JP4361710B2

JP4361710B2 - 徐放製剤

Info

Publication number: JP4361710B2
Application number: JP2001575984A
Authority: JP
Inventors: オクム，フランクリン
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2001-04-19
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2021-04-19
Also published as: ES2253375T3; ATE309822T1; DE60115005T2; IL152360A0; DE60115005D1; EP1274459B1; CA2406790A1; US6992065B2; WO2001078683A3; WO2001078683A2; JP2004500423A; US20020001631A1; CA2406790C; AU5911101A; AU2001259111B2; EP1274459A2; DK1274459T3

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
この発明は、成長ホルモン、特にヒト成長ホルモンの徐放調製物に関する。
【０００２】
（関連した開示の説明）
徐放送達系は、患者の薬剤服用順守性、耐容性、製品性能を改善でき、製品の市場での潜在性を拡大させ得るので、興味深い。ＳＡＢＥＲ系は新規な注射可能な液体非ポリマー性薬剤送達系である（SmithとTipton (1996) Pharmaceutical Research 13(3): 300）。SABER系は、Sucrose Acetate isoButyrate Extended Release（スクロースアセテートイソブチラート長期放出）の略で、スクロースアセテートイソブチレート（ＳＡＩＢ）と可塑化溶媒からなる。ＳＡＢＥＲは低粘度液体として注射され、注射後に急速に粘度が増大する。得られる高粘度マトリックスは接着性、生物分解性及び生体適合性である。
【０００３】
臨床的には、ｒｈＧＨは成長ホルモン欠乏（ＧＨＤ）患者に毎日投与される。投薬頻度を減少させ患者の薬剤服用順守性を増大させるべく、徐放製剤の開発が行われている。最近、ＦＤＡは最初のｒｈＧＨ徐放製剤を承認した。この製剤により、患者の投薬間隔は毎日からｒｈＧＨの要求に応じて一ヶ月に一回又は二回まで減少させることが可能になる。しかし、承認された蓄積（Depot）製剤は最初の二日でカプセル化タンパク質の１０−２０％を放出し、高ｒｈＧＨ血清レベルにしてしまう（Johnson等, (1996) Nature Medicine (2):795-799）。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は成長ホルモンの新規な非ポリマー性徐放製剤を提供する。
【０００５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
（発明の実施の形態）
この研究の目的は、非ポリマー性スクロースアセテートイソブチレート徐放系からの組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の放出を評価することにあった。
上記系はスクロースアセテートイソブチレート（ＳＡＩＢ）と溶媒を含んでいた。重炭酸ナトリウム中のｒｈＧＨと亜鉛で錯化したｒｈＧＨの二種のスプレー凍結乾燥ｒｈＧＨ製剤を評価した。ｒｈＧＨパウダーを、二つの異なったタンパク質負荷（５及び１５％ｗ／ｖ）で様々な系とホモジェナイズした。放出速度とタンパク質安定性を逆相-ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー及びＢＣＡによって２８日間モニターした。放出速度とタンパク質安定性に対する亜鉛と表面積の効果もまた調査した。
