JP4490369B2 - マレアミド酸ポリマー誘導体及びこれらの生物学的複合体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、総体的にはポリマー化学分野に関し、そしてより具体的には、マレイミド又はマレアミド酸官能化型水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコールから製造された化学的に安定な活性剤複合体、及びこのようなポリマー試薬及び複合体の合成、特徴付け及び使用方法に関する。

発明の背景
バイオテクノロジーの最近の進歩により、治療用タンパク質及びその他の生体分子、例えば抗体及び抗体断片を今や大規模に調製することができ、このような生体分子はより広範囲に利用可能になっている。残念ながら、潜在的な治療用生体分子の臨床上の有用性は、これらの急速なタンパク質分解、低い生体利用効率、製造、貯蔵又は投与時の不安定性、又はこれらの免疫原性によってしばしば阻まれる。タンパク質及びその他の生体分子を治療用に投与することに対する継続した関心により、これらの欠陥を克服しようとする種々のアプローチが探求されている。

幅広く探求されている１つのアプローチは、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール又は「ＰＥＧ」の共有結合により、タンパク質及び潜在的に治療用の他の分子を改変することである（Abuchowski, A.他、J. Biol. Chem. 252 (11), 3579(1977);Davis, S他、Clin. Exp. Immunol., 46, 649-652(1981))。ＰＥＧ複合体又はペグ化タンパク質とも呼ばれるＰＥＧ改変型タンパク質の生物学的特性が、非ペグ化対応タンパク質の生物学的特性に対してかなり改善されることが、多くの事例において示されている(Herman他、Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209(1994))。ポリエチレングリコール改変型タンパク質は、タンパク質分解に対する抵抗性が増大することによって、また熱安定性が増大することによっても、体内の循環時間が長くなることが示されている(Abuchowski, A.他、J. Biol. Chem., 252, 3582-3586(1977))。他の生体分子、例えば抗体及び抗体断片を用いても、生体効率の同様の増大が観察されている(Chapman, A., Adv. Drug Del. Rev. 54, 531-545(2002))。

典型的には、活性化型ＰＥＧ誘導体、すなわち、生体分子（例えばリジン、システイン及び同様のタンパク質残基）の求核中心との反応に適した少なくとも１の活性化された末端を有するＰＥＧを使用して、薬物又はその他の表面にポリエチレングリコールが結合される。最も一般に採用されるのは、活性化型ＰＥＧと、タンパク質アミノ基、例えばタンパク質のリジン側鎖中に存在する基とを反応させることに基づく方法である。タンパク質のアミノ基との反応に適した活性化された末端基を有するポリエチレングリコールは、ＰＥＧ−アルデヒド（Harris, J. M., Herati, R. S., Polym Prepr. (Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem), 32(1), 154-155(1991)、混合された無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、カルボニルイマダゾリド、及びクロロシアヌレート(Herman, S.他、Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209(1994))を含む。多くのタンパク質は、ＰＥＧ改変中に活性を維持することが判ってはいるものの、いくつかの事例において、例えば特定のリジン残基の誘導体化がタンパク質を不活性化する場合に、タンパク質アミノ基を介したポリマー結合が望ましくない場合がある(Suzuki, T.他、Biochimica et Biophysica Acta 788, 248-255(1984))。さらに、ほとんどのタンパク質がいくつかの利用可能／アクセス可能なアミノ基を有しているので、形成されるポリマー複合体は典型的には、モノ・ペグ化型、ジ・ペグ化型、トリ・ペグ化型などの種の混合物となり、このような混合物は、特徴付け及び分離を行うのが難しく、またこれには時間がかかるおそれがある。さらに、このような混合物は再現性よく製造されない場合が多く、このことは、規制認可及びこれに続く商業化のための規模拡大中に問題を生じさせるおそれがある。
これらの問題を回避するための１つの方法は、アミン以外の官能基を標的とする部位選択的なポリマー試薬を採用することである。１つの特に魅力的な標的はチオール基である。チオール基はタンパク質において、アミノ酸システイン中に存在する。システインはタンパク質中にリジンほど豊富には存在しないのが典型的であり、従って、これらのチオール含有アミノ酸との複合時におけるタンパク質失活の確率を低減する。さらに、システイン部位との複合は、しばしば明確に定義された様式で行うことができ、単独種ポリマー−複合体の形成をもたらす。

チオール選択的反応性末端基を有するポリエチレングリコール誘導体は、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、チオール、及びジスルフィドを含み、マレイミドが最もよく知られている。これらの誘導体は全て、タンパク質のシステイン側鎖にカップリングするために使用されている(Zalipsky, S. Bioconjug. Chem. 6, 150-165(1995); Greenwald, R. B.他、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17, 101-161(2000); Herman, S.他、Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209(1994))。しかしこれらの試薬の多くは、その合成及び精製の困難さにより、広範囲には利用されていない。

末端マレイミド基を有するポリエチレングリコール誘導体は、スルフヒドリル選択的試薬の最もよく知られたタイプのうちの１つであり、数多くの販売元から市販されている。広範囲にわたって認められ又は認識されているわけではないが、出願人は、多くのＰＥＧ−マレイミドが残念ながら、貯蔵中及び／又は薬物候補との複合体中において加水分解による不安定性を示すことを認識している。より具体的には、複合体形成前にも複合体形成後にも、マレイミド環のかなりの度合いの加水分解が観察されている。この不安定性の結果、薬物複合体組成物内部に複数の薬物複合体種が形成されるおそれがある。種々の薬物複合体種は、同様の生体活性を有すると考えられるが、しかし、これらの薬物動態特性が異なることがある。このことは、患者への投与のために意図された組成物にとって特に不都合である。それというのも、結果として得られる薬物組成物は、定義が不明確な薬物複合体種混合物であるおそれがあり、これらの種の具体的な安全性プロフィール及び蓄積プロフィールは未知であるからである。さらに、種々異なるファクターが加水分解速度に影響を及ぼすことにより、薬物複合体バッチ組成物間の不一致が付加的な問題を引き起こすおそれがある。

出願人によって観察されている別の潜在的な問題は、ＰＥＧマレイミドから製造された複合体の脱ペグ化により、変化した薬物と除去されたＰＥＧ不純物との混合物を産出することである。このような理由から出願人は、ＰＥＧマレイミドが、標的薬物上又はその他の活性剤上のチオール基にカップリングするためには望ましくない試薬であり得ることを見いだした。この問題に対処しようとする以前の試みは、加水分解（すなわち開環）されにくくすることにより、ポリマーマレイミドの安定性を高めることに焦点をあてていた。例えば、米国特許出願公開第2003/0065134号を参照されたい。

このように、望ましくは部位選択的な様式で生物学的に活性な分子をカップリングするために有用な新規の活性化型ＰＥＧであって、現在利用できるチオール選択的ポリマー試薬の欠点を補い、そして貯蔵及びカップリングの間安定であるＰＥＧを開発することについて、当該技術分野における継続した必要性を出願人は認識している。

発明の概要
本発明は、（ｉ）貯蔵中及びカップリング中に安定であり、（ｉｉ）加水分解に対して抵抗性を有し、そして（ｉｉｉ）脱ペグ化に対する高められた抵抗を示し、これにより、下記により詳細に説明する、実質的に化学的に安定であり且つ明確に定義された薬物複合体組成物の形成を可能にする、チオール選択的試薬及びこれらの複合体を提供する。

本発明は、慣用のポリマー・マレイミド試薬に取って代わるものが必要であるとの出願人の認識に基づいている。この必要性に応じて、出願人は、今日まで採用された他のアプローチとは正反対のアプローチを考え出した。すなわち、マレイミド環の加水分解を阻止しようとする習慣的なアプローチ及び試みを利用するのではなく、出願人はその代わりに、マレイミド環を意図的に強制的に開環させることにより、「マレイミド」がその安定なスクシンアミド酸開環形に変換されたポリマー試薬及び複合体を提供した。

より具体的には、１の態様において、活性剤とのカップリング前、又はより慣用的には活性剤とのカップリング後に、水溶性ポリマーのマレイミド基が強制的に（意図的に）その開環マレアミド酸形に変換される方法が提供される。こうして、（ｉ）明確に定義された成分、及び（ｉｉ）特にそのマレイミド誘導型スクシンイミド対応物と比較して、加水分解の傾向の減小、を有するマレアミド酸又はスクシンアミド酸ポリマー組成物が提供される。

より具体的には、１の態様において、本発明はポリマー複合体を製造する方法を提供する。この方法は以下のステップ：
（ａ）マレイミド基を含む水溶性ポリマーを準備し、そして
（ｂ）このポリマーを、求核基を有する活性剤と、マイケル型付加反応を介して該活性剤を該水溶性ポリマーにカップリングするのに効果的な条件下で反応させることにより、ポリマー−スクシンイミド結合型活性剤複合体を形成するステップ
を含む。この複合体を、次いでステップ（ｃ）において、スクシンイミド環を強制的に開環するのに効果的な条件下で処理することにより、ポリマー−スクシンアミド酸−複合体を形成する。

１の実施態様では、マレイミド環は加水分解反応を介して強制的に開環される。典型的には、開環加水分解は、溶液中又は固体支持体上に存在しうる塩基の存在下において行われる。加水分解を行うための典型的なｐＨは約６〜１２である。

好ましい実施態様では、加水分解は、化学的に安定なポリマー−スクシンアミド酸−複合体組成物を提供するのに効果的な条件下で行われる。

この方法の１の実施態様では、加水分解反応は、閉環形の変換を基準として、約１５％以上のポリマー−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる。別の実施態様では、加水分解反応は、少なくとも約３５％、約５０％、約８０％、約９５％、約９８％、又は実質的に１００％のポリマー−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで、すなわち、ポリマーマレイミド複合体が事実上完全に開環されるまで行われる。

本発明において使用するための水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレン・オキシド）、ポリ（ビニル・ピロリドン）、ポリ（ビニル・アルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、及びポリ（オキシエチル化ポリオール）を含む。好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。

さらに別の態様では、上記方法によって製造されたポリマー・スクシンアミド酸複合体組成物がここに提供される。

さらに別の態様では、以下の：

及び／又は

[式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマー・セグメントであり、Ｌは任意のリンカーであり、そして「Ｎｕ−活性剤」は、求核基「Ｎｕ」を含む活性剤を表す]
で表される組成物が本明細書中に提供される。好ましい求核基はチオール、チオレート、及びアミノを含む。

さらに別の態様では、本発明は、水溶性ポリマーで誘導体化されたタンパク質を提供し、ここで該ポリマーが、システインスルフヒドリル基又はリジンアミノ基に共有結合されたスクシンイミド基を介して、タンパク質にカップリングされており、そしてスクシンイミド基の全てが、開環された形態で存在する。

本発明のこれらの及びその他の対象及び特徴は、以下の図面及び詳細な説明を併せて読めばより完全に明らかになる。

発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定のポリマー、合成技術、活性剤などに限定されることはなく、そのようなものとして変化しうるということは理解されるべきである。また、本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施態様を記載する目的であり、そして制限することを意図しないということも理解されるべきである。
本発明を説明し特許請求する上で、下記定義に従って以下の専門用語が使用される。

定義
本明細書中に使用される下記用語は、指示された意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形は、文脈上明確に断らない限りは、複数形の指示対象を含む。
本明細書中に使用される「ＰＥＧ」又は「ポリ（エチレングリコール）」は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含するものとする。典型的には、本発明において使用するためのＰＥＧは、例えば合成転換中に、末端酸素が置換されているか否かに応じて、以下の２つの構造：「−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−」又は「（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n-1ＣＨ₂ＣＨ₂−」のうちの一方を含むことになる。変数（ｎ）は３〜３０００の範囲であり、そして末端基及びＰＥＧ全体の構造は変化してもよい。ＰＥＧがさらにリンカー部分（さらに詳細に以下に説明する）を含む場合、リンカーを含む原子は、ＰＥＧセグメントに共有結合される場合には、結果として（ｉ）酸素−酸素結合（−Ｏ−Ｏ−、過酸化結合）、又は（ｉｉ）窒素−酸素結合（Ｎ−Ｏ、Ｏ−Ｎ）を形成することはない。「ＰＥＧ」は、大部分すなわち５０％超の、−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−であるサブユニットを含有するポリマーを意味する。本発明において使用するためのＰＥＧは、種々の分子量、構造又は幾何構造(geometry)（例えば分枝状、線状、フォーク状ＰＥＧ、樹状など）を有するＰＥＧを含み、これらは下記に詳細に説明する。

α−、ω−ジヒドロキシポリ（エチレン・グリコール）としても知られる「ＰＥＧジオール」は、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして短い形で表すことができる。ここで、ＰＥＧは上記に定義した通りである。

本発明のポリマーとの関連において使用される「水溶性」又は「水溶性ポリマー・セグメント」は、室温で水に可溶性である任意のセグメント又はポリマーである。典型的には、水溶性ポリマー又はセグメントは、濾過後の同じ溶液によって透過される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を透過させることになる。重量を基準にすると、水溶性ポリマー又はそのセグメントは好ましくは少なくとも約３５（重量）％、より好ましくは少なくとも約５０（重量）％、さらにより好ましくは約７０（重量）％、そしてさらにより好ましくは約８５（重量）％水に溶解できる。しかし、水溶性ポリマー又はセグメントが約９５（重量）％だけ水に溶解できるか、或いは完全に水中に溶解できることが最も好ましい。

