JP4350895B2 - トリフルオロ−３（ｒ）−ヒドロキシ酪酸誘導体の調製方法 - Google Patents
トリフルオロ−３（ｒ）−ヒドロキシ酪酸誘導体の調製方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は一般構造式Iに示されるトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体の新規な生物工学的調製法に関する。
【０００２】
【化３】
【０００３】
4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルのようなトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体は、例えば、モノアミンオキシダーゼ阻害剤(EP-A-0 736 606)であるベフロキサトン (Befloxatone) 製造のような医薬品製造における重要な中間体である。
【０００４】
4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エステル類の生物工学的調製法はすでに幾つか知られている。
【０００５】
Guerrero,A.および Raja,E. (Bioorganic Chemistry Letters 1(12),675-678) は、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)を用い、相当するラセミ体から出発して、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸を微生物学的に調製する方法を発表している。この方法においては、得られた所望の生成物の光学純度は低い。
【０００６】
EA-A-0 736 606にはリパーゼ ノボザイム 435(Novozym 435)を用い、4,4,4-トリフルオロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルから出発して、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルを調製するための生物工学的方法が記載されている。この方法の不利な点は所望の生成物の収率が良くないことである。
【０００７】
EA-A-0 577 446にはリパーゼを用い、相当するラセミ体のエステルから出発して、光学活性な4,4,4-トリフルオロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルを調製する生物工学的方法が示されている。この方法を用いると、生成物は低収率であり、また光学純度も低い。
【０００８】
WO 89/02 470には加水分解酵素を用い、ラセミ体 4,4,4-トリフルオロ-3-アシロキシ酪酸エチルから出発して、光学活性な4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルを調製するための方法が記載されている。しかしながら、この方法では光学純度的に純粋な、相当する生成物が作ることができない。
【０００９】
本発明の目的は、高収率、高光学純度で所望の生成物を単離することができるような、トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体の有用な生物工学的調整法を創出することであった。
【００１０】
その目的は請求項１に記載される方法により達成された。
【００１１】
本発明よれば、当該方法は一般式IIに示されるトリフルオロアセト酢酸エチル誘導体を、
【化４】
【００１２】
［ここで、R1は-OR2（ここで、R2は水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、アリール、アルコキシアルキル、もしくは、アルコキシアルコキシアルキルである）、-NR3R4（ここで、R3およびR4は同一、または、異なり、そして、水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、もしくは、アリールである）、或いは、-SR5（ここで、R5は水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、もしくは、アリールである）である］
カルボニル基を還元することのできる微生物、または、これら微生物の無細胞酵素抽出液を用いて、一般式Iに変換することによって行われる。
【００１３】
【化５】
【００１４】
（ここで、R1は 前述の通りである
以下に示すように、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、もしくは、デシルのような分岐鎖、直鎖、１級、２級、または３級の脂肪族基がC1-10-アルキルとして用いられる。C1-10-アルキルとしてはエチル、プロピル、イソプロピル、またはヘキシルが好ましい。
【００１５】
例として、エテニル、プロペニル、アリル、ブテニルを、C1-10-アルケニルとして用いることができ、好ましくは、アリルが用いられる。
【００１６】
アリールとは、置換または無置換の、ベンジル、フェニル、またはナフチルを意味する。例として、クロロベンジル、またはブロモベンジルのようなハロゲン化ベンジルを置換ベンジルとして用いることができる。無置換ベンジルを好ましく用いることができる。
【００１７】
C3-8-シクロアルキルとは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、またはシクロオクチルを意味し、シクロヘキシルが好ましい。
【００１８】
アルコキシアルキルとしては、好ましくはメトキシエチルやエトキシエチルのようなC1-6-アルコキシエチルを意味し、特に好ましくはエトキシエチルである。
【００１９】
アルコキシアルコキシアルキルとしては、好ましくは2-(2-メトキシエトキシ)エチルおよび2-(2-エトキシエトキシ)エチルのような2-(2-C1-6-アルコキシ-エトキシ)エチルを意味し、特に好ましくは、後者の例が用いられる。
【００２０】
その結果、好ましい出発化合物はトリフルオロアセト酢酸エチル、トリフルオロアセト酢酸プロピル、トリフルオロアセト酢酸イソプロピル、トリフルオロアセト酢酸ヘキシル、トリフルオロアセト酢酸シクロヘキシル、トリフルオロアセト酢酸ベンジル、トリフルオロアセト酢酸エトキシエチル、トリフルオロアセト酢酸エトキシエトキシエチルである。
【００２１】
カルボニル基を還元することができる適切な微生物の例として、カルボニル基を還元できる酵素（例えば、還元酵素活性を有する酵素）を発現できる遺伝子、特に、アルデヒド還元酵素、アルコール脱水素酵素、またはケトン還元酵素の遺伝子を含む微生物があげられる。カルボニル基を還元することができる酵素はNADPH(β-ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド)-依存性であるか、または他の補因子に依存している。NADPH-依存性の還元系を有する微生物がより好ましい。
【００２２】
