JP4236893B2 - 菌計数方法および菌計数装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、フローサイトメトリを用いる菌計数方法およびその方法を実現するための装置に関し、より詳細には、蛍光色素を用いて死菌と生菌を分類計数する菌計数方法およびその方法を実現するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
生体中または食品中に細菌が存在するかどうかを検査するために、生体または食品由来の試料中に含まれる細菌の数を計数することが、臨床検査や食品衛生検査の分野で行われている。従来の計数方法としては、培養法、ＡＴＰ測定法および蛍光測定法がある。
培養法とは、試料を寒天培地に塗布し、１８〜２４時間培養の後、形成されたコロニー数を数えることによる細菌計数方法である。または試料を液体培地に塗布し、培養後、懸濁の有無により、細菌の増殖の有無を判断することもできる。
ＡＴＰ測定法とは、細菌の活動を示すＡＴＰを試料から抽出し、ＡＴＰと反応する発光試薬を添加し、該発光試薬が発する光の強度を検出することにより、細菌の数を計数する方法である。
蛍光測定法とは、生菌染色用の蛍光色素と死菌染色用の蛍光色素を併用し、試料を染色し、フローサイトメータや蛍光顕微鏡で生菌および死菌をそれぞれ検出および計数する方法である。
【０００３】
しかし従来の方法では、以下のような様々な問題点がある。例えば培養法は、基本的に手作業で行う方法であり、操作が煩雑である。さらに培養に長時間がかかるので、細菌の計数までに時間がかかる。また、培養可能な生菌のみしか計数できない。
ＡＴＰ測定法は、ＡＴＰ抽出処理などの前処理が煩雑である。さらに細菌を直接計数するわけではなく、発光試薬が発する発光の強度からＡＴＰ濃度、ついで細菌数へ換算するため、換算誤差が生じる可能性がある。また、ＡＴＰを産生している生菌のみしか計数できない。
蛍光測定法は、生菌および死菌それぞれを検出するために検出波長の大きく異なる色素を二種類要する。したがって、生菌および死菌を計数するためには、同一試料について色素に応じて異なる検出装置を用いて測定する必要があり、測定装置の構成が複雑かつ操作が煩雑になる。
以上のように、従来の方法では、生菌のみしか計数できず、かつ操作が煩雑であるか、生菌と死菌のそれぞれを計数できるが複雑な測定装置を必要とする、といった問題点が主に存在していた。
【０００４】
ところで、菌を含む試料中に抗生物質を添加し、その殺菌効果を調べるために菌数の変化を経時的に観察する場合には、生菌数だけではなく、死菌数も併せて得ることが望まれる。また、試料中に菌の存在が予め確認されている場合に、菌が生きていれば培養検査を行って菌数を計数する必要があるが、死んでいるときには培養検査は不要であるので、その菌の培養検査が必要か否か判定するためには、試料中の生菌数を得ることが望まれる。
【０００５】
一方、特開2001-258590号には、ｐＨ約２．０〜４．５において、細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて、さらに色素を作用させて細菌を染色する方法が開示されているが、生菌数および死菌数それぞれを得ることについては報告されていない。
したがって、生菌数および死菌数を得ることができる、簡便な方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法が提供される。
本発明によれば、試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法が提供される。
【０００８】
本発明によれば、さらに、２分割した試料の一方を、ｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、第１の測定用試料を調製する工程、
前記２分割した試料の他方を、pH ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤とで処理して総菌を染色し、第２の測定用試料を調製する工程、
調製した第１および第２の各測定用試料を任意の順序でフローサイトメータに導入して、光を照射して、各測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
第１の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、生菌数を算出する工程とからなる菌計数方法が提供される。
【０００９】
さらに本発明によれば、試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置が提供される。
さらに本発明によれば、試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置も提供される。
【００１０】
さらに本発明によれば、試料を２つに分取し供給する試料供給手段を備え、分取した一方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素と反応させ生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた第１の測定用試料を調製し、分取した他方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤と反応させて総菌を染色した第２の測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した各測定用試料に、光を照射して、試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
第１の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数し、第２の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数し、第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、試料中の生菌数を算出する解析部とからなる菌計数装置も提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明でいう試料は、細菌の有無あるいは、細菌が含まれている場合にはその数を計数するためのものであり、例えば、尿試料、血液、髄液などの臨床試料もしくは食品や水、飲料水等またはそれらの培養物のすべてに適用することができる。ここで、細菌とは、E.coli、S.aureus、E.faecalis、S.marcescens、P.aeruginosa等の人体または環境に影響を与えるもの全てが挙げられる。
【００１２】
試料を蛍光色素で処理する際にｐＨを約２．０〜４．５に維持するために、酸あるいはｐＨ約２．０〜４．５の領域の緩衝溶液を使用することができる。酸としては、クエン酸、リン酸、フタル酸、コハク酸及びフマル酸などを用いることができる。使用量は、前記ｐＨ範囲を維持できる量であればよく、１０〜５００ｍＭの範囲の濃度が好ましい。ｐＨ約２．０〜４．５の領域の緩衝溶液としては、所望のｐＨのブリトン−ロビンソン（Britton-Robinson）の緩衝液、クラーク−ルーブズ（Clark-Lubs）の緩衝液、コルトフ（Kolthoff）の緩衝液、マッキルベイン（McIlvaine）の緩衝液、ミカエリス（Michaelis）の緩衝液、セーレンセン（Sorensen）の緩衝液等を用いることができる。なお、上記ｐＨにおいては、中性やアルカリ性に比べ、細菌以外のものに対する非特異的な染色を抑えることができる。
【００１３】
第１の蛍光色素は、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせるものであり、酸性域で死菌を染色できるものが好ましい。なかでもポリメチン系色素が好ましく、例えば、以下の（１）〜（１１）の色素が使用できる。
（１）チアゾールオレンジ、
（２）
【化１】
【００１４】
（３）
【化２】
【００１５】
（４）
【化３】
【００１６】
（５）
【化４】
【００１７】
（６）
【化５】
【００１８】
（７）
【化６】
【００１９】
（８）
【化７】
【００２０】
（９）
【化８】
【００２１】
（１０）以下の一般式で表される化合物：
【化９】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は炭素数１〜３のアルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）
【００２２】
（１１）以下の一般式で表される化合物：
【化１０】
（式中、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｒ7びＲ8は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ9は水素原子、アシル基、又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｚは硫黄、酸素あるいは炭素数１〜３のアルキル基を有する炭素であり；ｎは０、1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２３】
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。炭素数１〜１８のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。
炭素数１〜３のアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられる。
アシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル等のような炭素数１〜４のアルカノイルや、アクリロイル、プロピオロイル、オレオイル等のような炭素数３〜１８のアルケノイルや、ベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ナフトイル等のような炭素数７〜１１のアロイル等が挙げられる。
アニオンとしては、フッ素、臭素、ヨウ素、塩素等のようなハロゲンのイオン、ＣｌＯ4 -、ＢＦ4 -等が挙げられる。
【００２４】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手可能であり、（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手可能であり、（５）〜（９）は、モレキュラープローブス社（Molecular Probes,Inc.）より入手可能である。また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に記載されている製造方法により製造することができる。
【００２５】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化１１】
が好適である。
第１の蛍光色素の濃度については、色素の種類によって好適な濃度は異なるが、例えば、０．１〜１００ｐｐｍ（最終濃度）の範囲が好ましい。
【００２６】
