JP4375183B2 - マイクロチップ - Google Patents

Description

吸光光度法により血液分析を行うために使用するマイクロチップに関する。特に、人体の肝機能を診断する上で必要となるＧＴＰ（グルタミルトランスぺプチターゼ）、γ−ＧＴＰ等の酵素量を測定するために使用するマイクロチップに関する。

近年、マイクロマシン技術を応用して、化学分析等を従来の装置に比して微細化して行うμ−ＴＡＳ（μ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）が注目されている。μ−ＴＡＳを医療分野に使用した場合には、（１）例えば血液のような検体の量を少なくすることで患者への負担を軽減することができる、（２）試薬の量を少なくすることで検査のコストを低減することができる、（３）装置が小型であるため、検査を簡易に行うことができる、等の利点がある。このような利点を活かし、マイクロチップを使用した血液分析装置を家庭仕様として、家庭内において患者自らの手で血液分析を行うことが検討されている。

マイクロチップを使用した吸光光度法による分析によれば、（１）無痛針によって採血した血液をチップ内に導入する、（２）チップ内の血液に対し遠心分離処理を施して血漿と血球とに分離する、（３）血漿と試薬とをミキサーによって均一に混合させて測定液とする、（４）測定液を吸引ポンプによって検出部に導入する、（５）検出部に導入された測定液に光源からの光を当てて特定波長の光の減衰量を測定する、という一連の作業を行うことによって、血漿中に含まれる所望の酵素の濃度を測定することができる。肝機能を診断する上で必要となる、例えばＧＴＰやγ−ＧＴＰ等のような血液中に含まれる酵素濃度を分析する手法については、例えば特開２００４−１０９０９９号公報に開示されている。

上記公報には、発光ダイオード等の光源から放射され、チップの上面から入射して、例えば血漿のような分析検体が充填されたチップ内の微小流路にて全反射されてチップ上面から出てくる光を、シリコンフォトダイオード等の検出器によって検出する方法が示されている。

ところが、発光ダイオードから放射される光は発散光であり、チップ内に入射させた光の全てを微小流路内にて全反射させることは極めて困難であるため、吸光度を精度良く測定することができない、という問題がある。すなわち、上記公報のように、マイクロチップの上面に光源と検出器の両方を配置して吸光度を測定することは測定誤差を生じる原因となるため好ましくない。

その一方で、光源からの光をマイクロチップの一方の側面から入射させて、マイクロチップ内の微小流路に充填された検体によって光吸収させ、他方の側面から出てくる透過光を検出する方法が、例えば特開２００４−７７３０５号公報に記載されている。この方法において、検体として血液を用いれば、吸光度を精度良く測定できるものと考えられる。
特開２００４−１０９０９９号 特開２００４−７７３０５号

マイクロチップは、小型であるが故の課題を有する。すなわち、吸光度の測定には適切な吸光長が必要であるため、検体及び試薬の量を微量に抑えるには検出部における光入射面及び光出射面の面積を微小にする他はない。

このように検出部が非常に細長い形状であると、光入射面及び光出射面の状態が検出部における透過率に及ぼす影響が大きくなる。マイクロチップは、通常は高分子材料からなるため、吸光度測定装置へセッティングする際に周辺機器と接触した場合には簡単に傷が生じ、また、使用者が素手で取り扱うことによって光入射面等に皮脂のような不純物が付着する場合がある。このような場合には、光入射面等の凹凸状態に悪影響を及ぼすことにより、吸光度を正確に測定できないため、測定検体中に含まれる酵素成分の定量を正確に行うことができない、という問題が生じる。

以上のように、本発明は、検出部の光入射面等に悪影響を及ぼすおそれが少ないことにより吸光度を正確に測定することが可能なマイクロチップを提供することを目的とする。

本発明は、板部材からなり、検体を導入する検体導入部と、該検体と反応する試薬と、該試薬と前記検体とを混合させて測定液を生成する混合部と、該測定液を充填する測定液充填部を有する検出部とを備えたマイクロチップにおいて、前記検出部の長手方向における両端面のそれぞれには、前記測定液充填部に光を導入する光入射面を有する凹所と、前記測定液充填部を透過した光を出射する光出射面を有する凹所とが形成されていることを特徴とする。

