JP4324266B2

JP4324266B2 - α１Ａアドレナリン受容体の変異体、当該変異体を用いた測定方法及び前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤

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Publication number: JP4324266B2
Application number: JP05116399A
Authority: JP
Inventors: 郁延村松; 隆信谷口; 聡村田; 聡立道; 克良秋山
Original assignee: Kissei Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kissei Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: JP2000247998A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトα_1Aアドレナリン受容体の第２７１アミノ酸のアラニンをスレオニンに置換したα_1Aアドレナリン受容体の新規変異体、当該α_1Aアドレナリン受容体の変異体を用いたα_1Aアドレナリン受容体アンタゴニストのインバースアゴニスト活性の測定方法および当該測定方法においてインバースアゴニスト活性を示さないα_1Aアドレナリン受容体アンタゴニストを有効成分として含有する前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
α₁アドレナリン受容体（以下α₁−ＡＲという）サブタイプについては、これまでに薬理学的研究および受容体遺伝子のクローニングによりα_1Aアドレナリン受容体サブタイプ（以下α_1A−ＡＲという）、α_1Bアドレナリン受容体サブタイプ（以下α_1B−ＡＲという）およびα_1Dアドレナリン受容体サブタイプの３種のアドレナリン受容体サブタイプの存在が確認されている。
【０００３】
種々の動物及びヒトの各種臓器におけるこれらのα₁−ＡＲサブタイプの局在及び機能について多くの研究がなされ、ヒト前立腺組織にはα_1A−ＡＲが優位に存在し、α_1A−ＡＲ選択的アンタゴニストがノルアドレナリン収縮を最もよく抑制することからヒト前立腺はα_1A−ＡＲを介して収縮すると考えられている。また、ヒトの末梢血管はα_1B−ＡＲを介して収縮することが報告されている（British Journal of Pharmacology, Vol. 113, pp. 723-728 (1994))。更に、ヒト大網動脈およびヒト腸間膜動脈もα_1B−ＡＲを介するとされている。
【０００４】
最近、αアドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、ヒスタミンＨ受容体を始めとするＧ蛋白質共役型受容体は、不活性型と活性型がある一定の平衡状態で存在し、活性型のみがプロテインキナーゼＣなどの細胞内情報伝達系を介した生理反応を引き起こすことが報告されている。
【０００５】
一方、これらの受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニストの作用についても研究が行われており、アンタゴニストには不活性型と活性型の平衡状態に影響しないニュートラルアンタゴニストと平衡状態を不活性側に移動させるインバースアゴニストがあり、インバースアゴニスト活性の強いアンタゴニストを長期使用した場合は、一過性に細胞内情報伝達系が抑制された結果、代償性に受容体数が増加することが報告されている。
【０００６】
例えば、胃・十二指腸潰瘍治療剤として知られているヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニストのシメチジンやラニチジンはインバースアゴニストであるため、これらヒスタミンＨ₂受容体アンタゴニストを長期連用するとヒスタミンＨ₂受容体数が増加し、その結果、耐性発現（作用減弱）や使用中断により胃酸分泌亢進などのリバウンド現象を起こすことが問題点として指摘されている。このように、インバースアゴニストは耐性発現やリバウンド現象により予期せぬ症状を引き起こすため、医薬品として使用するアンタゴニストはニュートラルアンタゴニストが望ましいとして種々の研究がなされている。ヒスタミンＨ₂受容体の他にβ₂アドレナリン受容体やα_1B−ＡＲについても変異体を用いて種々の研究が活発に行われており、アンタゴニストの性質が受容体の活性を左右することが報告されている。（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 93, pp. 6802-6807 (1996); Biochem. J., Vol. 325, pp. 733-739 (1997))しかしながら、α_1A−ＡＲについてはこれまでニュートラルアンタゴニストかインバースアゴニストであるかを判定する実験手段自体が開発されていなかったため、今まで何ら報告がなされていない。