試料と第１の蛍光色素等との処理は、試料と色素と緩衝剤とを混合することで実施できる。混合する際には、必要に応じて、試料、色素および緩衝剤に溶媒を加えて、所望の濃度に希釈または溶解してもよい。また、試料、色素および緩衝剤の１以上は、それぞれ単独に溶媒を加えて希釈、溶解または懸濁された溶液を調製し、該溶液を混合することにより混合してもよい。溶媒としては、水、またはメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒を用いることができる。試料が尿である場合、一部の細菌が産生する亜硝酸の影響により蛍光色素での染色が阻害されることがある。そのような亜硝酸の影響を除去するために、試料と第1の蛍光色素等との処理において亜硝酸還元剤を添加してもよい。亜硝酸還元剤としてはアミド硫酸を用いることができる。
試料と第１の蛍光色素等との処理を行う際の温度および時間は特に限定されないが、温度は約３５〜５０℃、時間は１０〜３０秒程度が好ましい。このような処理により、第１の測定用試料が調製される。
【００２７】
調製された第１の測定用試料は、フローサイトメ−タに導入され、測定用試料中の蛍光色素で染色された菌の一つ一つに光を照射し、該細胞から発せられる散乱光や蛍光といった光学的情報を検出する。散乱光としては、側方散乱光、前方散乱光などが挙げられる。蛍光としては、側方蛍光、前方蛍光などが挙げられる。
【００２８】
得られた光学的情報を用いて、死菌と生菌とを分類計数する。生菌は死菌に比べ細部膜（細胞壁）の作用により菌内部の物質が蛍光染色されにくい。このことを利用し、本発明では死菌は十分に蛍光染色され、一方、生菌は死菌に比べ弱く蛍光染色されるか、又は実質的に蛍光染色されない条件において、第１の蛍光色素による試料の処理を行う。このようにして、生菌と死菌との間で染色度合いに差をつけ、各菌から検出される蛍光の強度に関して差異が生じるようにする。
【００２９】
生菌と死菌との間で蛍光強度に差異が生じると、図１に示すように、検出される蛍光強度の低い生菌と、検出される蛍光強度が高い死菌とが明確に分離して検出される。このような場合、蛍光強度のみに基づき、生菌と死菌とを分類計数することができる。蛍光強度に関して、生菌が発する蛍光強度よりも高く、死菌が発する蛍光強度よりも低い値に閾値を設定すれば、この閾値より低い蛍光強度を有する菌を生菌、この閾値よりも高い蛍光強度を有する菌を死菌として分類し、計数することができる。
【００３０】
また、前方散乱光強度と蛍光強度とを組み合わせて生菌と死菌とを分類計数してもよい。この方法は、蛍光強度だけでは生菌と死菌とを十分に分類することが困難な場合に有用である。図１に示すように、前方散乱光強度と蛍光強度とを各軸にとったスキャッタグラムを作成すれば、スキャッタグラム上に出現した生菌、死菌の各集団を囲むようにゲーティング（領域の設定）することで、各領域内の細菌を計数して生菌数及び死菌数を得ることができる。
【００３１】
また、本発明においては、用いる試料の種類、試料に含まれる細菌の種類等により、上述の方法に加えて、同じ試料の一部を第２の蛍光色素等で処理し、総菌を算出することにより、以下に示すようにより高精度に細菌数を分類および計数することができる。
第２の蛍光色素等で処理される試料は、予め２分割され、一方を第１の蛍光色素での上述のような処理に、他方を第２の蛍光色素等での処理に用いるのが好ましい。
【００３２】
第２の蛍光色素は、前述の第１の蛍光色素として挙げられているものから、選択することができる。使用濃度も、第１の蛍光色素と同様のものが好ましい。第１の蛍光色素と第２の蛍光色素の検出波長は、同じ検出装置を用いて検出可能なものが好ましく、特に、第２の蛍光色素と、第１の蛍光色素は同一であることが好ましい。
第２の蛍光色素で処理する際には界面活性剤を必須成分として用いる。界面活性剤としては、例えば、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤は細菌の細胞膜（細胞壁）を損傷させ、蛍光色素が細菌内へ効率よく入りこむことができるようにし、従って総ての細菌を染色することができる。なかでもカチオン界面活性剤は、細菌を効率よく染色可能であるので好ましい。さらにカチオン性界面活性剤は、試料中に存在する粘液糸、赤血球、細胞破片等を溶解および収縮することができ、それらにより細菌計数が妨害されることを防止する効果が大きいため、好ましい。
【００３３】
カチオン界面活性剤としては特に限定されないが、例えば、以下の式で示される第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【化１２】
（式中、Ｒ10は炭素数６〜１８のアルキル基又は（Ｃ6Ｈ5）−ＣＨ2−；Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基またはベンジル基；Ｙ-はハロゲンイオンである）。
【００３４】
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。炭素数６〜１８のアルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。ハロゲンとしては、フッ素、臭素、ヨウ素、塩素が挙げられる。
具体的には、ヘキシルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩が好適に用いられる。
【００３５】
また、カチオン界面活性剤の別の例として、ピリジニウム塩が挙げられる。
［（Ｃ5Ｈ5）Ｎ+−（ＣＨ2）ｎ−ＣＨ3］Ｙ-
（式中、ｎは７〜１７、Ｙ-はハロゲンイオンである）。
具体的には、オクチルピリジニウム塩、デシルピリジニウム塩、ドデシルトリメチルピリジニウム塩、テトラデシルトリメチルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルピリジニウム塩等が好適に使用される。
カチオン界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１０〜５００００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３０００ｍｇ／ｍｌの範囲で用いることができる。
【００３６】
アニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、Ｎ−アシルアミノ酢酸塩としてラウロイルサルコシン酸塩、ミリストイルサルコシン酸塩、オレイルサルコシン酸塩、オレイン酸塩等が好適に用いられる。
アニオン界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００３７】
両性界面活性剤は、特に限定されないが、好適には以下の酢酸ベタイン系のものが挙げられる。
【化１３】
（式中、Ｒ14は炭素数８〜２０のアルキル基；Ｒ15及びＲ16は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数２〜３のアルケニル基又はアルキニル基である）。
【００３８】
炭素数１〜３のアルキル基は上記と同様のものが挙げられる。炭素数２〜３のアルケニル基としては、ビニル、アリル等が挙げられる。炭素数２〜３のアルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。
具体的には、ドデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、ヘキサデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、デシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン等が挙げられる。
両性界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００３９】
ノニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン（ｎ）アルキルエーテルでは、アルキル基の炭素数１０〜２０、ｎ：１０〜２０のものがあげられる。ポリオキシエチレン（ｎ）アルキルフェニルエーテルでは、アルキル基の炭素数８〜１０、ｎ：２〜２０のもの、例えばＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテル等が好適である。
ノニオン性界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００４０】
また、上記以外の界面活性剤で細菌の細胞膜を損傷させる性質が認められているものとして、トリトンＸ−１００（ポリエチレン−グリコール−モノ［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］エーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）クロラミド）、デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシクロラミド）、シュクロースモノカプレート（sucrose monocaprate）、シュクロースモノコール酸エステル（sucrose monocholate）、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（n-octyl-α-D-glucopyranoside）、ｎ−ヘプチル−α−Ｄ−チオグルコピラノシド（n-heptyl-α-D-thioglucopyranoside）、ｎ−オクチル−α−Ｄ−チオグルコピラノシド（n-octyl-α-D-thioglucopyranoside）、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド（n-dodecyl-α-D-maltopyranoside）、ｎ−ノニル−α−Ｄ−チオマルトピラノシド（n-nonyl-α-D-thiomaltopyranoside）等が挙げられ、本発明の界面活性剤として用いることができる。
これらの界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．０〜１０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００４１】
試料と第２の蛍光色素等との処理は、試料と色素と界面活性剤と緩衝剤とを混合することで実施できる。混合する際には、必要に応じて試料と色素と界面活性剤と緩衝剤とに溶媒を加えて、所望の濃度に希釈または溶解してもよい。また、試料、色素、界面活性剤および緩衝剤の１以上は、それぞれ単独に溶媒を加えて希釈、溶解または懸濁された溶液を調製し、該溶液を混合することにより混合されてもよい。溶媒としては、水、またはメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒を用いることができる。試料が尿である場合、一部の細菌が産生する亜硝酸の影響により蛍光色素での染色が阻害されることがある。そのような亜硝酸の影響を除去するために、試料と第２の蛍光色素等との処理において亜硝酸還元剤を添加してもよい。亜硝酸還元剤としてはアミド硫酸を用いることができる。
試料と第２の蛍光色素との処理を行う際の温度および時間は特に限定されないが、温度は約３５〜５０℃、時間は３０秒〜１０分程度が好ましい。このような処理により、第２の測定用試料が調製される。
【００４２】
調製された第２の測定用試料は、フローサイトメータに導入され、測定用試料中の蛍光色素で染色された菌の一つ一つに光を照射し、上記と同様にして該細胞から発せられる散乱光や蛍光といった光学的情報を検出する。例えば前方散乱光強度と蛍光強度のスキャッタグラム中には、図２に示すように、総ての菌が分布する。その集団をゲーティングし、領域内の細菌を計数することにより、総菌数を得ることができる。