これらの微生物の無細胞酵素抽出液は例えば、フレンチプレス法、超音波法、またはリゾチーム法のような、当業者にとって慣用的方法により、手に入れることができる。
【００２３】
生物学的変換はアルデヒド還元酵素、特にNADPH-依存性アルデヒド還元酵素を有する微生物を用いて、適切に行われる。
【００２４】
スポロボロミセス サルモニックカラー(Sporobolomyces salmonicolor)種の微生物のようなNADPH-依存性アルデヒド還元酵素を有する微生物はすでにShimizuら(1990, Applied and Environmental Microbiology, 56(8), 2374-2377)やKataoka, M.ら(Biochimica Acta, 1112, 57-62 (1992)) によって報告されている。これらの微生物は、一方では、本発明に記載した方法に用いることができ、他方では、プラスミドや他の適当な微生物を構築する出発原料としても役立つ。
【００２５】
カルボニル基を還元することができる酵素をコードする遺伝子で形質変換した組換え微生物は生物学的変換によく用いられる。そのような遺伝子で形質変換できる微生物の例として、大腸菌属の微生物、特に、大腸菌JM109、大腸菌DH5、大腸菌HB101のような大腸菌種があげられる。
【００２６】
例えば、アルデヒド還元酵素のような還元酵素活性を有する遺伝子は、好ましくは形質転換に適したベクター、例えば、tacプロモーター(Ptac)のような遺伝子を発現するのに適したプロモーターを適切に伴っているプラスミド上に配置している。
【００２７】
用いる微生物がNADPH-依存性酵素を含むのであれば、生物学的変換はNADPH存在下で適切に行われるであろう。NADPHは必要量を直接加えるか、イン サイチュで生成されるかのどちらかである。好都合なことにNADPHはイン サイチュで生成される。この目的で、生物学的変換はNADPHの生成因子または再生因子、すなわち、その酸化体、（つまりNADP+）からNADPHの形成を触媒する酵素の存在下で適切に実行される。例えば、バチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素 (Bacillus megaterium glucose dehydrogenase)のようなグルコース脱水素酵素は、NADPH生成因子または再生因子としてよく用いられる。
【００２８】
生物学的変換でNADPHを発生させるためには、後者が、NADPH生成因子を発現する微生物の存在下で、好適に実行される。NADPH生成因子をコードする遺伝子で形質転換した組換え微生物は、とくに、この目的で用いられる。この場合、NADPH生成因子の遺伝子は、形質転換に適したベクター、例えば、tacプロモーター(Ptac)のような遺伝子を発現するのに適したプロモーターを適切に伴っているプラスミド上に位置している。
【００２９】
カルボニルを還元することができる他の微生物、および、NADPHを形成することができる他の微生物には、NADPH生成因子存在下で、カルボニル基を還元することができるNADPH-依存性酵素、例えば、NADPH-依存性アルデヒド還元酵素を使って、一般式Iに示されるトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するのに用いることのできるものがある。しかしながら、本発明に従って使われる、カルボニルを還元することができる微生物は、好都合なことに、すでにNADPH生成因子または再生因子をコードする遺伝子(例えば、グルコース脱水素酵素をコードするような遺伝子)をそれら自身に含んでいる。
【００３０】
NADPH-依存性酵素をコードする遺伝子（例えば、NADPH-依存性アルデヒド還元酵素)、をコードする遺伝子）およびNADPH生成因子または再生因子(例えば、グルコース脱水素酵素)をコードする遺伝子で形質転換した組換え微生物は、都合良く生物学的変換に用いられる。ある可能な態様において、これらの遺伝子は発現のため、１つのプラスミド上に位置している。また、もう１つの態様では、互いに適合する異なったプラスミド上にある。
【００３１】
その結果として、生物学的変換は次に示される事項を含む微生物を用いることにより、適切に実行される。
・少なくとも１つのベクター、例えば、アルデヒド還元酵素遺伝子のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子を有するプラスミド；
・少なくとも２つのベクター、例えば、それらのうち一方には、アルデヒド還元酵素遺伝子のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子を、他方には、グルコース脱水素酵素遺伝子のようなNADPH生成因子または再生因子の遺伝子を有するプラスミド；
或いは、
・少なくとも１つのベクター、例えば、アルデヒド還元酵素のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子と、グルコース脱水素酵素遺伝子のようなNADPH生成因子または生成因子の遺伝子とを有するプラスミド。
生物学的変換は、それぞれアルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する少なくとも２つのプラスミドで形質変換した大腸菌JM109種もしくは大腸菌DH5種の微生物、または両遺伝子、すなわち、アルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する少なくとも１つのプラスミドで形質変換した大腸菌HB101種もしくは大腸菌DH5種の微生物を用いて、都合良く行われる。特に、生物学的変換は、アルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する大腸菌JM109および大腸菌DH5を用いて行われる。当然、生物学的変換はまた、それぞれの場合によって、先に述べた遺伝子の１つのみを有する別の微生物を用いても行うことができる。
【００３２】
スポロボロミセス サルモニックカラー NADPH-依存性アルデヒド還元酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドpKAR、および、バチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドpKKGDHを与える微生物、大腸菌JM109は、1997年12月16日に、ブダペスト条約に従って、寄託番号DSM 11902のもとで、D-38124 Brauschweig, Mascheroderweg lb、Germanyに所在の微生物および細胞培養のドイツコレクション(Deutsue Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen［German Collection of Microorganisms and Cell Cultures］)有限会社(DSMZ)に寄託された。プラスミド pKAR、およびpKKGDH を与える微生物、大腸菌 DH5は1998年12月7日に、ブダペスト条約に従って、寄託番号DSM 12566 のもとで、前述の保管施設に寄託された。
