した分離材を用いて、実施例７と同様に位相差顕微鏡を用いた写真撮影の前までの操作を行った。その後、写真撮影は行わず、分離材の各ウェルを０．１％トリプシン溶液で処理し、細胞を剥離した。次いで、回収した細胞を遠心処理した後、培地にそれぞれ懸濁した。懸濁液の細胞数を、血球計算盤を用いて測定し、２０００個／ｍＬとなるように培地で希釈し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液０．５ｍＬを２４穴プレートの各ウェルに分注し、炭酸ガスインキュベータ内で４８時間培養した。その後、位相差顕微鏡で細胞の形態を確認し、繊維芽細胞及び表皮細胞の識別を行った。結果を表７に示す。
【００６１】
比較例６
分離材として、比較例５と同様の２４穴プレートを用いた以外は、実施例８と同様の方法で細胞の識別を行った。結果を表７に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
実施例８は、実施例７と同じ２種の細胞を含む懸濁液から１種類の初代培養細胞だけを選択的に分離した後、さらにその細胞を回収することを目的としている。ここでは、回収した細胞を培養し、その増殖の様子を観察することで、どちらの細胞が分離・回収できたかを評価している。表７より、分離材を用いて分離・回収したものは、繊維芽細胞のみ増殖していることが確認された。これに対して、比較例６では、繊維芽細胞及び表皮細胞のいずれの細胞も増殖していることが確認された。以上より、実施例８で使用した分離材は、選択的に繊維芽細胞を分離・回収できる機能を有していることが確認できた。
【００６４】
実施例９：情報伝達物質の分離
＜選択的分離操作＞
実施例５で調製したビーズ形状の分離材を使用し、この分離材５．０ｇをガラス製容器に入れ、ジベンゾフラン飽和水溶液２．５ｍＬとジベンゾ−ｐ−ジオキシン飽和水溶液２．５ｍＬとを加えてから容器を密閉した。６０分間容器ごと回転させることで内容物を攪拌した後、ロートを使って溶液を濾別した。回収した溶液は、吸光光度計を用いて、ジベンゾフランは２４９ｎｍ、ジベンゾ−ｐ−ジオキシンは２８９ｎｍの波長でそれぞれ吸光度を測定した。
予め作成しておいた検量線を使って、吸光度から溶液の濃度(Ｃn)を求め、分離材を入れないで上記と同様の操作をした各飽和水溶液の濃度(Ｃ0)に対する変化の割合を、変化率として以下の式により算出した。結果を表８に示す。
変化率(％)＝((Ｃ0−Ｃn)／Ｃ0)×１００
【００６５】
比較例７
分離材として、比較例３と同様な前処理ビーズを用いた以外は、実施例９と同様の方法で選択的分離を行い、その測定値から変化率を計算した。結果を表８に示す。
【００６６】
【表８】
【００６７】
表８の結果より、実施例９の分離材では、情報伝達物質である、ジベンゾフラン及びジベンゾ−ｐ−ジオキシンを含む水溶液から、ジベンゾフランを選択的に分離できることが判った。すなわち、ジベンゾフランの濃度の変化率は、比較例７の３倍以上の値を示した。一方のジベンゾ−ｐ−ジオキシンは分離材を用いた場合も、比較例７の場合もほぼ同じ変化率であった。すなわち、実施例９で使用した分離材によって、溶液中のジベンゾフランを選択的に分離した結果、溶液中のジベンゾフランの濃度が減少したと考えられる。以上より、実施例９で使用した分離材は、選択的にジベンゾフランを分離できる機能を有していることが判った。
【００６８】
以上の実施例及び比較例の結果より次のことがわかる。すなわち、実施例１〜９で調製した分離材は、ホスホリルコリン基に由来するリン元素が含まれており、それぞれ異なったＰ／Ｃ値を有していることを確認した。実施例で使用した分離材は、ＭＰＣと他の単量体とを共重合させてできた重合体を、ＰＥＴ、ポリスチレン、ガラス等からなる種々の形状をした基材の上にコートしたものである。実施例１、４、６、７及び８で使用した分離材は、全て同じ共重合体(Ａ)を表面にコートして調製したにも関わらず、Ｐ／Ｃの値は、基材の種類や形状によっていずれも異なる値を示した。すなわち、分離材を調製する際の、ホスホリルコリン基を含む共重合体と、それをコートする基材との組み合わせによって、Ｐ／Ｃの値をある程度制御することが可能であり、分離材のＰ／Ｃ値をある特定の範囲内に制御することで、結果として、所望の特定成分を選択的に分離・回収する機能が発現されたと考えられる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体に由来する細胞等の特定成分を、選択性良く分離することができる分離材を用い、体液等の溶液中から、特定成分を効率良く選択的に分離し、回収することができる分離・回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療用材料の研究において、ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされ、こうした機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。例えば、特開昭５４−３６０２５号公報には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、ＭＰＣと略す)の製造方法と、得られる重合体が優れた生体適合性を有することが、特開平３−３９３０９号公報には、ＭＰＣとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着・凝集や血漿蛋白質の付着が起こりにくく、医療用材料として有用であることが、特開平９−１８３８１９号公報には、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する共重合体を用いた医療用材料が、特表平６−５０２２００号公報(ＷＯ９２／０７８８５)及び特表平７−５０２０５３号公報(ＷＯ９３／０１２２１)には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生体適合性が得られることが、それぞれ開示されている。
これらホスホリルコリン類似基を含む共重合体を利用した従来の材料は、いずれも血球細胞や血漿蛋白質等が材料表面に非特異的に吸着することを防止又は抑制するというホスホリルコリン類似基を含む共重合体の作用に基づくものであり、生体に由来する成分と材料表面との相互作用を極力抑える方向で研究が進められている。
ところで、ホスホリルコリン類似基を含む重合体を、生体由来等の特定成分を分離する材料に応用する研究についてはこれまで報告されていない。加えて、ホスホリルコリン類似基を含む重合体を応用することにより、生体由来等の特定成分を選択的に分離しうる作用が得られることも知られていない。