第２の蛍光色素等で処理した試料（第２の測定用試料）から得られた総菌数から、第１の蛍光色素等で処理した試料（第１の測定用試料）から得られた死菌数を減じることにより、生菌数を算出することができる。なお、第１の蛍光色素等で処理した試料からも生菌数は分類計数することができるが、スキャッタグラム中に該試料の生菌が集団を形成する範囲に夾雑物が混在しており、生菌数が正確に得られない可能性のある試料についても、第２の蛍光色素等で処理した試料から得られた総菌数と、第１の蛍光色素等で処理した試料から得られた死菌数を用いて算出すると、正確な生菌数が得られるので、より好ましい。
【００４３】
以下に本発明のさらに詳細な実施の形態を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００４４】
・希釈液Ｉ液（界面活性剤なし）の組成
クエン酸 １００ｍｍｏｌ
硫酸ナトリウム ９０ｍｍｏｌ
アミド硫酸 １００ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ 溶液のｐＨが２．５になる
量
精製水 １リットル
【００４５】
・希釈液ＩＩ液（界面活性剤あり）の組成
クエン酸 １００ｍｍｏｌ
硫酸ナトリウム ９０ｍｍｏｌ
アミド硫酸 １００ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ 溶液のｐＨが２．５になる
量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド １ｇ
精製水 １リットル
【００４６】
・染色液
以下の構造式の蛍光色素 ４０ｍｇ
【化１４】
エチレングリコール １リットル
【００４７】
・本発明の菌計数装置
以下、後述する実施例１〜５において本発明の方法を実施するために用いた菌数計数装置について図３を用いて説明する。この菌計数装置は、測定用試料調製部１と、検出部２と、解析部３とから構成される。測定用試料調製部１は、試料をpH約２．０〜４．５において蛍光色素、および任意に界面活性剤で処理し、測定用試料を調製するためのものであり、試料吸引ピペット６、サンプリングバルブ５、反応チャンバ１４および１５、希釈液庫９および１０、染色液庫８、吸引吐出ポンプ４、１１、１２、１３、各部を接続するチューブ及び図示しない流体制御弁などからなる。前述の希釈液Ｉ液は第１希釈液庫９に、希釈液ＩＩ液は第２希釈液庫１０にセットされる。また染色液は染色液庫８にセットされる。
【００４８】
まず、試験管７内の試料が、吸引吐出ポンプ４の動作により試料吸引ピペット６から吸引される。吸引された試料はサンプリングバルブ５によって定量され、反応チャンバ１４および１５それぞれに分配供給される。つまり、元となる同一の試料から反応チャンバ１４および１５それぞれに所定量の試料が分取される。希釈液庫９および１０はそれぞれ反応チャンバ１４および１５に接続されており、希釈液Ｉ液は第１の反応チャンバ１４に、希釈液ＩＩ液は第２の反応チャンバ１５に、それぞれ吸引吐出ポンプ１２および１３によりチューブを介して供給される。また染色液庫８は反応チャンバ１４および１５に接続されており、蛍光色素を含んだ染色液が吸引吐出ポンプ１１によりチューブを介して反応チャンバ１４および１５それぞれに所定量供給される。第１の反応チャンバ１４では、試料５０μｌと希釈液Ｉ液３４０μｌと染色液１０μｌを混合して細菌の染色処理が行われ、測定用試料が調製される。第２の反応チャンバ１５では、試料５０μｌと希釈液ＩＩ液３４０μｌと染色液１０μｌを混合して細菌の染色処理が行われ、測定用試料が調製される。なお、希釈液Ｉ液を用いて調製した測定用試料の測定だけを行う場合、第２の反応チャンバ１５には試料、希釈液ＩＩ液、染色液が供給されない。各反応チャンバで調製された測定用試料は、後述する検出部２のフローセル１６に流される。
【００４９】
検出部２は、測定用試料中の各粒子から蛍光や散乱光といった光学的情報を検出するためのものであり、図４に示したフローサイトメータによって構成される。図４に示したフローサイトメータは、測定用試料を流すためのフローセル１６、フローセル１６を流れる測定用試料に光を照射するための光源１９、測定用試料中の粒子から発せられた側方蛍光を受光するフォトマルチプライヤチューブ１８、前方散乱光を受光するフォトダイオード１７を有する。光源１９には波長６３０ｎｍの赤色半導体レーザ光源が用いられている。フォトマルチプライヤチューブ１８は、検出した側方蛍光を光電変換（光を電気信号に変換）し、側方蛍光信号として出力する。フォトダイオード１７は、検出した前方散乱光を光電変換し、前方散乱光信号として出力する。これら光検出信号は解析部３に送られる。このような構成の検出部２において、フローセル１６に測定用試料液が流されると、測定用試料中に含まれる各粒子が光源１９によるレーザ光の照射領域を横切る度に蛍光や散乱光が生じる。フォトマルチプライヤチューブ１８によって側方蛍光が、フォトダイオード１７により前方散乱光が、それぞれ受光、光電変換され、側方蛍光信号や前方散乱光信号といった光検出信号として解析部３に出力される。
【００５０】
解析部３は、検出部２で検出された粒子毎の光検出信号を解析し、二次元スキャッタグラムを作成して菌を計数するためのものであり、信号を増幅したりノイズを除去する回路や、CPU、ROM、RAMなどからなるコンピュータによって構成されている。解析部３は、検出部２で検出された粒子毎の光検出信号を解析し、二次元スキャッタグラムを作成して菌を計数する。光検出信号のパルスのピークレベルから信号強度が得られる。蛍光信号の強度は、各粒子から検出された蛍光の強度を示し、蛍光色素による染色度合いを反映するパラメータとなる。前方散乱光の強度は、各粒子から検出された前方散乱光の強度を示し、粒子の大きさを反映するパラメータとなる。これらのパラメータを組み合わせ、図１や図２に示したような二次元スキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム上に出現する粒子は、生菌、死菌、総菌それぞれの出現位置に応じて設定される領域内に出現した粒子のプロットを計数して細菌数を得る。解析部３はLCDからなる表示部を有しており、細菌の計数結果や、解析の際に作成したスキャッタグラムを表示する。
【００５１】
上記組成の希釈液I液、希釈液II液、染色液、および上記構成の菌計数装置を用い、以下の実施例１〜５の実験を行った。各実施例の概要は次の通りである。
実施例１：希釈液I液（界面活性剤なし）と染色液により、試料中に含まれる生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料Iを調製し、測定して生菌数および死菌数を得た。
実施例２：実施例１と同一試料を希釈液II液（界面活性剤あり）と染色液により処理して総菌を蛍光染色した測定用試料IIを調製し、測定して総菌数を得る。総菌数から実施例１で得られた死菌数を減算し、生菌数を算出した。
実施例３：実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより生菌数を算出する方法を用い、生菌と死菌を所定の割合で混合した試料系列を測定し、検出精度を従来技術と比較した。
実施例４：抗生物質を添加した培地に細菌を所定量添加し、培地中の生菌数を経時的に測定することで細菌に対する抗生物質の効力を試験した。生菌数は、実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより算出する方法を用いた。
実施例５：尿試料を、実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより生菌数を算出する方法を用いて測定した。
【００５２】
実施例１
試料の調製
純培養したE.coli及びS.aureusそれぞれについて、以下の表の通り生菌および死菌を一定の割合で混合した系列１〜６を試料として調製した。試料はハートインフュージョン液体培地に菌を懸濁させたものであり、各系列において総菌数（１００％）は約１０5個／ｍｌとなるようにした（死菌は、生菌をアルコール処理し、遠心分離した後に上清を除き液体培地を加えて調製した）。
【００５３】
【表１】
【００５４】
E.coliの系列４の試料を、図３に示す装置で測定した。測定用試料調製部１では、反応チャンバ１４において、以下の割合で試料、染色液および希釈液Ｉ液が４０℃で１０秒間処理され、測定用試料Ｉが調製される。
試料 ５０μｌ
希釈液Ｉ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料Ｉ 計４００μｌ
【００５５】
検出部２によって測定用試料Ｉから前方散乱光信号及び側方蛍光信号を検出し、解析部３によって前方散乱光強度及び側方蛍光強度をパラメータとする二次元スキャッタグラムを作成した。スキャッタグラム上で、生菌および死菌それぞれのプロットを含むようにゲーティング（領域の設定）を行い、ゲーティングエリア内のプロットを計数することにより、各試料中の菌数とした。測定用試料Ｉから得られたスキャッタグラムを図５に示す。縦軸は前方散乱光強度を、横軸は側方蛍光強度を表す。図５中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。死菌は染色液により十分に蛍光染色されているが、生菌は実質的に蛍光染色されていないので、各ゲーティングエリアに、生菌および死菌がそれぞれ集団となって出現している。
【００５６】
図５に示すスキャッタグラムに基づき、生菌および死菌を分類計数した結果、生菌数は５．９×１０5個／ｍｌで、死菌数は７．１×１０5個／ｍｌであった。
【００５７】
他の方法による測定
（１）寒天培養によりE.coliの系列４の試料を培養し、生菌数の計数を行った。得られた生菌数は５．４×１０5個／ｍｌであった。
（２）モレキュラープローブス社の染色キットBacLightL-7012を用いて総菌用および死菌用蛍光色素で染色したE.coliの系列４の試料を、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にてそれぞれ測定した。BacLight L-7012は総菌染色用の緑色蛍光色素と、死菌染色用の赤色蛍光色素とからなるキットである。得られた生菌数（総菌数から死菌数を減じたもの）および死菌数はそれぞれ５．６×１０5個／ｍｌおよび６．８×１０5個／ｍｌであった。
【００５８】
同一試料を用いて本発明の方法により得られた生菌数および死菌数は、他の方法により得られた生菌数および死菌数とよく一致した。したがって、本発明の方法により、簡便に生菌数および死菌数を得ることができた。
【００５９】
実施例２
実施例１で調製した試料のうち、E.coliの系列４の試料を、図３に示す装置で測定した。測定用試料調製部１では、第２の反応チャンバ１５において、以下の割合で試料、染色液および希釈液ＩＩ液が４０℃で３０秒間処理され、測定用試料ＩＩが調製される。
試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料ＩＩ 計４００μｌ
【００６０】
実施例１と同様にして、測定用試料ＩＩから得られた前方散乱光強度と側方蛍光強度に基づき、図６に示すようなスキャッタグラムを得た。図６のスキャッタグラムでは、総菌のゲーティングエリアを、図５のスキャッタグラムにおける死菌のゲーティングエリアと同じ位置、すなわちＬＤ１の領域に設定してある。このスキャッタグラムを用いて、総ての菌を計数した。総菌数は１．３×１０6個／ｍｌであった。該総菌数から、図５から得られた死菌数を引くと、生菌数５．９×１０5個／ｍｌが得られた。該生菌数は、図５のみから得られた生菌数および他の方法で得られた生菌数とよく一致していた。
