JP4416841B2 - 胃腸管の微生物の定着の増進 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は栄養組成物の影響の増進、特に胃腸管とりわけヒトを包含する動物の大腸への共生微生物の送達および胃腸管中での共生微生物の維持のための組成物の影響の増進方法に関する。この明細書に用いる共生物(probiotics)または共生微生物(probiotic microorganisms)とは、腸の微生物バランスを改善して宿主動物に有益な影響を与える、生きた微生物食餌補助(live microbial feed supplement)物である。これはJournal of Applied Bacteriology, 1989, 66, 365-378頁”Probiotics in Man and Animals - A Review（ヒトおよび動物中の共生−展望）”においてR. Fuller（AFRC Institute of Food Research, Reading Laboratory, UK）により設定された定義である。
背景技術
人々の健康および安寧は胃腸管特に大腸に生息する微生物によりポジテイブにもネガテイブにも影響されることは多くの科学者の主張である。これらの微生物は毒素、代謝副産物、短鎖脂肪酸等の生産を通じて宿主の生理的状態および健康に影響を及ぼす。
消化微生物叢の構成および量は疾病、ライフスタイル、旅行、および他の因子により誘発される条件またはストレスにより影響され得る。個人の健康と安寧にポジテイブに影響する微生物が大腸に定住するように助長され得るならば、かかる個人の生理的安寧が改善されるはずである。
有益微生物または共生物の導入は通常、その生物が生存できる条件で大腸に到達するように、飲み物、ヨーグルト、カプセル、および他の形態での微生物の摂取により遂行される。大腸中の耐性澱粉の細菌醗酵により高レベルの短鎖脂肪酸特にプロピオネートおよびブチレート等の有益なタイプの脂肪酸が生ずることはEnglyst H.N.（1987）らにより証明された（”Polysaccharides breakdown by mixed populations of human faecal bacteria（ヒト糞便バクテリアの混合集団によるポリサッカライド分解）”、FEMS Microbiology Ecol 95: 163-71。）
本発明者らは、共生微生物を大腸に送達するだけではなく、また大腸に到達した際に微生物の成長を促進するように機能する培地(medium)を提供することもまた望ましいことを認識した。意外なことに、修飾または未修飾の耐性澱粉(resistant starches)が大腸への共生微生物の輸送手段として、および大腸の標的領域へと送達された微生物のための成長培地の両方として機能し得ることを見出した。国際公表番号ＷＯ 96/08261号では、かかる共生組成物を開示しており、この内容を便利な相互参照用の目的で本明細書中に加入する。
これら組成物の有益な効果を増進させるように、動物またはヒトに提供された共生微生物の胃腸管内の数および／または生存をさらに増強することは有利であろう。ここに本発明者らは、改良された共生組成物、およびヒトを包含する動物の胃腸管へと共生微生物を送達する改良方法を開発した。
発明の開示
最初の局面で本発明は、一つまたは二つ以上の共生微生物、一つまたは二つ以上の共生微生物を大腸または、胃腸管の他の領域へと輸送する機能を有する担体、およびオリゴ糖を含む共生組成物からなり、ここでの担体は修飾もしくは未修飾耐性澱粉またはそれらの混合物を含んでおり、この担体は大腸中または胃腸管の他の領域中で微生物に対する成長培地もしは維持培地として作用するものである。
第二の局面で本発明は、動物の胃腸管中の共生微生物または常在性(resident)微生物の数の増加方法にあり、この方法は一つまたは二つ以上の共生微生物、一つまたは二つ以上の共生微生物を大腸または、胃腸管の他の領域へと輸送する機能を有する担体、およびオリゴ糖を含む共生組成物を動物に提供することを含み、ここでの担体は修飾もしくは未修飾耐性澱粉またはそれらの混合物を含んでおり、この担体は大腸中または胃腸管の他の領域中で微生物に対する成長培地もしくは維持培地として作用するものである。
本発明は、共生的治療または投与により恩恵を受けることがてきるいずれの動物にも適用されることは理解されるはずである。特に本発明はヒト用に好適である。
広範囲な一つの局面では、上記耐性澱粉は共生微生物を大腸へ輸送する担体として機能する。これらの微生物を大腸中に導入すると、既に説明したように有益である。その上、耐性澱粉は大腸中に存在すると既に大腸中に存在する微生物に対する栄養源として機能する。共生組成物にオリゴ糖を添加すると胃腸管中の共生微生物の数の増加と永続性とを生起させる予想外の効果がある。
栄養源としての耐性澱粉を微生物が利用し得るように、いくつかの共生微生物を選択できる。このように、耐性澱粉はこれら共生微生物に対する担体および栄養源の両方として機能する。
本発明に使用するのに適する種々の共生微生物が存在し、これらにはSaccharomyces等の酵母、およびBifidobacterium、Bacteroides、Clostridium、Fusobacterium、Propionibacterium、Streptococcus、Enterococcus、Lactococcus、Staphylococcus、PeptostreptococcusおよびLactobacillus属等のバクテリアが包含される。しかし本発明は、これら特定の微生物のみに限定されるものではなく、当業者は本発明組成物中に包含できるこれら微生物を理解し、かつ認識するはずである。
好ましい実施態様では、この共生微生物はBifidobacteriumである。
投与される共生微生物の典型的濃度範囲は１日当たり１０³から１０¹³細胞である。共生投与の場合、通常１日当たり約１０⁸細胞が用いられる。