【０００７】
ヒト前立腺の収縮はα_1A−ＡＲを介し、ヒト末梢血管の収縮はα_1B−ＡＲを介する事が報告されていることより、起立性低血圧などの副作用を軽減するため前立腺肥大症治療剤として選択的α_1A−ＡＲアンタゴニストが開発されているが、当該アンタゴニストがインバースアゴニストの場合は耐性発現による増量を余儀なくされることが懸念される。即ち、各臓器の主要な受容体の活性化状態が異なると、インバースアゴニスト活性を持つアンタゴニストの作用強度が臓器によって変化することが考えられ、場合によっては起立性低血圧などの副作用が強く発現するようになることが懸念される。
【０００８】
特に、心臓においてもα_1A−ＡＲが発現していることが確認されており、α₁−ＡＲ刺激により心肥大が誘導されることが報告されている。α_1A−ＡＲは細胞内情報伝達経路の一つであるイノシトール１，４，５−三リン酸（以下ＩＰ₃という）を産生してプロテインキナーゼＣを活性化させることが知られており、プロテインキナーゼＣ活性の亢進が心肥大誘導の一因を担っているものと考えられる。それ故、心筋細胞においてα_1A−ＡＲが増加すると、心肥大が起こる危険性が増大する。（血管と内皮，Vol. 5, No. 6, pp. 81-86 (1995);医学のあゆみ，Vol. 172, No. 3, pp.151-154 (1995)；The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 10, pp. 5839-5843 (1996))従って、α_1A−ＡＲアンタゴニストとして、インバースアゴニストを使用すると受容体数が増加した場合、心肥大の危険性が増加することが予想される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、連用による耐性発現を抑え、また心肥大など他の臓器における副作用を回避することのできる前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤を提供することである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、α_1A−ＡＲに関して鋭意研究を重ねた結果、インバースアゴニストとニュートラルアンタゴニストの判定に適したα_1A−ＡＲ変異体を確立することができ、そのα_1A−ＡＲ変異体を発現させたＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞を用いる事により、α_1A−ＡＲにおいてもインバースアゴニストとニュートラルアンタゴニストが存在する事を見出した。更に、当該ＣＨＯ細胞を用いた実験でインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲ対するニュートラルアンタゴニストが前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤として非常に優れた薬剤となり得ることを見出し、本発明を成すに至った。
【００１１】
本発明者らは、α_1A−ＡＲの平衡状態を活性型優位にすべく研究した結果、野生型α_1A−ＡＲの２７１番目であるアミノ酸のアラニンをスレオニンに置換した４６６個のアミノ酸から構成されるα_1A−ＡＲ変異体をＣＨＯ細胞に発現させ、細胞内ＩＰ₃量を測定したところ、野生型に比べＩＰ₃量が顕著に上昇しており、活性型が優位であるα_1A−ＡＲ変異体の確立に成功した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１９５，Ｎｏ．２，ｐｐ．９０２−９０９（１９９３）；ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７９−２８３（１９９８））。
【００１２】