【００６１】
実施例３
実施例１で調製したE.coli、S.aureusおよびE.faecalisの系列１〜６の試料につき、実施例１と同様にして染色液と希釈液Ｉ液で処理した測定用試料Ｉと、実施例２と同様にして染色液と希釈液ＩＩ液で処理した測定用試料ＩＩを調製した。それぞれの測定用試料について、実施例１および２と同様にして測定し、スキャッタグラムを作成した。得られたスキャッタグラムのうち、系列２のみ図７〜９に示す。図（ａ）は試料Ｉについて本発明の方法により得られたものであり、図中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。図（ｂ）は試料ＩＩについて本発明の方法について得られたものであり、ＬＤ１で示す領域が総菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。図（ｃ）は同一試料について染色キットBacLightL-7012（モレキュラープローブス社）を用いて染色処理を施し、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にて測定して得られたものである。縦軸は死菌から検出される赤色蛍光の強度を、横軸は総菌から検出される緑色蛍光の強度を表す。なお、E.coliについては図７に、S.aureusについては図８に、E.faecalisについては図９に示す。
各スキャッタグラムを実施例２に記載のように解析することにより、各試料中の生菌数および死菌数（生菌数は総菌数から死菌数を減じて算出した）を得た。得られた生菌数および死菌数の試料中に占める割合を示したグラフを図１０に示す。図１０（ａ）はE.coliについて、図１０（ｂ）はS.aureusについて、図１０（ｃ）はE.faecalisについて示す。なお、同一試料について寒天培養により得られた生菌数の試料中に占める割合も同一グラフ中に示した。
図１０（ａ）〜（ｃ）グラフより、寒天培地を用いて計数した各系列の生菌の割合に、本発明の方法で測定した生菌の割合はよく一致することが示された。一方、BacLightを用いて測定した生菌の割合は、S.aureusにおいて寒天培地による計数結果と異なる数が得られることも示された。
【００６２】
実施例４
本発明の方法を用いた、細菌に対する抗生物質の効力（細菌の増殖能）試験
（１）一定量の抗生物質（ABPC）を添加したカチオン添加ミューラーヒントン液体培地（ABPC８μｇ／ｍｌ）に、細菌（E.coli）を一定量（約１０5個／ｍｌ）添加した。
（２）細菌増殖の対照として、（１）と同量の細菌を添加した液体培地（抗生物質無添加）を用意した。
（３）（１）及び（２）の培地を３５℃で培養した。
（４）細菌添加直後（０時間）、及び培養を開始してから、２時間後、４時間後、２４時間後に、（１）及び（２）の培地から試料を採取し、前記図３の装置にて、それぞれの試料を以下の通り処理し、測定した。
【００６３】
・（１）の培地からの試料の処理
（１）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液Ｉ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料Ｉ 計４００μｌ
（４０℃で１０秒間反応させた。）
【００６４】
（１）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料II 計４００μｌ
（４０℃で３０秒間反応させた。）
【００６５】
・（２）の培地からの試料の処理
（２）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料III 計４００μｌ
（４０℃で３０秒間反応させた。）
【００６６】
測定用試料Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩから実施例１および２と同様にして前方散乱光強度と側方蛍光強度を検出し、細菌数を計数した。なお、測定用試料Ｉから得たスキャッタグラムからは死菌数を、測定用試料ＩＩおよび測定用試料ＩＩＩから得られたスキャッタグラムからは総菌数を得、試料ＩとＩＩからは該総菌数から死菌数を減じて生菌数を得た。
また、本発明の方法と比較するため、（１）の培地から得られた試料を寒天培養法で測定して生菌数を得た。さらに、（１）の培地から得られた試料を、
染色キットBacLightL-7012（モレキュラープローブス社）で処理し、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にて測定して、生菌数を得た。
得られた結果を図１１のグラフに示す。
図１１によると、抗生物質を添加していない測定用試料ＩＩＩは総菌数が増加している。一方、寒天培養法により得られる生菌数は、抗生物質添加後２時間以降、生菌数が著しく減少している。ここで本発明の方法による測定用試料ＩＩから得られた抗生物質添加後の総菌数はほぼ一定であり、生菌数の減少が反映されていない。一方、本発明の方法による測定用試料ＩおよびＩＩから得られた抗生物質添加後の生菌数は、寒天培養法により得られる生菌数とよく一致しており、本発明の方法により抗生物質の効力を調べることができることが示された。
【００６７】
実施例５
尿試料の測定
前記図３の菌計数装置を用いて尿試料を測定した。実施例１および２と同様に希釈液I液またはII液および染色液を用い、界面活性剤を含まない希釈液で処理された測定用試料I、および界面活性剤を含む希釈液で処理された測定用試料IIを調製して測定を行った。測定用試料Iのスキャッタグラムを図１２に示し、図１２中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。測定用試料IIのスキャッタグラムを図１３に示し、図１３中、ＬＤ１で示す領域が総菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。いずれも縦軸は前方散乱光強度を、横軸は側方蛍光強度を表わす。本実施例５は実際の尿試料を測定した結果であるため、デブリス（白血球等の細胞の残骸）や粘液糸といった夾雑物が試料には含まれている。そのため図１２のスキャッタグラムにおいては生菌の出現する領域（ＶＩＡ１）に夾雑物が出現し、実施例１の解析方法を用いて図１２から正確な生菌数を算出するのは難しい。そこでさらに図１３のスキャッタグラムも用い、実施例２の解析方法により菌数を求めた。その結果、図１２のスキャッタグラムからは死菌数３．８×１０5/mlを得た。また図１３のスキャッタグラムからは総菌数６．８×１０5/mlを得た。従って図１３から得た総菌数から、図１２から得た死菌数を引くことにより、生菌数は３．０×１０5/mlと得られた。
【００６８】
対照として、同一尿試料を染色キットBacLight L-7012（モレキュラープローブス社）で処理したものを市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製FACSCalibur）で測定した。得られたスキャッタグラムを図１４に示す。縦軸は死菌から検出される赤色蛍光の強度を、横軸は総菌から検出される緑色蛍光の強度を表わす。このスキャッタグラムでは、染色された細菌が明確な集団を形成せず、生菌及び死菌を分類計数することはできなかった。これは尿試料中に含まれる細菌以外の夾雑物が染色されてしまっているためと考えられる。
【００６９】
さらに対照として同一の尿試料を寒天培養法で測定したところ、生菌数２．７×１０5/mlを得た。このことから、尿試料のように検出対象物が精製されていない試料であっても、本発明の方法および装置では寒天培養法に近い生菌数を得られることが示された。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によれば、一つの波長で測定することにより、試料中の生菌および死菌を計数できる。さらに、界面活性剤を用いる方法により総菌数を測定することができるので、先に得られた死菌数と、該総菌数から生菌数をより精密に得ることができる。従って、抗生物質の殺菌効果や食品の殺菌処理効果を迅速に確認することが可能である。さらに、従来技術よりも迅速に菌の検出が可能であるので、臨床試料などにおいて、培養検査の必要性の有無を迅速に判定することができる。また、簡便な前処理を必要とするのみであるので、測定試料調製の全自動化が可能であり、手技、手法による測定結果への影響を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法によって分類計数される各菌の出現位置を示す概念図である。
【図２】本発明の方法によって分類計数される各菌の出現位置を示す概念図である。
【図３】本発明の菌計数装置の概念図である。
【図４】本発明の菌計数装置に用いる検出部の構成を示す模式図である。
【図５】実施例１の測定用試料Ｉで得られたスキャッタグラムを示す。
【図６】実施例２の測定用試料ＩＩで得られたスキャッタグラムを示す。
【図７】実施例３のE.coliの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図８】実施例３のS.aureusの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図９】実施例３のE.faecalisの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図１０】実施例３で得られた各方法により計数された生菌数および死菌数の試料中に占める割合のグラフを示す。
【図１１】実施例４で得られた各方法により計数された菌数のグラフを示す。
【図１２】実施例５の測定用試料Ｉから得られたスキャッタグラムを示す。
【図１３】実施例５の測定用試料ＩＩから得られたスキャッタグラムを示す。
【図１４】実施例５のBaclightで染色した試料から得られたスキャッタグラムを示す。
【符号の説明】
１ 測定用試料調製部
２ 検出部
３ 解析部
４、１１、１２、１３ 吸引吐出ポンプ
５ サンプリングバルブ
６ 試料吸引ピペット
７ 試験管
８ 染色液庫
９ 第１希釈液庫
１０ 第２希釈液庫
１４ 第１の反応チャンバ
１５ 第２の反応チャンバ
１６ フローセル
１７ フォトダイオード
１８ フォトマルチプライヤチューブ
１９ 光源
【発明の属する技術分野】
この発明は、フローサイトメトリを用いる菌計数方法およびその方法を実現するための装置に関し、より詳細には、蛍光色素を用いて死菌と生菌を分類計数する菌計数方法およびその方法を実現するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
生体中または食品中に細菌が存在するかどうかを検査するために、生体または食品由来の試料中に含まれる細菌の数を計数することが、臨床検査や食品衛生検査の分野で行われている。従来の計数方法としては、培養法、ＡＴＰ測定法および蛍光測定法がある。
培養法とは、試料を寒天培地に塗布し、１８〜２４時間培養の後、形成されたコロニー数を数えることによる細菌計数方法である。または試料を液体培地に塗布し、培養後、懸濁の有無により、細菌の増殖の有無を判断することもできる。
ＡＴＰ測定法とは、細菌の活動を示すＡＴＰを試料から抽出し、ＡＴＰと反応する発光試薬を添加し、該発光試薬が発する光の強度を検出することにより、細菌の数を計数する方法である。
