JP4572003B2 - 自然老化または老化亢進性（日光皮膚炎、汚染）の際の、瘢痕化、保湿化および皮膚外観改良用のペプチドの化粧品としてのまたは皮膚薬品としての使用 - Google Patents

Description

【０００１】
老化、とりわけ肌のそれは、内奥組織の生化学的乱れを引き起こし、それは、通常、醜いと判断されている、肉眼で見える変調により具体化し、女性も男性もそれを絶えず気にかけてきた。
【０００２】
天然の太陽のＵＶ、または、ビューティーサロンの人工的なＵＶによる日焼けの探求は、日光皮膚炎（C. Musy-Prenault博士、(１９９４）Les Maladie de la peau, Albin Michel ed., Paris）の名で皮膚科医にはよく知られている皮膚の老化のプロセスの原因となっている。
【０００３】
我々の現在の生活における要素、例えば、汚染の物理的および化学的有害作用、アルコールやタバコの摂取は、老化のプロセスを助長し、深刻化する。
【０００４】
また、私的または職業生活において、生体の外界に対する最初の累壁である肌はその無傷であることを、切り傷、火傷、炎症反応などの、数多くの一時的な有害作用に、脅かされている。その損害を直すために、生体は、複雑で互いに錯綜し合った、一連の反応：瘢痕化を発展させてきた。
【０００５】
化粧品産業は、常に、一般的な老化の影響に相反すること、および／または、皮膚の瘢痕化を助長することのできる新成分の探求にある。
【０００６】
そのために、可能なアプローチの１つは、肌を構成する異なる要素の新合成により、組織の再構築を助長することから成る。壁においてレンガの付着を保証し、それに耐久性を与えるセメントのように、様々なタイプのコラーゲンおよびその他のムコ多糖は、肌の組織を構成する要素である。
【０００７】
これらの分子の合成および取込みを助長することは、絶対に必要であるが、それだけでは十分ではない。瘢痕化のメカニズムが持続する修理を行うことができる良い基盤を与えることによって、土壌をつくることもしなければならないのである。上記に記載された状況において、この基盤は、細胞外基質であり、上皮と結合組織とのインターフェースに位置する際に基底膜の名をとる。細胞外基質の改良または再構成は、必要不可欠である、なぜなら、この構造が、“組織の物理的構造を安定させる骨組みの役割”を果たすだけではなく、それが、“その接触にある細胞の反応の調節において、それらの発展、移動、増殖、形状および機能に影響する役割を果たす（Biologie Moleculaire de la Cellule, 3eme ed. Medecine-Sciences, Flammarion, Paris, page 972）。
【０００８】
したがって、我々は、この細胞外基質の２つの主な構成物：コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓの名においても知られている）に特に関心を寄せるのである。
【０００９】
本特許の枠内において、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンにおける老化の影響は次によって要約されることができる：
−線維芽細胞によるこれらの分子の合成の減少、２つの原因の結合による減少：年齢によるこれらの生産者細胞の更新率が低下すること、また、これらの細胞によって分泌される分子の量も同様に、低下すること。
【００１０】
コラーゲンが皮膚のたんぱく質のおよそ８０％を占めることを知っていれば、その組織の濃度のどんなに微小な減少も肌の力学的および生理学的特性に重要な結果をもつことができることを理解するのは容易である。
【００１１】
グリコサミノグリカンは、大量の水分を固定することができる。その組織の濃度の低下は、したがって、肌の脱水化を引き起こすのである。
【００１２】
−繊維の網状化、したがって、その硬化に導く、新合成された分子の構造的変質の発生。
【００１３】
コラーゲンに関しては、α鎖の変動はその様々な形状の分布を変化させる。例えば、タイプＩＶのコラーゲンが基底膜において蓄積される時、タイプＩＩＩのコラーゲンの比率は、表皮において、増加する。また、酵素性であろうとなかろうと（メイヤード反応の一種）、２つのコラーゲン繊維、または、コラーゲン自体とグルコース分子との間に、いわゆる、交差結合を発生させ、このようにして、コラーゲン繊維の網を硬化させる、反応の発生が確認される。
【００１４】
老化は、グリコサミノグリカンにおいては、その多糖類鎖の不完全な合成、および、その硫酸化の減少によって、表われる。コラーゲンにおいてよりもさらに、酸素のラジカル形状がＧＡＧｓを不可逆的に劣化させる。
【００１５】
肌は、したがって、その構成要素の量の減少により、その実体を失い、コラーゲン繊維の弾力性の喪失およびその脱水化によって、硬化する。
【００１６】
これらすべてが、加齢した肌にその特徴的外見：乾燥、柔軟性の欠如、敏感さ、もろさ、ある程度多数で、多かれ少なかれ深いしわ、を与えることになる。
【００１７】
瘢痕化は、一方で、組織の塊を再構成、したがって、造らなければならないので、少なくとも部分的に、類似の必要に訴える；このことは、局部的に、皮膚の様々な構成要素の合成の増大をともなうことになる。