【００３３】
遺伝子は発現系に依存して発現することができる。本発明に従って、好都合に用いられる発現系の場合、例えば、もし、大腸菌JM109または大腸菌 HB101が微生物として用いられるのであれば、遺伝子の発現は、IPTG(イソプロピルチオガラクトシダーゼ)を用いて誘発される。当業者に慣用的な、大腸菌DH5を用いるときは、IPTGでの誘発は必要ではない。
【００３４】
慣用的な細胞培養に従って、生物学的変換は１相もしくは２相系、好ましくは２相系で行うことができる。
【００３５】
低分子量リン酸緩衝液、もしくは、トリス緩衝液のような当業者に慣用的な緩衝液培地が１相系として用いられる。
【００３６】
出発化合物が溶解する有機溶媒とともに、当業者に慣用的な緩衝液培地は２相系として用いられる。適切な有機溶媒としては、エステル類、アルコール類、ハロゲン化炭化水素類、エーテル類、脂肪族C5-12炭化水素、または芳香属炭化水素があげられる。酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、および、酢酸ブチルのような酢酸エステルがエステル類として用いられる。ヘキサノール、ヘプタノールおよびオクタノールのようなC4-10アルコールがアルコール類として用いられる。例えば、ベンゼン、トルエンおよびキシレンが芳香族炭化水素として用いられる。例えば、クロロホルムおよびジクロロメタンがハロゲン化炭化水素として用いられる。例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、メチル tert-ブチル エーテルおよびジブチルエーテルがエーテル類として用いられる。適した脂肪族C5-12炭化水素の例としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、および、デカンがあげられる。
【００３７】
第２の相が出発化合物および／または生成物から成る２相系もまた適している。共溶媒は出発化合物の溶解度増加の目的で用いられる。メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、もしくは、tert-ブタノールのような低分子量脂肪族アルコール、またはジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリルのような不活性溶媒は共溶媒として使われる。
【００３８】
生物学的変換は、通例として、炭素源の存在下で行われる。適切な炭素源の例としては、グルコース、フルクトースまたはスクロースのような炭化水素、およびグリセロールのような糖アルコールがあげられる。
【００３９】
培地のpHは5〜10にわたる範囲内であり、6〜8が好ましい。
【００４０】
生物学的変換は、5〜60℃の温度で適切に行われ、10〜40℃が好ましい。
数分〜50時間の反応時間の後、所望の生成物を高収率、および高光学純度(ee)で単離することができる。
【００４１】
実 施 例
実施例１： 微生物の培養
大腸菌JM109/pKAR、pKKGDH(DMSZ 11902)細胞は20lの発酵槽にて、無機塩培地(Table 1)12l中、22℃で培養した。6時間後、細胞誘発の目的でIPTGが加えられた。それからグリセロールが加えられ、そして、52時間の範囲で、光学的密度OD650nm=41.8に至るまで、細胞を培養した。それから細胞を-80℃で保管した。
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
実施例２： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルの調製
ａ）OD650nm 7.2の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含む無機塩培地(table 1) 800ml中に、グルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0 に保たれた。24時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 67.8%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 48gが含まれていた。
【００４６】
ｂ）OD650nm 30.7の実施例１に記載した微生物を含むリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を実施例２ａに記載したように、発酵槽に入れた。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。25時間後、さらに4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 10gを加えた。45時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 60.6%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 49gが含まれていた。
【００４７】
ｃ）OD650nm 7.6の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1mM、pH 6.0) 800mlにグルコース140g および NADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.8%以上を有し、モル収率 71%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 50gが含まれていた。
【００４８】
ｄ）OD650nm 6.5の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140g および NADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。さらに、5時間後、および26時間後、それぞれにNADP+ 50mgを加えた。46時間後、有機層にはee価 99.7%以上を有し、モル収率 51％に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 35gが含まれていた。
【００４９】
実施例３： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピルの調製
ａ）OD650nm 9.7の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含む実施例１と一致した無機塩倍地800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸イソプロピル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を実施例２に記載したように、発酵槽に入れた。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。21時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 59.7%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピル 42.2gが含まれていた。