蛍光測定法とは、生菌染色用の蛍光色素と死菌染色用の蛍光色素を併用し、試料を染色し、フローサイトメータや蛍光顕微鏡で生菌および死菌をそれぞれ検出および計数する方法である。
【０００３】
しかし従来の方法では、以下のような様々な問題点がある。例えば培養法は、基本的に手作業で行う方法であり、操作が煩雑である。さらに培養に長時間がかかるので、細菌の計数までに時間がかかる。また、培養可能な生菌のみしか計数できない。
ＡＴＰ測定法は、ＡＴＰ抽出処理などの前処理が煩雑である。さらに細菌を直接計数するわけではなく、発光試薬が発する発光の強度からＡＴＰ濃度、ついで細菌数へ換算するため、換算誤差が生じる可能性がある。また、ＡＴＰを産生している生菌のみしか計数できない。
蛍光測定法は、生菌および死菌それぞれを検出するために検出波長の大きく異なる色素を二種類要する。したがって、生菌および死菌を計数するためには、同一試料について色素に応じて異なる検出装置を用いて測定する必要があり、測定装置の構成が複雑かつ操作が煩雑になる。
以上のように、従来の方法では、生菌のみしか計数できず、かつ操作が煩雑であるか、生菌と死菌のそれぞれを計数できるが複雑な測定装置を必要とする、といった問題点が主に存在していた。
【０００４】
ところで、菌を含む試料中に抗生物質を添加し、その殺菌効果を調べるために菌数の変化を経時的に観察する場合には、生菌数だけではなく、死菌数も併せて得ることが望まれる。また、試料中に菌の存在が予め確認されている場合に、菌が生きていれば培養検査を行って菌数を計数する必要があるが、死んでいるときには培養検査は不要であるので、その菌の培養検査が必要か否か判定するためには、試料中の生菌数を得ることが望まれる。
【０００５】
一方、特開2001-258590号には、ｐＨ約２．０〜４．５において、細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて、さらに色素を作用させて細菌を染色する方法が開示されているが、生菌数および死菌数それぞれを得ることについては報告されていない。
したがって、生菌数および死菌数を得ることができる、簡便な方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法が提供される。
本発明によれば、試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法が提供される。
【０００８】
本発明によれば、さらに、２分割した試料の一方を、ｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、第１の測定用試料を調製する工程、
前記２分割した試料の他方を、pH ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤とで処理して総菌を染色し、第２の測定用試料を調製する工程、
調製した第１および第２の各測定用試料を任意の順序でフローサイトメータに導入して、光を照射して、各測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
第１の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、生菌数を算出する工程とからなる菌計数方法が提供される。
【０００９】
さらに本発明によれば、試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置が提供される。
さらに本発明によれば、試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置も提供される。
【００１０】
さらに本発明によれば、試料を２つに分取し供給する試料供給手段を備え、分取した一方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素と反応させ生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた第１の測定用試料を調製し、分取した他方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤と反応させて総菌を染色した第２の測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した各測定用試料に、光を照射して、試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
第１の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数し、第２の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数し、第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、試料中の生菌数を算出する解析部とからなる菌計数装置も提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明でいう試料は、細菌の有無あるいは、細菌が含まれている場合にはその数を計数するためのものであり、例えば、尿試料、血液、髄液などの臨床試料もしくは食品や水、飲料水等またはそれらの培養物のすべてに適用することができる。ここで、細菌とは、E.coli、S.aureus、E.faecalis、S.marcescens、P.aeruginosa等の人体または環境に影響を与えるもの全てが挙げられる。
【００１２】
試料を蛍光色素で処理する際にｐＨを約２．０〜４．５に維持するために、酸あるいはｐＨ約２．０〜４．５の領域の緩衝溶液を使用することができる。酸としては、クエン酸、リン酸、フタル酸、コハク酸及びフマル酸などを用いることができる。使用量は、前記ｐＨ範囲を維持できる量であればよく、１０〜５００ｍＭの範囲の濃度が好ましい。ｐＨ約２．０〜４．５の領域の緩衝溶液としては、所望のｐＨのブリトン−ロビンソン（Britton-Robinson）の緩衝液、クラーク−ルーブズ（Clark-Lubs）の緩衝液、コルトフ（Kolthoff）の緩衝液、マッキルベイン（McIlvaine）の緩衝液、ミカエリス（Michaelis）の緩衝液、セーレンセン（Sorensen）の緩衝液等を用いることができる。なお、上記ｐＨにおいては、中性やアルカリ性に比べ、細菌以外のものに対する非特異的な染色を抑えることができる。
【００１３】
第１の蛍光色素は、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせるものであり、酸性域で死菌を染色できるものが好ましい。なかでもポリメチン系色素が好ましく、例えば、以下の（１）〜（１１）の色素が使用できる。
（１）チアゾールオレンジ、
（２）
【化１】
（３）
【化２】
（４）
【化３】
（５）
【化４】
（６）
【化５】
（７）
【化６】
（８）
【化７】
（９）
【化８】
（１０）以下の一般式で表される化合物：
【化９】
【００２２】
（１１）以下の一般式で表される化合物：
【化１０】
【００２３】
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。炭素数１〜１８のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。
炭素数１〜３のアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられる。
アシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル等のような炭素数１〜４のアルカノイルや、アクリロイル、プロピオロイル、オレオイル等のような炭素数３〜１８のアルケノイルや、ベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ナフトイル等のような炭素数７〜１１のアロイル等が挙げられる。
アニオンとしては、フッ素、臭素、ヨウ素、塩素等のようなハロゲンのイオン、ＣｌＯ4 -、ＢＦ4 -等が挙げられる。
【００２４】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手可能であり、（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手可能であり、（５）〜（９）は、モレキュラープローブス社（Molecular Probes,Inc.）より入手可能である。また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に記載されている製造方法により製造することができる。
【００２５】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化１１】
第１の蛍光色素の濃度については、色素の種類によって好適な濃度は異なるが、例えば、０．１〜１００ｐｐｍ（最終濃度）の範囲が好ましい。
【００２６】
試料と第１の蛍光色素等との処理は、試料と色素と緩衝剤とを混合することで実施できる。混合する際には、必要に応じて、試料、色素および緩衝剤に溶媒を加えて、所望の濃度に希釈または溶解してもよい。また、試料、色素および緩衝剤の１以上は、それぞれ単独に溶媒を加えて希釈、溶解または懸濁された溶液を調製し、該溶液を混合することにより混合してもよい。溶媒としては、水、またはメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒を用いることができる。試料が尿である場合、一部の細菌が産生する亜硝酸の影響により蛍光色素での染色が阻害されることがある。そのような亜硝酸の影響を除去するために、試料と第1の蛍光色素等との処理において亜硝酸還元剤を添加してもよい。亜硝酸還元剤としてはアミド硫酸を用いることができる。
試料と第１の蛍光色素等との処理を行う際の温度および時間は特に限定されないが、温度は約３５〜５０℃、時間は１０〜３０秒程度が好ましい。このような処理により、第１の測定用試料が調製される。
【００２７】
調製された第１の測定用試料は、フローサイトメ−タに導入され、測定用試料中の蛍光色素で染色された菌の一つ一つに光を照射し、該細胞から発せられる散乱光や蛍光といった光学的情報を検出する。散乱光としては、側方散乱光、前方散乱光などが挙げられる。蛍光としては、側方蛍光、前方蛍光などが挙げられる。
【００２８】
得られた光学的情報を用いて、死菌と生菌とを分類計数する。生菌は死菌に比べ細部膜（細胞壁）の作用により菌内部の物質が蛍光染色されにくい。このことを利用し、本発明では死菌は十分に蛍光染色され、一方、生菌は死菌に比べ弱く蛍光染色されるか、又は実質的に蛍光染色されない条件において、第１の蛍光色素による試料の処理を行う。このようにして、生菌と死菌との間で染色度合いに差をつけ、各菌から検出される蛍光の強度に関して差異が生じるようにする。
【００２９】
生菌と死菌との間で蛍光強度に差異が生じると、図１に示すように、検出される蛍光強度の低い生菌と、検出される蛍光強度が高い死菌とが明確に分離して検出される。このような場合、蛍光強度のみに基づき、生菌と死菌とを分類計数することができる。蛍光強度に関して、生菌が発する蛍光強度よりも高く、死菌が発する蛍光強度よりも低い値に閾値を設定すれば、この閾値より低い蛍光強度を有する菌を生菌、この閾値よりも高い蛍光強度を有する菌を死菌として分類し、計数することができる。
【００３０】