【０００６】
亜鉛錯化ｒｈＧＨに対するインビトロでの結果では０．１（ＳＡＩＢ：エタノール）から２．２％（ＳＡＩＢ：ミグリオール）の非常に低いバーストが示され、２８日にわたるタンパク質の放出が続いた。異なった調製物からの放出速度と放出された全タンパク質は広く異なっていた。高いタンパク質負荷（１５％）と低いタンパク質負荷（５％）がほぼ同じ量のタンパク質を放出しており、これはスクロースアセテートイソブチレート：溶媒／タンパク質混合物の表面積が初期のバーストと放出速度における重要な因子であったことを示している。放出媒質と接触するスクロースアセテートイソブチレート：溶媒／タンパク質の表面積を増加させたインビトロでの実験では、放出タンパク質のより高い全パーセントで１から４％のバーストの増加が生じた。重炭酸塩ｒｈＧＨ懸濁液はより高い初期バースト（７から１４％）を示しており、亜鉛錯化ｒｈＧＨ懸濁液と比較した場合２８日でより多くのタンパク質を放出した。
【０００７】
溶媒の極性を変化させると、ＳＡＩＢに対する溶媒の比と亜鉛の添加により、スクロースアセテートイソブチレート：溶媒系からのｒｈＧＨの放出速度を変化させることができる。これらの結果は、スクロースアセテートイソブチレート：溶媒送達系がインビトロで無傷のｒｈＧＨの徐放性をもたらし得ることを証明している。
スクロースアセテートイソブチレート長期放出系は例えば米国特許第５７４７０５８号に記載されており、その開示が出典明示により特にここに取り込まれる。
【０００８】
成長ホルモン（ＧＨ）は好ましくはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、好ましくは生物学的に活性な非凝集ｈＧＨである。本発明によれば、ＧＨは、好ましくは製剤の金属カチオン成分からの、好ましくは＋２又はそれ以上の価数を持つ、少なくとも一つのタイプの多価金属カチオンで錯化される。
好適な多価金属カチオンには生体適合性及び非毒性金属カチオンが含まれる。ＧＨのための好適な金属カチオン成分はＺｎ＋２である。典型的には、ＧＨに対する金属カチオン成分のモル比は１：１から１００：１、好ましくは１：１から２０：１、好ましくは１：１〜１０：１である。
【０００９】
次の実施例は例証のために提供されるもので発明を限定するものではない。明細書の全ての引用文献の開示は出典明示によってここに取り込むものである。
（実施例）
実施例Ｉ
方法
亜鉛錯化ｒｈＧＨの調製：２５ｍＭの重炭酸ナトリウムに入った２０ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨの溶液を、１０：１のｒｈＧＨ：亜鉛比にて亜鉛で錯化した。ｒｈＧＨ／亜鉛懸濁液をスプレー凍結乾燥して、およそ７０重量％のｒｈＧＨである微小粉末をつくった。
【００１０】
重炭酸塩ｒｈＧＨの調製：１０ｍＭの重炭酸アンモニウム中におよそ５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨの入った溶液を凍結乾燥して賦形剤非含有パウダーをつくった。
ＳＡＩＢ／ｒｈＧＨ懸濁液の調製：剪断ホモジナイザーを用いてＳＡＢＥＲ製剤とｒｈＧＨパウダーを混合することにより、ｒｈＧＨＳＡＢＥＲ懸濁液を調製した。放出速度の決定：０．２ｍＬの各ｒｈＧＨ／ＳＡＩＢ懸濁液を二本のエッペンドルフ試験管に加え、ついで０．５ｍＬの放出媒質（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＮａＮ３、ｐＨ７．２）を懸濁液の上に加えた。エッペンドルフ試験管を３７℃でインキュベートし、様々な時点でサンプリングした。それぞれの時点で、０．５ｍＬの放出媒質を除去し、０．５ｍＬの新鮮な放出媒質を加えた。収集した試料を分析前に−７０℃で貯蔵した。タンパク質濃度とタンパク質の品質について放出試料を分析した。
【００１１】