共生組成物を投与する場合、典型的な消費割合は体重ｋｇ当たり約０．１から１０ｇである。体重ｋｇ当たり約１ｇの消費が適当であることが判明している。
本発明に適するオリゴ糖の中には消費用に入手できる、任意のオリゴ糖が包含される。市場で現在入手できるオリゴ糖には、フルクト-、ガラクト-、マルト-、イソマルト-、ゲンチオ-、キシロ-、パラチノース-、ダイズ-（ラフイノースおよびスタキオースを包含）、キト-、アガロ-、ネオアガロ-、α−グルコ-、β−グルコ-、シクロ- イヌロ-、グリコシルスクロース、ラクツロース、ラクトスクロースおよびキシルスクロースが包含される。しかし他のオリゴ糖もまた本発明組成物中に含ませるのに適するであろうことは業界における熟練者には十分理解されるところである。
本発明に対して好適なオリゴ糖の一つはフルクト−オリゴ糖（Raftilose）である。しかしこの特定オリゴ糖は本発明者らにより実施された実験で好適であると判明したが、他のオリゴ糖もまた共生組成物において同様に有益な効果を有することが予想されるであろうことは十分理解し得るはずである。
オリゴ糖は約０．０１から１０％（w/w）濃度で組成物中に使用できる。好ましいオリゴ糖濃度は約０．０５から５％である。０．１％から１％（w/w）が本発明の組成物において望ましい有益な効果を生ずる。
本発明の重要な効果の一つは、共生微生物および耐性澱粉をオリゴ糖と組み合わせると、オリゴ糖不在の共生組成物に比べて、送達された微生物の有益な効果の相乗的増進が起こることである。この結果は驚くべきであり、かつ予想外であり、したがって本発明は従来の共生組成物および胃腸管へ共生微生物を送達する方法を越えた重要な改良を提供するものである。
この明細書で使用するように、”耐性澱粉”には、Brown, McNaughtおよびMoloney（1995）らによるFood Australia 47:272-275中で定義されたＲＳ1、ＲＳ2、ＲＳ3およびＲＳ4として定義された形態が包含される。本発明では修飾もしくは未修飾耐性澱粉のいずれも、またはこれらの混合物も使用される。共生組成物中の耐性澱粉の有利性は、このものが大腸に到達するまでは大部分が分解されないことである。したがって大腸に到達するやいなや、共生微生物による醗酵のために容易に利用できる基質をこれが提供する。両方の場合で、耐性澱粉の好ましい形態は高アミロース澱粉特にＷＯ 94/03049号およびＷＯ 94/14342号で開示および教示の高アミロース澱粉であり、この文献内容は便利な相互参照用の目的で本明細書中に包含する。
ＷＯ 94/03049号およびＷＯ 94/14342号には、高アミロース澱粉が開示され、これらは耐性澱粉であり、かつこの中には５０％ W/Wまたはそれ以上、特に８０％ w/wまたはそれ以上のアミロース含有量のトウモロコシ澱粉、２７％ w/wまたはそれ以上のアミロース含有量の米および小麦澱粉および；５０％またはそれ以上のアミロース含有量で耐性澱粉含有量を増加させた特有の粒状サイズ範囲の澱粉であってトウモロコシ、大麦、小麦およびマメ類が包含される澱粉等があげられる。しかし、本発明はこれらの形態の耐性澱粉に限定されるものではない。例えば、バナナまたは他の種の果物、ジャガイモ等の塊茎、およびこれらの混合物または組み合わせ等の供給源に由来する他の形態の耐性澱粉も本発明の場合に適する。
本発明で使用する組成物は、共生微生物、担体およびオリゴ糖が組み合わせで提供されるように調製することができる。別法として、共生微生物および担体は二つの別個の部分で提供されていてもよい。この形態では、共生微生物含有部分または担体およびオリゴ糖含有部分のいずれかが先ず消費され、その直後に他の部分が消費される。同様に、共生的微生物および担体が一つの部分で提供され、かつオリゴ糖が他の部分で提供されてもよい。この形態では、共生微生物および担体を含む部分が先ず消費され、その直後に他の部分が消費される。上記順序とは逆の順序でこれらの部分が投与され得ることは十分理解されうるところであろう。未修飾形態では、耐性澱粉は上記組成物が大腸に到達した際に共生微生物による醗酵に対する基質として役立つ。
微生物および耐性澱粉の間の付着的相容性を増進するために，例えば顆粒および／または顆粒表面の荷電密度または疎水性を変更する目的の澱粉の化学的修飾もまた都合がよい。エーテル化、エステル化、酸性化等の化学的修飾は、この業界では適切な化学的処理として周知である。同様に物理的、酵素的または他の手段によって誘導される他の修飾も当業者に周知である。
この澱粉の立体配座または構造を変えて耐性澱粉の酵素感受性の程度を修飾するのも有用である。この例のなかには、酸もしくは酵素菲薄化（thinning）および２官能試薬(difunctional reagents)を用いる交差結合（cross bonding）が包含される。
澱粉の修飾は結晶化によっても実施できる。かかる方法は当業界では既知であり、本発明の場合にも適当である。
ここに用いるＨｉ−Ｍａｉｚｅ^TM（登録商標）は、Starch Australasia Limitedから入手した高アミロース澱粉を指す。
本発明を一層明瞭に理解するために、次の図面および実施例を参照しながら好ましい形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実験動物における共生的bifidobacteria投与の中止後およびＨｉ−ｍａｉｚｅ^TM＋ フルクト（fructo）-オリゴ糖ダイエット(diet)継続後のbifidobacteriaの持続性を示し；また
図２は、bifidobacteria Ｚ8 ＡＴ1、Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TM＋ フルクト- オリゴ糖を投与した、ヒト糞便スラリー培養物中のbifidobacteria数を示す。
発明を実施するための形態
方法