「末端キャップ」基又は「末端キャップされる」基は、ポリマー、例えばＰＥＧの末端上に存在する不活性又は非反応性基である。末端キャップ基は、典型的な合成反応条件下で化学転換を容易には受けない基である。末端キャップ基は一般に、アルコキシ基、−ＯＲであり、この式中、Ｒは１−２０の炭素から構成される有機基であり、好ましくは、低級アルキル（例えばメチル、エチル）又はベンジルである。「Ｒ」は飽和型又は不飽和型であってよく、そしてアリール、へテロアリール、シクロへテロシクロ、及びこれらのうちのいずれかの置換形を含む。例えば、末端キャップされるＰＥＧは、典型的には構造「ＲＯ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−」を含むことになり、この式中、Ｒは上記に定義した通りである。或いは、末端キャップ基は有利には、検出可能な標識を含むこともできる。ポリマーが検出可能な標識を含む末端キャップ基を有すると、ポリマー、及び／又は、ポリマーがカップリングされた部分（例えば活性剤）の量又は位置を、適切な検出器を使用することによって測定することができる。このような標識は、非限定的に蛍光、化学発光、酵素標識に使用される成分、比色分析（例えば色素）、金属イオン、放射性部分などを含む。末端キャップ基は有利には、リン脂質を含むこともできる。ポリマーが末端キャップ基、例えばリン脂質を有していると、ポリマーには、固有の特性（例えば類似の末端キャップされたポリマーを伴う組織化された構造を形成する能力）が付与される。リン脂質の例は、非限定的に、ホスファチジルコリンと呼ばれるリン脂質のクラスから選択された脂質を含む。具体的なリン脂質は、非限定的に、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンから成る群から選ばれる脂質を含む。

本発明のポリマーに関して使用される「非天然」とは、自然においてその存在が見いだされないポリマーを意味する。しかし、本発明の非天然ポリマーは、そのポリマー構造全体が自然において見いだされない限り、天然に生じる１以上のサブユニット又はサブユニットのセグメントを含有してもよい。

本発明の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧとの関連において使用される「分子量」とは、典型的にはサイズ排除クロマトグラフィー、光散乱技術、又は１，２，４−トリクロロベンゼン中での固有速度測定によって測定したポリマーの公称平均分子量を意味する。本発明のポリマーは典型的には、約１．２０未満の低い多分散性を有する多分散系である。

「反応性」又は「活性化型」という用語は、慣用の有機合成条件下で、容易に又は実用的な速度で反応する官能基を意味する。これは、反応しないか、又は強力な触媒又は反応のために非実用的な反応条件を必要とする基（すなわち「非反応性」又は「不活性」基）とは対照的である。
反応混合物中の分子上に存在する官能基との関連において使用される「容易に反応しない」又は「不活性」は、該基が、反応混合液中において、所望の反応を行うために有効な条件下で大部分がそのままであることを指す。

「保護基」は、或る反応条件下で分子内の特定の化学反応性官能基の反応を妨げ又は阻害する部分である。保護基は、保護されている化学反応性基のタイプ、並びに、採用されるべき反応条件、及び分子内の付加的な反応性基又は保護基の存在に応じて変化するだろう。保護され得る官能基は例えば、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、及びカルボニル基などを含む。代表的な保護基は、カルボン酸の場合、エステル（例えばｐ−メトキシベンジルエステル）、アミド及びヒドラジド；アミノ基の場合、カルバメート（例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）及びアミド；ヒドロキシル基の場合、エーテル及びエステル；チオール基の場合、チオエーテル及びチオエステル；カルボニル基の場合、アセタール及びケタール；などを含む。このような保護基は当業者によく知られており、そして例えばT.W. Greene及びG.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis、第3版、Wiley, New York, 1999、及びこれに引用された参考文献に記載されている。

「保護された形態」の官能基は、保護基を有する官能基を指す。本明細書中に使用されるとき、「官能基」という用語又はその任意の同義語は、その保護された形態を包含することを意味する。

本明細書中に使用される「リンカー」は、相互結合部分、例えばポリマー・セグメント及びマレイミドを結合するのに場合により使用される原子又は原子群を意味する。本発明のリンカーは一般に加水分解に対し安定である。

「生理的状態で切断可能な」又は「加水分解可能な」又は「分解可能な」結合は、生理的条件下で水と反応する（すなわち加水分解される）比較的弱い結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を結合する一般的なタイプにだけではなく、これらの中心原子に結合された置換基にも左右される。加水分解に対し不安定な、又は加水分解に対して弱い好ましい結合は、非限定的にカルボキシレート・エステル、ホスフェート・エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキル・エーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチド、チオエステル、チオールエステル、及びカーボネートを含む。

「酵素により分解可能な結合」は、１以上の酵素により分解される結合を意味する。
本発明の目的における、また具体的には本発明のポリマーに関連する「加水分解に対し安定な」結合又はリンカーは、通常の生理条件下で加水分解に対し安定性である原子又は原子群を意味する。すなわち、加水分解に対し安定な結合は、長時間にわたって適切な程度まで、生理条件下で加水分解をうけることがない。加水分解に対し安定な結合の例としては、非限定的に、炭素−炭素結合（例えば脂肪鎖内）、エーテル、アミド、ウレタン、及びアミンなどが挙げられる。代表的な化学結合の加水分解速度は、標準的な化学の参考書の多くに見いだすことができる。

ポリマーの幾何構造又は構造全体に関連する「分枝状」は、２以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを意味する。分枝状ポリマーは、２つのポリマー・アーム、３つのポリマー・アーム、４つのポリマー・アーム、６つのポリマー・アーム、又は８つ以上のポリマー・アームを有してもよい。高分枝状ポリマーの１つの特定のタイプは、樹状ポリマー又はデンドリマーである。樹状ポリマー又はデンドリマーは、本発明の目的において、分枝状ポリマーとは区別される構造を有すると考えられる。

「分枝点」は、ポリマーが線状構造から枝分かれし又は分枝して、１以上の更なるポリマー・アームになる１以上の原子を含む分岐点を意味する。
「デンドリマー」は球形の、サイズが単分散のポリマーであり、該ポリマーにおいて、規則的な分枝パターンを伴って、また、それぞれが分枝点となる繰り返し単位を伴って、全ての結合が中央収束点又はコアから径方向に延びている。デンドリマーは、或る特定の樹状状態特性、例えばコアカプセル化を示し、デンドリマーを他のタイプのポリマーとは異なるものにしている。

「実質的に」又は「事実上」は、ほぼ全体的に又はほぼ完全に、という意味を有し、例えば或る規定の量の９５％以上を意味する。
「アルキル」又は「アルキレン」基は、分子内のその位置、及びこの基と水素以外の原子との結合点の数に応じて、典型的には原子数約１〜２０の長さの炭化水素鎖又は炭化水素部分を意味する。このような炭化水素鎖は飽和型であることが好ましいが、そのような指示がない限り必ずしも必要というわけではない。そしてこのような炭化水素鎖は、分枝鎖又は直鎖であってよいが、典型的には直鎖が好ましい。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、及び３−メチルペンチルなどを含む。

「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、１〜６個の炭素原子を含む上記で定義されたアルキル又はアルキレン基を意味し、そしてメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルによって例示されるように、直鎖又は分枝鎖であってよい。
「シクロアルキル」又は「シクロアルキレン」は、分子内のその位置、及び水素以外の原子との結合点の数に応じて、飽和型又は不飽和型環状炭化水素鎖を意味する。この炭化水素鎖は、多環、例えば好ましくは３〜約１２、より好ましくは３〜約８個の炭素原子から作られる架橋型、融合型又はスピロ環状化合物を含む。

「低級シクロアルキル」又は「低級シクロアルキレン」は、１〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味する。
「脂環式」は、炭素原子環を含有する任意の脂環式化合物を意味する。脂環式基は、上記に定義された「シクロアルキル」又は「シクロアルキレン」基であって、１以上のアルキル又はアルキレで置換されたものである。

「非干渉性置換基」とは、分子内に存在する場合、分子内部に含まれたその他の官能基と典型的には非反応性である基である。

例えば「置換型アルキル」におけるような「置換型」という用語は、１以上の非干渉性置換基で置換された部分（例えばアルキル基）を意味する。置換型アルキルの例は、非限定的にＣ₃−Ｃ₈シクロアルキル、例えばシクロプロピル、及びシクロブチルなど；ハロ、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；及び置換型フェニルなどが挙げられる。フェニル環上の置換では、置換基は任意の配向（すなわちオルト、メタ又はパラ）であってよい。

「アルコキシ」は−Ｏ−Ｒ基を意味し、この式中、Ｒはアルキル又は置換型アルキルであり、好ましくはＣ₁−Ｃ₂₀アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、ベンジルなど）、好ましくはＣ₁−Ｃ₇である。
本明細書に使用されるとき、「アルケニル」は、少なくとも１の二重結合を含有する、原子数１〜１５の長さの分枝状又は非分枝状炭化水素基を意味し、例えば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、及びテトラデセニルなどを含む。

本明細書に使用された「アルキニル」は、少なくとも１の三重結合を含有する、原子数２〜１５の長さの分枝状又は非分枝状炭化水素基を意味し、例えば、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、オクチニル、及びデシニルなどを含む。

「アリール」は、それぞれが５又は６個のコア炭素原子から構成される１以上の芳香環を意味する。アリールは、ナフチルのように融合された複数のアリール環或いはビフェニルのように融合されていない複数のアリール環を含む。アリール環は、１以上の環状炭化水素、へテロアリール環、複素環と融合されてもよいし、されなくてもよい。本明細書中に使用される「アリール」はへテロアリールを含む。

「へテロアリール」は、１〜４個のへテロ原子、好ましくはＮ、Ｏ、又はＳ、或いはその組合せを含むアリール基である。ヘテロアリール環は、１以上の環状炭化水素、複素環、アリール環、又はヘテロアリール環と融合されてもよい。
「複素環」又は「複素環式」とは、不飽和又は芳香族特性を有するか又は有さない５〜１２、好ましくは５〜７個の原子から構成される１以上の環であって、炭素ではない少なくとも１の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子は硫黄、酸素、及び窒素を含む。

「置換型ヘテロアリール」は、１以上の非干渉性基を置換基として有するヘテロアリールである。
「置換型複素環」は、非干渉性置換基から形成された１以上の側鎖を有する複素環である。
「求電子基」とは、イオン、イオン性でありうる原子又は原子群であって、求電子中心、すなわち電子を求引する中心を有し、求核基と反応することができるものを指す。

「求核基」とは、イオン、イオン性でありうる原子又は原子群であって、求核中心、すなわち求電子中心を求引する中心を有し、そして求電子基と反応することができるものを指す。

本明細書中に使用された「活性剤」は、in vivo又はin vitroで実証することができる、何らかの薬理学的な、しばしば有益な効果を提供する任意の試薬、薬物、化合物、組成物又は混合物を含む。活性剤は食品、補助食品、栄養素、栄養補助食品、薬物、ワクチン、抗体、ビタミン及びその他の有益な試薬を含む。本明細書に使用されたこれらの用語はさらに、患者において局所的又は全身的効果をもたらす生理的又は薬理的に活性な物質のいずれかを含む。

「医薬として許容される賦形剤」又は「医薬として許容される担体」は、本発明の組成物中に含めることができ、かつ著しい毒性効果を患者にもたらすことのない賦形剤を意味する。
「医薬有効量」、「生理的に有効な量」、及び「治療有効量」は、相互に置き換え可能に使用されて、血流中又は標的組織において、所望レベルの活性剤及び／又は複合体を提供することが必要とされる、医薬調製品中に存在するＰＥＧ活性剤複合体の量を意味する。正確な量は、多数のファクター、例えば医薬調製品の特定の活性剤、成分、及び物理的特性、意図される患者個体群、患者に対する配慮事項などに左右され、そして、本明細書中に提供された情報及び関連文献において入手可能な情報に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。

本発明のポリマーとの関連において使用される「多官能性」は、３以上の官能基を含めるポリマー骨格を意味する。ここで該官能基は同じ又は異なるものであってよく、そして典型的にはポリマー末端上に存在する。本発明の多官能性ポリマーは、典型的には、約３〜１００個、又は約３〜５０個、又は約３〜２５個、又は約３〜１５個、又は約３〜１０個の官能基を含有することになり、或いは、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の官能基をポリマー骨格内に含有することになる。

「二官能性」ポリマーは、典型的にはポリマー末端に、２個の官能基を含有するポリマーを意味する。官能基が同じものである場合、ポリマーはホモ二官能性と呼ばれる。官能基が互いに異なる場合、ポリマーはヘテロ二官能性と呼ばれる。
本明細書に記載された塩基性又は酸性試薬は、中性試薬、荷電試薬、及びこれらの任意の対応する塩形態を含む。
「ポリオレフィン系アルコール」は、オレフィンポリマー骨格、例えばポリエチレンを含むポリマーであって、ポリマー骨格にぶら下がって結合された複数のヒドロキシル基を有するポリマーを指す。ポリオレフィン系アルコールの例は、ポリビニルアルコールである。

本明細書中に使用されるとき、「非ペプチド性」は、ペプチド結合が実質的にないポリマー骨格を意味する。しかしこのポリマーは、反復モノマー・サブユニットに沿って所定の間隔を置いて形成された少数のペプチド結合、例えばモノマー単位約５０個当たり約１未満のペプチド結合を含んでよい。

「患者」という用語は、本発明のポリマー（典型的にはポリマー−活性剤複合体の形態を成すが必ずしもこの形態が必要というわけではない）を投与することにより予防又は治療することができる症状を患うか、又はこのような症状になりやすい生物を意味し、ヒト及び動物の双方を含む。
「任意の」又は「場合により」は、続いて記載された状況が発生してもよいししなくてもよいので、該記述が、状況が発生する場合と、状況が発生しない場合とを含むことを意味する。

「残基」は、１以上の分子との反応後に残った分子の部分を意味する。例えば本発明のポリマー複合体中にある生物学的に活性な分子の残基は、典型的には、生物学的に活性な分子のうち、その生物学的に活性な分子上の反応性基がポリマー試薬上の反応性基と反応した結果として生じる共有結合まで部分に対応するが、その共有結合は除外される。