本発明のマイクロチップによれば、測定液が充填された検出部の長手方向の少なくとも一方の端部において、光入射面若しくは光出射面を有する凹所が形成されていることにより、検出部の光入射端面等に傷がついたり不純物が付着する、という不具合が生じることが確実に防止されるため、例えば血液などの測定検体中に含まれる所望の酵素成分の定量値に誤差が生じることなく、正確な分析結果を得ることが期待できる。

図１は、本発明に係るマイクロチップの構造を説明するための概略図である。
マイクロチップ１は、例えば２枚の板部材を貼り合わせて構成される。貼り合わせ面の片面に予め溝が形成され、貼り合わせることで溝が空洞を形成する。具体的には、各々の板部材の間に、検体溜まり３、試薬溜まり４、混合部５、測定液充填部６を有する。またマイクロチップ１は、一方の面に検体導入部２及び吸引機構接続部７を有し、凸状の検出部８が形成されている。

検体導入部２は、例えば血液のような検体を導入させるためのものであり、板部材の一方の面に設けられた孔である。
検体溜まり３は、第１の検体溜まり３１と第２の検体溜まり３２とからなる。第１の検体溜まり３１は、流路１１により検体導入部２に通じ、さらに、流路１２により第２の検体溜まり３２に通じている。
試薬溜まり４は、基質液を充填するための第１の試薬溜まり４１と緩衝液を充填するための第２の試薬溜まり４２からなる。
混合部５は、基質液、緩衝液及び検体を混合して測定液とするためのものであり、流路１３、１４及び１５により、それぞれ、第２の検体溜まり３２、第１の試薬溜まり４１及び第２の試薬溜まり４２に通じている。
混合部５に充填された測定液は、流路１６内で十分に攪拌されて測定液充填部６へ充填される。
吸引機構接続部７は、測定液を吸引することによって測定液充填部６に導くための、図示していない吸引ポンプが接続される箇所であり、排出流路１７により測定液充填部６に接続されている。
検出部８は、板部材に形成された凸部分の内部に測定液を充填するための測定液充填部６を有するものであって、例えば放電ランプ等の光源からの光を透過させて吸光光度法によって測定液中に含まれる所望の成分の濃度測定を行うための箇所である。

図２は、図１に示すＸ部分の拡大図である。
検出部８は、板部材に形成された凸部分からなり、方形体形状を有し、その長手方向軸が光軸に略一致している。そして、一方の端面８１において凹所８２が形成され、この凹所８２には光入射面８３が形成されている。他方の端面８４において凹所８５が形成され、この凹所８５には光出射面８６が形成されている。そして、凹所８２と凹所８５とは光軸方向において対向している。

ここで、板部材の凸部分に検出部を設けることの利点を以下に説明する。検出路の長さ（光路長）は使用する試薬の種類毎に異なり、例えば吸収量の大きい試薬を使用する場合には、光路長を短くする必要がある。そのため、使用する試薬の種類に応じて適当な長さの検出部を有するマイクロチップを選択する必要があるところ、本発明に係るマイクロチップのような構造とすると、試薬の種類に応じて検出部の長さを適宜調整することができる。
その一方で、吸収量の大きい試薬を使用すべく全長の短い検出部を、例えば図３に示すように板部材の中央部付近に設けた構造とした場合には、後述の光源からの光が板部材によって吸収あるいは散乱することにより精度良く吸光度を測定することができない、という問題が生じる。

図４は、本発明のマイクロチップ用の吸光度測定ユニットを説明するための概略図である。図４（ａ）は、マイクロチップ１をチップホルダ１０に差し込んだ状態を示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）のＡ−Ａ´断面図を示す。

チップホルダ１０は、２つ割りの部材からなり、一方の内面に直線状の溝が形成されており、２つの部材を合わせることにより、キャピラリー部１１が形成されることになる。このように、２つの部材を合わせることにより、キャピラリー部１１をチップホルダ１０内に簡便に形成することができる。キャピラリー部１１の開口径は、検出部８の光軸に垂直な断面の径より狭い径になっている。一例を挙げると、キャピラリー部１１の開口径は０．３ｍｍ角、検出部８の光軸に垂直な断面の径は０．７ｍｍ角である。かかるキャピラリー部１１を設ける必要があるのは、本発明に係るマイクロチップ１が、上記のように、板部材に形成された凸部分に検出部が設けられている、という特殊な構造を有することによる。