実験のためにブタ１６匹を４匹×４群に分けた。全てがそれら自信の制御下にあり、かつ各ダイエットに時間をとる。ブタに１週間、実験的ダイエットを与え、次ぎの１週間はOliquindox含有ペレットを与えて掃除(cleaning out)した。実験的給餌は毎第２土曜に開始し、ブタには１日２回食餌を与えた。全てのブタの全ての食事と共にProbiotic（Bifidobacterium longum 1941）共生物を与えた。ダイエット２および４のブタにはフルクト- オリゴ糖（Raftilose）を与えた。最終給餌の週後は、Probioticを与えずに、さらに７日間全ての動物に実験的ダイエットを与えたままにした。
ブタに与えた量の処方： ７０ｇ×（体重）
与えたProbiotics： ０．５ｇ／ｋｇ体重
フルクト- オリゴ糖： １ｇ／ｋｇ体重
サンプリング：

結果
表２に示したように、Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TMプラス オリゴ糖 プラスbifidobacteria（1.38×10⁹ＣＦＵ／ｇ）を投与した動物中のbifidobacteria数は、Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TM＋ bifidobacteria（７．２４×１０⁸ＣＦＵ／ｇ）を投与した動物中のbifidobacteria数の２倍多く、オリゴ糖＋ bifidobacteria（１．９×１０⁸ＣＦＵ／ｇ）を投与した場合よりも約１０倍多いことが判る。トウモロコシを与えた対照動物は５．５×１０⁷ＣＦＵ／ｇ bifidobacteriaを有していた。

