JP4037268B2 - ヒトｎｍｄａレセプタースプライスバリアント - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ヒトＮＭＤＡレセプタースプライスバリアント；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；本発明発現ベクターを有する形質転換体；本発明のポリペプチドの製造方法；本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体；本発明のポリペプチドを用いる化合物のスクリーニング方法に関する。
従来の技術
中枢神経系の主要な興奮性伝達物質の一つであるＬ−グルタミン酸に対するレセプターは、イオンチャンネル型レセプターと代謝調節型レセプターに大別される。更に、イオンチャンネル型レセプターはその薬理学的性質からＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ：ＮＭＤＡ）レセプター、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソオキサゾール−４−プロピオン酸（α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｅ−４−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＡＭＰＡ）レセプターおよびカイニン酸（Ｋａｉｎｉｃ ａｃｉｄ：ＫＡ）レセプターの３種類に分類される。
ＮＭＤＡレセプターは、細胞内へのカルシウム導入経路として機能していることが想定され、さまざまな脳現象と関連づけて数多くの研究がなされている。例えば、興奮性シナプス伝達の長期増強への寄与、虚血性神経細胞死における役割、てんかん様神経活動への関与などの研究が例示される。そして、ＮＭＤＡレセプターのアンタゴニストは、興奮性神経伝達物質の過剰放出に起因している状態を治療または予防することが期待されている。ＮＭＤＡレセプターの関与が示唆されている疾患としては、てんかん発作、ハンチントン舞踏病、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病（神経精神薬理，１０，１３９〜１５７（１９８８）．）および精神分裂病（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１２，１〜１３（１９８９）．）などが例示されている。また、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストは、鎮痛作用も有しており、従ってこのような化合物は疼痛の管理にも有用になり得る。一方、ＮＭＤＡレセプターは、前頭葉皮質ではドーパミン伝達系の抑制に関与しており、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストがドーパミン伝達系の脱抑制を誘発し、精神分裂病様症状を呈することが報告されている。このことはＮＭＤＡレセプター機能を促進する化合物あるいは抑制ＮＭＤＡレセプター機能を脱抑制させる化合物が、精神分裂病の予防および治療に有効な化合物となりうる事を示唆している。
現在までに、ヒトおよびラットのＮＭＤＡレセプターを構成するサブユニットとして、ＮＭＤＡＲ１、ＮＭＤＡＲ２Ａ、ＮＭＤＡＲ２Ｂ、ＮＭＤＡＲ２Ｃ、ＮＭＤＡＲ２Ｄ、およびＮＭＤＡＲ３Ａの６種類のタンパク質が知られている。各タンパク質は、単独では、ＮＭＤＡレセプターとしては機能せず、ＮＭＤＡＲ１サブユニットとＮＭＤＡＲ２グループのいずれかのサブユニット（ＮＭＤＡＲ２Ａ、ＮＭＤＡＲ２Ｂ、ＮＭＤＡＲ２Ｃ、およびＮＭＤＡＲ２Ｄ）が異種多量体を形成することで、ＮＭＤＡレセプターとして機能することが確認されている。各サブユニットについて詳細に検討された結果、ヒトＮＭＤＡＲ１には８種類のスプライスバリアントが存在し、ＮＭＤＡＲ２Ｄには２種類のスプライスバリアントが存在することが明らかとなった。一方、ＮＭＤＡＲ２Ａにおいては、ヒト、ラット及びマウスのホモログが知られており、ヒトにおいては、ｈＮＲ２Ａとして報告されている（特表平８−５０３３６２、特表平８−５０９６０７、特開平８−５６６７５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２２３，１５５〜１５９（１９９４）．）。しかしながら、ＮＭＤＡＲ２Ａにおいて、スプライスバリアントが存在することは報告されていない。前述のとおり、ＮＭＤＡＲ１とＮＭＤＡＲ２Ａから成る多量体がＮＭＤＡレセプターとしてどのように機能するかについては、研究されてきたが（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，２７８（２），８０８〜８１６（１９９６）．）、ＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントを考慮した上での、ＮＭＤＡレセプターの機能の研究またはＮＭＤＡレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングは行われていなかった。従って、ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを入手することにより、てんかん発作、脳性麻痺、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病および精神分裂病等の疾患の新規の発症機序の解明および新規の治療剤や鎮痛剤などの開発に繋がる。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、新規なＮＭＤＡレセプタースプライスバリアント；本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブ；本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；本発明の発現ベクターを有する形質転換体；本発明の形質転換体を用いた本発明のＮＭＤＡレセプターバリアントの製造方法；本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体；本発明のバリアントを用いた化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らは、ＮＭＤＡレセプターの生理機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねた結果、ＮＭＤＡレセプターを構成するＮＭＤＡＲ２Ａに新規なスプライスバリアントを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列から成る（１）に記載のポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列と８６％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るＮＭＤＡレセプターを構成する（１）に記載のポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列において１から１０個のアミノ酸の欠失、置換または付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有するＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチド；
（５）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドを多量体の一部として含むＮＭＤＡレセプター；
（６）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（７）配列番号１に記載の１位のＡから３８４３位のＧまでの塩基配列から成る（６）に記載のポリヌクレオチド；
（８）（６）または（７）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチドをコードする配列番号３に記載の塩基配列以外のポリヌクレオチド；
（９）（６）から（８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
（１０）（９）に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体；