【００５０】
ｂ）OD650nm 8.5の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸イソプロピル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 46%に相当する、 4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピル 32gが含まれていた。
【００５１】
実施例４： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸ヘキシルの調製
OD650nm 9.5の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸ヘキシル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵層を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 3%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸ヘキシル 2gが含まれていた。
【００５２】
実施例５： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸シクロヘキシルの調製
OD650nm 8.9の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸シクロヘキシル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1 M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 23%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸シクロヘキシル 16gが含まれていた。
【００５３】
実施例６： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸ベンジルの調製
OD650nm 9.0の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸ベンジル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価99.9%以上を有し、モル収率 9%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸ベンジル 6gが含まれていた。
【００５４】
実施例７： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸 2-エトキシエチルの調製
OD650nm 10.2の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エトキシエチル 35gを含む酢酸ブチル300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 98.6%以上を有し、モル収率12%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エトキシエチル 4gが含まれていた。
【００５５】
実施例８： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸 2-(2-エトキシエチル)エチルの調製
OD650nm 10.7の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エトキシエトキシエチル 35gを含む酢酸ブチル 300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 16%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エトキシエトキシエチル 5gが含まれていた。
【００５６】
実施例９： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸メチルの調製
OD650nm 11.4の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸メチル 35gを含む酢酸ブチル 300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 96.1%以上を有し、モル収率 7%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸メチル 3.6gが含まれていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に適した、選択マーカーとしてtacプロモーターやアンピシリン(Ap)耐性を伴うスポロボロミセス サルモニックカラー NADPH-依存性アルデヒド還元酵素遺伝子を有するプラスミド、pKARの構造を示す図。
【図２】 本発明にした、選択マーカーとしてtacプロモーターやカナマイシン(Km)耐性を伴うバチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素遺伝子を有する別のプラスミド、pKKGDHの構造を示す図。
本発明は一般構造式Iに示されるトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体の新規な生物工学的調製法に関する。
【０００２】
【化３】
4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルのようなトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体は、例えば、モノアミンオキシダーゼ阻害剤(EP-A-0 736 606)であるベフロキサトン (Befloxatone) 製造のような医薬品製造における重要な中間体である。
【０００４】
4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エステル類の生物工学的調製法はすでに幾つか知られている。
【０００５】
Guerrero,A.および Raja,E. (Bioorganic Chemistry Letters 1(12),675-678) は、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)を用い、相当するラセミ体から出発して、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸を微生物学的に調製する方法を発表している。この方法においては、得られた所望の生成物の光学純度は低い。
【０００６】