チップホルダ１０には、光入射面８３にキャピラリー部１１の端部が対向するようにマイクロチップ１が差し込まれる。検出部８内の測定液充填部６を透過した光を検出するためのシリコンフォトダイオードからなる受光素子１４が、光出射面８６に対向して配置されている。
キャピラリー部１１に入射する光は、光源１３から放射されてバンドパスフィルタ１２で選別された光であり、キャピラリー部１１を通過して検出部８に入り、検出部８内の測定液充填部６を透過した後、受光素子１４で受光される。キャピラリー部１１を通過して検出部８に入射する光は平行光成分が多く、吸光度の測定精度を向上させる。

光源１３は、発光管内に発光物質としてキセノンが封入されたキセノンランプである。キセノンランプは、点光源に近く、平行光を効率良く取り出すことが可能な放射特性を有することにより、後述のような微小領域（検出部８）に光源からの光を入射することを要求されるマイクロチップ用の光源として適しており、また、紫外域から可視域においてブロードな光が放射されることにより、分析検体に応じた波長の光を利用することが可能であるため、分析検体毎に光源を交換する必要がない、という利点を有する。さらには、発光物質として水銀を使用しないことから、環境への負荷も小さい。

ここで、本発明に係るマイクロチップにおいて、血液中に含まれる酵素の濃度を測定する手順の一例を説明する。以下、一例としてγ−ＧＴＰの濃度測定方法について説明する。
〔試薬〕
基質液：ＧｌｕＣＡＮＡ（Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド） ３１ｍｍｏｌ／Ｌ
緩衝液：グリシルグリシン １９３ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．９（３０℃）
〔測定手順〕
（１）先端が非常に鋭利な無痛針によって採血した血液を検体導入部２からマイクロチップ１の内部に導入する。
（２）マイクロチップ１に対し６０００回転の遠心分離処理を施すことによって分離された血漿が第１の検体溜まり３１に満たされる。
（３）再びマイクロチップ１に対し６０００回転の遠心分離処理を施すことによって適当な量の血漿が第２の検体溜まり３２に満たされる。
（４）マイクロチップ１を反時計回り方向に９０°回転させることによって、第２の検体溜まり３２に満たされている血漿、第１の試薬溜まり４１に満たされている基質液及び第２の試薬溜まり４２に満たされている緩衝液を混合部５に流入させて混合を行い測定液とする。血漿に上記の基質液及び緩衝液を作用させると、図５に示すように、血漿中のγ−ＧＴＰの作用により、基質Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドのγ−グルタミル基はグリシルグリシンに転移し、測定液中においては、Ｌ−γ−グルタミルグリシルグリシンを生成すると同時に、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸が遊離する。
（５）測定液充填部６に、測定液を充填させる。充填作業は、吸引ポンプを吸引機構接続部７に接続して、測定液充填部６を負圧にすることによって行われる。
（６）検出部８に光源からの光を透過させて、上記５−アミノ−２−ニトロ安息香酸が吸収を持つ波長４０５ｎｍの吸収量を検出し、この検出結果に基づいて吸光光度法により５−アミノ−２−ニトロ安息香酸の濃度を求める。そして、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸の生成量によって、測定液中のγ−ＧＴＰの濃度が求まる。

以上のような本発明のマイクロチップによれば、検出部８において凹所８２及び凹所８５が形成されていることにより、光入射面等に傷が生じたり不純物が付着したりする、という不具合が生じることを確実に防止することができるため、例えば血液などの測定検体中に含まれる所望の酵素成分の定量値に誤差が生じることなく、正確な分析結果を得ることが期待できる。そして、マイクロチップ１をチップホルダ１０にセッティングする際に、光出射面等に傷をつけないようにすべく過剰な神経を使う必要がなく、また、素手で取り扱うことも可能となるため、作業性が向上する。

これに対し、従来のマイクロチップのように検出部に凹所を有しない構造によると、光入射面等に傷が生じたり不純物が付着することにより、定量値に誤差が生じるため正確な分析結果を得ることができないと考えられる。そして、かかる測定誤差が生じることを回避しようとすると、マイクロチップを吸光度測定装置にセッティングする際に、例えばチップホルダのような周辺機器に光入射面等が接触して光入射面等に傷をつけたり、あるいは光入射面等に不純物が付着したりすることを防止すべく過剰な神経を使う必要が生じ、作業性の面で好ましくない。