（１１）（９）に記載の発現ベクターおよびＮＭＤＡＲ１サブユニットを発現する発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体；
（１２）ＮＭＤＡＲ１サブユニットが配列番号５に記載の１０９４位のＡから３７４８位のＧまでの塩基配列から成る（１１）記載の形質転換体；
（１３）宿主が哺乳類細胞株である（１０）から（１２）いずれかに記載の形質転換体；
（１４）（１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程、および生産されたポリペプチドを培養培地から回収する工程を含む、ＮＭＤＡレセプターを構成する（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法；
（１５）（１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換体の培養物に由来するＮＭＤＡレセプターを構成する（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチド調製物；
（１６）（１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換体の培養物に由来するＮＭＤＡレセプターを構成する（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドを含む膜調製物；
（１７）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（１８）下記の工程を含む、（１７）に記載の抗体を用いることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの検出または定量方法、
（ａ）該ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程；
（１９）（１８）に記載の方法を用いることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドが関連する中枢神経系疾患の検出方法；
（２０）（１７）に記載の抗体を用いる、ＮＭＤＡレセプターのイオンチャンネル活性の調節方法；
（２１）下記の工程を含む、（６）から（８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはその断片を検出用ポリヌクレオチドとして用いることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出または定量方法；
（ａ）該ポリヌクレオチドと検出用ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドと検出用ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程；
（２２）（６）から（８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはその断片を含むことを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドが関連する神経系疾患の診断キット；
（２３）下記の工程を含む、ＮＭＤＡレセプターの結合物質のスクリーニング方法；
（ａ）（１）から（４）に記載のポリペプチドまたは（５）に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかと被検物質とを接触させる工程、および
（ｂ）該ポリペプチドまたは該レセプターとの被検物質との結合を検出する工程；
（２４）（１）から（４）に記載のポリペプチドまたは（５）に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかを含むことを特徴とする、ＮＭＤＡレセプター結合物質のスクリーニング用キット；
（２５）（２３）に記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする結合物質；
（２６）下記の工程を含む、（２５）に記載の結合物質と（５）に記載のＮＭＤＡレセプターとの結合活性調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、（１）から（４）に記載のポリペプチドまたは（５）に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかと（２５）に記載の結合物質を接触させる工程、および、
（ｂ）該ポリペプチドまたは該レセプターと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で検出し、比較する工程；
（２７）（１）から（４）に記載のポリペプチドまたは（５）に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかおよび（２５）に記載の結合物質を含むことを特徴とする、（５）に記載のＮＭＤＡレセプターの結合活性調節物質のスクリーニング用キット；
（２８）（２６）に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質；
（２９）（１）から（４）に記載のポリペプチドまたは（５）に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかをコードする遺伝子を発現または変異させたトランスジェニック非ヒト動物；
（３０）（１７）に記載の抗体，（２５）に記載の結合物質または（２８）に記載の結合活性調節物質を含有してなる医薬；
に関する。
本発明のポリペプチドは、「配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」であり、「配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩」も包含する。本発明のポリペプチドは、ヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプラスバリアントである。スプライスとは、ゲノムＤＮＡの一次転写産物である不均質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）中に存在するイントロンと呼ばれる介在配列を切除し、タンパク質をコードしているエキソンと呼ばれる配列を連結して最終的なｍＲＮＡ分子を形成する反応のことである。スプライスバリアントとは、スプライスを受けた際に生じる変異型ｍＲＮＡ、或いはそれにより産生されうるポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、ヒトＮＭＤＡＲ２ＡのＣ末端側に欠損および置換が生じているスプライスバリアントである。具体的には、配列番号４に記載の１４６４個のアミノ酸残基からなるヒトＮＭＤＡＲ２Ａのうち、１２５９位以降のアミノ酸配列に変異を有するスプライスバリアントである。
「塩」としては、酸または酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、または酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質は、「配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列において１０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換または付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有し、ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチド」も包含する。１０個以下のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸を意味する。さらに、本発明のポリペプチドは、欠失、置換または付加によっても生物学的活性を有しており、ＮＭＤＡレセプターとしての機能を有するポリペプチドであり、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と少なくとも８６％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは、９０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
本明細書において「ＮＭＤＡレセプター」とは、グルタミン酸およびＮ−メチル Ