JP4595081B2 - リン酸カルシウムコロイド、ドット、アイランド、薄膜または、グラニュール、およびその調製 - Google Patents

Description

本発明は、リン酸カルシウムイオン溶液を調製する新規な方法、および該リン酸カルシウムイオン溶液を使用して調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液に関する。さらに、本発明は、それを固体表面に付着させ、成長させることにより得られるリン酸カルシウムドット、アイランドまたは薄膜、およびそれらを溶液中で成長させることにより得られるリン酸カルシウムグラニュールに関する。

本発明の背景
リン酸カルシウムは生物学的に石灰化された組織に見いだされる生物学的適合性を有する物質であり［Ｈ．−Ｍ．Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．１９９５、１０、１５８９−１６０１；米国特許５，５６５，５０２号；および米国特許５，６９１，３９７号］、そしてそれはバイオマテリアル、特に骨代用品としてよく知られている。
リン酸カルシウムは、有機物および無機物に対する高い吸収能力を持っている。したがって、リン酸カルシウムは、重金属除去剤および脱臭剤として、ロッド、針、フレーク、箔、棒あるいはグラニュールの形態で使用される。リン酸カルシウムは様々な形態で使用することができる。例えば、リン酸カルシウム結晶の薄膜は表面積を拡大させるのに有効で、重金属に対するその高い吸収能力の使用により水溶液から効率的に重金属を取り除くことができる、またしたがって水を浄化するのに使用することができる。リン酸カルシウム結晶の薄膜も、それがバイオマテリアルの特性を維持しつつ生物学的適合性を向上させるので、バイオマテリアル表面を改質するために一般に使用される。
しかしながら、そのような結晶の薄膜は、固体の基体表面の全体にわたって形成され、したがって欠点を有する。たとえば、生分解性高分子に適用された時、ポリマーと組織液の間の直接の接触を阻むので、生分解性が減じることがある。さらに、ポリマーまたはチタン基体のような基板が変形された場合、結晶の薄膜が容易に固体基板から引き離されることができる。また、さらに、リン酸カルシウム上に形成された組織も、基体の変形の結果、リン酸カルシウム薄膜と一緒に基体から引き離される場合がある。

したがって、生体反応が固体の基体上で効率的に行なわれ、リン酸カルシウムが、外力あるいは固体の基体の変形により容易に分離されないような、新しい形態のリン酸カルシウムが必要である。
リン酸カルシウムの別の有用な形態として、リン酸カルシウムグラニュールは、薬または細胞デリバリーのためのキャリヤーおよび質量分離のためのフィルターに使用することができる。
リン酸カルシウムはリン酸カルシウムイオン溶液で調製することができ、それはＣａ^２＋イオンとＰＯ_４ ^３−イオンを有するすべての化合物で調製することができる。Ｃａ^２＋イオンを有する化合物の例としては、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＣａＣＯ_３、Ｃａ（ＮＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏ、Ｃａ（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）_２・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２、またはＣａＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏが挙げられ、ＰＯ_４ ^３−イオンを含む化合物の例としては、Ｈ_３ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、またはＨ_４Ｐ_２Ｏ_７があげられる。Ｃａ／Ｐモル比が０．８から２．０であるリン酸カルシウム化合物も、リン酸カルシウムの新しい形態を得るためのリン酸カルシウムイオン溶液を調製するために使用することができる。これらのリン酸カルシウム化合物の例としては、リン酸モノカルシウム一水塩、リン酸ジカルシウム二水和物、リン酸ジカルシウム無水物、リン酸オクタカルシウム、無定形のリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸トリカルシウムがあげられる。

様々な形態のリン酸カルシウム化合物は水性溶液中で様々な条件においてＣａ^２＋イオンおよびＰＯ_４ ^３−イオンを混合することにより調製することができる。また、イオン濃度、Ｃａ／Ｐ比率およびｐＨ条件によって化合物のタイプおよび形態が大きく影響されることが知られている［Ａｙａｋｏ Ｏｙａｎｅ、Ｋａｚｕｏ Ｏｎｕｍａ、Ｔａｄａｓｈｉ Ｋｏｋｕｂｏ、およびＡｔｓｕｏ Ｉｔｏ Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、１９９９，１０３，８２３０−８２３５、Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｊ．Ｃ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐａｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ， Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ １１１−１９０ （１９９４）］。

発明の要約
本発明の目的は、第１の実施態様および第２の実施態様を含むリン酸カルシウムイオン溶液を調製する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、低温でリン酸カルシウムイオン溶液を維持することにより調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を提供することである。
さらに、本発明の別の目的は、前記溶液を使用して、固体の表面上に調製されたリン酸カルシウムのドット、アイランドあるいは薄膜を提供すること、並びにリン酸カルシウムコロイドイオン溶液中で調製されたグラニュールを提供することである。

発明の詳細な説明
前述の目的を達成するために、（１）本発明はリン酸カルシウムイオン溶液を提供する。
第１の実施態様では、リン酸カルシウムイオン溶液の調製のための方法は、次の工程を含む：
１）リン酸カルシウム結晶あるいはカルシウム塩およびリン酸塩を酸性溶液中に溶解することにより、カルシウムイオンおよびリン酸イオンの溶液を調製する工程；
２）低温でアルカリ性溶液と、工程１のカルシウムとリン酸イオンの酸性溶液を混合する工程；および
３）工程２で調製された溶液から、結晶の核生成および成長のための核となることができるリン酸カルシウム粒子又は結晶を除去し、溶液中のさらなる結晶の核生成と成長を防止して、未反応の遊離カルシウムとリン酸イオンが多いイオン溶液を得る工程。
工程２の酸性溶液とアルカリ性溶液との混合は、０−３７℃、好ましくは０−２０℃で行なわれる。より好ましくは、混合の間のリン酸カルシウムの沈殿の形成を防止するため、温度は前記温度範囲中のできるだけ低い温度である。最も好ましくは、温度は０℃である。
さらに、本発明において調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、緩衝液として貯蔵され、０−１０℃の低温で維持される。上記の温度範囲中のできるだけ低い温度で、高度に過飽和されたリン酸カルシウムイオン溶液は、沈殿することなく維持することができる。好ましくは、リン酸カルシウムイオン溶液は０℃で貯蔵される。