ＢＣＡアッセイ：マイクロタイタープレートの形態のＢＣＡアッセイを用いて放出試料のタンパク質濃度を決定した。ｒｈＧＨタンパク質標準を０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．２、０．５ｇ／ｍｌの放出媒質中で調製した。０．０２ｍＬの各ブランク、標準、及び放出試料をマイクロタイタープレート中の０．２ｍＬのＢＣＡ作動試薬と混合した。マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５６２ｎｍで吸光度を測定した。放出試料のタンパク質濃度を、４つのパラメータの非線形曲線フィッティング法を用いて標準曲線から決定した。ｒｈＧＨ放出試料中の酸化した変異体の量はＲＰ-ＨＰＬＣによって測定した。このアッセイは室温に保持された４．６ｘ１５ｃｍ、８ｍｍ、３００オングストロームのＰＬＲＰＳカラムを使用して実施した。移動相Ａは５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０を含んでおり、移動相Ｂはアセトニトリル中に２０％のプロパノールを含んでいた。分離は４９％で定組成であり（Ｂ）、溶離液について２１４ｎｍでの吸光度をモニターした。
【００１２】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、放出試料中に存在するモノマーの量を決定した。このアッセイは室温に保持した７．８ｘ３００ｍｍのＴＳＫ２０００ＳＷＸＬカラムを使用して実施した。使用した移動相は５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で、流速は１．０ｍｌ／分で操作時間は２０分であった。１０ｇのタンパク質を注入し、２１４ｎｍでの吸光度について溶離液をモニターした。
ｒｈＧＨのインビボでの薬物動態学を、スピローグ・ドゥリー（ＳＤ）ラットでのｒｈＧＨのＳＡＢＥＲ製剤（ＳＡＩＢ：ベンジルアルコール；８５：１５ｗ／ｗ及びＳＡＩＢ：安息香酸ベンジル；７０：３０ｗ／ｗ）でＳＣ注射後に決定した。血清ｒｈＧＨレベルを０．１ｎｇ／ｍＬのアッセイ検出限界のエライザ（ジェネンテック）によって決定した。
【００１３】
結果と検討
溶媒比
放出されたタンパク質に対するＳＡＩＢ／溶媒比の影響を、ＳＡＩＢ：エタノール比、８５：１５、７５：２５及び５０：５０（ｗ／ｗ）でｒｈＧＨの累積放出をプロットすることによって調べた。このプロットはＦｉｇ２Ａに示す。８５：１５、７５：２５及び５０：５０ｗ／ｗ比は２８日で１０％、１３％、及び２６％のタンパク質の放出を生じた。ＳＡＩＢ／溶媒比は放出速度の一因子であるが、ＳＡＩＢ：エタノール製剤に対する初期バーストに影響は与えない。
【００１４】
ＳＡＢＥＲ溶媒タイプ
ＳＡＢＥＲからの放出速度に対する溶媒の影響をＦｉｇ３に示す。全てのＳＡＩＢ／溶媒調製物が最初の日にｒｈＧＨの低い初期バーストを示し、２８日までタンパク質の放出を示した。ｒｈＧＨ／ＳＡＩＢ：ミグリオール懸濁液が乏しい放出曲線を持つ唯一の試料であった。全ての試料について２８日にわたって放出されたタンパク質の全量は全タンパク質負荷の１３％を超えることはなかった。この結果は、インビトロ実験ではこれらの酵素分解が欠如しているためであると予想された。
【００１５】
負荷
全てのＳＡＩＢ／溶媒調製物と両方のタンパク質負荷に対する放出結果はＦｉｇ２Ｂ−Ｃに詳細に示されている。理想的には、一ヶ月の徐放系はおよそ＜１０％の初期バーストと３％の一日平均放出を持っていなければならない。ｒｈＧＨを有するＳＡＢＥＲに対する結果では、０．１から２．２％のバーストが示され、２８日にわたる一日平均放出は０．１から０．９％である。これらの値は極めて低いが、ＳＡＢＥＲのインビトロでの分解が欠如しているためであると予想される。
【００１６】
製剤
ＳＡＢＥＲからのｒｈＧＨの放出に対する亜鉛の影響を、ＳＡＢＥＲからの重炭酸塩中の亜鉛錯化ｒｈＧＨと凍結乾燥ｒｈＧＨの放出速度を比較することにより、評価した。５％ｗ／ｖ懸濁液を、二つのＳＡＩＢ／溶媒調製物、安息香酸ベンジル及びエタノールを使用して調製した。放出曲線はＦｉｇ４に示す。重炭酸塩ｒｈＧＨは両方のＳＡＢＥＲ調製物に対して亜鉛錯化ｒｈＧＨよりも高い初期バーストをつくりだす。ＳＡＩＢ：エタノールからの重炭酸塩ｒｈＧＨに対する初期バーストは亜鉛錯化ｒｈＧＨに対する０．５３％と比較して６．５３％である。ＳＡＩＢ：安息香酸ベンジルからの初期バーストは亜鉛錯化ｒｈＧＨについての１．０６％と比較して重炭酸塩ｒｈＧＨに対して１４．６４％である。毎日の放出と放出された全タンパク質の全体はまた重炭酸塩ｒｈＧＨのものよりも更に高い。これらの結果は、亜鉛のような賦形剤がＳＡＢＥＲからのタンパク質の放出に影響を及ぼし得ることを示している。この影響は粒子の形態の差異か又はよりありそうなものとしてはタンパク質の溶解度の差異による可能性がある。亜鉛錯化ｒｈＧＨは重炭酸塩製剤よりも低い溶解度を持つ。放出されたタンパク質の完全性はＲＰ-ＨＰＬＣとＳＥＣによって測定した。その結果は、天然タンパク質での経時的な減少を示している（Ｆｉｇ５）。この減少は、安息香酸ベンジルとエタノールを含むＳＡＢＥＲ製剤から放出されるタンパク質において最も顕著であった。５％の負荷の製剤から放出されたタンパク質は１５％負荷の製剤から放出されたタンパク質ほどは未変性ではなかった。これは、放出媒質での高い溶媒暴露を生じる、５％負荷の製剤中のタンパク質：溶媒比の減少のためである可能性がある。これらの実験の過程で、幾つかのグレードの安息香酸ベンジルを用いた（試薬グレード及びＵＳＰグレード）。これらの溶媒グレードを使用する実験からの試料について酸化（ＲＰ-ＨＰＬＣ）と凝集（ＳＥＣ）を試験した。結果は、ＵＳＰグレードの安息香酸ベンジルを含むＳＡＢＥＲ製剤から放出されたタンパク質は、試薬グレードの安息香酸ベンジルから放出されたタンパク質よりも分解が少なかったことを示している（Ｆｉｇ６）。２１日後に、残っているｒｈＧＨモノマーの量は、試薬グレードの製剤の７５％と比較してＵＳＰグレードの安息香酸の製剤では９０％を超えていた。逆相の結果はまたＵＳＰグレードの安息香酸ベンジルでタンパク質の品質が改善されることを示している。２１日で、試薬グレード溶媒で見られた６０％と比較して、主ピークの８０％が残った。ＳＡＢＥＲ製剤に使用された溶媒の純度はタンパク質の性質に直接的な影響を持っており、よってモニターされなければならない。
【００１７】
亜鉛がタンパク質の放出速度に対して示した影響を測定するために、亜鉛錯化ＧＨと重炭酸塩ｒｈＧＨを、溶媒としてエタノールと安息香酸ベンジルを含む２つのＳＡＢＥＲ製剤と混合した。放出媒質（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＮａＮ３、ｐＨ７．２）を含むＥＤＴＡを使用してインビトロの放出実験を実施した。これらの結果をＦｉｇ７にまとめる。放出媒質中のＥＤＴＡの存在は両方のｒｈＧＨのＳＡＢＥＲ製剤に対して、初期バーストと全体的な放出の両方を増加させた。
【００１８】
表面積
溶媒が接近できる露出した表面積とＳＡＢＥＲ：バッファー比はＳＡＢＥＲ製剤からのｒｈＧＨの放出に影響を及ぼすように思われた（Ｆｉｇ８）。大なる表面積と低いＳＡＢＥＲ：バッファー比（＞バッファー容積）を用いた場合、より多くのｒｈＧＨが放出された。この結果は、露出した表面積とＳＡＢＥＲ：バッファー比の双方をインビトロ実験中に制御しなければならないことを示している。
【００１９】
薬物動態学
インビボでの薬物動態学では、ＳＡＢＥＲ製剤がかなり低い初期バーストで長い期間の間、ｒｈＧＨを送達することができることが示されている（Ｆｉｇ９）。しかし、ＳＡＢＥＲ溶媒の性質が放出機構に大きな役割を担っている。安息香酸ベンジルを含むＳＡＢＥＲ製剤は最初の４８時間で＞８０％の利用できる負荷物質を放出したが、ベンジルアルコール製剤はこれらの実験の間にわたって目標（１０ｎｇ／ｍＬ）レベルのｒｈＧＨを送達した。コントロールのミクロスフィアと比較すると、ベンジルアルコール製剤は顕著に低い初期バーストを持っていたが、７日間、同様の血清レベルを維持した。
【００２０】
結論