【００１８】
このように、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの合成を局部的に増加させる１つまたは複数のプロセスを誘発することのできるあらゆる生成物は、はやさにおいても、そして、美的にも結果の質においても、老化による皮膚の傷痕を減少させることを望むすべての人、並びに、瘢痕化を改良することを望む人によって探求されている効果を獲得することを可能にするであろう。
【００１９】
この特許出願の対象である本発明は、我々が先の基準に応える製品を開発したこと、および、高度な科学的テストによって、生体外および生体内におけるその有効性を証明したことに存するものである。
【００２０】
細胞培養において、ペプチドＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒが構成するコラーゲンＩのＣ−末端の断片によってコラーゲン合成が（生体外で）増進されることができることは知られている（Katayama K. et al., Journal of Biological Chemistry (1993), 259:9941-9944）。
【００２１】
また、植物抽出物によって、皮膚のグリコサミノグリカンの合成を増加させることも可能である（例えば、ネズミにおいて：Chithra P. et al., Journal of Ethnopharmacology (1998), 59:179-186）。
【００２２】
我々の特許出願は、
・Ｘが、ＤまたはＬの形の塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、シトルリン、サルコシン、スタチン）を表し、
・（ＡＡ）_nが、０から５までの変数であるｎにおいて、ｎ個の天然またはそうでないアミノ酸のつながりを表し、
・Ｒ₁が、Ｈまたは、２から２２の炭素の、ヒドロキシル基を含んだ、または含まない、飽和した、またはしていない、線状のまたは分枝した、硫黄を含んだ、または含まない、環状の、またはそうでない、脂肪酸の鎖、または、ビオチニル基、あるいは、ペプチド合成に用いられるウレタンタイプの保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、テルブチルオキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）を表し、
・Ｒ₂および／またはＲ₃が、水素原子Ｈ、または、炭素が１から２２の、ヒドロキシル基を含んだ、または含まない、飽和した、またはしていない、線状のまたは分枝した、硫黄を含んだ、または含まない、環状の、またはそうでない、脂肪族または芳香族の鎖であるときにおいて、Ｙ＝ＯＲ₂またはＮＲ₂Ｒ₃であるときの、
Ｒ₁＝ＨおよびＸ＝ＬｙｓおよびＹ＝ＯＨ、（ＡＡ）_n＝Ｓｅｒでｎ＝０またはｎ＝１であるときのペプチドを除く、
一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−（ＡＡ）_n−Ｙのペプチドおよびその塩が、単独でまたは互いに組み合わせて、生体内に局所的に投与されるとき、したがって、化粧品によって高めるアプローチにおいて、コラーゲンの相伴的合成および糖アミノグリカンのそれを大幅に増加させることができること、および、そのことによって、観察された結果がこれらの効果のそれぞれを加算したものから望むことのできたものを超えているために、相乗作用を得ることができることの発見に存する。
【００２３】
実際、新規に形成されるコラーゲン繊維は、新規に合成された基底膜のグリコサミノグリカンの網に直ちに付着する；このように皮膚の再生プロセス並びに組織の保湿の平均水準を加速しながらである。
【００２４】
この観点において有利に用いられるペプチドは、ｎ＝１、Ｒ₁が２から２２の炭素の脂肪酸の鎖であり、ＹがＯＨまたはＮＨ₂、より厳密には、Ｘ＝リジン、（ＡＡ）_n＝セリン、Ｒ₁＝パルミトイル基およびＹ＝ＯＨであることによって特徴づけられることができる。
【００２５】
この特許出願の対象である、ペプチドは、従来の化学合成（不均質相で、あるいは、均質相で）によって、または、構成要素であるアミノ酸またはその派生物からの酵素合成（Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 255, 8234）によって獲得される。
【００２６】
ペプチドのサイズの小ささは、工業的合成を有利なコストで行うことを可能にする。証明されたその偉大な活動は、財政的に容認される数多くの化粧品または皮膚薬品における商業的使用を認めるものである。
【００２７】
ペプチドは、その求められるシーケンスまたはその様々な断片を生成するために、遺伝子工学的に操作された、またはされていない、バクテリアの株の発酵によってもまた、獲得される。
【００２８】