EA-A-0 736 606にはリパーゼ ノボザイム 435(Novozym 435)を用い、4,4,4-トリフルオロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルから出発して、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルを調製するための生物工学的方法が記載されている。この方法の不利な点は所望の生成物の収率が良くないことである。
【０００７】
EA-A-0 577 446にはリパーゼを用い、相当するラセミ体のエステルから出発して、光学活性な4,4,4-トリフルオロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルを調製する生物工学的方法が示されている。この方法を用いると、生成物は低収率であり、また光学純度も低い。
【０００８】
WO 89/02 470には加水分解酵素を用い、ラセミ体 4,4,4-トリフルオロ-3-アシロキシ酪酸エチルから出発して、光学活性な4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルを調製するための方法が記載されている。しかしながら、この方法では光学純度的に純粋な、相当する生成物が作ることができない。
【０００９】
本発明の目的は、高収率、高光学純度で所望の生成物を単離することができるような、トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体の有用な生物工学的調整法を創出することであった。
【００１０】
その目的は請求項１に記載される方法により達成された。
【００１１】
本発明よれば、当該方法は一般式IIに示されるトリフルオロアセト酢酸エチル誘導体を、
【化４】
［ここで、R1は-OR2（ここで、R2は水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、アリール、アルコキシアルキル、もしくは、アルコキシアルコキシアルキルである）、-NR3R4（ここで、R3およびR4は同一、または、異なり、そして、水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、もしくは、アリールである）、或いは、-SR5（ここで、R5は水素、C1-10-アルキル、C1-10-アルケニル、C3-8-シクロアルキル、もしくは、アリールである）である］
カルボニル基を還元することのできる微生物、または、これら微生物の無細胞酵素抽出液を用いて、一般式Iに変換することによって行われる。
【００１３】
【化５】
（ここで、R1は 前述の通りである
以下に示すように、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、もしくは、デシルのような分岐鎖、直鎖、１級、２級、または３級の脂肪族基がC1-10-アルキルとして用いられる。C1-10-アルキルとしてはエチル、プロピル、イソプロピル、またはヘキシルが好ましい。
【００１５】
例として、エテニル、プロペニル、アリル、ブテニルを、C1-10-アルケニルとして用いることができ、好ましくは、アリルが用いられる。
【００１６】
アリールとは、置換または無置換の、ベンジル、フェニル、またはナフチルを意味する。例として、クロロベンジル、またはブロモベンジルのようなハロゲン化ベンジルを置換ベンジルとして用いることができる。無置換ベンジルを好ましく用いることができる。
【００１７】
C3-8-シクロアルキルとは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、またはシクロオクチルを意味し、シクロヘキシルが好ましい。
【００１８】
アルコキシアルキルとしては、好ましくはメトキシエチルやエトキシエチルのようなC1-6-アルコキシエチルを意味し、特に好ましくはエトキシエチルである。
【００１９】
アルコキシアルコキシアルキルとしては、好ましくは2-(2-メトキシエトキシ)エチルおよび2-(2-エトキシエトキシ)エチルのような2-(2-C1-6-アルコキシ-エトキシ)エチルを意味し、特に好ましくは、後者の例が用いられる。
【００２０】
その結果、好ましい出発化合物はトリフルオロアセト酢酸エチル、トリフルオロアセト酢酸プロピル、トリフルオロアセト酢酸イソプロピル、トリフルオロアセト酢酸ヘキシル、トリフルオロアセト酢酸シクロヘキシル、トリフルオロアセト酢酸ベンジル、トリフルオロアセト酢酸エトキシエチル、トリフルオロアセト酢酸エトキシエトキシエチルである。
【００２１】
カルボニル基を還元することができる適切な微生物の例として、カルボニル基を還元できる酵素（例えば、還元酵素活性を有する酵素）を発現できる遺伝子、特に、アルデヒド還元酵素、アルコール脱水素酵素、またはケトン還元酵素の遺伝子を含む微生物があげられる。カルボニル基を還元することができる酵素はNADPH(β-ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド)-依存性であるか、または他の補因子に依存している。NADPH-依存性の還元系を有する微生物がより好ましい。
【００２２】
これらの微生物の無細胞酵素抽出液は例えば、フレンチプレス法、超音波法、またはリゾチーム法のような、当業者にとって慣用的方法により、手に入れることができる。
【００２３】
生物学的変換はアルデヒド還元酵素、特にNADPH-依存性アルデヒド還元酵素を有する微生物を用いて、適切に行われる。
【００２４】
スポロボロミセス サルモニックカラー(Sporobolomyces salmonicolor)種の微生物のようなNADPH-依存性アルデヒド還元酵素を有する微生物はすでにShimizuら(1990, Applied and Environmental Microbiology, 56(8), 2374-2377)やKataoka, M.ら(Biochimica Acta, 1112, 57-62 (1992)) によって報告されている。これらの微生物は、一方では、本発明に記載した方法に用いることができ、他方では、プラスミドや他の適当な微生物を構築する出発原料としても役立つ。
【００２５】
カルボニル基を還元することができる酵素をコードする遺伝子で形質変換した組換え微生物は生物学的変換によく用いられる。そのような遺伝子で形質変換できる微生物の例として、大腸菌属の微生物、特に、大腸菌JM109、大腸菌DH5、大腸菌HB101のような大腸菌種があげられる。
【００２６】
例えば、アルデヒド還元酵素のような還元酵素活性を有する遺伝子は、好ましくは形質転換に適したベクター、例えば、tacプロモーター(Ptac)のような遺伝子を発現するのに適したプロモーターを適切に伴っているプラスミド上に配置している。
【００２７】