生体由来の成分は、用途によっては生理的な活性を保持したまま高純度で得ることが必要であり、そのような目的を達成しうる簡便な分離方法の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定成分を選択的に分離し、さらにその成分を回収することができる分離・回収方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のホスホリルコリン類似基を少なくとも表面に、特定範囲で有する材料において、該特定のホスホリルコリン類似基の割合等を制御することによって、生体に由来する細胞等の特定成分を選択的に分離する作用を示すことを見出し、更には分離した特定成分を容易に回収しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明によれば、式(１)で表される基を少なくとも表面に有する分離材を、特定成分を含む溶液に接触させ、溶液中に含まれる１種類又は複数の特定成分を選択的に分離・回収する方法であって、
前記分離材が、その表面をＸ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、式(１)で表される基に由来するリン元素の量Ｐと、炭素元素の量Ｃとの比(Ｐ／Ｃ)が０．００２〜０．３となる量の式(１)で表される基を有し、
前記特定成分が、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞からなる群より選択される１種又は２種以上の生体に由来する細胞、免疫グロブリン、又はダイオキシンもしくはその誘導体であることを特徴とする分離・回収方法が提供される。
【化３】
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる分離材は、上記式(１)で表される基を少なくとも表面に有する分離材であって、その表面をＸ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、式(１)で表される基に由来するリン元素の量Ｐと、表面全体における炭素元素の量Ｃとの比(Ｐ／Ｃ)が０．００２〜０．３となる量の式(１)で表される基を有する分離材である。分離材の選択的分離能を向上させるために、上記Ｐ／Ｃの範囲は０．０１〜０．２が好ましい。
ここで、分離材の表面をＸ線光電子分光分析によって測定する方法としては、後述する実施例に基づいて測定することができる。
【０００７】
式(１)中のＲ1、Ｒ2及びＲ3は、同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。
炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、フェニル基等が挙げられる。
炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。
【０００８】
式(１)で表される基としては、例えば、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体に由来する基、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体に由来する基等が挙げられる。
【化４】
【０００９】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体としては、例えば、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、３−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、４−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、５−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、６−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリエチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリプロピルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリブチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリシクロヘキシルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリフェニルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート等が挙げられる。
中でも２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートが好ましく、さらにＭＰＣが入手性等の点でより好ましい。
【００１０】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示される公知の方法に準じて製造できる。
具体的には、環状リン化合物と２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレートとを、脱ハロゲン化水素剤のもとで反応させ、次いで、トリメチルアミンを反応させることにより、開環させて目的物を得る方法等が挙げられる。
【００１１】
式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体としては、(Ａ)式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体１０〜１００ｍｏｌ％、(Ｂ)疎水性単量体０〜９０ｍｏｌ％及び(Ｃ)親水性単量体０〜７０ｍｏｌ％からなる単量体組成物を重合してなる重合体が好ましく、特に、(Ａ)成分２０〜８０ｍｏｌ％、(Ｂ)成分２０〜６０ｍｏｌ％及び(Ｃ)成分０〜２０ｍｏｌ％からなる単量体組成物を重合してなる重合体が望ましい。(Ａ)成分が１０ｍｏｌ％未満の場合は、分離材としての性能を発現させることが困難であるので好ましくない。(Ｂ)成分を２０〜６０ｍｏｌ％の範囲で適宜配合することにより、分離材としての性能を安定して発現させることが容易となる。また、(Ｃ)成分を２０ｍｏｌ％以下配合することにより、得られる重合体の水溶液等に対する親和性を向上させることができる。