ヒト糞便ホモジネートのin vitroでの研究の実験を実施した。この実験的デザイン中には、オリゴ糖（０．５％または１％）およびBifidobacterium株Ｘ8 ＡＴ1（１％接種材料）の不在または存在下にＨｉ−ｍａｉｚｅ^TM（０．５％または１％）を用いてWilkin Chalgren’sブロス(broth)（1:1000 wt/vol）中に希釈したヒト糞便ホモジネートの保温工程が包含される。３７℃での嫌気性保温６時間後、種々の培養物のｐＨを測定し、そのｐＨを６．５に調整した。次いで培養物を６時間さらに保温した。このｐＨ値を表３に示し、かつBifidobacterium数を図２に示す。表４は図２に示した結果の統計分析である。
BifidobacteriumのｐＨ値およびカウント数の両方は、Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TM（０．５％）およびフルクト- オリゴ糖（０．５％）がこの混合物中に一緒に含まれる場合に相乗効果があることを示している。この組合わせの場合の値は１％Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TMまたは１％フルクト- オリゴ糖を単独で使用した場合よりも大きい。その上、比成長速度は、Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TM単独またはフルクト- オリゴ糖単独における場合よりも、Ｈｉ−Ｍａｉｚｅ^TM（０．５％）およびフルクト- オリゴ糖（０．５％）混合物中における成長の場合の方が大きい。

用途
図１および図２の結果は、オリゴ糖＋Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TM＋ bifidobacteriaを投与ししたブタでは、オリゴ糖＋ bifidobacteriaまたはＨｉ−ｍａｉｚｅ^TM＋ bifidobacteriaを与えたブタで観察された場合よりも著しく長期間、bifidobacteriaの高レベルが持続したことを示す。
本発明者らは実施例で、オリゴ糖、耐性澱粉およびbifidobacteriaの組み合わせが：
（ａ）腸bifidobacteria数の増加の効果を、添加効果を超えて一層増強し；かつ
（ｂ）三つの成分を経口で投与すると長期間に亙ってその数が持続する
ことを示した。
共生物の通常の用途以外にも、耐性澱粉＋オリゴ糖＋ bifidobacteriaの組み合わせは、投与を中止後でも著しく多数のbifidobacteriaの永続性が引き伸ばされる結果になった。この追加的用途は、例えば旅行等で日々の投与ができない状況下では価値がある。Ｈｉ−ｍａｉｚｅ^TMプラスbifidobacteriaをこれらの動物に用いた場合、同様に永続性が観察された。
特定実施態様で示したこの発明に対して、広く記載した本発明の精神と範囲から逸脱することなく多くの変形および／または修飾がなし得ることは当業界の専門家には十分理解し得るはずである。したがって、ここに記載の実施態様は、あらゆる観点において説明目的のものであり、制限を意図するものではない。

Claims (11)

1. 一つまたは二つ以上の共生的微生物；一つまたは二つ以上の共生微生物を動物の大腸または胃腸管の他の領域へ輸送するように機能する担体であって、未修飾耐性澱粉からなり大腸中または胃腸管の他の領域中の微生物の成長培地または維持培地として作用する担体；およびフルクト-、ガラクト-、マルト-、イソマルト-、ゲンチオ-、キシロ-、パラチノース-、ダイズ-（ラフイノースおよびスタキオースを包含）、キト-、アガロ-、ネオアガロ-、α−グルコ-、β−グルコ-、シクロ-イヌロ-、グリコシルスクロース、ラクツロース、ラクトスクロースおよびキシルスクロースからなる群から選択されるオリゴ糖であって０．０１から１０％（w/w）の濃度のオリゴ糖を含んでなる共生組成物。
2. オリゴ糖が、フルクト-オリゴ糖である、請求項１記載の共生組成物。
3. 共生微生物が、酵母、バクテリア、およびこれらの混合物から選択される、請求項１または２記載の共生組成物。
4. 酵母が、Saccharomycesである、請求項３記載の共生組成物。
5. バクテリアが、Bifidobacterium、Bacteroides、Clostridium、Fusobacterium、Propionibacterium、Streptococcus、Enterococcus、Lactococcus、Staphylococcus、PeptostreptococcusおよびLactobacillus属からなる群から選択される、請求項３記載の共生組成物。
6. バクテリアがBifidobacteriumである、請求項５記載の共生組成物。
7. オリゴ糖濃度が０．０５から５％（w/w）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共生組成物。
8. 耐性澱粉が、トウモロコシ、大麦、小麦、米、マメ、バナナもしくはジャガイモ、またはこれらの混合物に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の共生組成物。
9. 耐性澱粉が、アミロース含有量５０％ w/wもしくはそれ以上の高アミロース澱粉、または、アミロース含有量２７％ w/wもしくはそれ以上の米および小麦澱粉である、請求項８記載の共生組成物。
10. 耐性澱粉が、アミロース含有量８０％ w/wもしくはそれ以上の高アミロース澱粉である、請求項９記載の共生組成物。
11. 請求項１から１０のいずれかに記載の共生組成物を含む、動物の胃腸管中の共生微生物もしくは常住性微生物の数の増加のための組成物。

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