用いる微生物がNADPH-依存性酵素を含むのであれば、生物学的変換はNADPH存在下で適切に行われるであろう。NADPHは必要量を直接加えるか、イン サイチュで生成されるかのどちらかである。好都合なことにNADPHはイン サイチュで生成される。この目的で、生物学的変換はNADPHの生成因子または再生因子、すなわち、その酸化体、（つまりNADP+）からNADPHの形成を触媒する酵素の存在下で適切に実行される。例えば、バチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素 (Bacillus megaterium glucose dehydrogenase)のようなグルコース脱水素酵素は、NADPH生成因子または再生因子としてよく用いられる。
【００２８】
生物学的変換でNADPHを発生させるためには、後者が、NADPH生成因子を発現する微生物の存在下で、好適に実行される。NADPH生成因子をコードする遺伝子で形質転換した組換え微生物は、とくに、この目的で用いられる。この場合、NADPH生成因子の遺伝子は、形質転換に適したベクター、例えば、tacプロモーター(Ptac)のような遺伝子を発現するのに適したプロモーターを適切に伴っているプラスミド上に位置している。
【００２９】
カルボニルを還元することができる他の微生物、および、NADPHを形成することができる他の微生物には、NADPH生成因子存在下で、カルボニル基を還元することができるNADPH-依存性酵素、例えば、NADPH-依存性アルデヒド還元酵素を使って、一般式Iに示されるトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するのに用いることのできるものがある。しかしながら、本発明に従って使われる、カルボニルを還元することができる微生物は、好都合なことに、すでにNADPH生成因子または再生因子をコードする遺伝子(例えば、グルコース脱水素酵素をコードするような遺伝子)をそれら自身に含んでいる。
【００３０】
NADPH-依存性酵素をコードする遺伝子（例えば、NADPH-依存性アルデヒド還元酵素)、をコードする遺伝子）およびNADPH生成因子または再生因子(例えば、グルコース脱水素酵素)をコードする遺伝子で形質転換した組換え微生物は、都合良く生物学的変換に用いられる。ある可能な態様において、これらの遺伝子は発現のため、１つのプラスミド上に位置している。また、もう１つの態様では、互いに適合する異なったプラスミド上にある。
【００３１】
その結果として、生物学的変換は次に示される事項を含む微生物を用いることにより、適切に実行される。
・少なくとも１つのベクター、例えば、アルデヒド還元酵素遺伝子のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子を有するプラスミド；
・少なくとも２つのベクター、例えば、それらのうち一方には、アルデヒド還元酵素遺伝子のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子を、他方には、グルコース脱水素酵素遺伝子のようなNADPH生成因子または再生因子の遺伝子を有するプラスミド；
或いは、
・少なくとも１つのベクター、例えば、アルデヒド還元酵素のようなカルボニル基を還元することができる酵素の遺伝子と、グルコース脱水素酵素遺伝子のようなNADPH生成因子または生成因子の遺伝子とを有するプラスミド。
生物学的変換は、それぞれアルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する少なくとも２つのプラスミドで形質変換した大腸菌JM109種もしくは大腸菌DH5種の微生物、または両遺伝子、すなわち、アルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する少なくとも１つのプラスミドで形質変換した大腸菌HB101種もしくは大腸菌DH5種の微生物を用いて、都合良く行われる。特に、生物学的変換は、アルデヒド還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素を有する大腸菌JM109および大腸菌DH5を用いて行われる。当然、生物学的変換はまた、それぞれの場合によって、先に述べた遺伝子の１つのみを有する別の微生物を用いても行うことができる。
【００３２】
スポロボロミセス サルモニックカラー NADPH-依存性アルデヒド還元酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドpKAR、および、バチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドpKKGDHを与える微生物、大腸菌JM109は、1997年12月16日に、ブダペスト条約に従って、寄託番号DSM 11902のもとで、D-38124 Brauschweig, Mascheroderweg lb、Germanyに所在の微生物および細胞培養のドイツコレクション(Deutsue Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen［German Collection of Microorganisms and Cell Cultures］)有限会社(DSMZ)に寄託された。プラスミド pKAR、およびpKKGDH を与える微生物、大腸菌 DH5は1998年12月7日に、ブダペスト条約に従って、寄託番号DSM 12566 のもとで、前述の保管施設に寄託された。
【００３３】
遺伝子は発現系に依存して発現することができる。本発明に従って、好都合に用いられる発現系の場合、例えば、もし、大腸菌JM109または大腸菌 HB101が微生物として用いられるのであれば、遺伝子の発現は、IPTG(イソプロピルチオガラクトシダーゼ)を用いて誘発される。当業者に慣用的な、大腸菌DH5を用いるときは、IPTGでの誘発は必要ではない。
【００３４】
慣用的な細胞培養に従って、生物学的変換は１相もしくは２相系、好ましくは２相系で行うことができる。
【００３５】
低分子量リン酸緩衝液、もしくは、トリス緩衝液のような当業者に慣用的な緩衝液培地が１相系として用いられる。
【００３６】
出発化合物が溶解する有機溶媒とともに、当業者に慣用的な緩衝液培地は２相系として用いられる。適切な有機溶媒としては、エステル類、アルコール類、ハロゲン化炭化水素類、エーテル類、脂肪族C5-12炭化水素、または芳香属炭化水素があげられる。酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、および、酢酸ブチルのような酢酸エステルがエステル類として用いられる。ヘキサノール、ヘプタノールおよびオクタノールのようなC4-10アルコールがアルコール類として用いられる。例えば、ベンゼン、トルエンおよびキシレンが芳香族炭化水素として用いられる。例えば、クロロホルムおよびジクロロメタンがハロゲン化炭化水素として用いられる。例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、メチル tert-ブチル エーテルおよびジブチルエーテルがエーテル類として用いられる。適した脂肪族C5-12炭化水素の例としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、および、デカンがあげられる。
【００３７】