「複合体」という用語は、反応性ポリマー分子、好ましくは反応性ポリ（エチレングリコール）に対する分子、例えば生体活性分子又は任意の反応性表面の共有結合の結果として形成された存在物を意味するものとする。「電子吸引性基」という用語は、化学的部分であって、メソメリー・メカニズム（すなわち、π結合を介して局所的な電子密度を付加又は除去するメカニズム）を介して、又は誘導メカニズム（σ結合に沿って電子密度を引き込み、これにより結合を分極する電気陰性部分）を介して、電子密度を該化学的部分に向かって運び、分子の他の領域からこれを運び去る化学的部分を意味する。

本明細書中に記載された組成物、ポリマー及び複合体との関連において「化学的に安定な」とは、最初の試料調製時から測定し、室温条件下で実質的に中性ｐＨ（例えば６．８〜７．２）の緩衝溶液として３か月にわたって貯蔵したときに、そのポリマー組成物中で被る変化が５％以下である試料を意味する（すなわち、このポリマー又は複合体などは、著しく化学変化又は分解されることはなく、例えば妥当な場合には脱ペグ化又は加水分解によって、試料中に元々存在した種とは量又は構造が異なる化学種が生じることはない）。

本発明との関連において使用される「加水分解に対して抵抗性を有する」ポリマー又は組成物は、最初の試料調製時から測定し、室温条件下で実質的に中性ｐＨ（例えば６．８〜７．２）の緩衝溶液として３か月にわたって貯蔵したときに被る加水分解の程度が５％未満である、ポリマー又は組成物である。

「２又は３−置換型スクシンアミド酸」とは、置換基の位置、例えばポリマースクシンアミド酸上の活性剤の一部である求核基の位置を意味する。ここでスクシンアミド酸のカルボン酸基は炭素番号１を表し、そしてこれと隣接する位置の炭素は炭素番号２であり、以下同様である。

発明の概要
通例では、ポリマー上に位置するマレイミド基を使用して、活性剤、例えば生体分子、特に１以上の反応性チオール基を含有する生体分子にポリマーを共有結合又は複合体形成させる。このようなチオール基は、天然の基であってよく、或いは、マレイミドとのカップリングに適したチオールを含むように、生体分子を改変又は遺伝子操作されうる。或る特定のより厳密な反応条件下、例えばより高いｐＨレベルでは、生体分子上の活性アミノ基は、ポリマー誘導体上のマレイミド基に加えられて、対応する複合体を形成することもできる。一連の試験を通して出願人は、或る特定のポリマー−マレイミド誘導体が、それらの構造に応じて、活性剤との複合体形成前又は複合体形成後に加水分解されて、ポリマーの開環マレアミド酸形態を形成しやすいことを認識した。加水分解反応は、ポリマー誘導体の構造全体にだけではなく、ｐＨにも依存する。一般に、加水分解速度は、ｐＨの増大につれて高まる。加えて、結果として生じた組成物の含水量及びｐＨに応じて、乾燥ポリマー複合体組成物、例えば活性剤が非タンパク質薬物である組成物の貯蔵時に、ポリマー複合体の開環形が形成されるおそれがある。開環が生じる場合、結果として生じる組成物は、実際には、開環複合体と閉環複合体との複雑な混合物であることがある。一般には、このような加水分解は、特に長期安定性及び薬物ロットの一貫性という特徴が高く望まれる商業的な製薬組成物にとっては、問題をはらむおそれがある。

この問題に対処しようと、本発明は、或る特定のマレアミド酸ポリマー誘導体、これらの複合体、及びこれらを含有する組成物を、このようなマレアミド酸誘導型ポリマー誘導体の製造方法及び使用方法とともに提供する。本発明のポリマーは、複合体形成前に又はより好ましくは複合体形成に続いて、マレイミド環の加水分解を強制又は促進することにより、マレイミド官能化型ポリマーに伴う問題を克服するように提供される。このようにして、マレイミド（又はスクシンイミド）対応物よりも著しく安定な開環ポリマーマレアミド酸構造が提供される。好ましくは、本発明のポリマーマレアミド酸組成物は、明確に定義された実質的に不変の量のポリマーマレアミド酸又はポリマースクシンアミド酸複合体を有しているので、本発明の組成物は、哺乳動物患者に投与するための医薬組成物として使用するのに特に適している。

このアプローチの概要を行う２つの反応スキーム例を図１及び図２に提供する。反応スキームＩ（図１）は、ポリマー−マレイミド（構造Ｉ）及びポリマーマレアミド酸（構造ＩＩ）の双方と、生体活性分子、この場合はタンパク質のチオール基との反応を示す。図１及び２に示された反応条件は一例にすぎず、本発明を限定するものではない。反応スキームＩＩ（図２）も同様に、ポリマーマレイミド及びポリマーマレアミド酸の双方と、生体活性分子、この場合はタンパク質のアミノ基との反応を示す。それぞれのスキームにおいて、複合体形成されたスクシンアミド酸生成物の異性体構造の両方が示されている（構造ＩＶ及びＶ。ここでＩＶ−Ａ及びＶ−Ａはチオール複合型ポリマースクシンアミド酸に相当し、またＩＶ−Ｂ及びＶ−Ｂはアミノ複合型ポリマースクシンアミド酸に相当する）。入来する求核基を、マレイミド環の二重結合の２つの炭素Ｃ−２又はＣ−３のいずれかに付加することから、２つの異なる生成物が生じる。

図１又は図２を見ると、活性剤とポリマーマレアミド酸ＩＩとを複合体形成することはできるものの、その反応は特に遅い。このような理由から、所望のスクシンアミド酸複合体に至る、より好ましいルートは、全体的に構造ＩＩＩとして示すようなポリマースクシンイミド複合体を加水分解することによるものである。すなわち、対応するポリマーマレイミド誘導体と比較して、マレアミド酸ポリマー誘導体は、対応複合体を形成するための、求核基との反応性が低い。従って、ポリマーマレイミドとの複合体形成に続いて開環する方が、ポリマーマレイミドの開環に続いて複合体形成するよりも一般には好ましいものの、これらのアプローチは結果として両方とも、全体的に構造ＩＶ及びＶとして示されたポリマー−スクシンアミド酸複合体を形成する。

マレアミド酸ポリマー誘導体、スクシンアミド酸ポリマー誘導体、及び複合体の形成
ポリマーマレイミド
一般に、ここで提供される方法は、ポリマーマレイミドで始まる。ポリマーマレイミドは、商業的な供給元、例えばNektar, Huntsville, Alabamaから入手することができる。例えば、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、及びｍＰＥＧ−ＭＡＬのようなポリマーマレイミドが、広範囲の分子量でＮｅｋｔａｒから市販されている。これらのポリマーに対応するマレイミドは、「Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications」と題されたNektarカタログ 2001第8頁に見いだされ、これらは本明細書中に援用される。

或いは、本発明のポリマーマレイミドは、下記のものを含む多数の合成ルートのうちのいずれかによって製造することができる。１のアプローチにおいて、ポリマー・セグメント（すなわち活性化型ポリマー・セグメント）に結合された官能基と、二官能性試薬の官能基とを反応させることにより、マレイミドを末端基とするポリマーを製造する。二官能性試薬はその官能基のうちの一方として、マレイミド、又はマレイミドに変換することができる官能基、例えばアミノ基を有する。ポリマー・セグメントと二官能性試薬とを反応させる結果として、典型的には加水分解安定性リンケージを介して、試薬とポリマー・セグメントとの共有結合が生じることにより、ポリマーマレイミド又はポリマーマレイミド前駆体を提供する。

例えば、二官能価試薬は構造Ａ−Ｌ−Ｂを有してもよい。ここで、Ａは第１官能基であって、この第１官能基は、ポリマー・セグメント上の第２官能基と反応性であることによりリンケージＬを形成して、これによりＰＯＬＹ−Ｌ−Ｂを形成し、Ｂはマレイミド、又はマレイミドに容易に変換することができる官能基（例えばメトキシカルボニルマレイミドとの反応によりマレイミドに変換できるアミン）である。上記アプローチの場合、Ａは、数多くの官能基、ハロ、ヒドロキシル、活性エステル（例えばＮ−スクシンイミジルエステル）、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、チオール、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、及び、活性化型ポリマー試薬上の標的基と反応するのに適したエポキシドのうちのいずれかでありうる。

ポリマーアミンＰＯＬＹ−Ｌ_0.1−ＮＨ₂を出発材料又は中間体として利用するアプローチを採用する事例において、例えば無水マレイン酸を使用してアミンをマレイミドに変換することができる。好ましくは、例えばクロマトグラフィー又は任意のその他の好適な方法によって、マレイミド基への変換前にポリマーアミンを精製して、最終マレイミド生成物の純度を改善する。１つの特定のアプローチの場合、ポリマー・アミンを無水マレイン酸と先ず反応させることにより、開環アミドカルボン酸中間体を形成し、次いで、無水酢酸及び酢酸塩、例えば酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムの存在下において中間体を加熱することにより、この中間体を第２工程において閉じる。好ましくは、中間体は約５０℃〜約１４０℃の温度で、約０．２〜約５時間にわたって加熱する。

或いは、試薬、例えばＮ−メトキシカルボニルマレイミド又はエキソ−７−オキサ［２．２．１］ビシクロヘプタン−２，３−ジカルボン酸無水物と反応させることにより、ＰＯＬＹ−Ｌ_0.1−ＮＨ₂上のアミノ基をマレイミドに転換することもできる。

代表的なポリマー・マレアミド酸及びポリマースクシンアミド酸複合体（後続の項で提供）に対応する構造を、上記の対応する出発物質及び中間体にまで拡大適用することができる。

活性剤との複合
当該技術分野に周知である適切な反応条件を使用して、ポリマーマレイミドを生体活性分子又は活性剤にカップリングする。正確な条件が、特定の活性剤、マレイミド基に対するマイケル型付加を施されることになる正確な求核基、及びポリマー試薬自体などに応じて当然変化する。

適切な複合条件は、ポリマーマレイミドと活性剤とを複合体形成するのに十分な時間、温度、ｐＨ、試薬濃度、及び溶媒などの条件である。具体的な条件は中でも、活性剤、所望の複合タイプ、及び反応混合液中の他の物質の存在などに依存する。いかなる特定の事例においても複合を生じさせるのに十分な条件は、本明細書の開示内容、関連文献の引用を読めば、且つ／又は日常の実験を通して、当業者によって決定されうる。

複合条件の例は、約６〜約１０のｐＨで、例えば約６．０、６.５、７.０、７.５、８.０、８.５、９.０、９.５、又は１０．０のｐＨで複合反応を実施することを含む。より好ましくは、ポリマーマレイミドは典型的には、ｐＨ約６〜約９．５、より好ましくはｐＨ約７〜約９、さらにより好ましくはｐＨ約７〜約８で、スルフヒドリル含有活性剤に結合される。最も好ましくは、チオール選択的複合体がｐＨ約７で行われる。

反応温度は生体分子の反応性に大きく依存し、典型的には０℃〜７５℃、好ましくは１０℃〜４５℃、より好ましくは１８℃〜２８℃でありうる。これよりも温度が高いと、より反応性の高い生体分子を失活させることがあるが、より反応抵抗性の生体分子を変換させることが必要となる場合もある。

複合反応は、緩衝剤、例えばリン酸又は酢酸緩衝液又は類似の系中で行うことができる。
一般に、僅かにモル過剰の、例えば１．５〜１５倍のモル過剰、好ましくは２倍〜１０倍のモル過剰のポリマーマレイミドを採用する。生体活性分子に対する前駆ポリマーのモル比は１．０〜５０、好ましくは１．０〜８．０、より好ましくは１．０４〜１．５であってよい。ポリマー試薬と活性剤との比の例は、モル比約１：１（ポリマー試薬：活性剤）、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、又は１０：１を含む。複合反応は、更なる複合が実質的に発生しなくなるまで、進行させておかれる。更なる複合が実質的に発生しなくなるのは、一般に、時間に対して反応の進行をモニタリングすることによって決定されうる。種々の時点で反応混合物からアリコートを回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、又は任意のその他の適切な分析法によって反応混合物を分析することによって、反応の進行をモニタリングすることができる。形成された複合体の量、又は残った未複合ポリマーの量に関してプラトに達したら、反応は完了したと想定される。

この場合もまた、反応時間は特定の活性剤の反応性の関数であり、そして活性剤の反応が遅くしかも活性剤が温度に対して鋭敏である場合には、反応時間は長くなる。このような場合、適度の反応温度によって達成されるより長い反応時間が必要となることがある。典型的な反応時間は、典型的には小規模の試行反応によって測定して、やはり成分の反応性に応じて、５分〜１０日間、好ましくは３０分〜４８時間、そしてより好ましくは２〜１７時間であってよい。場合により、かき混ぜ（例えば撹拌、震盪など）によって、カップリング反応を促進する。立体障害を受けたスルフヒドリル基に対しては、所要反応時間が著しく長くなる場合がある。

アミノ基との反応はチオール基との反応と比較して、高いｐＨで進行するが、しかし相対的に遅い。
特定の反応条件及び方法は、活性分子が少なくとも部分的な活性を維持するように形成されるべきである。
こうして製造された複合体は、分析法、例えばＭＡＬＤＩ、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法、及び／又はクロマトグラフィーを用いて、さらに特徴付けすることができる。ポリマレイミドに対する活性剤のマイケル型付加から生じたポリマー複合体を、ここでは、ポリマースクシンイミド複合体又は複合型ポリマースクシンイミド（例えば構造ＩＩＩ）と呼ぶ。