インビトロでは放出速度はＳＡＩＢ／溶媒タイプ、ＳＡＩＢ／溶媒比、賦形剤、放出媒質、及び表面積に依存する。
放出されたタンパク質の品質はＳＡＢＥＲ調製物に使用される溶媒のタイプと溶媒の純度に依存する。ｒｈＧＨのＳＡＢＥＲ製剤はｒｈＧＨの送達に対して低いバーストの徐放系を提供し得る。しかし、インビボでは速度はタンパク質製剤とＳＡＢＥＲ溶媒の選択に依存するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】スクロースアセテートイソブチレートの構造がＦｉｇ１に示される。
【図２】Ｆｉｇ２はエタノールを含むスクロースアセテートイソブチレート製剤からのｈＧＨの放出に対する溶媒比（Ｆｉｇ２Ａ）及び負荷（Ｆｉｇ２Ｂ及び２Ｃ）の影響を示す。
【図３】Ｆｉｇ２Ｃ。
【図４】Ｆｉｇ３は、スクロースアセテートイソブチレート製剤からのｒｈＧＨの放出に対する溶媒の影響を示す。
【図５】Ｆｉｇ４は、スクロースアセテートイソブチレート製剤からのｒｈＧＨの逆戻りに対してタンパク質製剤が持つ影響を示す。
【図６】Ｆｉｇ５は天然サイズ排除クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣによって測定したスクロースアセテートイソブチレート製剤からの逆戻り後のタンパク質の完全性を示す。
【図７】Ｆｉｇ５Ｃ−５Ｄ。
【図８】Ｆｉｇ６は、試薬及びＵＳＰグレードの安息香酸ベンジルを含むスクロースアセテートイソブチレート製剤から放出されたｒｈＧＨの安定性に対する溶媒の性質の影響を示す。
【図９】Ｆｉｇ７は、スクロースアセテートイソブチレート製剤からの亜鉛錯化ｒｈＧＨの逆戻りへのキレート剤（ＥＤＴＡ）が持つ影響を示す。
【図１０】Ｆｉｇ８は、スクロースアセテートイソブチレート製剤からのｒｈＧＨの逆戻りへの、バッファー露出表面積とスクロースアセテートイソブチレートバッファー比が持つ影響を示す。
【図１１】Ｆｉｇ９は、ｒｈＧＨスクロースアセテート製剤の皮下投与後（ＳＤラット６／群、１５ｍｇ／Ｋｇ）のｒｈＧＨ血清レベルを示す。

Claims

スクロースアセテートイソブチレートを含む担体物質と；
成長ホルモンと；
Ｚｎ ^２＋と；
安息香酸ベンジル又はミグリオールから選択される溶媒とを含有する、徐放組成物。
成長ホルモンがヒト成長ホルモンである請求項１に記載の組成物。
スクロースアセテートイソブチレートと；
安息香酸ベンジル又はミグリオールから選択される溶媒と；
Ｚｎ ^２＋と；
成長ホルモンと、
を含有する徐放組成物。
室温で１０００ｃＰより低い粘度を持つ請求項３に記載の組成物。
室温で２００ｃＰより低い粘度を持つ請求項３に記載の組成物。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから８５：１５ｗ／ｗである請求項３に記載の組成物。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７５：２５ｗ／ｗである請求項３に記載の組成物。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７０：３０ｗ／ｗである請求項３に記載の組成物。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１００：１から１：１である請求項３に記載の組成物。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が２０：１から１：１である請求項３に記載の組成物。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１０：１から１：１である請求項３に記載の組成物。