第２の実施態様では、リン酸カルシウムイオン溶液の調製のための方法は、次の工程を含む：
１）リン酸イオンを含んでいるｐＨ６．０−１０．０のイオン溶液を調製する工程、
２）カルシウムイオンを含んでいるｐＨ６．０−１０．０のイオン溶液を調製する工程、および
３）工程２のイオン溶液と工程１のイオン溶液を混合することにより、ｐＨ６．０−１０．０のカルシウムおよびリン酸イオン溶液を調製する工程。

本発明では、「リン酸カルシウムイオン溶液」は、リン酸イオンとカルシウムイオンの濃度はそれぞれ１−２５ｍＭであり、イオン溶液中のカルシウムおよびリン酸のイオン濃度の積は、１−６４ｍＭ^２の範囲にあるように調製される。
工程３の混合温度は、０−３７℃、好ましくは０−２０℃で維持される。より好ましくは、リン酸カルシウム沈殿の形成を防止するよう、温度は前記温度範囲中のできるだけ低い温度である。さらに、混合の時に局所的に増大した濃度のために形成される場合があるリン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、混合溶液は、撹拌方法あるいは機械的な方法の使用により小量づつそれを分配することによりゆっくり加えられる。混合溶液のイオン濃度の積の局所的な増大を防ぐ機械的な方法の例としては、好ましくは、小量の連続的な追加のための蠕動ポンプの使用、あるいはスプレーの使用があげられる。

混合溶液の低い速度での追加、そして混合溶液の高速撹拌は、加えられたイオンの拡散を促進し、その結果、混合物の局所的に増大したカルシウムおよびリン酸イオン濃度の積によって引き起こされたリン酸カルシウム沈殿の自発的な形成は防止されるか、又は遅延させることができる。したがって、第２の実施態様の調製方法は、リン酸カルシウム析出物の除去のために分離ろ過あるいは遠心分離の手順の必要のない、リン酸カルシウムイオン溶液を大量生産することができる経済的な方法である。

さらに、本発明は、次の工程を含む、リン酸カルシウムイオン溶液を調製する別の方法を提供する：
１）リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含んでいるｐＨ６．０以下のイオン溶液を調製する工程、および
２）工程１のイオン溶液にアルカリ性溶液を加えることにより、ｐＨ６．０−１０．０のリン酸カルシウムイオン溶液を調製する工程。
工程２の混合温度および他の条件は、前記方法の温度および条件と同一である。工程２では、混合温度は、０−３７℃、好ましくは０−２０℃で維持される。より好ましくは、リン酸カルシウム沈殿の形成を防止するため、温度は前記温度範囲中のできるだけ低い温度である。

さらに、混合の時に局所的に増大したイオン濃度による混合イオン溶液中のリン酸カルシウム沈殿の形成を防ぐために、混合物溶液は、撹拌方法あるいは機械的な方法の使用により小量づつそれを分配することによりゆっくり加えられる。混合溶液のイオン濃度の積の局所的な増大を防ぐ機械的な方法の例としては、好ましくは、小量の連続的な追加のための蠕動ポンプの使用、あるいはスプレーの使用があげられる。

さらに、第２の実施態様の中で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、緩衝液として貯蔵され、０−１０℃の低温で維持される。高度に過飽和されたリン酸カルシウムイオン溶液は、上記の温度範囲中のできるだけ低い温度でそれを維持することにより、沈殿なしで維持することができる。好ましくは、リン酸カルシウムイオン溶液は０℃で貯蔵される。
本発明のリン酸カルシウムイオン溶液の調製方法では、１）ｐＨ、２）温度、３）混合速度、および４）イオン濃度が、イオン溶液における自発的なリン酸カルシウムの沈殿の形成に影響する。ｐＨが低いほど、温度が低いほど、混合速度が遅いほど、そしてイオン濃度がより低いほど、リン酸カルシウムの沈殿の形成は、しのがれるかまたは遅延される。

均一のリン酸カルシウム溶液を得るために緩衝系を使用することは望ましい。有機イオンまたは無機イオンの任意の緩衝液を本発明において使用することができる。イオン溶液のｐＨは酸又は塩基、より具体的には無機酸、有機酸、無機塩基あるいは有機塩基を加えることによりコントロールされる。この時に、無機酸の例は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ_２ＳＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＨＮＯ_３、Ｈ_２ＣＯ_３、ＨＣｌＯ_４およびＨ_３ＢＯ_３からなる群から選ばれる。また、有機酸の例はＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２’−エタンスルホン酸、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、（２−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、および酢酸からなる群から選ばれる。好ましくは、ＨＣｌおよびＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２’−エタンスルホン酸が使用される。さらに、無機塩基の例は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、Ｍｇ（ＯＨ）_２、およびＮＨ_４ＯＨからなる群から選ばれる。また、有機塩基の例はトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンから成る群から選ばれる。有機塩基は各緩衝液の干渉範囲を考慮して、好ましいｐＨに応じて選択される。