第２の相が出発化合物および／または生成物から成る２相系もまた適している。共溶媒は出発化合物の溶解度増加の目的で用いられる。メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、もしくは、tert-ブタノールのような低分子量脂肪族アルコール、またはジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリルのような不活性溶媒は共溶媒として使われる。
【００３８】
生物学的変換は、通例として、炭素源の存在下で行われる。適切な炭素源の例としては、グルコース、フルクトースまたはスクロースのような炭化水素、およびグリセロールのような糖アルコールがあげられる。
【００３９】
培地のpHは5〜10にわたる範囲内であり、6〜8が好ましい。
【００４０】
生物学的変換は、5〜60℃の温度で適切に行われ、10〜40℃が好ましい。
数分〜50時間の反応時間の後、所望の生成物を高収率、および高光学純度(ee)で単離することができる。
【００４１】
実 施 例
実施例１： 微生物の培養
大腸菌JM109/pKAR、pKKGDH(DMSZ 11902)細胞は20lの発酵槽にて、無機塩培地(Table 1)12l中、22℃で培養した。6時間後、細胞誘発の目的でIPTGが加えられた。それからグリセロールが加えられ、そして、52時間の範囲で、光学的密度OD650nm=41.8に至るまで、細胞を培養した。それから細胞を-80℃で保管した。
【００４２】
実施例２： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチルの調製
ａ）OD650nm 7.2の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含む無機塩培地(table 1) 800ml中に、グルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0 に保たれた。24時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 67.8%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 48gが含まれていた。
【００４６】
ｂ）OD650nm 30.7の実施例１に記載した微生物を含むリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を実施例２ａに記載したように、発酵槽に入れた。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。25時間後、さらに4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 10gを加えた。45時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 60.6%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 49gが含まれていた。
【００４７】
ｃ）OD650nm 7.6の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1mM、pH 6.0) 800mlにグルコース140g および NADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.8%以上を有し、モル収率 71%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 50gが含まれていた。
【００４８】
ｄ）OD650nm 6.5の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140g および NADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エチル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。さらに、5時間後、および26時間後、それぞれにNADP+ 50mgを加えた。46時間後、有機層にはee価 99.7%以上を有し、モル収率 51％に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エチル 35gが含まれていた。
【００４９】
実施例３： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピルの調製
ａ）OD650nm 9.7の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含む実施例１と一致した無機塩倍地800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 0.56gを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸イソプロピル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を実施例２に記載したように、発酵槽に入れた。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。21時間後、有機層にはee価 99%以上を有し、モル収率 59.7%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピル 42.2gが含まれていた。
【００５０】
ｂ）OD650nm 8.5の大腸菌JM109/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸イソプロピル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 46%に相当する、 4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸イソプロピル 32gが含まれていた。
【００５１】
実施例４： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸ヘキシルの調製
OD650nm 9.5の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800ml にグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸ヘキシル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵層を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 3%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸ヘキシル 2gが含まれていた。
【００５２】
実施例５： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸シクロヘキシルの調製