【００１２】
(Ｂ)成分としては、例えば、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、２−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、ラウリル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート；シクロヘキシル(メタ)アクリレート等の環状アルキル(メタ)アクリレート；ベンジル(メタ)アクリレート、フェノキシエチル(メタ)アクリレート等の芳香族(メタ)アクリレート；ポリプロピレングリコール(メタ)アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール(メタ)アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
【００１３】
(Ｃ)成分としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基、アミド基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ塩基、トリアルキルホスホニウム塩基及びポリオキシエチレン基からなる群より選ばれる親水性基を有する単量体等が挙げられる。具体的には、２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、２−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート、４−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等の水酸基含有(メタ)アクリレート；アクリル酸、メタクリル酸等のカルボン酸；スチレンスルホン酸、(メタ)アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−(メタ)アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体；(メタ)アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート等の含窒素単量体；ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート等が挙げられる。これらは単独若しくは混合物として使用できる。
【００１４】
前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体は、前記(Ａ)成分だけからなる単量体組成物、前記(Ａ)成分及び(Ｂ)成分からなる単量体組成物、前記(Ａ)成分及び(Ｃ)成分からなる単量体組成物、あるいは前記(Ａ)成分、(Ｂ)成分及び(Ｃ)成分からなる単量体組成物を重合したものであればよく、通常のラジカル(共)重合により製造することができる。
この重合体の分子量は、重量平均分子量で、５０００〜５００００００の範囲が好ましく、選択的分離性能を向上させる上で、また各種溶媒に対する重合体の耐溶出性を向上させる上で、１０００００〜２００００００の範囲が特に好ましい。
【００１５】
本発明に用いる分離材の調製は、上記(Ｐ／Ｃ)比が特定範囲となるような方法であれば特に限定されない。例えば、上記式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体等の式(１)で表される基を有する単量体、若しくは上記式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体を用いて、基材の少なくとも表面に化学的に修飾させるか、若しくは基材の表面にコートして乾燥固定させる方法等により得ることができる。
【００１６】
前記基材の材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂；磁性粉、シリカ、アルミナ、ガラス等の無機物が挙げられる。基材の形態は、特に限定されず、例えば、粉体、粒子、ビーズ、フレーク形状物、シート、フィルム、プレート、ゲル、繊維状物、織布、布織布等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いる分離材を調製するにあたり、前記(Ｐ／Ｃ)の制御は、後述する分離対象物質である特定成分によって、使用するホスホリルコリン類似基含有単量体、該単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体の種類や、基材の種類及び形状等を適宜選択して行うことができる。
分離対象物質が、赤血球、白血球、血小板の血球細胞の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ブチルメタクリレート(ＢＭＡ)、ステアリルメタクリレート(ＳＭＡ)等の炭素数４〜１８のアルキル(メタ)アクリレート、カチオン性基含有単量体とを用い、ＭＰＣ／(疎水性基含有単量体＋カチオン性基含有単量体)のモル比が１０／９０〜１００／０、特に２０／８０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００１８】
分離対象物質が、リンパ球の分離の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に５０／５０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００１９】
分離対象物質が、ＩｇＧ等の免疫グロブリンの場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に３０／７０〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２０】
分離対象物質が、株細胞及び初代培養細胞の場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に４０／６０〜８５／１５となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２１】
分離対象物質が、ダイオキシン、その誘導体であるジベンゾフランの場合は、例えば、前記ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物として、ＭＰＣと、ＢＭＡ等のアルキル(メタ)アクリレートとを用い、ＭＰＣ／疎水性基含有単量体のモル比が１０／９０〜１００／０、特に１５／８５〜９０／１０となる単量体組成物を用いて重合体を調製し、該重合体を所定の(Ｐ／Ｃ)比となるように基材に固定することが好ましい。