（２） 本発明は、低温でリン酸カルシウムイオン溶液から調製されるリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を提供する。
リン酸カルシウムコロイドイオン溶液であって、そのコロイド粒子サイズが、１ｎｍ−１，０００ｎｍの範囲にあるものが、０−６０℃でリン酸カルシウムイオン溶液を維持することにより調製される。
リン酸カルシウムコロイドイオン溶液は、低温でリン酸カルシウムイオン溶液の中で最初に形成される、よく分散したリン酸カルシウムコロイド粒子を含んでいる。コロイド粒子は、固体の基体に付着する能力を持っている。リン酸カルシウムコロイドイオン溶液は、温度に応じて様々な異なるタイプに調製することができる。より詳細には、固体の基体へのコロイド粒子の付着および成長は低温でより高く、その一方で溶液中では、コロイド粒子の成長は高温で促進されている。

図１はドットとして基体に付着したリン酸カルシウムコロイド粒子の写真である。それは、低温でコロイド粒子を含まないリン酸カルシウムイオン溶液の上に置かれたフォームバー（ｆｏｒｍｖａｒ）フィルム上に、コロイド粒子を含まないイオン溶液にリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を加えた後に観察される。
本発明のリン酸カルシウムコロイドイオン溶液は、低温で長期間コロイド状態を維持することができる。コロイド粒子は固体の基体上に付着し成長することができる。また、したがって、それらは基体上においてリン酸カルシウムドット、アイランドおよび薄膜を得るために使用することができる。さらに、それらは、さらに、イオン溶液中でリン酸カルシウムグラニュールとして成長することができる。したがって、リン酸カルシウムコロイド粒子は、本発明においてリン酸カルシウムのドット、アイランド、薄膜あるいはグラニュールの調製において先駆物質として働く。

（３） 本発明は、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液を使用して調製された、固体の基体上のリン酸カルシウムドット、アイランドおよび薄膜を提供する。
さらに、本発明は、リン酸カルシウムイオン溶液を使用して調製されたイオン溶液中のリン酸カルシウムグラニュールを提供する。
本発明のリン酸カルシウムは、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液が固体の基体あるいは溶液に適用されるかどうかに応じて、様々な形式で調製される。
Ａ．リン酸カルシウムコロイドイオン溶液を固体の基体に適用することにより調製されたリン酸カルシウムドットあるいはアイランド
本発明は、リン酸カルシウムドットあるいはアイランドを含む物質を提供する。それは、１−６０℃で固体の基体の上にリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を注ぐことにより調製される。リン酸カルシウムドットは、様々なサイズの無定形、結晶、またはそれらの混合物の形態で、固体の基体上に形成される。リン酸カルシウムドットは、固体の基体の上に不連続的に散在し、各ドット間の空間に固体の基体が露出された２元的な表面を提供する。

２元的な表面はバイオマテリアルとして使用することができ、それの高い細胞接着および活性のためにリン酸カルシウム表面、並びにドット間の基体表面を有する細胞を提供することができ、細胞はマトリックスに堆積しバイオマテリアル基体に直接結合する。上記の特性に基づいて、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、結合組織細胞および骨芽細胞細胞のような様々な細胞などを、そのような２元的表面上で増殖し分化させることができる。
下記は、上記のリン酸カルシウムドットのサイズをコントロールする３つの方法である。
最初の方法では、イオン溶液の温度によりコントロールすることができる。詳細には、イオン溶液の温度がより低くなるとともに、ドットはより小さくなる。さらに、より小さなサイズのドットは、低温で結晶に変換される。一方、イオン溶液の温度がより高くなるとともに、ドットはより大きくなる。さらに、より大きなサイズのドットは、高温で結晶に変換される。したがって、適切なサイズのドットは、好ましくは１−４０℃の範囲で、イオン溶液の温度をコントロールすることにより調製することができる。

第２の方法では、イオン溶液のｐＨがｐＨ６．０−９．０の範囲でコントロールされる。望ましい範囲はｐＨ６．０−８．０の範囲から選ばれる。より詳細には、ｐＨがより低くなるにつれ、ドットのサイズはより小さくなり、またそれらが結晶に変換されるドットのサイズはより小さくなる。一方、ｐＨがより高くなるにつれ、ドットのサイズはより大きくなり、またそれらが結晶に変換されるドットのサイズはより大きくなる。

第３の方法では、反応時間がコントロールされることができる。ドットのサイズは時間の進行とともにより大きくなる。また、ドットは徐々に結晶に変換され、結晶のアイランドを形成する。 本発明では、無定形のドットのサイズは５−１，０００ｎｍである。また、結晶のアイランドのサイズは５−５，０００ｎｍである。
図２は、フォームバーフィルムへのリン酸カルシウムコロイド粒子の接着を通して形成された無定形相ドットの透過電子顕微鏡写真である。直径で２０−９０ｎｍのサイズのドットが形成された。それは１平方ミクロンあたり２０−２８ドットの高密度で散在する。さらに、それはリン酸カルシウム表面と、無定形相ドット間に露出された基体表面の２元的な表面を提供する。
図３は、フォームバーフィルム上で無定形相ドットが結晶に変換される時の、過渡期の段階の透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。上記の結果から、リン酸カルシウムドットから繊維状結晶が成長してゆくことが見いだされた。
さらに、図４に示されるように、リン酸カルシウム無定形相ドットが、フォームバーフィルム上で結晶に変換され、成長して結晶のアイランドを形成する。さらに、それは、結晶のアイランド表面、および結晶のアイランド間の空間であるフォームバーフィルム表面を有する２元的表面を提供する。