最後に、ペプチドは、平均サイズが３００から２０００ダルトンの間に含まれる問題のペプチドの断片（シーケンスＸ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−（ＡＡ）、好ましくは、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）を放出する、これは、これらのシーケンスをその構造の中に含むことの可能な植物において、放出される断片が先のペプチドのシーケンスに対応するという規定のもとにであるが、酵素性の、またはそうではない、制御された加水分解をされる、その構造の中にこれらのシーケンスを含むことのできる、動物性または植物性の、好ましくは植物性の、タンパク質抽出によって獲得されることができる。案配された加水分解によって、これらのペプチドの断片を取り払うことが可能になる。
【００２９】
本発明を実現するために、まず関与するタンパク質を抽出してそれから加水分解する、または、まず粗抽出物に加水分解を行ってから、次に、ペプチド断片を浄化することが可能であるが、必要ではない。問題のペプチド断片を抽出せずに加水分解生成物を使用することもできるが、それはやはり、タイミング良く、加水分解の酵素反応の停止、および、適切な分析手段（放射能による予熱、特殊な抗体での蛍光抗体法または免疫没降法、など）によって問題のペプチドの存在を配合することを確実なものにしてである。
【００３０】
より単純なまたはより複雑な、より安価なまたはより純度の高い生成物へと導く、他の方法は、タンパク質およびペプチドの抽出および精製の方法を知っている専門家によって、容易に検討されうる。
【００３１】
本発明を説明する例として、いくつかの代表的な、しかし本発明を限定するものではない、化粧品の処方を挙げる：
【００３２】
【表１】

【００３３】
【表２】

【００３４】
この出願の初めに記載されている活動は、以下の例によって説明される。
【００３５】
例３：コラーゲン合成の増加：生体外
選択された方法は、人間の肺の線維芽細胞の代わりに人間の肌の体外培養組織を用いた点において、Augustin C. et al. (Skin Pharmacol. (1997);10:63-70)によって記載されたそれの変型であり、それは、我々の結果が直接に化粧品研究に利用できるためにである。
【００３６】
乳房または腹部の形成に由来するこれらの体外培養組織は、７２時間、ペプチドＮ−パルミトイル−サルコシン−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒとともに、³Ｈ−プロリンの存在下で、培養環境において３つの最終的濃縮物として（２×１０^-4％、４×１０^-4％および８×１０^-4％；すなわち、２、４および８ｐｐｍ）、インキュベートされる。体外培養組織は、その後、洗浄され、それぞれの体外培養組織の真皮および表皮は、分離され、均質化され、溶解される。³Ｈ−プロリンの取込みの測定は、そこで、それぞれの細胞溶解産物において実現される。試験は三重反復で行われる。
【００３７】
並行して、同じ条件において、しかし、ペプチドはなしで、陰性検査が行われる。対して、陽性検査の方は、テストされたペプチドをビタミンＣにおき替えて、行われる。
【００３８】
２、４または８ｐｐｍのペプチドの存在下において、コラーゲンの合成を示す³Ｈ−プロリンの取込みは、それぞれ、３０．２（±２）％、５４．７（±５）％および９０．９（±５）％だけ、対照実験（ペプチドなし）において確認されたものに対して、増加している。
【００３９】
同じ条件において、参考生成物、０．５ｍＭの濃度のアスコルビン酸は、６１．４（±５）％だけ、コラーゲンの合成を増加させる。
【００４０】
例４：グリコサミノグリカンの合成の増加：生体外
例３のそれと同じプロトコルが用いられるが、第一に、インキュベーションが、³Ｈ−プロリンの代わりに³Ｈ−グリコサミンの存在下において実現され、また、ビタミンＣの代わりに、参考生成物として酸性ビタミンＡが用いられる。
【００４１】
２、４または８ｐｐｍのペプチドＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａの存在下において、ＧＡＧｓの合成を示す³Ｈ−グリコサミンの取込みは、それぞれ、２４．５（±３）％、４８．８（±３）％および６７．９（±５）％だけ、対照実験（ペプチドなし）において確認されたものに対して、増加している。
【００４２】
同じ条件において、参考生成物、１００ｎＭの濃度の酸性ビタミンＡは、４５．３（±２）％だけ、ＧＡＧｓの合成を増加させる。
【００４３】
これら２つの例において獲得された結果は、細胞外基質の２つの構成要素の合成に対するペプチドの濃度に依存した効果を明確に証明している。
【００４４】
例５：皮膚の引締め活動：生体外
２４時間、同じ細胞培養に由来する人間の線維芽細胞が、検査のために、追加された、またはされていない標準培養環境のもとに、異なるペプチド濃度（２、４および８ｐｐｍ）で置かれる。
【００４５】
タンパク質合成の刺激は、比色定量（いわゆるビウレット反応）によって評価される。
【００４６】
結果を標準化するために、測定されたタンパク質の量は、テストにおいて存在する１０００細胞について表される。
【００４７】
２、４および８ｐｐｍのペプチドＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒの存在下における検査実験に対して、タンパク質濃度の増加は、それぞれ、１４．７（±１．０）％、２１．０（±２．４）％および４４．８（±１．０）％である。