【００２２】
本発明の分離・回収方法は、上記分離材を、特定成分を含む溶液に接触させ、溶液中に含まれる１種類又は複数の特定成分を選択的に分離・回収する。特定成分を含む溶液と接触させる条件は、分離材表面に選択的に特定成分を付着させることができる条件を、分離対象物質である特定成分の種類等に応じて適宜選択することができる。更に特定成分を付着させた分離材は、洗浄又は溶剤で処理する方法等により、付着している特定成分を分離材表面から剥がして回収することができる。
【００２３】
特定成分を含む溶液としては、体液等が挙げられる。ここで、体液とは、動物体内の脈管又は組織・細胞の間を満たす全ての液体、及び体内から体外へ放出又は分泌される液体のことを指し、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、涙液、尿、脊髄液等が挙げられる。
体液以外の溶液としては、例えば、水溶液、有機溶媒を１種類あるいは複数種類含んだ溶液、水溶液と１種類あるいは複数種類の有機溶媒を混合した混合溶液等が挙げられる。具体的には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、生理的リン酸緩衝溶液、培地、アルコール、アセトン、クロロホルム、エーテル、トルエン、アセトニトリル又はこれらの２種以上の混合溶液等が挙げられる。なお、前記溶液には、体液を希釈したものも含まれる。
【００２４】
本発明において、分離対象とする特定成分は、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞からなる群より選択される１種又は２種以上の生体に由来する細胞、免疫グロブリン、又はダイオキシンもしくはその誘導体である。
【００２５】
前記血球細胞としては、赤血球、白血球、血小板又はこれらの混合物等が挙げられ、白血球としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球が挙げられる。リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞等が挙げられる。血小板としては、血小板の活性化度合い(凝集反応の進行度合い)は特に限定されず、未活性化及び活性化した血小板等が挙げられる。これらの血球細胞の中で特に好ましくは、種々の疾患に際してその数が増減する白血球等が挙げられる。
前記株細胞及び初代培養細胞としては、由来の動物、由来の臓器及び形態は特に限定されず、繊維芽細胞、表皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞等が挙げられる。特に好ましくは、ティシュ・エンジニアリング(tissue engineering)等で利用可能な、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞等が挙げられる。
【００２７】
前記免疫グロブリン(抗体)は、以下の(１)〜(７)が例示できる。
(１)Ｃ反応性蛋白質(ＣＲＰ)、リューマチ因子(ＲＦ)、トランスフェリン等の血漿蛋白質又はこれら血漿蛋白質に対する抗体、
(２)卵胞ホルモン、黄体ホルモン、男性ホルモン、インシュリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン等、更に好ましくは、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、トリヨードサイロニン(Ｔ３)、サイロキシン(Ｔ４)、チロキシン結合蛋白質(ＴＢＧ)、サイログロブリン、インスリン、エストリオール(Ｅ３)、絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ヒト胎盤性ラクトーゲン(ＨＰＬ)等のホルモンに対する抗体、
(３)癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、β２−マイクログロブリン、α−フェトプロテイン(ＡＦＰ)等の腫瘍関連物質に対する抗体、
(４)ＨＢＳ抗体、ＨＢｅ抗体等のウィルス肝炎の抗体、
(５)ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等のウィルス、抗エイズ抗体等の各種生体成分に対する抗体、
(６)フェノバルビタール、アセトアミノフェン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体、
(７)酵素に対する抗体。
ただし、前記抗体はＦａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ)'２フラグメント、又は還元型抗体であってもよい。前記(１)〜(７)のうち、特に好ましくは、種々の疾患に際してその量が増減し、診断あるいは治療にも利用することが可能である抗体が挙げられる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明に用いる分離材は、少なくとも表面に、特定のホスホリルコリン類似構造を有する基を、リン元素と炭素元素との割合を特定とする範囲で含まれるので、広範囲に及ぶ特定成分を選択的に分離することができ、本発明の方法では、この分離材を用いるので、特定成分を選択的に分離・回収することが可能である。すなわち、目的とする特定成分を選択的に効率よく、他の成分から分離することで、目的成分以外の成分の混入を極力抑えることができ、さらに分離した成分を回収することで、回収した成分を別の用途に応用することが可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、例中の分離材表面のＸ線光電子分光分析による測定は、以下の方法に基づいて行った。
＜分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定方法＞
Ｘ線光電子分光分析機(商品名「ＥＳＣＡ−３３００」、島津製作所社製)を用いて、分離材表面に対して、Ｘ線の照射角が９０°のときの、各元素のスペクトルを測定し、リン元素及び炭素元素の各ピーク面積を求め、以下の式によりリン元素の量Ｐ／炭素元素の量Ｃ(Ｐ／Ｃ)を算出した。
Ｐ／Ｃ＝Ａｐ／Ａｃ
ただし、Ａｐ：リン元素のピーク面積、Ａｃ：炭素元素のピーク面積とする。