Ｂ．固体の基体へのリン酸カルシウムコロイドイオン溶液の適用により調製されたリン酸カルシウム薄膜
固体の基体へのリン酸カルシウムコロイドイオン溶液の適用により得られるリン酸カルシウム材料の別の形態は、固体の基体上で形成されたリン酸カルシウムの薄膜である。
リン酸カルシウム薄膜は固体の基体上での、リン酸カルシウムドットあるいは結晶の融合および成長を通して形成される。本発明は、１−６０℃で固体の基体上へリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を注ぎ、一定の期間の間それを維持することにより、ドットまたは結晶が完全に融合し成長させることにより調製することができる薄膜を提供する。より好ましくは、温度条件は１−４０℃の範囲である。

リン酸カルシウム薄膜は、固体の基体上に形成された無定形相薄膜、結晶の薄膜あるいはそれらの混合物の薄膜を含む。
無定形相ドットは、イオン溶液の温度および濃度のコントロールにより結晶のアイランドに変換することができる。他の条件が同じである場合、結晶の薄膜は、無定形のリン酸カルシウムドットの結晶への転化を介して、イオン溶液の濃度あるいは温度を高くすることにより容易に調製することができる。
リン酸カルシウム薄膜は高い生物学的適合性を提供するためのバイオマテリアル表面のためのコーティング物質として使用することができ、あるいは重金属に対するその高い吸着力を使用して、水を清浄にするための重金属除去フィルターとして使用することができる。［Ｃｈｅｎ，Ｘ．−Ｂ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｖ．，Ｃｏｎｃａ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｅｕｒｒｕｎｇ，Ｌ．Ｍ．．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７；３１（３）；６２４−６３１．，Ｌｕｓｖａｒｄｉ Ｇ，Ｍａｌａｖａｓｉ Ｇ，Ｍｅｎａｂｕｅ Ｌ，Ｓａｌａｄｉｎｉ Ｍ． Ｗａｓｔｅ Ｍａｎａｇ．２００２；２２（８）：８５３−８５７］

さらに、それは、有機分子および無機分子に対するその高い吸着特性を使用し、臭気あるいはガスを除去する脱臭剤として使用することができる。
図４は、フォームバーフィルム上の、リン酸カルシウムの薄膜へ変換している、リン酸カルシウム結晶アイランドの透過電子顕微鏡写真である。
任意の親水性表面および疎水性表面が、リン酸カルシウムドット、アイランドあるいは薄膜の基体として使用することができる。好ましくは、固体の基体は、有機ポリマー、金属、セラミックス、ガラス、および動物または植物の生物組織から成る群から選ばれる。
任意の天然または、人工的に調製された有機のポリマーを使用することができる。有機ポリマーは、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリ乳酸グリコール酸から成る群から選ぶことができる。
さらに、任意の固体金属を使用することができ、バイオマテリアルとして使用される場合には、最も好ましくはチタンが使用される。
リン酸カルシウムドット、アイランドあるいは薄膜の調製をするためのの基体の幾何学的形状に制限はない。プレート、管、立方体、コーン、カラムまたはそれらの複合体のような様々な構造、および電気的に荷電された固体またはされていない固体の表面に適用することができる。

Ｃ． リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の中で調製されたリン酸カルシウムグラニュール
本発明は、リン酸カルシウムコロイド溶液の温度を４０−１００℃に上げることにより、イオン溶液の中で調製されるリン酸カルシウムグラニュールを提供する。
反応温度が、その以下の温度ではリン酸カルシウムドット、アイランドあるいは薄膜が好ましく形成される温度よりも高い温度に上げられる場合、コロイド粒子が好ましく溶液の中で成長する。この温度においては、コロイド粒子は表面に付着せず、成長する。無定形相リン酸カルシウムコロイド粒子は、当初その無定形相を維持し、その後結晶性グラニュールに変換するので、本発明は無定形のグラニュールおよび結晶のグラニュールの両方を提供する。

グラニュールを得る温度は、イオン溶液の濃度またはｐＨに依存する。イオン溶液のｐＨかイオン濃度が高い場合、低温で十分である。グラニュールの相が無定形であるか、または結晶であるかは、イオン溶液の温度、濃度およびｐＨに依存する。
さらに、リン酸カルシウムグラニュールは、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液に過剰のカルシウムイオンあるいはリン酸イオンを加えることにより、あるいはアルカリ度を増加させることにより調製することができる。
図５は、サイズが２．５−３．５ミクロン（ｎ＝５０）であるリン酸カルシウム結晶のグラニュールの走査電子顕微鏡写真（×２，０００）である。
本発明のリン酸カルシウムグラニュールは球形である。したがって、それは広い表面積を持っている。高い表面反応性並びに有機分子および無機イオンに対する高い吸着性のようなリン酸カルシウムの他の特性を備えた大きな表面積は、ドラッグデリバリーあるいは物質分離へのリン酸カルシウムグラニュールの適用をもたらす。
以下の例において、本発明の好ましい実施態様が例示される。
しかしながら、当業者は本開示を考慮し、本発明の範囲内において変更及び改良をすることができる。

１． リン酸カルシウムイオン溶液の調製
実施例１ リン酸カルシウムイオン溶液１の調製
リン酸塩の４．０ｍＭを含んでいるリン酸塩緩衝溶液が調製された。そのｐＨは１ＮのＮａＯＨを加えることにより７．５に調節された。リン酸塩の４．０ｍＭを含んでいるリン酸塩緩衝溶液の２０ｍｌ中に、２００ｍＭのＣａＮＯ_３溶液の４００マイクロリットルが、２．５℃で、３００マイクロリットル／分の速度で加えられた。この時に、蠕動ポンプが混合速度をゆっくりコントロールするために使用された。リン酸イオンを含んでいるリン酸塩緩衝溶液は急速に撹拌され、カルシウムイオンを含む溶液が加えられている間に沈殿が形成されないようにした。溶液中の自発的な沈殿の形成がないことが、粒子アナライザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）によって測定された。使用されるまで、上記で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、２．５℃で貯蔵された。