【００４８】
このように、この生体外での試験は、濃度に依存した、ペプチドの皮膚レベルでの、引締めおよび極度に薄い肌の厚みづけに直接関わる効果である、増進する潜在能力を証明している。
【００４９】
例６：シワ防止活動：生体内
この例は、年齢３５から６３歳までの、成人女性の志願者から成る調査対象において、生体内で、獲得されたシワ防止効果を示すものである。０．００５％（つまり、５０ｐｐｍ）の濃度でＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒを含む、例２のクリームのシワ防止力が、プラシーボのクリーム（同じクリームであるが有効成分なし）のそれに比較される。クリームは、右または左の目じりにおいて厳密に決められた部位に、無作為化された割当てで、１日２回、２８日間塗布される。考慮されるパラメータは、目の周囲の皮膚の起伏である（ガチョウの足跡と呼ばれるシワ）。起伏の異なる変数の数量化が、Corcuff et al. (1985, Int. J. Cosm. Sci.7:117-126)およびCorcuff et al. (1995, in Handbook of non-invasive methods and the skin, Serup & Jemec eds., CRC Press:89-96)によって説明されているプロトコルによる肌の表面において取られたシリコンの痕の画像コンピュータ分析によって実現される。
【００５０】
下の表は、パーセントで、主要なシワの平均深度（列Ａ）に関して、また、たるみの全体（列Ｂ）について；主要なたるみの集中度（列Ｃ）、並びにきめの粗さの測定に関して（列Ｄ）、Ｔ＋２８日とＴ０の間で獲得される平均値の差を示している。
【００５１】
【表３】

【００５２】
先に記載されたＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒを含むクリームは、この表示において従来用いられている４つのパラメータの全体において、生体内での研究の初めと終わりの間において大きな差が観察されるから、明確に強いシワ防止効果を証明している。
【００５３】
同じ実験条件において、プラシーボのクリームがＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒが含まれていないので、いかなる効果も有さず、そのことが、この特許の対象となるペプチドに対してのみ、観察された有益な効果が帰されることを確かに証明することに注意するべきである。
【００５４】
これらのペプチドを互いに組み合わせて用いることは、特に有利である。
【００５５】
この特許のペプチドは、化学合成によって、酵素の経路によって、発酵によって、植物系タンパク質の抽出によって、均質相または非均質相での従来のペプチド合成によって、または構成要素であるアミノ酸からの酵素合成によって、獲得されることができる。
【００５６】
この特許のペプチドは、加水分解をされる、酵素性の、または酵素性でない、その放出された断片の一部はシーケンスＸ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−（ＡＡ）_n、好ましくは、シーケンスＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒを含む、平均サイズが３００から２０００ダルトンの間に含まれるペプチド断片を発生させるような、植物タンパク質の抽出によって獲得されることができる。
【００５７】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、０．１から１０００ｐｐｍ（重量で）の間で、好ましくは、１から１００ｐｐｍ（重量で）の間で変動する濃度で、化粧品または皮膚薬品製品において用いられることができる。
【００５８】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、溶液、分散、エマルジョンで、または、大、小、あるいは微小カプセルのような媒介、リポソームまたはカイロミクロンにおいてカプセル化された形で、あるいは、大、小、あるいは微小カプセル、または、マイクロスポンジに含まれた形で、または、粉末有機ポリマー、タルク、ベントナイトまたは他の無機質媒体に吸収された形で、用いられることができる。
【００５９】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、あらゆる生薬の形：Ｏ／ＷおよびＷ／Ｏエマルジョン、ミルク、ローション、ゲル化および粘性、界面活性剤のおよび乳化ポリマー、ポマード、ヘアローション、シャンプー、石鹸、粉末、スティックおよびペンシル、スプレー、ボディーオイルで使用されることができる。
【００６０】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、通常用いられているその他一切の成分：抽出および／または合成脂質、ゲル化および粘性、界面活性剤のおよび乳化ポリマー、水溶性または脂溶性の主な有効成分、植物抽出物、組織抽出物、海洋抽出物、紫外線防止剤、酸化防止剤とともに使用されることができる。