また、前方散乱光強度と蛍光強度とを組み合わせて生菌と死菌とを分類計数してもよい。この方法は、蛍光強度だけでは生菌と死菌とを十分に分類することが困難な場合に有用である。図１に示すように、前方散乱光強度と蛍光強度とを各軸にとったスキャッタグラムを作成すれば、スキャッタグラム上に出現した生菌、死菌の各集団を囲むようにゲーティング（領域の設定）することで、各領域内の細菌を計数して生菌数及び死菌数を得ることができる。
【００３１】
また、本発明においては、用いる試料の種類、試料に含まれる細菌の種類等により、上述の方法に加えて、同じ試料の一部を第２の蛍光色素等で処理し、総菌を算出することにより、以下に示すようにより高精度に細菌数を分類および計数することができる。
第２の蛍光色素等で処理される試料は、予め２分割され、一方を第１の蛍光色素での上述のような処理に、他方を第２の蛍光色素等での処理に用いるのが好ましい。
【００３２】
第２の蛍光色素は、前述の第１の蛍光色素として挙げられているものから、選択することができる。使用濃度も、第１の蛍光色素と同様のものが好ましい。第１の蛍光色素と第２の蛍光色素の検出波長は、同じ検出装置を用いて検出可能なものが好ましく、特に、第２の蛍光色素と、第１の蛍光色素は同一であることが好ましい。
第２の蛍光色素で処理する際には界面活性剤を必須成分として用いる。界面活性剤としては、例えば、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤は細菌の細胞膜（細胞壁）を損傷させ、蛍光色素が細菌内へ効率よく入りこむことができるようにし、従って総ての細菌を染色することができる。なかでもカチオン界面活性剤は、細菌を効率よく染色可能であるので好ましい。さらにカチオン性界面活性剤は、試料中に存在する粘液糸、赤血球、細胞破片等を溶解および収縮することができ、それらにより細菌計数が妨害されることを防止する効果が大きいため、好ましい。
【００３３】
カチオン界面活性剤としては特に限定されないが、例えば、以下の式で示される第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【化１２】
【００３４】
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。炭素数６〜１８のアルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。ハロゲンとしては、フッ素、臭素、ヨウ素、塩素が挙げられる。
具体的には、ヘキシルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩が好適に用いられる。
【００３５】
また、カチオン界面活性剤の別の例として、ピリジニウム塩が挙げられる。
［（Ｃ5Ｈ5）Ｎ+−（ＣＨ2）ｎ−ＣＨ3］Ｙ-
（式中、ｎは７〜１７、Ｙ-はハロゲンイオンである）。
具体的には、オクチルピリジニウム塩、デシルピリジニウム塩、ドデシルトリメチルピリジニウム塩、テトラデシルトリメチルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルピリジニウム塩等が好適に使用される。
カチオン界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１０〜５００００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３０００ｍｇ／ｍｌの範囲で用いることができる。
【００３６】
アニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、Ｎ−アシルアミノ酢酸塩としてラウロイルサルコシン酸塩、ミリストイルサルコシン酸塩、オレイルサルコシン酸塩、オレイン酸塩等が好適に用いられる。
アニオン界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００３７】
両性界面活性剤は、特に限定されないが、好適には以下の酢酸ベタイン系のものが挙げられる。
【化１３】
【００３８】
炭素数１〜３のアルキル基は上記と同様のものが挙げられる。炭素数２〜３のアルケニル基としては、ビニル、アリル等が挙げられる。炭素数２〜３のアルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。
具体的には、ドデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、ヘキサデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、デシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン等が挙げられる。
両性界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００３９】
ノニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン（ｎ）アルキルエーテルでは、アルキル基の炭素数１０〜２０、ｎ：１０〜２０のものがあげられる。ポリオキシエチレン（ｎ）アルキルフェニルエーテルでは、アルキル基の炭素数８〜１０、ｎ：２〜２０のもの、例えばＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテル等が好適である。
ノニオン性界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００４０】
また、上記以外の界面活性剤で細菌の細胞膜を損傷させる性質が認められているものとして、トリトンＸ−１００（ポリエチレン−グリコール−モノ［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］エーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）クロラミド）、デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシクロラミド）、シュクロースモノカプレート（sucrose monocaprate）、シュクロースモノコール酸エステル（sucrose monocholate）、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（n-octyl-α-D-glucopyranoside）、ｎ−ヘプチル−α−Ｄ−チオグルコピラノシド（n-heptyl-α-D-thioglucopyranoside）、ｎ−オクチル−α−Ｄ−チオグルコピラノシド（n-octyl-α-D-thioglucopyranoside）、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド（n-dodecyl-α-D-maltopyranoside）、ｎ−ノニル−α−Ｄ−チオマルトピラノシド（n-nonyl-α-D-thiomaltopyranoside）等が挙げられ、本発明の界面活性剤として用いることができる。
これらの界面活性剤の濃度は種類によって異なるが、例えば最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．０〜１０ｍｇ／ｍｌで用いることができる。
【００４１】
試料と第２の蛍光色素等との処理は、試料と色素と界面活性剤と緩衝剤とを混合することで実施できる。混合する際には、必要に応じて試料と色素と界面活性剤と緩衝剤とに溶媒を加えて、所望の濃度に希釈または溶解してもよい。また、試料、色素、界面活性剤および緩衝剤の１以上は、それぞれ単独に溶媒を加えて希釈、溶解または懸濁された溶液を調製し、該溶液を混合することにより混合されてもよい。溶媒としては、水、またはメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒を用いることができる。試料が尿である場合、一部の細菌が産生する亜硝酸の影響により蛍光色素での染色が阻害されることがある。そのような亜硝酸の影響を除去するために、試料と第２の蛍光色素等との処理において亜硝酸還元剤を添加してもよい。亜硝酸還元剤としてはアミド硫酸を用いることができる。
試料と第２の蛍光色素との処理を行う際の温度および時間は特に限定されないが、温度は約３５〜５０℃、時間は３０秒〜１０分程度が好ましい。このような処理により、第２の測定用試料が調製される。
【００４２】
調製された第２の測定用試料は、フローサイトメータに導入され、測定用試料中の蛍光色素で染色された菌の一つ一つに光を照射し、上記と同様にして該細胞から発せられる散乱光や蛍光といった光学的情報を検出する。例えば前方散乱光強度と蛍光強度のスキャッタグラム中には、図２に示すように、総ての菌が分布する。その集団をゲーティングし、領域内の細菌を計数することにより、総菌数を得ることができる。
第２の蛍光色素等で処理した試料（第２の測定用試料）から得られた総菌数から、第１の蛍光色素等で処理した試料（第１の測定用試料）から得られた死菌数を減じることにより、生菌数を算出することができる。なお、第１の蛍光色素等で処理した試料からも生菌数は分類計数することができるが、スキャッタグラム中に該試料の生菌が集団を形成する範囲に夾雑物が混在しており、生菌数が正確に得られない可能性のある試料についても、第２の蛍光色素等で処理した試料から得られた総菌数と、第１の蛍光色素等で処理した試料から得られた死菌数を用いて算出すると、正確な生菌数が得られるので、より好ましい。
【００４３】
以下に本発明のさらに詳細な実施の形態を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００４４】
・希釈液Ｉ液（界面活性剤なし）の組成
クエン酸 １００ｍｍｏｌ
硫酸ナトリウム ９０ｍｍｏｌ
アミド硫酸 １００ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ 溶液のｐＨが２．５になる
量
精製水 １リットル
【００４５】
・希釈液ＩＩ液（界面活性剤あり）の組成
クエン酸 １００ｍｍｏｌ
硫酸ナトリウム ９０ｍｍｏｌ
アミド硫酸 １００ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ 溶液のｐＨが２．５になる
量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド １ｇ
精製水 １リットル
【００４６】
・染色液
以下の構造式の蛍光色素 ４０ｍｇ
【化１４】
【００４７】
・本発明の菌計数装置
以下、後述する実施例１〜５において本発明の方法を実施するために用いた菌数計数装置について図３を用いて説明する。この菌計数装置は、測定用試料調製部１と、検出部２と、解析部３とから構成される。測定用試料調製部１は、試料をpH約２．０〜４．５において蛍光色素、および任意に界面活性剤で処理し、測定用試料を調製するためのものであり、試料吸引ピペット６、サンプリングバルブ５、反応チャンバ１４および１５、希釈液庫９および１０、染色液庫８、吸引吐出ポンプ４、１１、１２、１３、各部を接続するチューブ及び図示しない流体制御弁などからなる。前述の希釈液Ｉ液は第１希釈液庫９に、希釈液ＩＩ液は第２希釈液庫１０にセットされる。また染色液は染色液庫８にセットされる。
【００４８】