【００３０】
合成例１
ＭＰＣ ３５．７ｇ及びｎ−ブチルメタクリレート(以下、ＢＭＡと略記する)４．３ｇ(単量体組成モル比：ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０)をエタノール１６０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃に昇温し、アゾビスイソブチロニトリル０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。得られた重合液を３リットルのジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末２９．６ｇを得た。得られた粉末をＧＰＣにより評価したところ、重量平均分子量は１５３０００であった。この粉末を共重合体(Ａ)とする。
【００３１】
合成例２〜４
単量体の種類、組成比及び溶媒種を表１に示すとおりに代えた以外は、合成例１と同様の操作により粉末を得、分子量を測定した。結果を表１に示す。なお、合成例２で調製した粉末を共重合体(Ｂ)、合成例３で調製した粉末を共重合体(Ｃ)、合成例４で調製した粉末を共重合体(Ｄ)とする。また、表１中のＳＭＡはステアリルメタクリレート、ＱＡは２−ヒドロキシ−３−メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドを示す。
【００３２】
【表１】
実施例１：白血球の分離
＜分離材の調製＞
合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇを、エタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。次いで、ポリエチレンテレフタレート(以下、ＰＥＴと略記する)製のシートをφ１３ｍｍの大きさの円形に切り抜いた円形シートを、上記共重合体溶液中に静かに浸漬させてから引き上げ、そのまま室温で１時間乾燥させた。さらに、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で減圧下１６時間乾燥させることにより、ディスク形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表２に示す。
【００３４】
＜選択的分離操作＞
ウサギから採取した新鮮血１０ｍＬにハンクス緩衝液１０ｍＬを加えて１／２に希釈することで、血球成分を選択的に分離するために用いる希釈血を調製した。
次に、上記で調製したディスク形状の分離材を、２４穴プレートに１枚／ウェルずつセットし、３ｍＬのろ過滅菌した蒸留水を加えて１時間湿潤させた。アスピレータで蒸留水を除去し、３ｍＬのハンクス緩衝液を加えて溶媒置換した後、これを完全に除去した。
次いで、上記で調製した希釈血を、この２４穴プレートに７００μＬ／ウェルずつ加えて、２５℃で６時間静置した。続いて、２４穴プレートから分離材を取り出し、３７℃に加温したDulbecco−リン酸緩衝生理食塩水を満たしたシャーレ中に浸してリンスした。この操作を２回繰り返した。その後、シャーレに満たした１０％中性緩衝ホルマリン液中で５分間、さらに、２．５％グルタルアルデヒド水溶液中で１時間固定化処理した。取り出した分離材は蒸留水で十分に洗った後、２５℃で１０時間風乾し、さらに減圧下で１６時間乾燥させた。
以上の操作を行った分離材の表面を走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)で観察し、単位面積あたりの表面に付着している各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３５】
比較例１
実施例１で調製したディスク形状を有する分離材の代わりに、何も処理していないφ１３ｍｍのＰＥＴ製円形シートを用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択的分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３６】
実施例２：赤血球の分離
実施例１において、共重合体(Ａ)の代わりに合成例２により合成した共重合体(Ｂ)を用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３７】
実施例３：白血球の分離
実施例１において、共重合体(Ａ)の代わりに合成例３により合成した共重合体(Ｃ)を用いた以外は、実施例１と同様の方法で選択分離を行い、分離材表面をＳＥＭで観察し、各血球が占める面積の割合(占有率％)を計算した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
表２の結果より、実施例１及び実施例３で調製した分離材は、希釈血中に含まれる赤血球、白血球、血小板のうち、白血球だけを選択的に分離材表面の約１割程度の範囲に付着させうることが確認できた。また実施例２で調製した分離材は、希釈血中に含まれる赤血球、白血球、血小板のうち、赤血球だけを選択的に分離材表面の６割以上の範囲に付着させうることが確認できた。これに対して、比較例１では、赤血球、白血球、血小板全ての血球成分の付着が確認され、特に血小板については、基材表面の半分を覆うという結果になった。
【００４０】
実施例４：リンパ球の分離及び回収
＜分離材の調製＞
平均粒径０．２ｍｍのガラスビーズ(ｉｕｃｈｉ社製)を、アセトン及びエタノールで順に洗浄した後、さらに、蒸留水で十分すすぎ、乾燥器内で６０℃まで昇温させ、そのままの温度で１６時間減圧乾燥させて前処理ビーズを調製した。
一方、合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。
次いで、上記前処理ビース５０ｇをポリプロピレン製の容器に入れ、上記共重合体溶液２０ｍＬを加えた後に密閉した。次に、３０分間容器ごと回転させることで内容物を攪拌した後、ロートを使ってビーズを濾別した。取り出したビーズをシャーレ上に広げてから乾燥器に入れ、徐々に５０℃まで温度を上げた後、そのままの温度で１０時間減圧下で乾燥することにより、ビーズ形状を有する分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表３に示す。
【００４１】
＜選択的分離操作＞