実施例２ リン酸カルシウムイオン溶液２の調製
リン酸イオンの４．５ｍＭを含んでいるリン酸塩緩衝溶液が調製された。そのｐＨは１ＮのＨＣｌを加えることにより５．０に調節された。リン酸塩の４．０ｍＭを含んでいるリン酸塩緩衝溶液の２０ｍｌ中に、４５０ｍＭのＣａＮＯ_３溶液の２００マイクロリットルが加えられ、リン酸カルシウム酸性イオン溶液が調製された。２．５℃において、酸性イオン溶液のｐＨが１ＮのＮａＯＨで７．４まであげられた。蠕動ポンプが３００マイクロリットル／分でゆっくりとＮａＯＨを加えるために使用された。リン酸イオンとカルシウムイオンを含む酸性イオン溶液が急速に撹拌され、ＮａＯＨが加えられている間に沈殿が形成されないようにした。溶液中での沈殿の形成がないことが、粒子アナライザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）によって測定された。使用されるまで、上記で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、２．５℃で貯蔵された。

実施例３ リン酸カルシウムイオン溶液３の調製
リン酸塩緩衝液の代わりに、ｐＨ７．４のトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）−ＨＣｌ緩衝溶液が使用されたことを除き、リン酸カルシウムイオン溶液は実施例１と同じ条件によって調製された。

実施例４ リン酸カルシウムイオン溶液４の調製
Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２’−エタンスルホン酸］がＨＣｌの代わりに酸性溶液として使用され、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）がＮａＯＨの代わりにアルカリ溶液として使用されたことを除き、リン酸カルシウムイオン溶液は実施例２と同じ条件によって調製された。

実施例５ リン酸カルシウムイオン溶液５の調製
蒸留水２５０ｍｌに溶解された１７．７ｍｇのＣａ（ＮＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏの溶液、および蒸留水５００ｍｌに溶解された４０ｍｇの（ＮＨ_４）_２・ＨＰＯ_４、および１ｍｌの液体アンモニアを、手早く混合し、濾過し、凍結乾燥して、アパタイト結晶を調製した。４００ｍｇのアパタイト結晶を４０ｍｌの０．２ＭのＨＣｌに溶解し、カルシウムとリン酸のイオンを含んでいる酸性イオン溶液を調製した。酸性イオン溶液は、３０％（ｖ／ｖ）の比率で０．２Ｍ ＨＣｌで希釈した。ついでこの希釈された酸性イオン溶液は再度１：１．７（ｗ／ｗ）の比率でＰＢＳで希釈された。ついで、ＰＢＳで希釈されたイオン溶液は、１：１．７（ｗ／ｗ）の比率でＰＢＳで希釈された０．２ＮのＮａＯＨ溶液と混合された。このとき、混合された溶液のｐＨは７．６に調節された。ついで、酸性イオン溶液とＮａＯＨ溶液の混合の間に形成された無定形のリン酸カルシウム沈殿を、０．２マイクロメーターのサイズのフィルターで溶液を濾過して除去することにより、沈殿を含まない、中性のイオン緩衝溶液を得た。上記のすべての溶液の温度は４℃に維持された。使用されるまで、上記で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、４℃で貯蔵された。

実施例６ リン酸カルシウムイオン溶液６の調製
４．０ｍＭのリン酸イオンを含んでいるリン酸塩緩衝溶液が調製された。そのｐＨは１ＮのＮａＯＨを加えることにより７．５に調節された。２０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液に、４ｍＭのＣａＮＯ_３溶液の２０ｍｌが、２．５℃で、５００マイクロリットル／分の速度で加えられた。蠕動ポンプがゆっくりとした混合のために使用された。リン酸イオンを含んでいるリン酸塩緩衝溶液は急速に撹拌され、カルシウムイオンを含む溶液が加えられている間に沈殿が形成されないようにした。イオン溶液中での自発的な沈殿の形成がないことが、粒子アナライザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ、ドイツ）によって測定された。使用されるまで、上記で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、２．５℃で貯蔵された。

２． リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の調製
実施例７ リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の調製
実施例１において調製されたイオン溶液を、様々な温度および反応時間で加熱し、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液を調製した。
調製されたリン酸カルシウムコロイド粒子のサイズは、粒子アナライザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）によって測定され、表１に示された。

表１
反応温度と時間に依存するリン酸カルシウムコロイド粒子のサイズ。
（ｎｍ）（［Ｃａ×Ｐ］＝１６ｍＭ^２、ｐＨ ７．５）

表１の中で示されるように、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の温度がより高くなるとともに、およびより多くの時間が経過するとともに、粒径はより大きくなる。
別の実験として、異なるｐＨ条件の下で調製されたことを除き、実施例１と同じ方法によって調製されたイオン溶液を、１８℃で異なる時間加熱し、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液を調製した。
調製されたリン酸カルシウムコロイド粒子のサイズは、粒子アナライザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）によって測定された。

表２
種々の反応ｐＨと時間によるリン酸カルシウムコロイド粒子のサイズ。
（ｎｍ）（［Ｃａ×Ｐ］＝１６ｍＭ^２、１８℃）

上記の結果から、イオン溶液中のリン酸カルシウムコロイド粒子の形成および成長が、低いｐＨ条件では遅れ、高いｐＨ条件で加速されることが示される。

実施例８ リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の調製、および固体の基体への接着能力の測定
リン酸イオンとカルシウムイオンを含む溶液の濃度は、それぞれ８．２ｍＭおよび４．０ｍＭにセットされ、リン酸カルシウムイオン溶液は例１と同じ方法で調製された。調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、３０分間、１８℃に加熱され次に、ついで４℃に冷却された。次にそれは同量の４℃で維持されたコロイド粒子を含有しない別のイオン溶液と混合された。その後、透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッド上に形成されたフォームバーフィルムが、混合イオン溶液の表面の上に浮かされ、３０分間４℃でそれを維持した。その後、フォームバーフィルムを蒸留水で洗浄し、フォームバーフィルムにリン酸カルシウムコロイドが付着していることが見いだされた。それは、リン酸カルシウムが表面に付着する能力を持っていることを示している。（図１）