まず、試験管７内の試料が、吸引吐出ポンプ４の動作により試料吸引ピペット６から吸引される。吸引された試料はサンプリングバルブ５によって定量され、反応チャンバ１４および１５それぞれに分配供給される。つまり、元となる同一の試料から反応チャンバ１４および１５それぞれに所定量の試料が分取される。希釈液庫９および１０はそれぞれ反応チャンバ１４および１５に接続されており、希釈液Ｉ液は第１の反応チャンバ１４に、希釈液ＩＩ液は第２の反応チャンバ１５に、それぞれ吸引吐出ポンプ１２および１３によりチューブを介して供給される。また染色液庫８は反応チャンバ１４および１５に接続されており、蛍光色素を含んだ染色液が吸引吐出ポンプ１１によりチューブを介して反応チャンバ１４および１５それぞれに所定量供給される。第１の反応チャンバ１４では、試料５０μｌと希釈液Ｉ液３４０μｌと染色液１０μｌを混合して細菌の染色処理が行われ、測定用試料が調製される。第２の反応チャンバ１５では、試料５０μｌと希釈液ＩＩ液３４０μｌと染色液１０μｌを混合して細菌の染色処理が行われ、測定用試料が調製される。なお、希釈液Ｉ液を用いて調製した測定用試料の測定だけを行う場合、第２の反応チャンバ１５には試料、希釈液ＩＩ液、染色液が供給されない。各反応チャンバで調製された測定用試料は、後述する検出部２のフローセル１６に流される。
【００４９】
検出部２は、測定用試料中の各粒子から蛍光や散乱光といった光学的情報を検出するためのものであり、図４に示したフローサイトメータによって構成される。図４に示したフローサイトメータは、測定用試料を流すためのフローセル１６、フローセル１６を流れる測定用試料に光を照射するための光源１９、測定用試料中の粒子から発せられた側方蛍光を受光するフォトマルチプライヤチューブ１８、前方散乱光を受光するフォトダイオード１７を有する。光源１９には波長６３０ｎｍの赤色半導体レーザ光源が用いられている。フォトマルチプライヤチューブ１８は、検出した側方蛍光を光電変換（光を電気信号に変換）し、側方蛍光信号として出力する。フォトダイオード１７は、検出した前方散乱光を光電変換し、前方散乱光信号として出力する。これら光検出信号は解析部３に送られる。このような構成の検出部２において、フローセル１６に測定用試料液が流されると、測定用試料中に含まれる各粒子が光源１９によるレーザ光の照射領域を横切る度に蛍光や散乱光が生じる。フォトマルチプライヤチューブ１８によって側方蛍光が、フォトダイオード１７により前方散乱光が、それぞれ受光、光電変換され、側方蛍光信号や前方散乱光信号といった光検出信号として解析部３に出力される。
【００５０】
解析部３は、検出部２で検出された粒子毎の光検出信号を解析し、二次元スキャッタグラムを作成して菌を計数するためのものであり、信号を増幅したりノイズを除去する回路や、CPU、ROM、RAMなどからなるコンピュータによって構成されている。解析部３は、検出部２で検出された粒子毎の光検出信号を解析し、二次元スキャッタグラムを作成して菌を計数する。光検出信号のパルスのピークレベルから信号強度が得られる。蛍光信号の強度は、各粒子から検出された蛍光の強度を示し、蛍光色素による染色度合いを反映するパラメータとなる。前方散乱光の強度は、各粒子から検出された前方散乱光の強度を示し、粒子の大きさを反映するパラメータとなる。これらのパラメータを組み合わせ、図１や図２に示したような二次元スキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム上に出現する粒子は、生菌、死菌、総菌それぞれの出現位置に応じて設定される領域内に出現した粒子のプロットを計数して細菌数を得る。解析部３はLCDからなる表示部を有しており、細菌の計数結果や、解析の際に作成したスキャッタグラムを表示する。
【００５１】
上記組成の希釈液I液、希釈液II液、染色液、および上記構成の菌計数装置を用い、以下の実施例１〜５の実験を行った。各実施例の概要は次の通りである。
実施例１：希釈液I液（界面活性剤なし）と染色液により、試料中に含まれる生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料Iを調製し、測定して生菌数および死菌数を得た。
実施例２：実施例１と同一試料を希釈液II液（界面活性剤あり）と染色液により処理して総菌を蛍光染色した測定用試料IIを調製し、測定して総菌数を得る。総菌数から実施例１で得られた死菌数を減算し、生菌数を算出した。
実施例３：実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより生菌数を算出する方法を用い、生菌と死菌を所定の割合で混合した試料系列を測定し、検出精度を従来技術と比較した。
実施例４：抗生物質を添加した培地に細菌を所定量添加し、培地中の生菌数を経時的に測定することで細菌に対する抗生物質の効力を試験した。生菌数は、実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより算出する方法を用いた。
実施例５：尿試料を、実施例２と同様に総菌数から死菌数を減算することにより生菌数を算出する方法を用いて測定した。
【００５２】
実施例１
試料の調製
純培養したE.coli及びS.aureusそれぞれについて、以下の表の通り生菌および死菌を一定の割合で混合した系列１〜６を試料として調製した。試料はハートインフュージョン液体培地に菌を懸濁させたものであり、各系列において総菌数（１００％）は約１０5個／ｍｌとなるようにした（死菌は、生菌をアルコール処理し、遠心分離した後に上清を除き液体培地を加えて調製した）。
【００５３】
【表１】
E.coliの系列４の試料を、図３に示す装置で測定した。測定用試料調製部１では、反応チャンバ１４において、以下の割合で試料、染色液および希釈液Ｉ液が４０℃で１０秒間処理され、測定用試料Ｉが調製される。
試料 ５０μｌ
希釈液Ｉ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料Ｉ 計４００μｌ
【００５５】
検出部２によって測定用試料Ｉから前方散乱光信号及び側方蛍光信号を検出し、解析部３によって前方散乱光強度及び側方蛍光強度をパラメータとする二次元スキャッタグラムを作成した。スキャッタグラム上で、生菌および死菌それぞれのプロットを含むようにゲーティング（領域の設定）を行い、ゲーティングエリア内のプロットを計数することにより、各試料中の菌数とした。測定用試料Ｉから得られたスキャッタグラムを図５に示す。縦軸は前方散乱光強度を、横軸は側方蛍光強度を表す。図５中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。死菌は染色液により十分に蛍光染色されているが、生菌は実質的に蛍光染色されていないので、各ゲーティングエリアに、生菌および死菌がそれぞれ集団となって出現している。
【００５６】
図５に示すスキャッタグラムに基づき、生菌および死菌を分類計数した結果、生菌数は５．９×１０5個／ｍｌで、死菌数は７．１×１０5個／ｍｌであった。
【００５７】
他の方法による測定
（１）寒天培養によりE.coliの系列４の試料を培養し、生菌数の計数を行った。得られた生菌数は５．４×１０5個／ｍｌであった。
（２）モレキュラープローブス社の染色キットBacLightL-7012を用いて総菌用および死菌用蛍光色素で染色したE.coliの系列４の試料を、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にてそれぞれ測定した。BacLight L-7012は総菌染色用の緑色蛍光色素と、死菌染色用の赤色蛍光色素とからなるキットである。得られた生菌数（総菌数から死菌数を減じたもの）および死菌数はそれぞれ５．６×１０5個／ｍｌおよび６．８×１０5個／ｍｌであった。
【００５８】
同一試料を用いて本発明の方法により得られた生菌数および死菌数は、他の方法により得られた生菌数および死菌数とよく一致した。したがって、本発明の方法により、簡便に生菌数および死菌数を得ることができた。
【００５９】
実施例２
実施例１で調製した試料のうち、E.coliの系列４の試料を、図３に示す装置で測定した。測定用試料調製部１では、第２の反応チャンバ１５において、以下の割合で試料、染色液および希釈液ＩＩ液が４０℃で３０秒間処理され、測定用試料ＩＩが調製される。
試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料ＩＩ 計４００μｌ
【００６０】
実施例１と同様にして、測定用試料ＩＩから得られた前方散乱光強度と側方蛍光強度に基づき、図６に示すようなスキャッタグラムを得た。図６のスキャッタグラムでは、総菌のゲーティングエリアを、図５のスキャッタグラムにおける死菌のゲーティングエリアと同じ位置、すなわちＬＤ１の領域に設定してある。このスキャッタグラムを用いて、総ての菌を計数した。総菌数は１．３×１０6個／ｍｌであった。該総菌数から、図５から得られた死菌数を引くと、生菌数５．９×１０5個／ｍｌが得られた。該生菌数は、図５のみから得られた生菌数および他の方法で得られた生菌数とよく一致していた。
【００６１】
実施例３
実施例１で調製したE.coli、S.aureusおよびE.faecalisの系列１〜６の試料につき、実施例１と同様にして染色液と希釈液Ｉ液で処理した測定用試料Ｉと、実施例２と同様にして染色液と希釈液ＩＩ液で処理した測定用試料ＩＩを調製した。それぞれの測定用試料について、実施例１および２と同様にして測定し、スキャッタグラムを作成した。得られたスキャッタグラムのうち、系列２のみ図７〜９に示す。図（ａ）は試料Ｉについて本発明の方法により得られたものであり、図中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。図（ｂ）は試料ＩＩについて本発明の方法について得られたものであり、ＬＤ１で示す領域が総菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。図（ｃ）は同一試料について染色キットBacLightL-7012（モレキュラープローブス社）を用いて染色処理を施し、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にて測定して得られたものである。縦軸は死菌から検出される赤色蛍光の強度を、横軸は総菌から検出される緑色蛍光の強度を表す。なお、E.coliについては図７に、S.aureusについては図８に、E.faecalisについては図９に示す。
各スキャッタグラムを実施例２に記載のように解析することにより、各試料中の生菌数および死菌数（生菌数は総菌数から死菌数を減じて算出した）を得た。得られた生菌数および死菌数の試料中に占める割合を示したグラフを図１０に示す。図１０（ａ）はE.coliについて、図１０（ｂ）はS.aureusについて、図１０（ｃ）はE.faecalisについて示す。なお、同一試料について寒天培養により得られた生菌数の試料中に占める割合も同一グラフ中に示した。
図１０（ａ）〜（ｃ）グラフより、寒天培地を用いて計数した各系列の生菌の割合に、本発明の方法で測定した生菌の割合はよく一致することが示された。一方、BacLightを用いて測定した生菌の割合は、S.aureusにおいて寒天培地による計数結果と異なる数が得られることも示された。
【００６２】
実施例４
本発明の方法を用いた、細菌に対する抗生物質の効力（細菌の増殖能）試験
（１）一定量の抗生物質（ABPC）を添加したカチオン添加ミューラーヒントン液体培地（ABPC８μｇ／ｍｌ）に、細菌（E.coli）を一定量（約１０5個／ｍｌ）添加した。
（２）細菌増殖の対照として、（１）と同量の細菌を添加した液体培地（抗生物質無添加）を用意した。