更に、本発明者らは、上記α_1A−ＡＲ変異体を発現させたＣＨＯ細胞を用いて実験することにより、細胞内ＩＰ₃量を減少させ、その結果としてα_1A−ＡＲ数を増加させるインバースアゴニスト活性を示すアンタゴニストと、細胞内ＩＰ₃量およびα_1A−ＡＲ数を変化させないニュートラルアンタゴニストを判定する事ができ、医薬品として有用なニュートラルアンタゴニストの開発が可能である事を見出した。
【００１３】
そして、上記実験でインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲアンタゴニストは長期投与で耐性を発現せず、しかも心臓においてα_1A−ＡＲ数を変化させず好適な前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤として期待できることを見出した。
【００１４】
即ち、本発明者らが確立した活性型が優位にある上記α_1A−ＡＲ変異体を発現させたＣＨＯ細胞を用いた実験において、α_1A−ＡＲに対して高親和性を示すプラゾシンは細胞内ＩＰ₃量を３０％程度減少させ、その結果α_1A−ＡＲ数を約３倍に増加させたのに対し、α_1A−ＡＲに対して高親和性を示す選択的な尿道平滑筋収縮抑制作用を有する排尿困難症治療剤として開発されたインドリン誘導体（特開平６−２２００１５号公報）の中の一化合物である（−）−（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシプロピル）−５−〔２−〔〔２−〔２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）フェノキシ〕エチル〕アミノ〕プロピル〕インドリン−７−カルボキサミド（以下ＫＭＤ−３２１３という）はＩＰ₃量には影響を与えず、α_1A−ＡＲ数も変化させなかった。以上の事から、プラゾシンはα_1A−ＡＲに対して強いインバースアゴニスト活性を示すアンタゴニスト（インバースアゴニスト）であり、一方、ＫＭＤ−３２１３はα_1A−ＡＲに対するインバースアゴニスト活性を示さないニュートラルアンタゴニストであることが確認された。
【００１５】
次に、本発明者らは、上記α_1A−ＡＲに対するインバースアゴニストであるプラゾシンとα_1A−ＡＲに対するニュートラルアンタゴニストであるＫＭＤ−３２１３をラットを用いてインバースアゴニスト活性と耐性に関する相関性を確認すべく各被験薬物を４週間連続経口投与した後、フェニレフリン誘発尿道内圧上昇に対する阻害活性を各被験薬物の静脈内投与により検討したところ、プラゾシンは５０％阻害量（ＩＤ₅₀値）として対照群に比し約１．７倍の高値を示し、耐性を発現したのに対し、ＫＭＤ−３２１３は耐性を発現しなかった。
【００１６】
また、同様にラットを用いて塩酸プラゾシンおよびＫＭＤ−３２１３を２週間連続腹腔内投与して、心臓におけるα_1A−ＡＲ発現に対する影響を調べたところ、プラゾシン連続投与群ではα_1A−ＡＲ数は約１．７倍に増加した。一方、ＫＭＤ−３２１３連続投与群ではα_1A−ＡＲ数は変化しなかった。
【００１７】
従って、α_1A−ＡＲ変異体発現ＣＨＯ細胞でインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲに対するニュートラルアンタゴニストは、連続投与によりフェニレフリン誘発尿道内圧上昇の阻害活性を減弱させないため、耐性が生じることなく、また薬物使用中断によるリバウンド現象を示すことがなく、前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤として極めて有用である。
【００１８】
更に、上記α_1A−ＡＲに対するインバースアゴニスト活性を示さないニュートラルアンタゴニストは、心肥大との関連性が示されている心臓におけるα_1A−ＡＲ数に関しても何ら影響を示さないことから、薬物使用中の耐性獲得および使用中断によるリバウンド現象などα_1A−ＡＲ数増加に起因する心臓に対する副作用を回避できる。
【００１９】
このように、本発明のα_1A−ＡＲ変異体を用いる事により、このような前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤として有用なインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲに対するニュートラルアンタゴニストを開発することができる。
【００２０】