３． 固体の基体上に適用されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液
実施例９ リン酸カルシウムドット１の調製
実施例５において調製されたリン酸カルシウムイオン溶液は、細胞培養のためにペトリ皿（コーニング社、米国）へ注がれた。温度を３７℃に上げ、その温度に１０分間保持し、リン酸カルシウムのドットを調製した。

実施例１０ リン酸カルシウムドット２の調製：
工程１：無定形のリン酸カルシウムドットの調製
透過型電子顕微鏡のためのフォームバーフィルムで覆われたニッケルグリッドが、実施例６で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液の上に、１８℃で１２０分浮かされ、無定形のリン酸カルシウムのドットを得た。
グリッドは、１５、３０、６０および１２０分でそれぞれ採取され、フォームバーフィルムが透過型電子顕微鏡によって観察された。
図２は、１２０分で採取されたグリッド上で検討された無定形のリン酸カルシウムのドットの透過電子顕微鏡写真を示す。
工程２：無定形リン酸カルシウムドットの結晶への変換
工程１で調製された透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッド上を覆うフォームバーフィルム上の無定形のリン酸カルシウムのドットを、再びイオン溶液の表面に浮かせ、３時間１８℃で維持した。リン酸カルシウムのドットが結晶に変換していることが観察された。図３は、無定形のリン酸カルシウムのドットの結晶への変換の透過電子顕微鏡写真を示す。
工程３：リン酸カルシウム結晶アイランドの調製
工程１で調製された透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッド上の無定形のリン酸カルシウムのドットは、イオン溶液の表面に浮かされ、６時間、１８℃で維持された。リン酸カルシウムドットは結晶に変換され、結晶のアイランドへ成長した。
図４は、リン酸カルシウム結晶の結晶のアイランドの透過電子顕微鏡写真である。

実施例１１ リン酸カルシウムの薄膜１の調製
実施例５において調製されたイオン溶液は、ペトリ皿（コーニング社、米国）へ注がれ、２日間、８℃でインキュベートされ、リン酸カルシウムの薄膜を形成した。

実施例１２ リン酸カルシウムの薄膜２の調製
透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッド上を覆うフォームバーフィルムが、実施例６で調製されたイオン溶液の表面上に浮かされ、１２時間、１８℃に維持され、リン酸カルシウム薄膜を調製した。
図５は、透過型電子顕微鏡を使用した、リン酸カルシウムの薄膜の写真である。

４． 溶液相で適用されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液
実施例１３ リン酸カルシウムグラニュール１の調製
実施例５において調製されたリン酸カルシウムイオン溶液を、ポリカーボネート容器へ注ぎ、５℃／分の速度で温度を６０℃まで上げ、リン酸カルシウムグラニュールを含む溶液を調製した。その後、リン酸カルシウムグラニュールをイオン溶液の遠心分離により集め、ついで蒸留水で洗浄した。グラニュールは、透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッド上に形成されたフォームバーフィルム上で乾燥され、走査電子顕微鏡で観察された（図６）。
リン酸カルシウムグラニュールは最初の加熱では無定形であり、時間の経過とともにリン酸カルシウム結晶のグラニュールに変換された。

実施例１４ リン酸カルシウムグラニュール２の調製
実施例６で調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を使用したことを除き、実施例１３と同じ方法でリン酸カルシウムグラニュールを調製した。

実施例１５ リン酸カルシウムグラニュール３の調製
実施例１で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液１ｍｌに、４００ｍＭのカルシウムイオン１００マイクロリットルが加えられ、リン酸カルシウムグラニュールを含む溶液を得た。リン酸カルシウムグラニュールを溶液の遠心分離により集め、蒸留水で洗浄した。リン酸カルシウムグラニュールは、透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッドを覆うフォームバーフィルム上にマウントされ、乾燥後、走査電子顕微鏡により観察された。無定形相のリン酸カルシウムグラニュールが観察された。したがって、無定形相のグラニュールが、加熱することなく、リン酸カルシウムイオン溶液から直接得られた。

実施例 １６ リン酸カルシウムグラニュール４の調製
実施例１において調製されたリン酸カルシウムイオン溶液に、ＮａＯＨを加えてｐＨ１０にすることにより、リン酸カルシウムグラニュールを含むイオン溶液が調製された。その後、リン酸カルシウムグラニュールは溶液の遠心分離により集められ、蒸留水で洗浄された。リン酸カルシウムグラニュールは、透過型電子顕微鏡用のニッケルグリッドを覆うフォームバーフィルム上にマウントされ、乾燥後、走査電子顕微鏡により観察された。無定形相のリン酸カルシウムグラニュールが観察された。したがって、無定形相のグラニュールが、加熱することなく、リン酸カルシウムイオン溶液から直接得られた。

実験例１ リン酸カルシウムドット上の細胞接着テスト
実施例９において調製されたリン酸カルシウムドットの生物学的適合性を測定するために、細胞接着テストが行われた。
ＭＧ６３骨芽細胞（ＡＴＣＣ）が、リン酸カルシウムアパタイトの結晶のドットがあらかじめ形成されたペトリ皿内に置かれた。細胞は、９５％の空気および５％のＣＯ_２が供給されたＣＯ_２インキュベーターにおいて、３７℃で培養された。６日後に、ペトリ皿の表面が位相差顕微鏡（×２００）によって観察された。
図７の中で示されるように、実施例９と同じ方法によりあらかじめ形成された高密度のリン酸カルシウムドットの上に、細胞はよく付着し、いくつかの層へ増殖した。結果として、本発明中のリン酸カルシウムの結晶のドットが生物学的適合性を持っており、バイオマテリアルとして使用することができることが確認された。