リンパ球懸濁液を以下の方法により調製した。市販のリンパ球分離試薬であるFicoll−Paque(ファルマシアバイオテク社製)を用い、手順書に従ってヒトから採取した血液からリンパ球を採取した。まず、Ficoll−Paqueを３ｍＬずつシリコン処理した試験管に取り分け、この上にハンクス溶液で１／２に希釈したヒト全血４ｍＬを静かに重層した。次いで、２０℃、１５５０ｒｐｍで４０分間遠心分離し、最上層部にある血漿を除去した。その後、ピペットでリンパ球層を丁寧に採取し、シリコン処理した試験管に移した。続いて、採取したリンパ球懸濁液の３倍量のハンクス溶液を加えて、ピペッティングにより静かに攪拌した。次いで２０℃、７００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去した。さらに、ハンクス溶液を加えて再懸濁させ、２０℃、７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。採取したリンパ球を、１０％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地(ＧＩＢＣＯ社製)で再懸濁することでリンパ球懸濁液を調製し、血球計算盤を用いて培地１．０ｍＬ中に含まれるリンパ球の数を測定した。さらに、リンパ球を活性化させる目的で１ｇ／Ｌのリポ多糖類(以下、ＬＰＳと略記する。ＳＩＧＭＡ社製)を１／１００量加えたリンパ球懸濁液を調製した。すなわち、ＬＰＳを加えていないリンパ球懸濁液(以下、ＬＰＳ−と略記する)とＬＰＳを加えたリンパ球懸濁液(以下、ＬＰＳ＋と略記する)の２種類のリンパ球懸濁液を調製した。
上記ビーズ形状の分離材５．０ｇをシリコン処理した試験管に入れ、ＬＰＳ−又はＬＰＳ＋を５．０ｍＬ加えてから、室温で２時間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。次いで、生理的リン酸緩衝溶液(以下、ＰＢＳと略記する)を５．０ｍＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。この洗浄操作を３回繰り返した。
洗浄操作後、試験管内の分離材が流出しないように注意しながら、残っているＰＢＳを完全に除去した。その後、素早くＰＢＳ５．０ｍＬを加えてから、攪拌子を用いてスターラー上で緩やかに１分間かき混ぜ、ビーズ表面に付着していたリンパ球をＰＢＳ中に分散させた。その後、上清からＰＢＳを採取し、血球計算盤を用いてＰＢＳ１．０ｍＬ中に含まれるリンパ球の数を測定し、添加したリンパ球数(Ｃ0)に対する回収したリンパ球数(ＣR)の割合を、回収率として下記式により算出し、結果を表３に示す。
回収率(％)＝(ＣR／Ｃ0)×１００
【００４２】
比較例２
分離材として、実施例４で調製した前処理ビーズを用いた以外は、実施例４と同様の方法で分離を行い、リンパ球の回収率を求めた。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
表３の結果より、実施例４で調製した分離材は、リンパ球を活性化させる目的でＬＰＳを加えたＬＰＳ＋と、加えていないＬＰＳ−のいずれの場合においても、約半分のリンパ球を分離した後、さらに回収可能であることが確認できた。一方、比較例２では、ＬＰＳ−の場合、約１割程度のリンパ球を分離・回収できたが、ＬＰＳ＋の場合では、一切の分離・回収ができなかった。すなわち、実施例４で使用した分離材は、リンパ球の活性化の程度に関わらず、選択的にリンパ球を分離・回収できる機能を有することが判った。
【００４５】
実施例５：免疫グロブリンの分離
＜分離材の調製＞
実施例４における分離材の調製において、共重合体(Ａ)の代わりに、合成例４により合成した共重合体(Ｄ)を使用した以外は、実施例４と同様の方法で分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表４に示す。
【００４６】
＜選択的分離操作＞
上記分離材５．０ｇをポリプロピレン製試験管に入れ、ＰＢＳを用いて１／２５６に希釈したウシ胎児血清(以下、ＦＣＳと略記する、ＧＩＢＣＯ社製)５．０ｍＬを加えて、室温で２時間インキュベートした。その後３０分間静置した後、上清を静かに除いた。次いで、ＰＢＳ５．０ｍＬを加え、室温で１０分間インキュベートした後、３０分間静置し、上清を静かに除いた。この洗浄操作を３回繰り返した。
洗浄操作後、２０倍濃度のＰＢＳ５．０ｍＬを加え、室温で２時間インキュベートすることで、分離材表面に付着した蛋白をＰＢＳ中に溶解させた。３０分間静置した後、上清を静かに分取し、これを検体とした。
次に、ポリスチレン製９６穴プレート(Ｎｕｎｃ社製)に、抗(ウシＩｇＧ)ウサギＩｇＧ((株)ヤガイ社製)、抗(ウシアルブミン)ウサギＩｇＧ((株)ヤガイ社製)又は抗(ウシファイブロネクチン)ウサギＩｇＧ(ＳＩＧＭＡ社製)を各々１００μＬ／ウェル注入し、室温で２時間インキュベートした。次いで、各抗体溶液を除去した後に、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
１／４に希釈したブロックエース溶液(雪印乳業(株)社製)２００μＬ／ウェルを加えて、室温で２時間インキュベートした。ウェル中にあるブロックエース溶液を除去した後、前記検体１００μＬ／ウェルを加えて室温で２時間インキュベートし、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
西洋ワサビ過酸化酵素(以下、ＨＲＰと略記する)を修飾した抗(ウサギＩｇＧ)ヤギＩｇＧ(ＳＩＧＭＡ社製)溶液１００μＬ／ウェルを注入し、室温で２時間インキュベートした。次いで、各抗体溶液を除去した後に、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。
各ウェルに、ＨＲＰ発色溶液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、室温で２時間インキュベートした後、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ＨＲＰ発色溶液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、室温で１０分間インキュベートした。さらに、反応停止液(ペルオキシダーゼ用発色キットＴ、住友ベークライト(株)社製)１００μＬ／ウェルを注入し、反応を停止した。次いで、プレートリーダー(SPECTRA MAX250、モレキュラーデバイス社製)を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