（３）（１）及び（２）の培地を３５℃で培養した。
（４）細菌添加直後（０時間）、及び培養を開始してから、２時間後、４時間後、２４時間後に、（１）及び（２）の培地から試料を採取し、前記図３の装置にて、それぞれの試料を以下の通り処理し、測定した。
【００６３】
・（１）の培地からの試料の処理
（１）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液Ｉ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料Ｉ 計４００μｌ
（４０℃で１０秒間反応させた。）
【００６４】
（１）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料II 計４００μｌ
（４０℃で３０秒間反応させた。）
【００６５】
・（２）の培地からの試料の処理
（２）の培地からの試料 ５０μｌ
希釈液ＩＩ液 ３４０μｌ
染色液 １０μｌ
測定用試料III 計４００μｌ
（４０℃で３０秒間反応させた。）
【００６６】
測定用試料Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩから実施例１および２と同様にして前方散乱光強度と側方蛍光強度を検出し、細菌数を計数した。なお、測定用試料Ｉから得たスキャッタグラムからは死菌数を、測定用試料ＩＩおよび測定用試料ＩＩＩから得られたスキャッタグラムからは総菌数を得、試料ＩとＩＩからは該総菌数から死菌数を減じて生菌数を得た。
また、本発明の方法と比較するため、（１）の培地から得られた試料を寒天培養法で測定して生菌数を得た。さらに、（１）の培地から得られた試料を、
染色キットBacLightL-7012（モレキュラープローブス社）で処理し、市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製ＦＡＣＳCalibur）にて測定して、生菌数を得た。
得られた結果を図１１のグラフに示す。
図１１によると、抗生物質を添加していない測定用試料ＩＩＩは総菌数が増加している。一方、寒天培養法により得られる生菌数は、抗生物質添加後２時間以降、生菌数が著しく減少している。ここで本発明の方法による測定用試料ＩＩから得られた抗生物質添加後の総菌数はほぼ一定であり、生菌数の減少が反映されていない。一方、本発明の方法による測定用試料ＩおよびＩＩから得られた抗生物質添加後の生菌数は、寒天培養法により得られる生菌数とよく一致しており、本発明の方法により抗生物質の効力を調べることができることが示された。
【００６７】
実施例５
尿試料の測定
前記図３の菌計数装置を用いて尿試料を測定した。実施例１および２と同様に希釈液I液またはII液および染色液を用い、界面活性剤を含まない希釈液で処理された測定用試料I、および界面活性剤を含む希釈液で処理された測定用試料IIを調製して測定を行った。測定用試料Iのスキャッタグラムを図１２に示し、図１２中、ＶＩＡ１で示す領域が生菌の出現する領域としてゲーティングされた領域であり、ＬＤ１で示す領域が死菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。測定用試料IIのスキャッタグラムを図１３に示し、図１３中、ＬＤ１で示す領域が総菌の出現する領域としてゲーティングされた領域である。いずれも縦軸は前方散乱光強度を、横軸は側方蛍光強度を表わす。本実施例５は実際の尿試料を測定した結果であるため、デブリス（白血球等の細胞の残骸）や粘液糸といった夾雑物が試料には含まれている。そのため図１２のスキャッタグラムにおいては生菌の出現する領域（ＶＩＡ１）に夾雑物が出現し、実施例１の解析方法を用いて図１２から正確な生菌数を算出するのは難しい。そこでさらに図１３のスキャッタグラムも用い、実施例２の解析方法により菌数を求めた。その結果、図１２のスキャッタグラムからは死菌数３．８×１０5/mlを得た。また図１３のスキャッタグラムからは総菌数６．８×１０5/mlを得た。従って図１３から得た総菌数から、図１２から得た死菌数を引くことにより、生菌数は３．０×１０5/mlと得られた。
【００６８】
対照として、同一尿試料を染色キットBacLight L-7012（モレキュラープローブス社）で処理したものを市販のフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社製FACSCalibur）で測定した。得られたスキャッタグラムを図１４に示す。縦軸は死菌から検出される赤色蛍光の強度を、横軸は総菌から検出される緑色蛍光の強度を表わす。このスキャッタグラムでは、染色された細菌が明確な集団を形成せず、生菌及び死菌を分類計数することはできなかった。これは尿試料中に含まれる細菌以外の夾雑物が染色されてしまっているためと考えられる。
【００６９】
さらに対照として同一の尿試料を寒天培養法で測定したところ、生菌数２．７×１０5/mlを得た。このことから、尿試料のように検出対象物が精製されていない試料であっても、本発明の方法および装置では寒天培養法に近い生菌数を得られることが示された。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によれば、一つの波長で測定することにより、試料中の生菌および死菌を計数できる。さらに、界面活性剤を用いる方法により総菌数を測定することができるので、先に得られた死菌数と、該総菌数から生菌数をより精密に得ることができる。従って、抗生物質の殺菌効果や食品の殺菌処理効果を迅速に確認することが可能である。さらに、従来技術よりも迅速に菌の検出が可能であるので、臨床試料などにおいて、培養検査の必要性の有無を迅速に判定することができる。また、簡便な前処理を必要とするのみであるので、測定試料調製の全自動化が可能であり、手技、手法による測定結果への影響を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法によって分類計数される各菌の出現位置を示す概念図である。
【図２】本発明の方法によって分類計数される各菌の出現位置を示す概念図である。
【図３】本発明の菌計数装置の概念図である。
【図４】本発明の菌計数装置に用いる検出部の構成を示す模式図である。
【図５】実施例１の測定用試料Ｉで得られたスキャッタグラムを示す。
【図６】実施例２の測定用試料ＩＩで得られたスキャッタグラムを示す。
【図７】実施例３のE.coliの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図８】実施例３のS.aureusの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図９】実施例３のE.faecalisの系列で得られたスキャッタグラムを示す。
【図１０】実施例３で得られた各方法により計数された生菌数および死菌数の試料中に占める割合のグラフを示す。
【図１１】実施例４で得られた各方法により計数された菌数のグラフを示す。
【図１２】実施例５の測定用試料Ｉから得られたスキャッタグラムを示す。
【図１３】実施例５の測定用試料ＩＩから得られたスキャッタグラムを示す。
【図１４】実施例５のBaclightで染色した試料から得られたスキャッタグラムを示す。
【符号の説明】
１ 測定用試料調製部
２ 検出部
３ 解析部
４、１１、１２、１３ 吸引吐出ポンプ
５ サンプリングバルブ
６ 試料吸引ピペット
７ 試験管
８ 染色液庫
９ 第１希釈液庫
１０ 第２希釈液庫
１４ 第１の反応チャンバ
１５ 第２の反応チャンバ
１６ フローセル
１７ フォトダイオード
１８ フォトマルチプライヤチューブ
１９ 光源
Claims (8)
- 試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法。 - 試料を、pH ２．５〜４．５においてポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、測定用試料を調製する工程、
調製した測定用試料をフローサイトメータに導入して、光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する工程とからなる菌計数方法。 - ２分割した試料の一方を、ｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素で生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせて染色し、第１の測定用試料を調製する工程、
前記２分割した試料の他方を、pH ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤とで処理して総菌を染色し、第２の測定用試料を調製する工程、
調製した第１および第２の各測定用試料を任意の順序でフローサイトメータに導入して、光を照射して、各測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する工程、
第１の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料中の各菌から検出した散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数する工程、
第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、生菌数を算出する工程とからなる菌計数方法。 - 第２の蛍光色素が、第１の蛍光色素と同一である請求項３に記載の菌計数方法。
- 界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である請求項３に記載の菌計数方法。
- 試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置。 - 試料をｐＨ２．５〜４．５においてポリメチン系色素と反応させ、生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
検出部により各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、生菌と死菌を分類計数する解析部とからなる菌計数装置。 - 試料を２つに分取し供給する試料供給手段を備え、分取した一方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第１のポリメチン系色素と反応させ生菌と死菌との間に蛍光強度の差異を生じさせた第１の測定用試料を調製し、分取した他方の試料をｐＨ２．５〜４．５において第２のポリメチン系色素と界面活性剤と反応させて総菌を染色した第２の測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料調製部で調製した各測定用試料に、光を照射して、試料中の各菌が発する散乱光と蛍光を検出する検出部、
第１の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第１の測定用試料に関し死菌を分類計数し、第２の測定用試料中の各菌から得られた散乱光と蛍光に基づき、第２の測定用試料に関し総菌を分類計数し、第２の測定用試料から得られた総菌数と、第１の測定用試料から得られた死菌数に基づき、試料中の生菌数を算出する解析部とからなる菌計数装置。
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