マレイミド環加水分解
ポリマーマレイミド又は複合型ポリマースクシンイミド（それぞれ構造Ｉ及びＩＩＩに対応）を手に入れたら、次いでポリマー種を加水分解によりその開環形にする。ポリマーマレイミドで始める場合、対応する開環形をここでは、構造ＩＩに対応するポリマーマレアミド酸と呼ぶ。複合型ポリマースクシンイミド（ＩＩＩ）から誘導される場合、対応する開環形をここでは、構造ＩＶ又は構造Ｖに対応する複合型ポリマースクシンアミド酸と呼ぶ。構造ＩＶ及びＶは構造異性体であり、活性剤の求核基の結合点だけが異なっている。マレイミドに対するマイケル型付加反応を施される入来求核基が、Ｃ１と称される開環型の最終カルボキシル炭素に対して、Ｃ２位に、又はＣ３位に加わる。

一般に、ポリマーのマレイミド基を測定可能な程度まで加水分解するのに効果的な条件下で、好ましくは活性剤に複合されたポリマーマレイミドを水性塩基に暴露することにより、複合型スクシンアミド酸を製造する。好ましくは、加水分解反応は、反応条件（水量、温度、反応物質の相対モル比など）を調節して所望の程度の加水分解又は開環を達成することにより行われる。典型的には、加水分解反応は閉環ポリマー対応物に対して、複合型又は非複合型の、少なくとも約１５％超のポリマー開環形を形成するように実施される。ここでポリマースクシンアミド酸複合体に焦点を絞ると、本発明の特に好ましい組成物は、その加水分解されていないポリマー対応物に対して、最小約３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は本質的に１００％の複合型ポリマースクシンアミド酸を含有する。例えば、６０％のポリマースクシンアミド酸複合体を含む加水分解されたポリマー組成物は、従って４０％の複合型ポリマー・スクシンイミド（その閉環ポリマー対応物）を含有することになる。

最も好ましくは、加水分解は完了するまで、すなわち、複合体中のポリマーマレイミド又はスクシンイミド基の全てが開環系に変換され、その結果生じる組成物に、検出可能な量の閉環形が事実上存在しなくなるまで行われる。完全に開環されたポリマー複合体が最も好ましい。なぜなら、開環反応のために採用された加水分解条件下では、これらの複合体が逆反応、すなわち脱水分解反応をうける傾向が最小限であるからである。上記部分的に開環された組成物に対して、完全に開環された組成物は、更なる化学転換、例えば脱ペグ化又は加水分解に対して最も安定である。

特に好ましい組成物は、約５０重量％未満の閉環形態、又は約４０％未満の閉環形態を含有する組成物である。より好ましくは、約３０重量％未満、又はより好ましくは約１５％未満の閉環形態を有する組成物である。さらにより好ましいのは、約１０重量％未満、約５重量％未満、又は約２重量％以下の閉環形態を含む組成物である。

加水分解を生じさせるために採用される条件に目を向けると、加水分解は一般には塩基条件下で行われる。反応混合物又は溶液のｐＨを中性ｐＨよりも高くすることにより、開環反応を事実上強制的に完成させることができる。最も効率的な（最も短い）反応時間を達成するために、可能な限りの高いｐＨ、例えば最大約１２で加水分解を実施して、活性剤の活性又は完全性に不都合な影響を与えることなく、開環を達成することが望ましい。

塩基により促進される開環は、塩基溶液又は固体支持体物質、すなわちイオン交換器に結合された塩基を使用して行うことができる。好ましい塩基は、望ましくない副反応を被ることなしに、適度に迅速な開環のための適正ｐＨを提供する塩基である。塩基の例は、アルカリ金属、例えばナトリウム又はカリウム金属；アルカリ金属水酸化物、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムなど；並びに水酸化第４級アンモニウム、例えば水酸化テトラアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、及び水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムを含む。

加水分解はｐＨ約６〜約１２で行われるのが典型的である。すなわち、加水分解は、約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、又は１２．０から選択されたｐＨで行われる。好ましいｐＨは約７．５〜１１の範囲である。

加水分解反応は、場合により緩衝剤を含んでよい。緩衝剤の例は、有機緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、すなわち４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペルジンエタンスルホン酸；並びに、アニオンのナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩、例えばクエン酸塩、アルキルスルホン酸塩、水酸化物、酢酸塩、炭酸塩、四ホウ酸塩、重炭酸塩、リン酸塩及びリン酸水素塩のような緩衝剤を含む。理想的には、大規模なプロセスを実施する前に、特定のマレイミド又はマレイミド複合体を伴う特定の塩基及び任意の緩衝系を、小さい規模で評価することにより、変換速度が受け入れられる範囲のものであること、そして不所望な副反応が生じないことを確認するべきである。

加水分解範囲を生じさせる適切な温度は、約４℃〜約７５℃、好ましくは約０℃〜約６０℃、より好ましくは約１５℃〜約４５℃、及びより好ましくは約１８℃〜約３０℃である。前述のように、反応時間はｐＨ依存性である。反応時間は典型的には、約５分〜数日間、例えば副反応が明らかではない場合には９６時間以上となる。しかし好ましい時間は約３０分〜約２４時間であり、より好ましくは約２時間〜約１７時間である。撹拌を場合により用いて、反応を促進することができる。

或る特別な場合、例えば、緩衝剤及びポリマーまれ意味度の特定の濃度でのいくらかの緩衝液が存在する場合、開環反応が時間とともに遅くなるおそれがある。安定した反応速度を得るためには、採用された加水分解条件下で所定の時間にわたって安定したｐＨを提供する緩衝剤系を使用することが好ましく、或いは、ｐＨをモニタリングし、必要な場合には塩基を定期的に添加することにより、一定のｐＨ範囲を維持することもできる。しかしながら、完全な開環を得るために一定ｐＨが必要とはされないということが強調されるべきである。

理想的には、ポリマー・スクシンイミド複合体を、十分な温度でそして十分な時間にわたって塩基に晒すことにより、所望の開環度を達成する。開環反応は所定のｐＨ値範囲にわたって起こりうるので、例えばより高いｐＨで、短い反応時間を達成するようにバランスをとること、そして、より大きな程度の加水分解を優先すること、例えば、望ましくない生成物混合物又は失活された活性剤をもたらすおそれのある競合的副反応の発生可能性に抗して、スクシンイミド環の事実上全てが加水分解された完全加水分解組成物を形成することが好ましい。従って、小規模の試行反応を通して、不所望な副反応を最小化するｐＨを選ぶのが理想的である。例えば５．０〜６．５のｐＨ値では、副反応は最小であるが、しかしポリマーマレイミド又はこれらの複合体の開環は極めて遅く、しばしば禁止された程度である。

例えば、Nektar(Huntsville, AL)から得られるｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ、以下の構造ＶＩＩ：

は、対応するマレアミド酸を形成するための或る特定の条件下で、極めて制限された度合いのマレイミド環の加水分解を受ける。開環反応の動態に対応するデータを実施例２に提供する。

この場合もやはり、ポリマー誘導体を生体活性分子と複合体形成するように意図されるならば、加水分解反応条件及び方法論は、生体活性分子が少なくとも部分的な活性を維持するようにするべきであることは理解されるべきである。

加水分解に続いて、ポリマー・スクシンアミド酸複合体を含有する反応混合物のｐＨは典型的には、約５．５〜８のｐＨに調節される。次いで組成物は任意には脱塩され、そして例えば凍結乾燥により乾燥させられる。次いで、その結果として生じる組成物は、所望の場合には、例えば沈澱又はクロマトグラフィーによってさらに精製することができる。利用することができる種々異なるクロマトグラフィー分離アプローチは、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ゲル透過クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。１つの特に好ましいアプローチはイオン交換クロマトグラフィーであり、該イオン交換クロマトグラフィーは、カルボン酸官能性を有するポリマースクシンアミド酸複合体を、対応する閉環複合型ポリマー・スクシンイミドから分離する上で有利である。開環の程度が完全ではない、すなわち、加水分解がまだ完了に至っていない組成物にとって、組成物のｐＨを下げ、そして例えば凍結乾燥によって組成物を乾燥させることは特に有利である。なぜなら、低いｐＨ及び水が存在しないと、更なる加水分解が優先されないからである。こうして、反応混合物の組成物は、或る非平衡量の開環形態おいて事実上「凍結」され、すなわち化学的に安定である。

さらに、本明細書中に記載されたポリマー・スクシンアミド酸複合体を含有する組成物をさらに精製して、異なるＰＥＧ化スクシンアミド酸種を獲得／分離することもできる。或いは、より低分子量のＰＥＧ、例えば分子量約２０キロダルトン未満、好ましくは約１０キロダルトン以下のＰＥＧでは、妥当な場合、生成物混合体を精製して、１タンパク質分子当たり特定数前後のＰＥＧの分布を得ることができる。例えば生成物混合体を精製して、１タンパク質当たり平均１〜５個のＰＥＧ、典型的には１タンパク質当たり平均約３個のＰＥＧをいかなる場所でも得ることができる。最終的な複合体反応混合体を精製するための戦略は、多数のファクター、例えば採用されるポリマーの分子量、特定のタンパク質、所望の投与計画、並びに、個々の複合体種の残留活性及びin vivo特性に依存することになる。このアプローチは、ＰＥＧマレイミドと、所与のタンパク質内部で典型的にはスルフヒドリル基よりも多量に存在するタンパク質アミノ基とを反応させることによって製造された複合体に対して、より一般的により適用可能である。

所望されるならば、種々異なる分子量を有するＰＥＧ複合体は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して分離することができる。このアプローチを用いて、種々異なる分子量を有するＰＥＧ複合体を分離することはできる一方で、このアプローチは、タンパク質内部に異なるペグ化部位を有する位置異性体を分離するためには、一般に有効ではない。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、ＰＥＧ１−ｍｅｒ、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒなどの混合体を互いに分離することができる一方で、回収されたＰＥＧ−ｍｅｒ組成物のそれぞれは、そのタンパク質内の異なる反応性アミノ基（例えばリジン残基）に結合されたＰＥＧを含むことがある。

このタイプの分離を実施するのに適したゲル濾過カラムは、Amersham Biosciencesから入手可能なSuperdex（商標）及びSephadex（商標）カラムを含む。具体的なカラムは、所望の分画範囲に応じて選択されることになる。非アミン系緩衝剤、例えばリン酸緩衝液又は酢酸緩衝液などを用いて、溶出が一般に行われる。数多くの種々異なる方法、例えば、（ｉ）タンパク質含量に対応する２８０ｎｍにおけるＯＤ、（ｉｉ）ＢＳＡタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量に関するヨウ素試験（Sims G. E. C.他、Anal. Biochem. 107, 60-63, 1980）によって、或いは、（ｉｖ）ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動させ、続いてヨウ化バリウムで染色することによって、回収された分画を分析することができる。

例えばＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム(Amersham Biosciences又はVydac)を用いた逆相クロマトグラフィーによって、或いは、イオン交換カラム、例えばAmersham Biosciencesから入手可能なSepharose（商標）イオン交換カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによって、位置異性体を分離することができる。いずれの方法も、同じ分子量を有するＰＥＧ−生体分子異性体（位置異性体）を分離するために使用されうる。

複合体形成ステップ並びに場合により付加的な分離ステップに続いて、得られたＰＥＧ−複合体の意図された用途に応じて、複合体混合物は濃縮され、滅菌濾過され、そして約−２０℃〜約−８０℃の低温で貯蔵されうる。或いは、残留緩衝剤を伴って又は伴わずに複合体を凍結乾燥させ、凍結乾燥粉末として貯蔵されうる。いくつかの事例において、複合体形成のために使用された緩衝剤、例えば酢酸ナトリウムを、凍結乾燥中に容易に除去することができる揮発性緩衝剤、例えば炭酸アンモニウム、又は酢酸アンモニウムと交換し、その結果凍結乾燥されたタンパク質複合体粉末製剤には、残留緩衝剤が存在しないようにすることが好ましい。或いは、製剤緩衝剤を用いて緩衝剤交換ステップは使用され、その結果凍結乾燥された複合体は、製剤緩衝剤に戻すのに適し、そして最終的には哺乳動物への投与に適した形にすることもできる。

前駆マレイミドポリマー誘導体及びポリマースクシンアミド酸複合体
本発明において有用な前駆マレイミドポリマー誘導体は、一般には、水溶性ポリマー・セグメントにカップリングされた少なくとも１のマレイミド置換基を含む。マレイミド置換基（単数又は複数）は、水溶性ポリマー・セグメントに直接共有結合することができ、或いはリンク基（linking group）Ｌを介してポリマー・セグメントに結合することもできる。一般化構造を以下のＩに示す。この式において、任意のリンカーはＬと称され、Ｌ₀はリンカーのが存在しないことを示し、Ｌ₁はリンカーが存在することを示す。

対応するポリマーマレアミド酸ＩＩ、並びにポリマースクシンアミド酸複合体ＩＶ及びＶは、以下に与えられる構造を有する。これらの構造は全て相互関連しているので、ＰＯＬＹ及びＬに関して本明細書中に与えられた説明及び実施態様は、これらの構造全てに等しく適用する。

ポリマー・セグメント
上記構造例に示すように、本発明のポリマー試薬及び複合体は、水溶性ポリマーセグメントを含む。代表的なＰＯＬＹは、ポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレン・グリコールとポリプロピレン・グリコールとのコポリマー、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、多糖、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、及びポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）を含む。ＰＯＬＹは、上記のうちのいずれかのホモポリマー、交互コポリマー、ランダム・コポリマー、ブロック・コポリマー、交互トリポリマー、ランダム・トリポリマー、又はブロック・トリポリマーを含む。水溶性ポリマー・セグメントは、好ましくはポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」又はその誘導体であるが、必ずしもそうである必要はない。