予め作成しておいた検量線を使って、吸光度から検体中の各蛋白質量を求め、回収したアルブミン量に対する選択的に分離したＩｇＧ量の割合(Ｕｉ／Ｕａ)、及び回収したファイブロネクチン量に対する選択的に分離したＩｇＧ量の割合(Ｕｉ／Ｕｆ)をそれぞれ求めた。結果を表４に示す。
【００４７】
比較例３
分離材として、実施例４で調製した前処理ビーズを用いた以外は、実施例５と同様の方法で選択的分離を行い、その測定値からＵｉ／Ｕａ及びＵｉ／Ｕｆを求めた。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
表４の結果より、実施例５で調製した分離材は、アルブミンに対するＩｇＧの割合(Ｕｉ／Ｕａ)では、比較例３の分離材より７０倍以上の分離性能を示し、ファイブロネクチンに対するＩｇＧの割合(Ｕｉ／Ｕｆ)では、比較例３の３０倍以上の分離性能を示すことが判った。すなわち、実施例５の分離材を用いることで、他のアルブミンやファイブロネクチンの数十倍、ＩｇＧを選択的分離によって濃縮できることを意味している。以上の結果から、実施例５で使用した分離材は、選択的にＩｇＧを分離・回収できる機能を有していることが確認できた。
【００５０】
実施例６：株細胞の分離
＜分離材の調製＞
合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解した共重合体溶液に、低蛍光セルデスク(住友ベークライト社製)を室温で５分間浸漬した。溶液からセルデスクを取り出し、室温で１時間乾燥させた。さらに、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間減圧乾燥させ、セルデスク形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表５に示す。
【００５１】
＜選択的分離操作＞
φ９ｃｍのポリスチレンディッシュ中で、１０％ＦＣＳを含んだダルベッコ改変イーグルメディウム(ＤＭＥＭ、以下、培地と略記する)を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞(マウス胎児繊維芽細胞)及びＳＩＲＣ細胞(ウサギ角膜上皮細胞)をサブコンフルエント程度にまで培養した。これらの細胞を０．１％トリプシン溶液で処理して剥がし、遠心操作した後に培地にそれぞれ懸濁した。各懸濁液の細胞濃度を血球計算盤を用いて測定し、２０００個／ｍＬとなるように培地で希釈した。
２４穴プレートの各ウェルに、それぞれの細胞懸濁液０．５ｍＬを注入し、その中に上記セルデスク状の分離材を沈めた。次いで、２４時間炭酸ガスインキュベータ内で培養した後、分離材表面に接着した細胞の同定を行った。細胞の同定は、細胞内に発現している細胞骨格蛋白質であるビメンチンに対する特異抗体を用いる方法で行った。まず、細胞をメタノールで固定した後、抗ビメンチン抗体(コスモバイオ社製)を添加した。次に、洗浄処理を行い、ＦＩＴＣ標識抗(マウスＩｇＧ)抗体(ＳＩＧＭＡ社製)を用いてビメンチン陽性細胞を検出した。一方、全細胞数の測定はプロピジウムイオダイド(ＳＩＧＭＡ社製)を用いた核染色により行った。蛍光顕微鏡下で、ＦＩＴＣ観察用及びプロピジウムイオダイド観察用フィルターをそれぞれ用いて、同一画面を写真撮影し、全細胞数中に占めるＦＩＴＣ陽性細胞(ビメンチン陽性細胞：ＳＩＲＣ細胞)の割合から、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＳＩＲＣ細胞の接着率(％)を計算した。結果を表５に示す。
【００５２】
比較例４
セルデスク形状の分離材の代わりに、何も処理していない低蛍光セルデスクを用いた以外は、実施例６と同様の方法でそれぞれの細胞の接着率を計算した。結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
表５の結果より、実施例６で調製した分離材は、表面にＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６％選択的に接着していることが判った。これに対して、比較例４では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＳＩＲＣ細胞がほぼ同じ割合で表面に接着していることが判った。以上より、実施例６で使用した分離材は、選択的にＮＩＨ３Ｔ３細胞を分離できる機能を有していることが確認できた。
【００５５】
実施例７：初代培養細胞の分離
＜分離材の調製＞
２４穴プレート(Ｎｕｎｃ社製)の各ウェルに、合成例１により合成した共重合体(Ａ)０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解した共重合体溶液１．０ｍＬずつを分注し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ウェル中の溶液を除去した後に、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間、減圧下で乾燥することにより、培養プレート形状の分離材を調製した。
得られた分離材表面のＸ線光電子分光分析の測定を行い、Ｐ／Ｃの値を求めた。結果を表６に示す。
【００５６】
＜選択的分離操作＞
生後２４時間以内のラット胎児から皮膚の切片を採取し、０．０５％のコラゲナーゼを含むＤＭＥＭで処理した。得られた溶液をメッシュで濾過した後、遠心操作を行い、回収した細胞を５％のＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。細胞濃度を血球計算盤を用いて測定し、５０００個／ｍＬとなるように培地で希釈した。
上記培養プレート形状の分離材のウェル中に、上記で調製した細胞懸濁液０．５ｍＬずつを分注し、１６時間炭酸ガスインキュベータ内で培養した。その後、ウェル内を生理緩衝食塩水で洗浄し、位相差顕微鏡を用いて写真撮影を行った。細胞の形態を観察することで、繊維芽細胞及び表皮細胞の識別を行い、分離材表面への各細胞の接着率を計算した。結果を表６に示す。
【００５７】
比較例５
培養プレート形状の分離材の代わりに、何も処理していない２４穴プレートを用いた以外は、実施例７と同様の方法でそれぞれの細胞の接着率を計算した。結果を表６に示す。
【００５８】
【表６】
表６の結果より、実施例７で調製した分離材は、生体組織から採取した繊維芽細胞と表皮細胞を含む懸濁液から、繊維芽細胞だけを９２％選択的に接着分離できることが判った。これに対して、比較例５では、繊維芽細胞及び表皮細胞がほぼ同じ割合で表面に接着していることが判った。以上より、実施例７で使用した分離材は、選択的に繊維芽細胞を分離できる機能を有していることが確認できた。