実験例２ リン酸カルシウム薄膜の金属イオン除去試験
リン酸カルシウム薄膜を、実施例１２と同じ方法によって、４ウエル細胞培養皿の上に調製した。その後、３．１１マイクロｇ／ｍｌの亜鉛、あるいは０．８１マイクロｇ／ｍｌのアルミニウムを含むイオン溶液の１ｍｌをウエルに注ぎ、２４時間維持した。その後、イオン溶液中に残留している亜鉛イオンまたはアルミニウムイオンの濃度が測定された。
２４時間後、リン酸カルシウムの薄膜上のイオン溶液中で、０．０３５マイクロｇ／ｍｌの亜鉛イオンが検出され、またアルミニウムイオンは全く検知されなかった。結果として、本発明のリン酸カルシウム薄膜は、重金属イオン溶液から重金属を取り除く高い能力を有していることが確認された。

実験例３ リン酸カルシウムグラニュールの無機イオン吸収試験
実施例１３において調製されたリン酸カルシウムグラニュールの表面の反応性を測定するために、フッ素イオンを用いた以下の試験が行なわれた。
実施例１３において調製されたリン酸カルシウム結晶グラニュールを含む溶液の０．５ｍｌ中に、４１．９９ｐｐｍのＮａＦが加えられた。混合物は３７℃で１時間反応させられた。その後、結晶グラニュールは１０００×ｇで１分間、遠心分離により集められ、蒸留水により３回洗浄された。結晶グラニュールへ結合したフッ素の量は、０．１ＮのＨＣｌの中に結晶グラニュールを溶かした後に、フッ素測定電極（コーニング社、米国）によって決定された。
結果として、リン酸カルシウムの結晶のグラニュールに付着したフッ素（Ｆ⁻）は、３８．８３ｐｐｍだった、それは、９２％の高い吸収率を示した。

実験例 ４ リン酸カルシウムグラニュールの有機分子吸収試験
例１３において調製されたリン酸カルシウムグラニュールの有機分子への表面の反応性を決定するために、アルブミンを使用して、次の試験が行なわれた。
１００マイクロｇ／ｍｌのアルブミンを、実施例１３において調製されたリン酸カルシウムグラニュールを含んでいる溶液の１ｍｌに加えた。混合物は３７℃で１時間反応させられた。その後、結晶グラニュールは１０００×ｇで１分間、遠心分離により集められ、蒸留水により３回洗浄された。結晶グラニュールに吸収されたアルブミンの量は、タンパク質分析キット（バイオ−ラド、米国）を使用して、比色法によって決定された。
結果として、リン酸カルシウム結晶グラニュールに吸収されたアルブミンの量は、１．１マイクログラムであった。したがって、リン酸カルシウム結晶グラニュールの表面が有機分子に対する反応性を持っていることが確認された。

産業上の利用可能性
上に述べられたように、本発明は従来過飽和されたリン酸カルシウムイオン溶液で形成されていたリン酸カルシウム沈殿を除去するためのろ過あるいは遠心分離の必要なく、リン酸カルシウムイオン溶液を大量生産する方法を提供する。これは、イオン溶液を低温で調製するとともに、添加されるイオンを迅速に拡散させて沈殿を引き起こす局所的な蓄積を防止することにより、リン酸カルシウム化合物の自発的な沈殿を防止するか遅らせることにより達成された。
第２に、本発明は、カルシウムおよびリン酸イオン溶液から調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を提供する。本発明は、さらにカルシウムおよびリン酸コロイドイオン溶液から調製された無定形または結晶相のドット、アイランド、薄膜を提供し、それはバイオマテリアルとして使用することができる。
第３に、非連続的に散在されたリン酸カルシウムのドット、またはアイランドの第１の表面、およびリン酸カルシウムのドット、またはアイランドの間に暴露される基体自身の表面として細胞に２元的に露出されるバイオマテリアル表面を提供し、これは細胞の付着を促進する。
第４に、本発明はリン酸カルシウムコロイドイオン溶液から調製された、リン酸カルシウム薄膜を提供し、これはバイオマテリアル、重金属を除去するフィルター、または脱臭剤として使用することができる。
第５に、本発明はコロイド粒子を大きなグラニュールに成長させ、無定形のリン酸カルシウムグラニュールを結晶のリン酸カルシウムグラニュールに変換することにより、イオン溶液中で調製される無定形または結晶のリン酸カルシウムグラニュールを提供する。
第６に、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液中で調製されるリン酸カルシウムグラニュールは、薬品または細胞デリバリーのためのキャリヤー、および質量分離のためのフィルターとして使用することができる。

図１は、ドットとして基体に付着しているリン酸カルシウムコロイドの透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。これはイオン溶液にリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を加えた後、低温で、コロイドを含まないリン酸カルシウムイオン溶液上に置かれたフォームバーフィルム上で観察された。 図２は、本発明のリン酸カルシウム無定形相のドットの透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。 図３は、結晶に変換される本発明のリン酸カルシウムの無定形相のドットの透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。 図４は、リン酸カルシウムの無定形相のドットから変換され成長した結晶のアイランドの透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。 図５は、リン酸カルシウム結晶アイランドから成長した本発明のリン酸カルシウム薄膜の透過電子顕微鏡写真（×１００，０００）である。 図６は、本発明のリン酸カルシウムグラニュールの走査電子顕微鏡写真（×２，０００）である。 図７は、本発明のリン酸カルシウムドット材料上で培養された骨芽細胞セルラインの位相差顕微鏡写真（×２００）である。