ポリマー・セグメントは、数多くの異なる位置のいずれかを有することができ、例えばＰＯＬＹは線状、分枝状、又はフォーク状でありうる。最も典型的には、ＰＯＬＹは線状、又は例えば２つのポリマー・アームを有する分枝状である。本明細書中の論議のほとんどは、ＰＯＬＹの一例としてＰＥＧに焦点を当てているが、上記水溶性ポリマー・セグメントのいずれをも包含するように、本明細書中に提供される論議及び構造を容易に拡大されうる。

少なくとも１の反応性マレイミド末端を有する任意の水溶性ポリマーを使用して、本発明に従ってポリマースクシンアミド酸複合体を製造することができる。そして本発明はこの点において限定されることはない。単一の反応性マレイミドだけを有する水溶性ポリマーを使用することができるが、本発明中で前述した開環形態への変換に適した、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又はそれ以上の反応性マレイミドを有するポリマーを使用することができる。水溶性ポリマー・セグメントと連携するマレイミド又はアミノ前駆体部分の数の上限の非限定的な例は、約１〜約５００個、約１〜約１００個、約１〜約８０個、約１〜約４０個、約１〜約２０個、及び約１〜約１０個を含む。

ここで好ましいＰＯＬＹに目を向けると、ＰＥＧは、その線状、分枝状、又は多アーム形態のうちのいずれかにおける形のポリ（エチレングリコール）を包含し、末端キャップされたＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、吊り下げ型ＰＥＧ、及びあまり好ましくないものとしては、モノマー・サブユニットを分離する１以上の分解可能な結合を含有するＰＥＧを含み、これらを下記により十分に説明する。

ＰＥＧポリマー・セグメントは、−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−を含み、この式中、（ｎ）は典型的には約３〜約４，０００、又は約３〜約３，０００、又はより好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。

ＰＯＬＹは、末端キャップされることがあり、例えばＰＥＧが不活性末端キャップ基で末端をキャップされる末端キャップされたＰＥＧである。好ましい末端キャップされるＰＥＧは、末端キャップ部分として、例えばアルコキシ、置換アルコキシ、アルケニルオキシ、置換アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、置換アルキニルオキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシを有するＰＥＧである。好ましい末端キャップ基はメトキシ、エトキシ、及びベンジルオキシである。末端キャップ基は有利には、リン脂質を含むこともできる。リン脂質の例は、ホスファチジルコリン、例えばジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンを含む。しかし１の実施態様では、本発明のポリマーには、脂肪酸基又はその他の親油性部分は実質的に存在しない。

ポリマー・セグメント、ＰＯＬＹを含有する構造のいくつかをここで参照すると、ＰＯＬＹは以下の：
「Ｚ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−」又は「Ｚ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−」
[式中、ｎは約３〜約４０００、又は約１０〜約４０００であり、そしてＺは官能基であるか又は官能基を含み、該官能基は、反応気又は末端キャップ基であってよい]
に相当するか又はこれを含んでもよい。Ｚの例は、ヒドロキシ、アミノ、エステル、カーボネート、アルデヒド、アセタール、アルデヒド水和物、ケトン、ケタール、ケトン水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、スルホン、チオール、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジド、尿素、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、アルコキシ、ベンジルオキシ、シラン、脂質、リン脂質、ビオチン、及びフルオレセインを含み、そして妥当な場合にはこれらの活性化形態及び保護形態を含む。好ましいのは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル・エステル、ベンゾトリアゾリル・カーボネート、アミン、ビニルスルホン、マレイミド、Ｎ−スクシンイミジル・カーボネート、ヒドラジド、スクシンイミジル・プロピオネート、スクシンイミジル・ブタノエート、スクシンイミジル・スクシネート、スクシンイミジル・エステル、グリシジル・エーテル、オキシカルボニルイミダゾール、ｐ−ニトロフェニル・カーボネート、アルデヒド、オルトピリジル−ジスルフィド、及びアクリロールである。

これらの及びその他の官能基Ｚは、以下の参考文献に記載されており、これら全ては本明細書中に援用される。Ｎ−スクシンイミジル・カーボネート（例えば米国特許第5,281,698号、第5,468,478号参照）、アミン（例えばBuckmann他、Makromol.Chem. 182:1379(1981)、Zalipsky他、Eur. Polym. J. 19:1177(1983)参照）、ヒドラジド（例えばAndresz他、Makromol. Chem. 179:301(1978) 参照）、スクシンイミジル・プロピオネート及びスクシンイミジル・ブタノエート（例えばOlson他、Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications、第170-181頁、Harris & Zalipsky編、ACS, Washington, DC, 1997参照;米国特許第5,672,662号明細書も参照）、スクシンイミジル・スクシネート（例えばAbuchowski他、Cancer Biochem. Biophys. 7:175(1984)及びJoppich他、Makromol. Chem. 180:1381(1979)参照）、スクシンイミジル・エステル（例えば米国特許第4,670,417号参照）、ベンゾトリアゾールカーボネート(例えば米国特許第5,650,234号明細書参照)、グリシジル・エーテル(例えばPitha他、Eur. J. Biochem. 94:11(1979)、Elling他、Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991)参照)、オキシカルボニルイミダゾール（例えばBeauchamp他、Anal. Biochem. 131:25(1983)、Tondelli他、J. Controlled Release 1:251(1985)参照）、ｐ−ニトロフェニル・カーボネート（例えばVeronese他、Appl. Biochem. Biotech., 11:141(1985);及びSartore他、Appl. Biochem. Biotech., 27:45(1991) 参照）、アルデヒド（例えばHarris他、J. Polym. Sci. Chem.編、22:341(1984)、米国特許第5,824,784号及び第5,252,714号参照）、マレイミド（例えばGoodson他、Bio/Technology 8:343(1990)、Romani他、Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984)、及びKogan, Synthetic Comm. 22:2417(1992)参照）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えばWoghiren他、Bioconj. Chem. 4:314(1993)参照）、アクリロール(例えばSawhney他、Macromolecules, 26:581(1993)参照)、ビニルスルホン（例えば米国特許第5,900,461号参照）。

この場合もやはり、すぐ上に示したＰＯＬＹ構造は、線状ポリマー・セグメントを表してもよいし、或いは分枝状又はフォーク状ポリマー・セグメントの一部を形成してもよい。ポリマー・セグメントが分枝状である場合、すぐ上に示したＰＯＬＹ構造は、例えばＰＯＬＹ構造全体のポリマーアーム形成部分に相当してもよい。或いは、ＰＯＬＹがフォーク状構造を有する場合、上記ＰＯＬＹ構造は、例えば分枝点の前のポリマー・セグメントの線状部分に相当しうる。

ＰＯＬＹは、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のアームを有する分枝状ＰＥＧ分子に相当してもよい。本発明のポリマー・マレイミドを製造するために使用される分枝状ポリマーは、いずれかの場所に２〜３００個の反応性末端を有してもよい。２又は３個のポリマーアームを有する分枝状ポリマー・セグメントである。米国特許第5,932,462号に記載された分枝状ＰＯＬＹの例は、以下の：

[式中、Ｒ”は非反応性部分、例えばＨ、メチル又はＰＥＧであり、そしてＰ及びＱは非反応性の結合である]
で表される構造に対応する。好ましい実施態様では、分枝状ＰＥＧポリマー・セグメントは、メトキシ・ポリ（エチレン・グリコール）二置換型リジンであり、そして以下の：

に相当する。

上記特定の分枝状形態において、分枝状ポリマー・セグメントは、本明細書中に記載されるリンカーを介して反応性マレイミド基を位置決めするための「Ｃ」分枝点から延びる単一の反応性部位を有する。分枝状ＰＥＧ、例えば本発明において使用するためのＰＥＧは、典型的には、４未満のＰＥＧアーム、より好ましくは２又は３のＰＥＧアームを有することになる。このような分枝状ＰＥＧは、線状ＰＥＧ対応物よりも大きくより高密度のポリマー群とカップリングされた単一の反応性部位を有するという利点を提供する。

分枝状ＰＥＧマレイミドの１の特定のタイプは、構造：（ＭｅＯ−ＰＥＧ−）_iＧ−Ｌ_0.1−ＭＡＬに対応し、この式中、ＭＡＬはマレイミドを表し、ｉは２又は３と等しく、そしてＧはリジン又はその他の適切なアミノ酸残基である。

本発明の分枝状ポリマーマレイミドの例は以下の：

[式中、Ｌは本明細書中に記載されたリンカーのいずれかである]
に表される構造を有する。

上に一般的に示した分枝状構造を有するＰＥＧマレイミドの例は、構造ＶＩＩに相当する。
本発明のポリマー・マレイミドを製造する際に使用するための分枝状ＰＥＧは、加えて、式Ｒ（ＰＥＧ）_nによってより一般的に表されるＰＥＧを含む。この式中、Ｒは、そこから２以上のＰＥＧアームが延びる中央又はコア分子である。変数ｎはＰＥＧアームの数を表し、ポリマーアームのそれぞれは独立して末端キャップすることができ、或いは、その末端に反応性官能基、例えばマレイミド又はその他の反応性官能基を有する。複数のアームを有する本発明のこのような実施態様の場合、各ＰＥＧアームは典型的にはその末端にマレイミド基を有している。分枝状ＰＥＧ、例えば上記式Ｒ（ＰＥＧ）_dによって総体的に表されるＰＥＧは、２〜約３００個のポリマーアーム（すなわちｎは２〜約３００）を有している。これらのような分枝状ＰＥＧは好ましくは、２〜約２５個、より好ましくは２〜約２０個、そしてさらにより好ましくは２〜約１５個以下のポリマーアームを有している。最も好ましいのは、３、４、５、６、７、又は８個のアームを有する多アーム状ポリマーである。

上記分枝状ＰＥＧ内の好ましいコア分子は、ポリオールである。このようなポリオールは、炭素原子数１〜１０及びヒドロキシル基数１〜１０を有する脂肪族ポリオールを含み、これらは、エチレングリコール、アルカンジオール、アルキルグリコール、アルキリデン・アルキルジオール、アルキル・シクロアルカン・ジオール、１，５−デカリンジオール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキリデン・ジオール、ジヒドロキシアルカン、及びトリヒドロキシアルカンなどを含む。脂環式ポリオールを使用してもよい。脂環式ポリオールは、直鎖状又は閉環状の糖及び糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ザイリトール、ケブラキトール、スレイトール、アラビトール、エリスリトール、アドニトール、ズルシトール（dulcitol）、ファコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タギトース、ピラノシド、スクロース、ラクトース、及びマルトースなどを含む。更なる脂肪族ポリオールは、グリセルアルデヒド、グルコース、リボース、マンノース、ガラクトース及び関連立体異性体の誘導体を含む。使用することができるその他のコア・ポリオールは、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン及びその他の炭水化物、例えばデンプン及びアミロースを含む。好ましいポリオールは、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール及びトリメチロールプロパンを含む。

上記タイプの代表的な多アーム状ポリマー構造は：

[式中、ｄは、３〜約１００の整数であり、そしてＲは、３つ以上のヒドロキシル基、アミノ基又はこれらの組合わせを有する中央コア分子の残基である]
である。

本発明のポリマーマレイミドを製造する際に使用するための多アーム状ＰＥＧは、Nektar(Huntsville, Alabama)から入手可能な多アーム状ＰＥＧを含む。好ましい実施態様では、本発明の多アーム状ポリマーマレイミドは、以下の：

[式中、
ＰＥＧは、−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₂ＣＨ₂−であり、
Ｍは以下の：

であり、そして
ｍは３、４、５、６、７、及び８からなる群から選ばれる]
に相当し、ここで、分子のリンカーで結合されたマレイミド部分の詳細は、本明細書の別の箇所に記載される。

或いは、ポリマーマレイミドは、全体としてフォーク状の構造を有していることもある。フォーク状ＰＥＧの例は以下の：

[式中、ＰＥＧは、本明細書中記載されたＰＥＧの形態のいずれかであり、Ａはリンク基、好ましくは加水分解に対し安定なリンケージ、例えば酸素、硫黄、又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｆ及びＦ´は、場合により存在する加水分解に対し安定なスペーサ基であり、そしてその他の変項Ｌ及びマレイミド（ＭＡＬ）は上で定義した通りである]
出表される構造に相当する。Ａ、Ｆ及びＦ´に相当するリンカー基及びスペーサ基の例は、国際出願PCT/US99/05333号に記載されており、そして本発明における使用のためにこのタイプのポリマー・セグメントを形成する際に有用である。Ｆ及びＦ´は、同じであっても異なっていてもよいスペーサ基である。上の１の特定の実施態様では、ＰＥＧはｍＰＥＧであり、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−に相当し、Ｆ及びＦ´は両方ともメチレン又は−ＣＨ₂−である。このタイプのポリマー・セグメントは、２個の活性剤との反応にとって有用である。ここで２個の活性剤は、Ｆ及びＦ´の選択に応じて、正確な又は所定の間隔を置いて位置決めされる。
分枝状、フォーク状ＰＥＧの例は、以下の：

で表される構造を有し、ここで、分枝状部分は左側に位置し、そして２つのマレイミド基がそこから延びているフォーク状部分が右側に位置している。

或いは、本発明のポリマー・マレイミドを製造する際に使用するためのＰＥＧポリマー・セグメントは、末端にではなくＰＥＧ鎖の長さに沿って吊り下げ型の反応性基を有するＰＥＧ分子であってもよく、これにより、リンカーＬによってＰＥＧ鎖に１以上の吊り下げ型のマレイミド基が結合された、安定化されたポリマーマレイミドが産出される。

さらに、余り好ましくはない実施態様では、ポリマー・セグメント自体が、加水分解を受ける１以上の弱い又は分解可能な結合を有することができる。ポリマー・セグメント内に存在することができる分解可能な結合の例としては、非限定的にカーボネート、イミン、ホスフェート・エステル及びヒドラゾンが挙げられる。