【００６１】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、瘢痕化、保湿化を促進するための、すべての、とりわけ、シワの形成および深刻化に対する、および、自然な、または加速された（日光皮膚炎、汚染）肌の老化のすべての結果に対する、肌のケアのための、化粧品への応用において使用される。
【００６２】
この特許のペプチドは、単独で、または互いに組み合わせて、並びに、それらを含む化粧品および皮膚薬品組成物は、瘢痕化、保湿化を促進するための、そしてすべての、とりわけ、シワの形成および深刻化に対する、および、自然な、または加速された（日光皮膚炎、汚染）肌の老化のすべての結果に対する、肌のケアのための、薬品の調合のために使用される。

Claims (13)

1. ・Ｒ_１がパルミトイル基であり、ＹがＯＨ基であることを特徴とする、一般式Ｒ _１ −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｙのペプチドおよびその塩。
2. 請求項１に記載のペプチドおよびその塩を、単独で、または互いに組み合わせて用いた、化粧品または皮膚薬品組成物。
3. ペプチドが、化学合成によって、酵素の経路によって、発酵によって、または植物系タンパク質の抽出によって、獲得されることを特徴とする、請求項２に記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
4. ペプチドが均質相もしくは非均質相でのペプチド合成によって、または構成要素であるアミノ酸もしくはそれらの派生物からの酵素合成によって、獲得されることを特徴とする、請求項３に記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
5. ペプチドが、植物タンパク質の抽出と、その後の、酵素性の、または酵素性でない、その放出された断片の一部がシーケンスＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒを含む、平均サイズが３００から２０００ダルトンの間に含まれるペプチド断片を発生させるような加水分解とによって獲得されることを特徴とする、請求項３または４に記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
6. ペプチドが、０．１から１０００ｐｐｍ（重量で）の間で変動する濃度で用いられることを特徴とする、請求項３から５のいずれか１つに記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
7. ペプチドが、１から１００ｐｐｍ（重量で）の間で変動する濃度で用いられることを特徴とする、請求項６に記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
8. ペプチドが、溶液、分散、エマルジョンの形で、あるいは、マクロカプセル、マイクロカプセル、もしくはナノカプセルのような媒介、リポソームまたはカイロミクロンにおいてカプセル化された形で、あるいは、マクロ粒子、マイクロ粒子、もしくはナノ粒子、または、マイクロスポンジに含まれた形で、あるいは、粉末有機ポリマー、タルク、ベントナイト、および他の無機媒体に吸着された形で用いられることを特徴とする、請求項３から７のいずれか１つに記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
9. ペプチドが、Ｏ／ＷおよびＷ／Ｏエマルジョン、ミルク、ローション、ゲル化剤および増粘剤、界面活性ポリマーおよび乳化ポリマー、ポマード、ヘアローション、シャンプー、石鹸、粉末、スティックおよびペンシル、スプレー、またはボディーオイルから選択される１つの生薬の形で使用されることを特徴とする、請求項３から８のいずれか１つに記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
10. ペプチドが、抽出および／または合成脂質、ゲル化剤および増粘剤、界面活性ポリマーおよび乳化ポリマー、水溶性もしくは脂溶性の有効成分、植物抽出物、組織抽出物、海洋抽出物、紫外線防止剤、または酸化防止剤とともに使用されることを特徴とする、請求項３から９のいずれか１つに記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
11. 瘢痕化、保湿化を促進するための、そして、シワの形成および深刻化に対する、ならびに、日光皮膚炎および自然なまたは加速された肌の老化に対する、肌のケアのための、化粧品への応用において使用される、請求項３から１０のいずれか１つに記載の化粧品または皮膚薬品組成物。
12. コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの同時合成のための、請求項１に記載のペプチドの使用方法、または請求項３から１１のいずれか１つに記載の組成物の使用方法。
13. 瘢痕化、保湿化を促進するための、そして、シワの形成および深刻化に対する、ならびに、日光皮膚炎および自然なまたは加速された肌の老化に対する、肌のケア用の医薬品の調合のための、請求項１２に記載のペプチドの使用方法。