本発明において、有効成分として含有されるインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲに対するアンタゴニストとは、全くインバースアゴニスト活性を示さないニュートラルアンタゴニストに限定されるものではなく、４６６個のアミノ酸から構成されるα_1A−ＡＲ変異体を用いた本発明のインバースアゴニスト活性測定方法におけるプラゾシンによるα_1A−ＡＲ数の増加量をインバースアゴニスト活性１００％とした場合、実質的にα_1A−ＡＲに対する影響がないと考えられるインバースアゴニスト活性が概ね３０％以下のアンタゴニストであればよく、概ね１０％以下のアンタゴニストであれば更に好適である。ＫＭＤ−３２１３のインバースアゴニスト活性は０％であり、極めて優れたニュートラルアンタゴニストとして挙げられる。
【００２１】
また、ＫＭＤ−３２１３はＳＤ系ラットでの単回経口投与による毒性試験において、５０％致死量（ＬＤ₅₀値）が雌雄共に８７８ｍｇ／ｋｇであり、特に重篤な副作用もなく、安全な化合物である。
【００２２】
従って、インバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲアンタゴニスト、例えば、ＫＭＤ−３２１３またはその薬理学的に許容される塩を活性成分として含有させることにより、連用による耐性発現を抑え、また使用中断後の心肥大などの他の臓器における副作用を回避することのできる極めて好適な前立腺肥大に伴う排尿困難症治療剤を得る事が出来る。
【００２３】
本発明の排尿困難症治療剤の活性成分の一つであるＫＭＤ−３２１３およびその薬理学的に許容される塩は公知化合物であり、文献記載の方法により製造することができる（特開平６−２２００１５号公報）。
【００２４】
本発明の排尿困難症治療剤において活性成分として含有される化合物は遊離体のままで使用してもよく、薬理学的に許容される塩として使用してもよい。例えば、ＫＭＤ−３２１３の薬理学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸、２，５−ジメチルベンゼンスルホン酸、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホン酸、（＋）−カンファースルホン酸、（−）−カンファースルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１−ブタンスルホン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等とのモノまたはジ酸付加塩等を挙げることが出来る。
【００２５】
また、本発明の排尿困難症治療剤において活性成分として含有される化合物には、上記の塩の他、水和物やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００２６】
本発明の医薬品組成物を実際の治療に用いる場合、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。このような剤型としては例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、錠剤、カプセル剤などの経口投与剤、注射剤、貼付剤あるいは坐剤などの非経口投与剤を挙げることができる。
【００２７】
これらの医薬品組成物は、その剤型に応じ調剤学上使用される手法により、適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
【００２８】
例えば、散剤は活性成分、例えば、ＫＭＤ−３２１３またはその薬理学的に許容される塩に、必要に応じ、適当な賦形剤、滑沢剤等を加えよく混和して散剤とする。
【００２９】
錠剤は、活性成分、例えば、ＫＭＤ−３２１３またはその薬理学的に許容される塩に、必要に応じ、適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等を加え常法に従い打錠して錠剤とする。錠剤はまた必要に応じ、コーティングを施し、フィルムコート錠、糖衣錠等にすることができる。
【００３０】
カプセル剤は、活性成分、例えば、ＫＭＤ−３２１３またはその薬理学的に許容される塩に、必要に応じ、適当な賦形剤、滑沢剤等を加えよく混和した後、適当なカプセルに充填してカプセル剤とする。また、常法により顆粒あるいは細粒とした後あるいは分散剤、乳化剤、安定化剤、溶解補助剤などを加え液状とした後充填してもよい。
【００３１】