一般に水溶性ポリマー・セグメントＰＯＬＹの公称平均分子量は変化するだろう。ＰＯＬＹの公称平均分子量は典型的には１以上の以下の範囲内に含まれる：約１００〜約１００，０００ダルトン；約５００〜約８０，０００ダルトン；約１，０００〜約５０，０００ダルトン；約２，０００〜約２５，０００ダルトン；約５，０００〜約２０，０００ダルトン。水溶性ポリマー・セグメントＰＯＬＹの公称平均分子量の例は、約１，０００ダルトン、約５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、及び約４０，０００ダルトンを含む。低分子量ＰＯＬＹの分子量は約２５０、５００、７５０、１０００、２０００、又は５０００ダルトンを有する。

ポリマー−マレイミドに相当する上記構造のうちのいずれかは、たとえ明示されていなくても、その対応するポリマースクシンアミド酸対応物をも含むものとする。このように、本明細書中に記載された全てのポリマー・マレイミド構造は、マレイミド環がその開環形を成していて、非複合型（マレアミド酸）又は複合型（スクシンアミド酸複合体）であり得ることを除いては同じ構造にまで拡大されるものとする。

リンカー
ここでリンカー部分に目を向けると、本発明のリンカー部分又は単に「リンカー」は、変項Ｌによって総体的に表される。本発明のリンカーＬは、存在するならば、典型的には約１〜約４０個の原子を含有する。リンカーは、ポリマーのマレイミド又はマレアミド酸又はスクシンアミド酸部分をポリマー・セグメントと結合する、ポリマー全体の部分である。本発明のリンカーは、単一の原子、例えば酸素又は硫黄、２つの原子、又は多数の原子であってよい。しかしリンカーは典型的には必ずしも本質的に線状でなくてもよい。リンカーの全長は、典型的には１〜約４０個の原子の範囲である。この場合、長さは単鎖内の原子数を意味し、置換基はカウントしない。例えば、−ＣＨ₂−は、リンカー全長に対して１原子とカウントされ、−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−は、３原子長とカウントされる。好ましくは、リンカーは約１〜約２０原子、又は約２〜約１５原子、又は約１〜約６原子の長さを有し、加水分解に対して安定性である。

本発明のリンカーは単一の官能基、例えばアミド、エステル、ウレタン、又は尿素であってよく、或いは、単一の官能基のいずれかの側に繋がるメチレン又は他のアルキレン基を含んでもよい。或いは、リンカーは、同じであってもよいし異なってもよい官能基の組み合わせを含んでもよい。加えて、本発明のリンカーは、場合により１以上の酸素又は硫黄原子を含有するアルキレン鎖（すなわちエーテル又はチオエーテル）でありうる。好ましいリンカーは、加水分解に対し安定なリンカーである。本明細書中の構造との関連で見ると、リンカーは、ポリマー全体の一部として考えるとき、過酸化結合（−Ｏ−Ｏ−）又は−Ｎ−Ｏ−又は−Ｏ−Ｎ−結合を含む構造全体をもたらすことがないリンカーである。

構造Ｉ， ＩＩとの関連において、本発明のリンカーは、以下の：

のいずれかであってもよく、そして前記のうちのいずれかの２以上の組み合わせであってもよい。ここで、（ｈ）は０〜６であり、（ｊ）は０〜２０であり、Ｒ⁶はＨであるか或いはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択された有機ラジカルである。

しかしながら本開示の目的上、一連の原子がポリマー・セグメントＰＯＬＹにすぐに隣接しているときには、これらの一連の原子はリンカー部分とは考えられず、そしてこれらの一連の原子は別のモノマーであるので、提案されたリンカー部分は、ポリマー鎖の単なる延長部分しか表さない。例えばこの場合におけるＰＯＬＹが「ＣＨ₃Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−」と定義される部分構造「ＰＯＬＹ−Ｌ−」を考えると、リンカー部分は「−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−」とはならない。なぜならこのような定義は、単にポリマーの延長を示すにすぎないからである。しかし換言すれば、本発明のリンカーは、１以上の隣接する−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−部分を有することはできない。例えばリンカーは、１以上の（−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−）サブユニットを含んでもよく、これらのサブユニットの一方又は両方の側面には、上記リンカー例のうちの１つ又は組み合わせが位置することができる。

本発明の１の実施態様では、リンカーは以下の：

で表される構造を有する。

上記リンカーにおいて、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれの出現においてそれぞれ独立に、Ｈ、或いは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキレンシクロアルキル、及び置換アルキレンシクロアルキルからなる群から選ばれる有機ラジカルである。上記構造において、ゼロの下付き文字は、その特定の原子又は官能基が存在しないことを示す。

単一のマレイミド末端基及びメトキシ・キャップを代表として使用して、特定のＰＥＧマレイミド構造例を、以下の構造１−４に示す。表１に示すリンカーＬを使用して、本発明のマレアミド酸ポリマー及び複合体を形成する。構造３−ＥＴによって表されるＰＥＧマレイミドは「リンカーレス」と呼ばれる。なぜなら、マレイミド環は、ＰＥＧ内の末端ヒドロキシル基を置き換えるにすぎないからである。下に示すリンカー例を、上述のポリマー・セグメントのいずれかと組み合わせて利用することができ、ｍＰＥＧを有する以下の実施態様は一例にすぎない。

一般に、リンカーが存在しない同じ水溶性ポリマーと比較して、カップリングされていないポリマーマレイミドの開環加水分解速度を高くする（速くする）のを可能にするのに効果的なリンカーが好ましい。好ましい実施態様の場合、リンク基が開環を高めることにより、マレイミドの開環加水分解速度は、室温で測定してｐＨ７．５で約１２時間以下の半減期を有する。より好ましい実施態様の場合、リンク基が開環を高めることにより、マレイミドの開環加水分解速度は、室温で測定してｐＨ９で約１２時間以下の半減期を有する。開環を容易にする好ましいリンク基は、リンカーなしのマレイミド、すなわちＬ₃−ＥＴ、短いアルキル・リンカーを有する基、例えばＬ₃−ＰＲ、マレイミド環の窒素に結合されるエチレン又はアリール基を有する基、例えばＬ₁−ＭＣＨ及びＬ₁−ｐＰＨＡＬ、マレイミド窒素原子とカルボニル基との間の短いアルキル・リンカーを有する基、例えばＬ₁−ＡＭＥＴ、及び、著しい立体障害を加水分解に与えることなしに、すなわち、環窒素に結合されたリンカー原子に分枝置換をもたらすことなしに、マレイミド環窒素からの電子吸引を増強する置換基を含有する、上記基の種々の改変形を含む。好ましいリンカーは、マレイミド又はマレイミド誘導型窒素の約６個の原子以内に、すなわち、マレイミド又はマレイミド誘導型窒素から１，２，３，４，５又は６個の原子以内、又はさらにより好ましくは約３つの原子以内に電子吸引基を有する。

本発明のポリマー及び複合体は、前述のような単官能性、二官能性及び多官能性構造を含む。
例えば、本発明のポリマー又は複合体のポリマーマレイミド前駆体は、以下の：

によって一般的に記載されうる。式中、変項は本明細書中の他の箇所で定義された通りである。
上記実施態様のでは、Ｌは同じ又は異なるものであってよい。１の特定の実施態様では、ポリマー試薬はホモ二官能性であり、すなわちＬは両方とも同じである。

スクシンアミド酸複合体
本発明の複合体の一般化された特徴は、上の詳細な様式で説明されている。ポリマー・スクシンアミド酸に共有結合された活性剤は、以下から明らかになるように、数多くのタイプの分子、実体、及び表面などのいずれかを包含する。

標的分子及び表面
本発明のポリマーマレイミド（開環及び閉環の双方）は、数多くの実体に共有結合又は非共有結合することができる。これらの実体は、フィルム、化学分離及び精製表面、固体支持体、金属／金属酸化物表面、例えば金、チタン、タンタル、ニオビウム、アルミニウム、スチール、及びこれらの酸化物、酸化ケイ素、マクロ分子、及び小分子を含む。加えて、本発明のポリマー及び方法は、生化学センサー、生体電子スイッチ、及びゲートにおいて使用することもできる。本発明のポリマー及び方法は、ペプチド合成のための担体の製造、ポリマー・コーティングされた表面及びポリマー・グラフトの製造、アフィニティ分配のためのポリマー−リガンド複合体の製造、架橋型又は非架橋型ヒドロゲルの製造、及びバイオリアクターのためのポリマー−補因子付加物の製造のために用いることもできる。

本発明の複合体を提供する際に使用するための生体活性剤は、下記のもののうちのいずれか１以上であってよい。適切な薬剤は、例えば、睡眠薬及び鎮静薬、精神賦活剤、精神安定剤、呼吸器薬、抗けいれん薬、筋肉弛緩剤、抗パーキンソン病薬（ドーパミン・アンタゴニスト）、鎮痛剤、抗炎症薬、抗不安薬（不安緩解剤）、食欲抑制薬、片頭痛薬、筋収縮剤、抗感染薬（抗生物質、抗ウィルス薬、抗真菌剤、ワクチン）、抗関節炎薬、抗マラリア薬、制吐薬、抗てんかん薬、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗癌剤、抗血栓剤、抗高血圧薬、心臓血管薬、抗不整脈薬、抗酸化剤、抗ぜんそく薬、避妊薬を含むホルモン剤、交感神経様作用薬、利尿薬、脂質調節剤、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫薬、抗凝固薬、新生物薬、抗腫瘍薬、血糖降下薬、栄養剤及びサプリメント、成長用サプリメント、抗腸炎薬、ワクチン、抗体、診断薬及び造影剤から選ばれうる。

より具体的には、活性剤は、多数の構造クラスのうちの１つに分類され、該クラスは、非限定的に、小分子（好ましくは不溶性小分子）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、多糖、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、及び電解質などを含む。好ましくは、ポリマー・マレイミドとのカップリングのための活性剤は、天然アミノ、又はスルフヒドリル基を有するか、或いは、ポリマー・マレイミドへのカップリングに適した少なくとも１の反応性アミノ又はスルフヒドリル基を含有するように改変される。

本発明のポリマーとの共有結合に適した活性剤の具体例は、非限定的に、アスパリギナーゼ、アムドキソビル（ＤＡＰＤ）、アンチド（antide）、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキン・ジフチトックス、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト（例えば約１０−４０アミノ酸長に由来するペプチドであり、国際公開第９６／４０７４９号パンフレットに記載された特定のコア配列を含む）、ドルナーゼ・アルファ、赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、血液凝固因子、例えば第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ、フォン・ウィルブランド因子；セレダーゼ、セレザイム、アルファ・グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファ・デフェンシン、ベータ・デフェンシン、エキセジン−４、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤、エルカトニン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、フィブリノーゲン、フィルグラスチム、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ベータ抗体、骨形成タンパク質、例えば骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−６、ＯＰ−１；酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、ＣＤ−４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロン、例えばインターフェロン・アルファ、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・ガンマ、インターフェロン・オメガ、インターフェロン・タウ、コンセンサス・インターフェロン；インターロイキン及びインターロイキン受容体、例えばインターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−２融合タンパク質、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−１７受容体；ラクトフェリン及びラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロ−インスリン、インスリン・アナログ（例えば米国特許第5,922,675号明細書に記載されたモノアシル化インスリン）、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチンアナログ、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インフルエンザ・ワクチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、プラスミノゲン活性化因子、例えばアルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びテネテプラーゼ；神経成長因子（ＮＧＦ）、オステオプレテゲリン、血小板由来増殖因子、組織成長因子、トランスフォーミング成長因子−１、血管内皮成長因子、白血病抑制因子、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球走化性タンパク質−１、内皮増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、チモシン・アルファ１、チモシン・アルファ１ ＩＩｂ／ＩＩＩｂインヒビター、チモシン・ベータ１０、チモシン・ベータ９、チモシン・ベータ４、アルファ−１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４（超後期抗原−４）、ＶＬＡ−４阻害剤、ビスホスフォネート、呼吸器合胞体ウィルス抗体、嚢胞性線維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、及び抗ＣＭＶ抗体が挙げられる。モノクローナル抗体の例は、エタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されたヒト７５ｋＤ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分から成る二量体融合タンパク質）、アブシキシマブ、アフェリイオモマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、イブリツモマブ・チウエキセタン、ミツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ヨウ素１３１トシツモマブ複合体、オリズマブ、リツキシマブ、及びトラスツズマブ（ハーセプチン）を含む。

ポリマーとの共有結合に適した付加的な物質の一例としては、アミフォスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、アミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、アントラサイクリン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、カンプトセシン、１３−シス・レチノイン酸、オールトランス・レチノイン酸；ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、エピネフリン、Ｌ−ドパ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロルエタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、酒石酸メタラミノール、メトトレキサート、メトクロプラミド、メキシレチン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、ピリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、ラルチトレキセド、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ドラセトロン、グラニセトロン；ホルモテロール、フルチカゾン、ロイプロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アムホテリシンＢ、ポドフィロトキシン、ヌクレオシド抗ウィルス薬、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン；マクロライド、例えばエリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フルリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシン及びスウィノリドＡ；フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキシシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシン、及びシタフロキサシン；アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、ネチルマイシン、パラマイシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメタート；ポリミキシン、例えばポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム；ペニシリナーゼ感受性物質、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶを含むペニシリン；ペニシリナーゼ耐性物質、例えばメチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリン；グラム陰性微生物活性剤、例えばアンピリジン、アモキシシリン、及びヘタシリン、シリン及びプラムピシリン；抗シュードモナル・ペニシリン、例えばカルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、及びピペラシリン；セファロスポリン、例えばセフポドキシム、セフプロジル、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロル、セファドロキシル、セファログリジン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ、及びモキサラクタム、モノバクタム、例えばアズトレオナム；及びカルバペネム、例えばイミペネム、メロペネム、イソチオン酸ペンタミジン、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ベクロメタゾンジプレピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、フルチカゾン、臭化イプラトリピウム、フルニソリド、クロモリンナトリウム、及び酒石酸エルゴタミン；タキサン、例えばパクリタキセル；ＳＮ−３８、及びチルホスチンが挙げられる。