【００６０】
実施例８：初代培養細胞の回収
＜選択的分離操作＞
実施例７で調製した分離材を用いて、実施例７と同様に位相差顕微鏡を用いた写真撮影の前までの操作を行った。その後、写真撮影は行わず、分離材の各ウェルを０．１％トリプシン溶液で処理し、細胞を剥離した。次いで、回収した細胞を遠心処理した後、培地にそれぞれ懸濁した。懸濁液の細胞数を、血球計算盤を用いて測定し、２０００個／ｍＬとなるように培地で希釈し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液０．５ｍＬを２４穴プレートの各ウェルに分注し、炭酸ガスインキュベータ内で４８時間培養した。その後、位相差顕微鏡で細胞の形態を確認し、繊維芽細胞及び表皮細胞の識別を行った。結果を表７に示す。
【００６１】
比較例６
分離材として、比較例５と同様の２４穴プレートを用いた以外は、実施例８と同様の方法で細胞の識別を行った。結果を表７に示す。
【００６２】
【表７】
実施例８は、実施例７と同じ２種の細胞を含む懸濁液から１種類の初代培養細胞だけを選択的に分離した後、さらにその細胞を回収することを目的としている。ここでは、回収した細胞を培養し、その増殖の様子を観察することで、どちらの細胞が分離・回収できたかを評価している。表７より、分離材を用いて分離・回収したものは、繊維芽細胞のみ増殖していることが確認された。これに対して、比較例６では、繊維芽細胞及び表皮細胞のいずれの細胞も増殖していることが確認された。以上より、実施例８で使用した分離材は、選択的に繊維芽細胞を分離・回収できる機能を有していることが確認できた。
【００６４】
実施例９：情報伝達物質の分離
＜選択的分離操作＞
実施例５で調製したビーズ形状の分離材を使用し、この分離材５．０ｇをガラス製容器に入れ、ジベンゾフラン飽和水溶液２．５ｍＬとジベンゾ−ｐ−ジオキシン飽和水溶液２．５ｍＬとを加えてから容器を密閉した。６０分間容器ごと回転させることで内容物を攪拌した後、ロートを使って溶液を濾別した。回収した溶液は、吸光光度計を用いて、ジベンゾフランは２４９ｎｍ、ジベンゾ−ｐ−ジオキシンは２８９ｎｍの波長でそれぞれ吸光度を測定した。
予め作成しておいた検量線を使って、吸光度から溶液の濃度(Ｃn)を求め、分離材を入れないで上記と同様の操作をした各飽和水溶液の濃度(Ｃ0)に対する変化の割合を、変化率として以下の式により算出した。結果を表８に示す。
変化率(％)＝((Ｃ0−Ｃn)／Ｃ0)×１００
【００６５】
比較例７
分離材として、比較例３と同様な前処理ビーズを用いた以外は、実施例９と同様の方法で選択的分離を行い、その測定値から変化率を計算した。結果を表８に示す。
【００６６】
【表８】
表８の結果より、実施例９の分離材では、情報伝達物質である、ジベンゾフラン及びジベンゾ−ｐ−ジオキシンを含む水溶液から、ジベンゾフランを選択的に分離できることが判った。すなわち、ジベンゾフランの濃度の変化率は、比較例７の３倍以上の値を示した。一方のジベンゾ−ｐ−ジオキシンは分離材を用いた場合も、比較例７の場合もほぼ同じ変化率であった。すなわち、実施例９で使用した分離材によって、溶液中のジベンゾフランを選択的に分離した結果、溶液中のジベンゾフランの濃度が減少したと考えられる。以上より、実施例９で使用した分離材は、選択的にジベンゾフランを分離できる機能を有していることが判った。
【００６８】
以上の実施例及び比較例の結果より次のことがわかる。すなわち、実施例１〜９で調製した分離材は、ホスホリルコリン基に由来するリン元素が含まれており、それぞれ異なったＰ／Ｃ値を有していることを確認した。実施例で使用した分離材は、ＭＰＣと他の単量体とを共重合させてできた重合体を、ＰＥＴ、ポリスチレン、ガラス等からなる種々の形状をした基材の上にコートしたものである。実施例１、４、６、７及び８で使用した分離材は、全て同じ共重合体(Ａ)を表面にコートして調製したにも関わらず、Ｐ／Ｃの値は、基材の種類や形状によっていずれも異なる値を示した。すなわち、分離材を調製する際の、ホスホリルコリン基を含む共重合体と、それをコートする基材との組み合わせによって、Ｐ／Ｃの値をある程度制御することが可能であり、分離材のＰ／Ｃ値をある特定の範囲内に制御することで、結果として、所望の特定成分を選択的に分離・回収する機能が発現されたと考えられる。
Claims (5)
- 式(１)で表される基を少なくとも表面に有する分離材を、特定成分を含む溶液に接触させ、溶液中に含まれる１種類又は複数の特定成分を選択的に分離・回収する方法であって、
前記分離材が、その表面をＸ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、式(１)で表される基に由来するリン元素の量Ｐと、炭素元素の量Ｃとの比(Ｐ／Ｃ)が０．００２〜０．３となる量の式(１)で表される基を有し、
前記特定成分が、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞からなる群より選択される１種又は２種以上の生体に由来する細胞、免疫グロブリン、又はダイオキシンもしくはその誘導体であることを特徴とする分離・回収方法。
- 式(１)で表される基が、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体に由来する基であることを特徴とする請求項１記載の分離・回収方法。
- 式(１)で表される基が、式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体に由来する基であることを特徴とする請求項１記載の分離・回収方法。
- ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体が、(Ａ)式(２)で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体１０〜１００ｍｏｌ％、(Ｂ)疎水性単量体０〜９０ｍｏｌ％及び(Ｃ)親水性単量体０〜７０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合してなる重合体であることを特徴とする請求項３に記載の分離・回収方法。
- 血球細胞が、赤血球、白血球及び血小板からなる群より選択される１種又は２種以上である請求項１〜４のいずれかに記載の分離・回収方法。
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