また、本製剤は徐放性製剤として投与してもよい。通常の徐放性製剤として錠剤もしくは顆粒中に徐放性基剤を配合したマトリックス型徐放性製剤、あるいは常法により得た錠剤または顆粒またはマトリックス型徐放性製剤を徐放性基剤によりコーティングした皮膜制御型徐放性製剤として経口投与することができる。徐放性基剤としては、硬化油、ステアリルアルコール、セチルアルコール、パラフィン、脂肪酸モノグリセリン等のワックス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、酢酸ビニル樹脂、アクリル酸エチルメタクリル酸メチルコポリマー、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマーなどを挙げることが出来る。
【００３２】
本発明の医薬品組成物を実際の治療に用いる場合、その活性成分であるインバースアゴニスト活性を示さないα_1A−ＡＲアンタゴニストの投与量は対象となる患者の性別、年齢、体重、症状の度合などによって適宜決定されるが、例えば活性成分としてＫＭＤ−３２１３またはその薬理学的に許容される塩を用いる場合、経口的に、概ね成人１日当たり０．１〜１００mg、非経口的に、概ね成人１日当たり０．０１〜１００mgの範囲内で投与される。
【００３３】
【実施例】
本発明の内容を以下の試験例および処方例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
【００３４】
試験例１
α_1A−ＡＲ変異体発現ＣＨＯ細胞における細胞内ＩＰ₃の定量及びα_1A−ＡＲ数の測定
▲１▼目的
ヒトα_1A−ＡＲ変異体（ヒトα_1A−ＡＲの第３細胞内ループにある第２７１番目のアラニンをスレオニンに置換した４６６個のアミノ酸から構成される受容体）を発現したＣＨＯ細胞を用いて、塩酸プラゾシンおよびＫＭＤ−３２１３のα_1A−ＡＲ活性に対する影響を細胞内ＩＰ₃量および受容体発現量を指標として検討した。
【００３５】
▲２▼方法
ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーに対してウシα_1A−ＡＲ遺伝子（３３３ｂｐ）をプローブとしてスクリーニングを行い、全長１．５ｋｂｐのヒトα_1A−ＡＲｃＤＮＡ断片（５’非翻訳領域７ｂｐおよび３’非翻訳領域≦１００ｂｐも含む）を単離した。また、α_1A−ＡＲ変異体はｍｏｄｉｆｉｅｄｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ法を用いて、得られたヒトα_1A−ＡＲ（野生型）の第２７１アミノ酸のアラニンをスレオニンに置換することにより作製した。α_1A−ＡＲ遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて哺乳類発現ベクターｐＣＲ３に挿入し、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、５００μｇ／ｍｌのＧ−４１８の存在下、αＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧ，１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを含む）を用いて３７℃で培養し、恒常的にα_1A−ＡＲを発現する細胞を得た。
【００３６】
上述した方法によりα_1A−ＡＲを発現させたＣＨＯ細胞を各被験薬物（１０^-7Ｍ）存在下で３７℃で１６時間培養し、培養終了３０分前に細胞をＰＢＳで洗浄し、血清除去培地に交換した。その後、ＣＨＯ細胞に０．８Ｍ過塩素酸処理を施し、氷上で３０分間放置後、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６０ｍＭのＥＤＴＡを含む４Ｍ水酸化ナトリウムで中和し、遠心分離を行い沈渣を除去した。得られた細胞抽出液を用いてＩｎｏｓｉｔｏｌ−１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ〔³Ｈ〕ＲａｄｉｏｒｅｃｅｐｔｏｒＡｓｓａｙＫｉｔ（ＮＥＮ社製）により細胞内ＩＰ₃量を測定した。一方、受容体発現量を検討する実験においては、α_1A−ＡＲ変異体を発現させたＣＨＯ細胞を各被験薬物（１０^-12〜１０^-7Ｍ）の存在下で４８時間３７℃で培養した。その後、Ａｓｓａｙｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．４）にて細胞を回収し、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒを用いて破砕し、８００００ｘｇで３０分間遠心分離後、得られた沈渣をＡｓｓａｙｂｕｆｆｅｒで懸濁して膜分画とした。