以下、本発明の作用効果を確認するために行った実験について説明する。

〔実施例〕
図１に示す構造に従い、本発明に係るマイクロチップ１を作製した。このマイクロチップ１の構成は、以下に示すとおりである。
マイクロチップ１を構成する板部材は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）からなり、縦（検出部８を含む）が２５ｍｍ、横が２５ｍｍであり、厚みが２ｍｍである。
検出部に係る数値例について図２を参照して詳細に説明する。検出部８は、縦（Ｙ軸）が２．５ｍｍ、横（Ｘ軸）が１２．０ｍｍ、厚みが２ｍｍである。第１の凹所８２は、深さ（Ｘ軸）が１ｍｍである。光入射面８３は、縦（Ｚ軸）が１ｍｍであり、横（Ｙ軸）が２ｍｍである。第２の凹所８５は、深さ（Ｘ軸）が１ｍｍである。光出射面８６は、縦（Ｚ軸）が１ｍｍであり、横（Ｙ軸）が２ｍｍである。
測定検体は、１〜２μＬ（マイクロリットル）の血液である。
試薬は、上記の〔試薬〕に記載したとおりであり、２．１μＬのＧｌｕＣＡＮＡを基質液とし、８．４μＬのグリシルグリシンを緩衝液として使用した。

〔比較例〕
検出部の両端面において凹所を有しないことを除く他の構造は、実施例に係るマイクロチップ１と同様のマイクロチップを作製した。

作製した実施例に係るマイクロチップ及び比較例に係るマイクロチップを使用して図４に示す吸光度測定ユニットを構成し、それぞれのユニットに対し、７５Ｗのキセノンランプから放射された光をキャピラリー部を通じて検出部に入射させ、測定液充填部を透過した光を受光素子によって検出し、波長が４０５ｎｍの光の透過率について調べた。尚、この実験は、前述の測定手順に記載した（１）〜（５）の手順を行わない状態、すなわち、測定液充填部が空の状態で行った。表１にその結果を示す。表１では、比較例１、２、３及び４の光透過率を、実施例に係るマイクロチップの光透過率を１００％とする相対値にて示す。

表１に示すとおり、比較例１及び比較例２に係るマイクロチップは、実施例に係るマイクロチップに比して、その光透過率が低下していることが判明した。これは、比較例１及び比較例２に係るマイクロチップは、その光入射面等に対し、吸光度測定装置へセッティングする際に、例えばチップホルダのような周辺機器と接触したことに起因する傷がついていることが影響している、と推測される。さらに、比較例３及び比較例４に係るマイクロチップは、実施例に係るマイクロチップに比して、その光透過率が増加していることが判明した。これは、比較例３及び比較例４に係るマイクロチップは、検出部の両端面に対して皮脂などの不純物が付着したことにより、検出部の両端面に存在する凹凸（マイクロチップの製造時には多少の凹凸が形成される）が埋まったことによるものと考えられる。
以上から、比較例に係るマイクロチップによると、検出部の光入射面等に生じる傷や付着した皮脂などの不純物に起因して、波長が４０５ｎｍの光の透過率に誤差が生じるため、正確な分析結果を得ることができず、本発明のように検出部の端部に凹所を有する構造の有効性が確認された。

本発明のマイクロチップを説明するための概略図である。 図１のＸ部分の拡大図である。 全長の短い検出部を板部材の中央付近に設けたマイクロチップを説明するための概略図である。 本発明のマイクロチップ用の吸光度測定ユニットを説明するための概略図である。 測定液中における化学反応について説明するための図である。

符号の説明

１ マイクロチップ
２ 検体導入部
３ 検体溜まり
４ 試薬溜まり
５ 混合部
６ 測定液充填部
７ 吸引機構接続部
８ 検出部
１０ チップホルダ
１１ キャピラリー部
１２ バンドパスフィルタ
１３ 光源
１４ 受光素子
８２ 凹所
８３ 光入射面
８５ 凹所
８６ 光出射面

Claims (1)

1. 板部材からなり、検体を導入する検体導入部と、該検体と反応する試薬と、該試薬と前記検体とを混合させて測定液を生成する混合部と、該測定液を充填する測定液充填部を有する検出部とを備えたマイクロチップにおいて、
   前記検出部は、板部材の凸部分によって形成され、その長手方向軸が光軸に対して一致するように配置され、
   前記検出部の長手方向における両端面のそれぞれには、前記測定液充填部に光を導入する光入射面を有する凹所と、前記測定液充填部を透過した光を出射する光出射面を有する凹所とが形成されていることを特徴とするマイクロチップ。

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