OD650nm 8.9の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸シクロヘキシル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1 M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 23%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸シクロヘキシル 16gが含まれていた。
【００５３】
実施例６： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸ベンジルの調製
OD650nm 9.0の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 800mlにグルコース 140gおよびNADP+ 50mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸ベンジル 70gを含む酢酸ブチル 400mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(400ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵を始動してから5時間後、さらにNADP+ 50mgを加えた。24時間後、有機層にはee価99.9%以上を有し、モル収率 9%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸ベンジル 6gが含まれていた。
【００５４】
実施例７： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸 2-エトキシエチルの調製
OD650nm 10.2の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エトキシエチル 35gを含む酢酸ブチル300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 98.6%以上を有し、モル収率12%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エトキシエチル 4gが含まれていた。
【００５５】
実施例８： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸 2-(2-エトキシエチル)エチルの調製
OD650nm 10.7の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸エトキシエトキシエチル 35gを含む酢酸ブチル 300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 99.9%以上を有し、モル収率 16%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸エトキシエトキシエチル 5gが含まれていた。
【００５６】
実施例９： 4,4,4-トリフルオロエチル-3(R)-ヒドロキシ酪酸メチルの調製
OD650nm 11.4の大腸菌DH5/pKAR、pKKGDHを含むリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH 6.0) 600mlにグルコース 105gおよびNADP+ 37.5mgを加えた。4,4,4-トリフルオロアセト酢酸メチル 35gを含む酢酸ブチル 300mlを加え、その混合物を2lの発酵槽に入れ、400rpmで攪拌し、空気を供給した(300ml/min)。pHは1M Na2CO3を加えることで、6.0に保たれた。発酵槽を始動してから5時間後、さらにNADP+ 37.5mgを加えた。24時間後、有機層にはee価 96.1%以上を有し、モル収率 7%に相当する、4,4,4-トリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸メチル 3.6gが含まれていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に適した、選択マーカーとしてtacプロモーターやアンピシリン(Ap)耐性を伴うスポロボロミセス サルモニックカラー NADPH-依存性アルデヒド還元酵素遺伝子を有するプラスミド、pKARの構造を示す図。
【図２】 本発明にした、選択マーカーとしてtacプロモーターやカナマイシン(Km)耐性を伴うバチルス メガテリウム グルコース脱水素酵素遺伝子を有する別のプラスミド、pKKGDHの構造を示す図。
Claims (8)
- 下記一般式Iを有するトリフルオロ-3(R)-ヒドロキシ酪酸誘導体の調製方法であって、
下記一般式IIを有するトリフルオロアセト酢酸誘導体を、
スポロボロミセス・サルモニックカラー由来のNADPH依存性アルデヒド還元酵素をコードする遺伝子、および酸化体であるNADP + からのNADPHの形成を触媒するNADPH生成因子としてのグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子で形質転換した大腸菌（Escherichia）属の微生物、またはこれらの微生物の無細胞酵素抽出液を用いて、エナンチオ選択的に変換することを具備する方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記微生物は、大腸菌（Escherichia coli.）種の微生物であることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記グルコース脱水素酵素はバチルス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素であることを特徴とする方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記変換は、大腸菌(Escherichia coli) JM109、大腸菌 HB101または大腸菌 DH5の微生物種を用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項４に記載の方法であって、前記大腸菌 JM109は、寄託番号DSM 11902の下で寄託され、プラスミド pKARおよびpKKGDHで形質転換したことを特徴とする方法。
- 請求項４に記載の方法であって、前記大腸菌 DH5は、寄託番号DSM 12566の下で寄託され、プラスミド pKARおよびpKKGDHで形質転換したことを特徴とする方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的変換は、5〜60℃の温度で行われることを特徴とする方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的変換は、pH 5〜10にわたる範囲で行われることを特徴とする方法。
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