膜分画（１０μｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｔｕｂｅ）を〔³Ｈ〕−プラゾシン（１０〜２０００ｐＭ）共存下４５分間３０℃でインキュベーション後、Ｃｅｌｌｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍ−３０Ｔ，Ｂｒａｎｄｅｌ社製）を用いて膜分画をＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）上に回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で数回洗浄後、液体シンチレーションカウンターを用いて結合量を測定した。非特異的結合は１μＭ塩酸タムスロシン存在下での結合とした。得られた実験結果を非線形近似プログラムＰＲＩＳＭ（登録商標）（ＧｒａｐｈｐａｄＳｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて解析し、受容体量を算出した。
【００３７】
▲３▼結果
野生型と比べて変異体を発現した細胞は細胞内ＩＰ₃量が上昇しており、α_1A−ＡＲ変異体では活性型が優位であることが確認された。この様なα_1A−ＡＲ変異体を用いた実験において、塩酸プラゾシン処置は細胞内ＩＰ₃量を減少させ、受容体発現量を増加させたが、ＫＭＤ−３２１３処置では細胞内ＩＰ₃量および受容体量いずれにおいても影響が認められなかった。また、ＫＭＤ−３２１３は塩酸プラゾシンのＩＰ₃減少作用に拮抗した。このことから、α_1A−ＡＲにおいてプラゾシンはインバースアゴニストとして、ＫＭＤ−３２１３はニュートラルアンタゴニストとして作用していることが判明した。
【００３８】
【図１】
【００３９】
【図２】
【００４０】
試験例２
ラットの尿道内圧に対するα₁−ＡＲアンタゴニストの影響
▲１▼目的
ＳＤ系雄性ラットを用いたフェニレフリン誘発尿道内圧上昇に対するＫＭＤ−３２１３及び塩酸プラゾシンの抑制作用の程度を各被験薬物非投与群と４週間連続投与群で比較検討した。
【００４１】
▲２▼方法
最低６日間の検疫後、ＫＭＤ−３２１３及び塩酸プラゾシンを０．５％メチルセルロース水溶液に懸濁または溶解し、各３００μｇ／ｋｇの用量で２８日間連続経口投与した。また、それぞれの被験薬物投与群（ＫＭＤ−３２１３連続投与群，プラゾシン連続投与群）に対して０．５％メチルセルロース水溶液のみを投与した対照群を設けた。最終投薬日の２日後、ラットをウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ，腹腔内投与）で麻酔した。下腹部切開を施し、尿道に沿って恥骨結合部を切開した。膀胱頂部より生理的食塩水を満たしたカニューレ（ポリエチレンチューブＮｏ．５，ヒビキ社製）を挿入し、先端部を前立腺部尿道に位置するよう留置した。さらに、膀胱頸部および遠位尿道部を結紮した。尿道内圧はカニューレ後端に接続した圧力トランスデューサー（ＤＴ−ＸＸ，オメダ株式会社製）および変換器増幅ユニット（１８２９，日本電気三栄株式会社製）を介して測定し、レコーダー（ＲＥＣＴＩ−ＨＯＲＩＺ−８Ｋ又はＲＴ−３２００Ｎ，日本電気三栄株式会社製）上に記録した。尿道内圧上昇は、塩酸フェニレフリン（３０μｇ／ｋｇ）を左大腿部静脈よりシリンジポンプ（Ｍｏｄｅｌ１００，室町機械株式会社製）を用いて３６ｍｌ／ｈｒの速度で注入する事により惹起した。
【００４２】
ＫＭＤ−３２１３連続投与群では静脈内投与のＫＭＤ−３２１３の尿道内圧上昇抑制作用、プラゾシン連続投与群では静脈内投与の塩酸プラゾシンの尿道内圧上昇抑制作用を検討した。被験薬物を右大腿静脈より用量増加法により１時間ごとに投与（ＫＭＤ−３２１３：０．３，１，３および１０μｇ／ｋｇ；塩酸プラゾシン：１，３，１０および３０μｇ／ｋｇ）し、各用量投与５分後に尿道内圧上昇を惹起して被験薬物投与前の尿道内圧上昇値と比較した。これより、各投与用量の尿道内圧上昇抑制率を算出し、その用量−抑制曲線よりＩＤ₅₀値（被験薬物投与前の尿道内圧上昇反応を５０％抑制する被験薬物の投与用量）を算出して、それぞれの対照群におけるＩＤ₅₀値と比較した。尚、ＫＭＤ−３２１３連続投与群およびその対照群はＫＭＤ−３２１３二臭化水素酸塩を乳酸リンゲル液に溶解して静脈内投与し、プラゾシン連続投与群およびその対照群は塩酸プラゾシンを生理食塩水に溶解して静脈内投与した。
【００４３】
▲３▼結果
α_1A−ＡＲに対するニュートラルアンタゴニストであるＫＭＤ−３２１３連続投与群のＩＤ₅₀値は対照群に比し増加は示さなかった。一方、α_1A−ＡＲに対するインバースアゴニストであるプラゾシン連続投与群では対照群に比し約１．７倍の高値を示した。