５０：５０ｗ／ｗから８５：１５ｗ／ｗの溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレート比を有し、スクロースアセテートイソブチレートと溶媒が共に液体を形成し；成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１００：１から１：１で、Ｚｎ ^２＋と成長ホルモンが共に錯体を形成する、請求項３に記載の組成物。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７５：２５ｗ／ｗである請求項１２に記載の組成物。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７０：３０ｗ／ｗである請求項１２に記載の組成物。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が２０：１から１：１である請求項１２に記載の組成物。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１０：１から１：１である請求項１２に記載の組成物。
請求項１に記載の組成物を含む、成長ホルモンの注射製剤。
成長ホルモンの０．２％未満が注射の２４時間以内に放出される請求項１７に記載の製剤。
２４時間の期間内に放出される成長ホルモンの割合が０．０５％から３％である請求項１７に記載の製剤。
２４時間の期間内に放出される成長ホルモンの割合が１％から３％である請求項１７に記載の製剤。
請求項３に記載の組成物を含む、成長ホルモンの注射製剤。
成長ホルモンの０．２％未満が注射の２４時間以内に放出される請求項２１に記載の製剤。
２４時間以内に放出される成長ホルモンの割合が０．０５％から３％である請求項２１に記載の製剤。
２４時間以内に放出される成長ホルモンの割合が１％から３％である請求項２１に記載の製剤。
請求項１２に記載の組成物を含む、成長ホルモンの注射製剤。
成長ホルモンの０．２％未満が注射の２４時間以内に放出される請求項２５に記載の製剤。
２４時間以内に放出される成長ホルモンの割合が０．０５％から３％である請求項２５に記載の製剤。
２４時間以内に放出される成長ホルモンの割合が１％から３％である請求項２５に記載の製剤。
徐放組成物を調製する方法において、錯体と液体担体を混合して徐放組成物を生成することを含み；前記液体担体がスクロースアセテートイソブチレート、及び安息香酸ベンジル又はミグリオールから選択される溶媒を含み；前記錯体が成長ホルモンとＺｎ^２＋を含む方法。
前記徐放組成物が室温で１０００ｃＰより低い粘度を持つ請求項２９に記載の方法。
前記徐放組成物が室温で２００ｃＰより低い粘度を持つ請求項２９に記載の方法。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１００：１から１：１である請求項２９に記載の方法。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１０：１から１：１である請求項２９に記載の方法。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから８５：１５ｗ／ｗである請求項２９に記載の方法。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７０：３０ｗ／ｗである請求項２９に記載の方法。
前記徐放組成物が、５０：５０ｗ／ｗから８５：１５ｗ／ｗの溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレート比を有し、スクロースアセテートイソブチレートと溶媒が共に前記液体担体を形成し；成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１００：１から１：１で、Ｚｎ ^２＋と成長ホルモンが共に前記錯体を形成し；錯体に対する液体担体の比が９５：５ｖ／ｗから８５：１５ｖ／ｗである、請求項２９に記載の方法。
溶媒に対するスクロースアセテートイソブチレートの比が５０：５０ｗ／ｗから７０：３０ｗ／ｗである請求項３６に記載の方法。
成長ホルモンに対するＺｎ ^２＋のモル比が１０：１から１：１である請求項３６に記載の方法。