Claims (24)

1. １）ｐＨ６.０−１０.０の、リン酸イオンを含むイオン溶液を調製する工程；
   ２）ｐＨ６.０−１０.０のカルシウムイオンを含むイオン溶液を調製する工程；および
   ３）１）のイオン溶液と２）のイオン溶液を０−２０℃で混合してｐＨ６.０−１０.０のリン酸カルシウムイオン溶液を調製する工程、を含み
   リン酸イオンを含むイオン溶液中のリン酸イオンの濃度が１−２５ｍＭであり、カルシウムイオンを含むイオン溶液中のカルシウムイオンの濃度が１−２５ｍＭであり、リン酸カルシウム溶液中のリン酸イオンとカルシウムイオンのイオン濃度の積が１−６４ｍＭ ^２ である、リン酸カルシウムイオン溶液の調製方法。
2. 撹拌方法又は機械的方法を使用して少量を分配することにより混合溶液がゆっくりと加えられる方法から選択される方法を使用して工程３）が行われる、請求項１記載の方法。
3. ｐＨが無機酸、有機酸、またはそれらの混合物により調節される、請求項１記載の調製方法。
4. 無機酸が、ＨＣｌ、ＨＢｒ，Ｈ_２ＳＯ_４，Ｈ_３ＰＯ_４，ＨＮＯ_３，Ｈ_２ＣＯ_３，ＨＣｌＯ_４およびＨ_３ＢＯ_３からなる群から選択され、有機酸がＮ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ’−[２−エタンスルホン酸]、Ｎ−トリス[ヒドロキシメチル]メチル−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、（３−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、および酢酸からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
5. ｐＨが、無機塩基、有機塩基、またはそれらの混合物により調製される、請求項１記載の方法。
6. 無機塩基がＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ，Ｃａ(ＯＨ)_２、Ｍｇ(ＯＨ)_２、およびＮＨ_４ＯＨからなる群から選択され、有機塩基がトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン、ビス[２−ヒドロキシエタン]アミノとリス[ヒドロキシメチル]メタン、１，３−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンからなる群から選択される、請求項５記載の方法。
7. 請求項１記載の方法により調製されたリン酸カルシウムイオン溶液を０−６０℃に保持することを含む、リン酸カルシウムイオン溶液中で調製された、1ｎｍ−１０００ｎｍのサイズのコロイド粒子を含有する、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の調製方法。
8. １）ａ）カルシウム塩とリン酸塩を酸性溶液中に溶解し、カルシウムイオンとリン酸イオンの溶液を調製する工程；
   ｂ）工程ａ）で調製されたカルシウムイオンとリン酸イオンの酸性溶液を０−３７℃でアルカリ性溶液と混合する工程、および
   ｃ）上記工程で調製された溶液中の無定形リン酸カルシウムのグラニュ−ルまたは結晶を除去し、リン酸カルシウムイオン溶液を調製する工程、
   ２）工程１）で調製されたリン酸カルシウムイオン溶液を０−６０℃で保持することを含む、リン酸カルシウムイオン溶液中で調製された、1ｎｍ−１０００ｎｍのサイズのコロイド粒子を含有する、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液の調製方法。
9. 請求項７または８記載の方法により調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を、固体の基体の上に、１−６０℃で注ぐことにより調製される、ドットまたはアイランドを含む物質の調製方法。
10. ドットまたはアイランドのサイズが５ｎｍ−１５，０００ｎｍである、請求項９記載の調製方法。
11. ドットまたはアイランドが無定形、結晶またはそれらの混合物である、請求項９記載の調製方法。
12. 固体基体が有機ポリマー、金属、セラミック、ガラスおよび動物または植物の生物組織からなる群から選択される、請求項９記載の調製方法。
13. 請求項７または８記載の方法により調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液を、固体基体の上に、１−６０℃で注ぐことにより調製される、ドットまたはアイランドを含む物質。
14. ドットまたはアイランドのサイズが５ｎｍ−１５，０００ｎｍである、請求項１３記載の物質。
15. ドットまたはアイランドが無定形、結晶またはそれらの混合物である、請求項１３記載の物質。
16. 固体基体が有機ポリマー、金属、セラミック、ガラスおよび動物または植物の生物組織からなる群から選択される請求項１３記載の物質。
17. 請求項７または８記載の方法により調製された、リン酸カルシウムコロイドイオン溶液を固体基体の上に、１−６０℃で注ぎ、イオン溶液を保持し、ドットまたはアイランドを十分に成長させ、融合させることにより調製される薄膜の形成方法。
18. 薄膜が無定形、結晶またはそれらの混合物である、請求項１７記載の形成方法。
19. 固体基体が有機ポリマー、金属、セラミック、ガラスおよび動物または植物の生物組織からなる群から選択される、請求項１７記載の形成方法。
20. 請求項１３記載の物質を含む、重金属を除去するためのフィルター。
21. 請求項１３記載の物質を含む、脱臭剤。
22. 請求項７または８記載の方法により調製されたリン酸カルシウムコロイドイオン溶液の温度を４０−１００℃に上げる工程を含む方法により溶液中でリン酸カルシウムのグラニュールを調製する、リン酸カルシウムのグラニュールの調製方法。
23. リン酸カルシウムグラニュールの直径が５ｎｍ−５，０００ｎｍである、請求項２２記載の調製方法。
24. リン酸カルシウムコロイドイオン溶液に過剰のカルシウムイオンまたは過剰のリン酸イオンを加えるか、またはコロイドイオン溶液のアルカリ度を大きくすることによりグラニュールが調製される、請求項２２記載の調製方法。

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