【００４４】
【表１】

【００４５】
試験例３
ラット心臓のα_1A−ＡＲ発現に対するα₁−ＡＲアンタゴニストの影響
▲１▼目的
ラット心臓におけるα_1A−ＡＲ発現量に対する塩酸プラゾシンおよびＫＭＤ−３２１３投与の影響を被験薬物非投与群と２週間連続投与群で比較検討した。
【００４６】
▲２▼方法
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（７週齢）に各被験薬物２ｍｇ／ｋｇを１４日間腹腔内投与した。投与終了から２４時間後、心臓を摘出し、ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ，ＮａＣｌ１００ｍＭ，ＥＤＴＡ２ｍＭ，ｐＨ７．４）内で細断後、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いてホモジナイズし、ガーゼでろ過した。ろ過した上清は８００００ｘｇで３０分間遠心分離後、沈渣をＡｓｓａｙｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．４）に懸濁して再び８００００ｘｇで３０分間遠心分離し、得られた沈渣をＡｓｓａｙｂｕｆｆｅｒで再懸濁して膜分画とした。〔³Ｈ〕−ＫＭＤ−３２１３（１０〜２０００ｐＭ）および膜分画（２００μｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｔｕｂｅ）を３０℃で４５時間インキュベーション後、Ｃｅｌｌｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍ−３０Ｔ，Ｂｒａｎｄｅｌ社製）を用いて膜分画をＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）上に回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で数回洗浄後、液体シンチレーションカウンターを用いて結合量を測定した。非特異的結合は１μＭ塩酸タムスロシン存在下での結合とした。得られた実験結果を非線形近似プログラムＰＲＩＳＭ（登録商標）（ＧｒａｐｈｐａｄＳｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて解析し、α_1A−ＡＲ数を算出した。
【００４７】
▲３▼結果
塩酸プラゾシン２週間連続投与はラット心臓におけるα_1A−ＡＲ数を１．７倍に増加させたのに対し、ＫＭＤ−３２１３連続投与はα_1A−ＡＲ数に影響を与えなかった。
【００４８】
【表２】

【００４９】
試験例４
単回投与毒性試験
▲１▼方法
１群当たり５週齢のＳＤ系ラット、雌雄各５匹を用い、それぞれに４００、８００および１６００ｍｇ／ｋｇを単回経口投与した後、１４日間観察した。
【００５０】
▲２▼結果
死亡率は、雌雄とも４００ｍｇ／ｋｇ投与群で５例中０、８００ｍｇ／ｋｇ投与群で５例中３例、１６００ｍｇ／ｋｇ投与群で５例中４例であり、５０％致死量（ＬＤ₅₀）は雌雄とも８７８ｍｇ／ｋｇ、最小致死量は雌雄とも８００ｍｇ／ｋｇであった。
【００５１】
処方例
以下に処方例の１例として、活性成分としてＫＭＤ─３２１３を含有させたカプセル製剤の１処方例を示す。
【００５２】
ＫＭＤ−３２１３１．０ｍｇ含有カプセル製剤
処方

以上をよく混和し、１カプセル中ＫＭＤ−３２１３を１．０ｍｇ含有するように充填し、ＫＭＤ−３２１３の１．０ｍｇ含有カプセル製剤を製する。
【図面の簡単な説明】
【図１】α_1A−ＡＲ（変異体および野生型）発現ＣＨＯ細胞の薬物非処置群およびα_1A−ＡＲ変異体発現細胞の各被験薬物投与群（単独または併用）における細胞内ＩＰ₃量を示したグラフである。縦軸は細胞内ＩＰ₃量（ｐｍｏｌ／１０⁶細胞）を示す。横軸は使用したα_1A−ＡＲおよび使用薬物の種類を示す。
【図２】α_1A−ＡＲ変異体発現ＣＨＯ細胞における受容体発現量に対する各被験薬物の濃度−反応曲線を示したグラフである。縦軸は薬物非処置時の受容体数を１００％とした場合の薬物処置後のα_1A−ＡＲ数の変化（％）を示す。横軸は被験薬物処置濃度（Ｌｏｇ〔Ｍ〕）を示す。尚、−○−は塩酸プラゾシンを示し、−●−はＫＭＤ−３２１３を示す。

Claims

ヒトα_１Ａアドレナリン受容体において第２７１アミノ酸のアラニンをスレオニンに置換したα_１Ａアドレナリン受容体の変異体。
請求項１記載のα_１Ａアドレナリン受容体の変異体を用いたα_１Ａアドレナリン受容体アンタゴニストのインバースアゴニスト活性の測定方法。