本発明のポリマーマレイミドとカップリングするための好ましいペプチド又はタンパク質は、ＥＰＯ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、コンセンサスＩＦＮ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＩＬ−２、レミケード（インフリキシマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、シナジス（パリビズマブ）、レオプロ（アブシキシマブ）、ハーセプチン（トラスツジマブ）、ｔＰＡ、セリザイム（イミグルセラーゼ）、B型肝炎ワクチン、ｒＤＮＡｓｅ、α−１プロテイナーゼ阻害剤、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ｈＧＨ、インスリン、ＦＳＨ、及びＰＴＨを含む。

上記生体活性剤の例は、妥当な場合には、アナログ、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、異性体及びこれらの医薬として許容される塩を含むものとする。ペプチド及びタンパク質に関連して、本発明は、合成、組換え、天然、グリコシル化及び非グリコシル化形態、並びに、これらの生体活性断片を包含むものとする。上記生体活性タンパク質は加えて、結果として得られる変異体タンパク質が、親（天然型）タンパク質の少なくともある程度の活性を有している限り、置換又は欠失などをされる１以上のアミノ酸（例えばシステイン）有する変異体を含むものとする。
本明細書中に記載された複合体及び方法は、ヒドロゲル製剤にまで拡大適用されうる。

医薬組成物
本発明はまた、製薬賦形剤との組み合わせで本明細書中に提供された複合体を含む医薬組成物を含む。一般に、複合体自体は固体形態（例えば沈澱物）又は溶液の形態を成すことになる。これらの形態は、固形又は液体の形態中に存在できる適切な医薬賦形剤と混合されうる。

賦形剤の例は、非限定的に炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基及びこれらの組み合わせから成る群から選択された賦形剤を含む。

炭水化物、例えば糖、誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖、及び／又は糖ポリマーが賦形剤として存在してよい。具体的な炭水化物賦形剤は、例えば：単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、及びソルボースなど；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、及びセロビオースなど；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、及びデンプンなど；及びアルジトール、例えばマンニトール、ザイリトール、マルチトール、ラクチトール、ザイリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、及びミオイノシトールなどを含む。

賦形剤は、無機塩又は緩衝剤、例えばクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせも含みうる。

調製品は、微生物の成長を防止又は阻止するための抗菌剤を含んでもよい。本発明に適した抗菌剤の非限定的な例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジル・アルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、及びチメロサール、並びにこれらの組み合わせを含む。

調製品中には抗酸化剤が存在することもできる。抗酸化剤は、酸化を防止するために使用され、それにより、複合体又はその他の調製品成分の劣化が防止される。本発明において使用するのに適した抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒド・スルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせを含む。

界面活性剤が賦形剤として存在してよい。界面活性剤の例は、ポリソルベート、例えば「トウィーン２０」及び「トウィーン８０」、並びにプルロニック、例えばＦ６８及びＦ８８（これらは両方ともBASF(Mount Olive, New Jersey)から入手可能である）；ソルビタン・エステル；脂質、例えばリン脂質（例えばレシチン）及びその他のホフファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ただしリポソーム形態ではないことが好ましい）、脂肪酸及び脂肪エステル；ステロイド、例えばコレステロール；及びキレート剤、例えばＥＤＴＡ、亜鉛及びその他のこのような適切なカチオンを含む。

調製品中には、賦形剤として酸又は塩基が存在してよい。使用可能な酸の例は、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びこれらの組み合わせから成る群から選択された酸を含む。適切な塩基の非限定的な例は、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びこれらの組み合わせから成る群から選択された塩基が挙げられる。

医薬調製品は、全てのタイプの製剤、具体的には、注射に適した製剤、例えば再構成できる粉末、並びに懸濁液及び溶液を包含する。組成物中の複合体（すなわち活性剤と本明細書中に記載されたポリマーとの間に形成された複合体）の量は、数多くの要因に応じて変化するが、しかし、組成物が単位投与容器（例えばバイアル）内に貯蔵されると、場合により治療有効量になる。加えて、製薬調製品はシリンジ内に入れることができる。どの量が臨床上望ましい終点を作り出すかを測定するために、複合体の量を増加させながら繰り返し投与し、治療有効量を試験から見極めることができる。

組成物中の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の具体的なニーズに応じて変化することになる。典型的には、日常的に行われる試験によって、すなわち、種々の量（少量から多量まで）の賦形剤を含有する組成物を製造し、安定性及びその他のパラメータを試験し、次いで、著しい副作用なしにどの範囲において最適なパフォーマンスが得られるかを見極めることによって、任意の個々の賦形剤の最適な量が決定される。

しかし一般には、賦形剤は約１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜約９８重量％、より好ましくは約１５重量％〜約９５重量％で組成物中に存在することになり、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。

これらの前述の医薬賦形剤は、その他の賦形剤とともに、「Remington: The Science & Practice of Pharmacy」（第１９版、Williams & Williams, (1995)）、「the Physician´s Desk Reference」(第52版、Medical Economics, Montvale, NJ (1998)、及びKibbe, A.H.,「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(第3版、American Pharmaceutical Association, Washington, D.C. 2000)に記載されている。

本発明の医薬調製品は、典型的には注射を介して投与される（しかし必ずしも必要というわけではない）ので、投与直前には一般に溶液又は懸濁液の状態にある。医薬調製品は他の形態、例えばシロップ、クリーム、軟膏、錠剤、及び粉末などの形態をとりうる。他の投与様式、例えば肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、くも膜下、皮下、及び動脈内なども含まれる。

前述のように、複合体は静脈内注射によって、或いはあまり好ましくはないが筋内又は皮下注射によって、非経口投与することができる。非経口投与に適した製剤タイプは、特に、注射の準備ができた注射溶液、使用前に溶剤と組み合わせるための乾燥粉末、注射の準備ができた懸濁液、使用前に溶媒と組み合わせるための乾燥不溶性組成物、並びに投与前に希釈するためのエマルジョン及び液体濃縮物を含む。

投与方法
本発明はまた、複合体による治療に応答する病気を患う患者に、本明細書中に提供された複合体を投与する方法を提供する。この方法は、治療有効量の複合体（好ましくは医薬調製品の一部として提供される）を注射を介して全身に投与することを含む。この投与方法を用いることにより、特定の複合体の投与によって治療又は予防できる病気のいずれかを治療することができる。どの状態を特定複合物が効果的に治療できるかは、当業者に明らかである。投与されるべき実際の投与量は、患者の年齢、体重及び全身状態、並びに治療を受けている病気の重症度、医師の判断、及び投与される複合体に応じて変化することになる。治療有効量は当業者に知られており、且つ／又は、適切な参考テキスト及び参考文献に記載されている。一般に治療有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、好ましくは０．０１ ｍｇ／日〜７５ ｍｇ／日の投与量、より好ましくは約０．１０ ｍｇ／日〜５０ ｍｇ／日の投与量となる。

所与の複合体（この場合もやはり、好ましくは医薬調製品の一部として提供される）の単位投与量は、医師の判断、及び患者のニーズなどに応じて、種々の投与スケジュールで投与することができる。具体的な投与スケジュールは当業者に知られているか、或いは、日常的に行われる方法を用いて試験により決定することができる。投与スケジュールの例は日限定的に、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１週３回、１週２回、１週１回、ひと月２回、ひと月１回、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。臨床的な終点が達成されたら、組成物の投与は中止される。

本発明の複合体を投与する１つの利点は、個々の水溶性ポリマー部分を切断することができることである。このような結果は、身体からのクリアランスがポリマー・サイズに起因して潜在的に問題をはらむ場合に有利である。各水溶性ポリマー部分の切断は、最適には、生理学的に切断可能な且つ／又は酵素分解可能なリンケージ、例えばウレタン、アミド、カーボネート、又はエステル含有リンケージを使用することにより容易になる。こうして、複合体の（個々の水溶性ポリマー部分の切断を介した）クリアランスは、ポリマー分子のサイズ、及び所望のクリアランス特性を提供することになるタイプの官能基を選択することにより、調節することができる。当業者ならば、ポリマーの適正な分子サイズ、並びに切断可能な官能基を見極めることができる。例えば当業者は、日常的な試験を用いて、種々異なるポリマー重量と切断可能な官能基とを有する種々のポリマー誘導体を先ず調製し、次いでポリマー誘導体を患者に投与し、そして定期的に血液及び／又は尿をサンプリングすることによって、（定期的な血液及び尿のサンプリングによる）クリアランス・プロフィールを得ることにより、適正な分子サイズ及び切断可能な官能基を見極めることができる。一連のクリアランス・プロフィールが被験複合体毎に得られたら、好適な複合体を同定することができる。

全ての論文、書籍、特許明細書、特許公報及びその他の刊行物の全体は、本明細書中に援用される。

本発明の或る好ましい特定の実施態様と関連して本発明を説明してきたが、言うまでもなく前述の記載内容並びに以下の実施例は説明のために示すものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲内に含まれる他の観点、利点及び変更形が、本発明が関連する分野における当業者には明らかである。

略語
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＤＩ：脱イオン化
ｒ．ｔ．：室温
ａｎｈ．：無水
Ｄａ：ダルトン
ＧＰＣ：ゲル透過クロマトグラフィー

材料と方法
添付の実施例で言及される全ての化学試薬は、特に断りのない限り、商業的に入手可能である。
添付の実施例で言及される全てのＰＥＧ試薬は、Nektar (Huntsville, AL)から入手可能である。全ての¹ＨＮＭＲデータは、Brukerによって製造された３００又は４００ＭＨｚ・ＮＭＲ分光計によって生成された。
実施例１
リンカーを有するＰＥＧマレイミド例の加水分解速度
平均分子量５０００ダルトンの一連の代表的メトキシ−ＰＥＧマレイミドを合成し、そして研究した。ｐＨ約７．５の５０ｍＭ リン酸緩衝液中５ｍｇ／ｍＬの濃度の各ｍＰＥＧマレイミドの溶液の、２９７ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、各構造に対応するマレイミド環の加水分解反応動態を測定した。

ポリマーマレイミドの一般化構造を以下に示す。リンカー（Ｌ₁、Ｌ₂、及びＬ₃）のそれぞれに対応する正確な構造は、上記表１に与えられている。

表２のデータによって示されているように、このポリマーマレイミド例の加水分解速度は構造とともに変化する。この群において、ＨＥリンカーは加水分解に対して最も高い抵抗を有しているのに対して、ＥＴリンカーは最も早い加水分解速度を示し、このことは、ＥＴリンカーのマレイミド環が、相当穏和なｐＨでさえも加水分解に向かう傾向を有することを示している。

上記データは、開環を高めるための好ましいリンク基が、マレイミド置換基、すなわちマレイミド環の窒素に近接して（最も好ましくは約３つの原子以内に）、強力な電子吸引基ＥＷＧを有する基を含むことを示す。Ｌ₃−ＥＴリンカー、−Ｏ−エチレン−は、マレイミド窒素から３つの原子以内に電子吸引原子、酸素を有し、この酸素が、加水分解速度の向上に向かう傾向に寄与していると思われる。マレイミド窒素から最も好ましくは１，２，３又は４つの原子以内にＥＷＧを有するリンカーが好ましい。

実施例２
リンカーを有する分枝状ポリマー・マレイミド、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋの加水分解

上に示したポリマー・マレイミドｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０ＫをNektar (Huntsville, AL)から入手した。このポリマー誘導体は、下記のように対応するマレアミド酸誘導体を形成するための特定の条件下では、限られた程度のマレイミ度環の加水分解しか受けない。

ＨＰＬＣにより時間に対して親マレイミドの減少率を観察することによって、加水分解反応を分析的にモニタリングした。約２５℃のＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用して、加水分解反応の動態をｐＨ約５．５で測定した。

マレアミド酸又はマレイミドの濃度の対数を時間に対してプロットすることにより、生データから線形の相関関係を得た（後者を図３に示す）。
次いでそのデータを用いて、加水分解反応の半減期を測定した。この半減期は、試験条件下で約３４日であることが計算された。従って、これらの条件下では、この特定のマレイミドは開環に対して抵抗性を有している。しかし、やはり２５℃で、より高いｐＨの無緩衝水中では、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋの加水分解は同じように測定して、約２．１日の半減期を有すると測定された。

実施例３
ポリマー・スクシンイミド複合体の加水分解速度の研究
代表的なタンパク質及び小分子モデルの複合体の加水分解速度を調査して、これらの複合体の開環傾向に対する、ポリマーを末端基とするマレイミド自体の開環傾向の相関関係を試験した。

大型の生体分子成分、例えばタンパク質は、一般の液体クロマトグラフィー・カラム上の複合体形成された分子の保持に対して劇的な影響を及ぼすので、マレイミド複合体の動態を測定するのは、ポリマー自体に対するよりも一般に難しい。この分析の場合、マレアミド酸の開いた酸形態を、非開環又は閉環形態から明確に分離することはできなかった。他方において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥ）と分析的タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とに基づく組み合わせ分析を採用して、ポリマーマレイミド−タンパク質複合体、並びにモデル非タンパク質化合物を使用して調製された複合体の開環特性を評価するのに成功した。

この研究において、下に一般的に示した２個のＰＥＧ−球状タンパク質複合体を研究し、これにより開環特性を試験した。

上側の構造は、球状タンパク質２のＰＥＧ−マレイミド複合体である。ここで、球状タンパク質２は、分子量約４８ｋＤａのタンパク質である。球状タンパク質２は、ＰＥＧプロピオン酸、ＭＷ ３０ｋＤａから由来されたＰＥＧマレイミドに結合された。これはさらに、プロピオン酸に由来するポリマー部分とマレイミド末端との間に挿入された中程度の長さのリンカーを含んだ。上側の構造内のリンカーは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂ＣＨ₂−である。

下側の構造は、球状タンパク質１のＰＥＧ−マレイミド複合体である。この場合、タンパク質の分子量は約１１ｋＤａである。分子量約２０ｋＤａのリンカーなしマレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）を使用して、複合体を製造した。対応するＰＥＧマレイミド構造は３−ＥＴである。

下側の構造（球状タンパク質２）は、ｐＨ ８．５、室温で、２４時間後に完全に開環されており、従ってマレイミジルを末端基とするこのタイプのポリマーの不安定性を示す。従って、このポリマー複合体は、化学的に安定な組成物、すなわち、ポリマースクシンアミド酸複合体を含む平衡状態の組成物を提供するように開環反応を促進するのによい候補である。他方においてこのリンカーなし形態に対して、上側の構造（球状タンパク質１）におけるリンカーは、開環を遅らせるように見える。それというのは、上側の複合体における環構造は、１７時間にわたる５０℃までの加熱時に、ｐＨ９で、１７時間まで完全には開環されないからである。

実施例４
モデルＰＥＧ−スクシンイミド複合体の開環特性
モデル化合物、２−メルカプトエタノールに結合された或る特定のポリマー・マレイミドの例の加水分解速度を測定して、複合体が開環に向かう傾向を評価し、そして本明細書中に提供された開環アプローチについての適合性を評価する。

リンカーがＴＲＩ、ＰＥＮ及びＭＣＨと呼ばれるタンパク質を含む場合、下に示す構造を有する複合体の加水分解速度の研究を、複合体形成されていないマレイミドに関して上述したように行った。示された半減期は、２つの異なるｐＨ値でとられたデータから計算したものである。複合体形成されていないマレイミドと同様に、データは、開環が増大するのに伴ってｐＨがより低くドリフトするのにつれて、反応速度が遅くなることを示す。スクシンイミド環に隣接する最も短いの炭化水素鎖（すなわちＴＲＩ）との結合は、研究された他の複合体と比較して開くのが最も速かった。

実施例５
リンカーがないｍＰＥＧ−マレイミドに対する種々のＰｈ値における加水分解
モデル化合物２−メルカプトエタノールと、ｍＰＥＧ−５Ｋ−マレイミドとの反応によって形成された複合体の加水分解実験を、前述のように実施した。種々のＰｈ値における複合体の加水分解反応の動態の概要を、下記表４に示す。

Ａ． ２−メルカプトエタノールを有するｍＰＥＧ−５Ｋ−マレイミド付加物（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ−ＭＥ）の合成
アセトニトリル（６０ｍｌ）中のｍＰＥＧ（５０００ Ｄａ）−マレイミド（３．０ｇ、 ０．０００６モル、Nektar, Huntsville, Alabama）の溶液に、２−メルカプトエタノール（0.15g, 0.0190mol）を添加し、そして混合物をアルゴン雰囲気下で一晩にわたって室温で撹拌した。次いで溶剤を減圧下で蒸留して取り除いた。残渣をジクロロメタン（７．５ｍｌ）中に溶解し、次いでイソプロピル・アルコールを添加した。沈澱された生成物を濾過して取り除き、そして減圧下で乾燥させた。収量:2.80 g.NMR (d6-DMSO):2.78 ppm (bm, -S-CH ₂ CH₂OH, 2H)、3.24 ppm (s, -OCH₃, 3H)、3.51 ppm(s, PEGセグメント)、4.03 ppm (m, -CH-S, 1H)、4.85 ppm(7, -OH, 1H).

Ｂ． ｐＨ ９における加水分解
４ ｍＬの蒸留水中に、ｍＰＥＧ−ＭＡＬ−ＭＥ（０．２ ｇ）を溶解させ、そして得られた溶液を４ｍｌの０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ＝ ９．３）に添加した。０．０１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨをただちに９．０に調節した。０．２５ｍｌの溶液試料を１時間のインターバルをおいて回収し、ＨＰＬＣによって分析した。測定中、０．０１Ｍ・ＮａＯＨを定期的に添加することにより、溶液のｐＨを８．９５−９．０５の範囲内に維持した。

Ｃ． スクシンアミド酸複合体の分離
上に記載される加水分解反応を行い、ｐＨ９及びｐＨ１２で行われた反応から、生成物を分離した。それぞれの事例において、生成物は同じであった。２個の加水分解生成物、すなわち、対応する２−位付加物及び３−位付加物が形成された。スペクトル・シミュレーションに基づいて、生成物を特定した。ＮＭＲ分析は、２−位付加物と３−位付加物とのモル比が７１：２９であることを明らかにした。

前述の説明及び関連の図面に提供された教示内容の恩恵を受けた、本発明が関与する分野の当業者であれば、本発明の多くの変更形及び他の実施態様に思い至ることになる。従って、本発明は、開示された具体的な実施態様に限定されるべきではなく、そして変更形及び他の実施態様が添付の特許請求の範囲内に含まれることは言うまでもない。具体的な用語が本明細書中に採用されているが、これらは、一般的かつ記述的な意味でのみ使用されるのであり、限定目的では使用されない。

図１は、ポリマーマレイミド及びポリマーマレアミド酸の双方を、代表的な活性剤、この場合タンパク質のチオール基と反応させることにより、本発明のポリマー−スクシンアミド酸複合体を形成する例を示す。 図２は、ポリマーマレイミド及びポリマーマレアミド酸の双方を、代表的な活性剤、この場合タンパク質のアミノ基と反応させることにより、本発明のポリマー−スクシンアミド酸複合体を形成する例を示す。 図３は、実施例２に詳細に説明する時間に対する分枝状ポリマー結合型マレイミド例の濃度の対数プロットである。

Claims (54)

1. ＰＥＧ複合体の製造方法であって、以下のステップ：
   （ａ）マレイミド基を含む１００ダルトン〜１００，０００ダルトンの公称平均分子量を有するＰＥＧを準備し、
   （ｂ） 上記ＰＥＧを、求核基を含む活性剤と、マイケル型付加反応を介して該ＰＥＧに該活性剤をカップリングするために有効な条件下で反応させて、ＰＥＧ−スクシンイミドが結合された活性剤複合体を形成し、そして
   （ｃ） （ｂ）から得た複合体を、上記スクシンイミド環を強制的に開環するために有効な条件下で処理して、それによりＰＥＧ・スクシンアミド酸複合体を含むＰＥＧ−複合体組成物を形成する
   を含み、ここで上記活性剤が、タンパク質又はペプチドのいずれかである、前記方法。
2. 前記処理ステップが加水分解を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記処理が水性溶剤又は有機溶剤中で行われる、請求項２に記載の方法。
4. 前記処理ステップが塩基の存在下において行われる、請求項１に記載の方法。
5. 前記塩基が、金属又は非金属水酸化物、水酸化第４級アンモニウム、ナトリウム、及びカリウムからなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
6. 前記塩基が、固体支持体上又は溶液中に存在する、請求項４に記載の方法。
7. 前記処理ステップが、６〜１２の範囲のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。
8. 前記処理ステップが、７．５〜１１の範囲のｐＨで行われる、請求項７に記載の方法。
9. 前記処理ステップが緩衝液中で行われる、請求項１に記載の方法。
10. 前記処理が、化学的に安定な組成物を提供するために有効な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
11. 前記組成物中における前記スクシンイミド環の開環の程度を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記処理が、少なくとも１５％の前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記処理が、少なくとも３５％の前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる、請求項１１に記載の方法。
14. 前記処理が、少なくとも８０％の前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる、請求項１１に記載の方法。
15. 前記処理が、少なくとも９５％の前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる、請求項１１に記載の方法。
16. 前記処理が、少なくとも９８％の前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体が形成されるまで行われる、請求項１１に記載の方法。
17. 前記求核基が、スルフヒドリル（チオール）基又はアミノ基である、請求項１に記載の方法。
18. 前記組成物から、前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体を回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記回収ステップは、前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体を沈澱することを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記回収ステップは、前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体を精製することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記精製ステップが、前記ＰＥＧ−スクシンアミド酸−複合体を、クロマトグラフィーによって精製することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記クロマトグラフィーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル透過クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーからなる群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＰＥＧが、末端キャップ部分を含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記末端キャップ部分が、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニルオキシ、置換アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、置換アルキニルオキシ、アリールオキシ、及び置換アリールオキシからなる群から選ばれる、請求項２３に記載の方法。
25. 前記末端キャップ部分が、メトキシ、エトキシ、及びベンジルオキシからなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ＰＥＧが、１０００ダルトン〜８０，０００ダルトンの公称平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
27. 前記ＰＥＧが、２０００ダルトン〜５０，０００ダルトンの公称平均分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＰＥＧが、線状、分枝状、フォーク状、及び多アーム状構造からなる群から選ばれる構造を有する、請求項１に記載の方法。
29. 前記ＰＥＧが、以下の：
    Ｚ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−
    [式中、ｎは１０〜４０００であり、そしてＺは、ヒドロキシ、アミノ、エステル、カーボネート、アルデヒド、アルデヒド水和物、アセタール、ケトン、ケトン水和物、ケタール、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、スルホン、チオール、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジド、尿素、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、アルコキシ、ベンジルオキシ、シラン、脂質、リン脂質、ビオチン、及びフルオレセインからなる群から選ばれる部分を含む]
    で表される構造を含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記ＰＥＧが、該ＰＥＧと前記マレイミド基との間に挿入されたリンカーＬを含む、請求項１に記載の方法。
31. 前記リンカーが、ｐＨ ９．０のリン酸緩衝液中で室温にて測定されるとき、１２時間以下の前記ＰＥＧの開環加水分解半減期もたらすために有効である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＰＥＧが、前記マレイミド基の窒素原子に直接結合される、請求項１に記載の方法。
33. 請求項１に記載の方法に従って製造される、１００ダルトン〜１００，０００ダルトンの公称平均分子量を有するＰＥＧ複合体組成物。
34. 化学的に安定な組成物であって、以下の：
    

    

    [式中、
    ＰＯＬＹは１００ダルトン〜１００，０００ダルトンの公称平均分子量を有するＰＥＧセグメントであり、
    Ｌは任意のリンカーであり、そして
    「Ｎｕ−活性剤」は、求核基「Ｎｕ」を含む活性剤を表し、
    ここで当該活性剤が、タンパク質又はペプチドである]
    で表される構造を含む、前記組成物。
35. 前記Ｎｕがチオール又はチオレートである、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記Ｎｕが、システイン中に含まれるチオール又はチオレートである、請求項３５に記載の組成物。
37. Ｎｕがアミノである、請求項３４に記載の組成物。
38. Ｎｕがリジン中に含まれるアミノ基であるか、又は末端アミンである、請求項３４に記載の組成物。
39. 粉末形態である、請求項３４に記載の組成物。
40. 溶液形態である、請求項３４に記載の組成物。
41. ＰＯＬＹを含む成分を基準にして、少なくとも１５重量％の混合された構造Ｖ及びＩＶを含む、請求項３４に記載の組成物。
42. ＰＯＬＹを含む成分を基準にして、少なくとも３５重量％の混合された構造Ｖ及びＩＶを含む、請求項３４に記載の組成物。
43. ＰＯＬＹを含む成分を基準にして、少なくとも８０重量％の混合された構造Ｖ及びＩＶを含む、請求項３４に記載の組成物。
44. ＰＯＬＹを含む成分を基準にして、少なくとも９５重量％の混合された構造Ｖ及びＩＶを含む、請求項３４に記載の組成物。
45. ＰＯＬＹを含む成分を基準にして、少なくとも９８重量％の混合された構造Ｖ及びＩＶを含む、請求項３４に記載の組成物。
46. Ｌは、カップリングされていないＰＥＧマレイミド前駆体のマレイミド基の、Ｖ又はＩＶへの開環加水分解速度を、リンカーが存在しない同じＰＥＧマレイミド前駆体の加水分解速度と比較して高くするのに有効なリンカーである、請求項３４に記載の組成物。
47. Ｌは、ｐＨ９のリン酸緩衝液中で室温にて測定したとき、カップリングされていないＰＥＧ・マレイミド前駆体のＶ又はＩＶへの開環加水分解半減期が１２時間以下となるために有効なリンカーである、請求項３４に記載の組成物。
48. 構造Ｖ及びＩＶにはリンカーが存在しない、請求項３４に記載の組成物。
49. ＰＯＬＹが線状ポリエチレン・グリコールである、請求項４８に記載の組成物。
50. 前記リンカーが、前記スクシンアミド酸の窒素原子から６個の原子以内に電子吸引基（ＥＷＧ）を含む、請求項３４に記載の組成物。
51. 前記リンカーが、前記スクシンアミド酸の窒素原子から３個の原子以内に電子吸引基（ＥＷＧ）を含む、請求項５０に記載の組成物。
52. 前記活性剤が生物学的活性剤である、請求項３４に記載の組成物。
53. 請求項５２に記載される組成物を含む、単位投与形態。
54. １００ダルトン〜１００，０００ダルトンの公称平均分子量を有するＰＥＧで誘導体化されたタンパク質を含む組成物であって、ここで該ＰＥＧが、システイン・スルフヒドリル基又はリジンアミノ基に共有結合されたスクシンイミド基を介して、該タンパク質にカップリングされており、そして当該組成物中の該スクシンイミド基の実質的に全てが、以下の：
    

    

    [式中、各場合において、ＰＯＬＹがＰＥＧであり、Ｌが任意のリンカーであり、そしてＤｒｕｇがタンパク質である]
    で表される２つの構造のうちの１つに対応する開環された形態内に存在する、前記組成物。

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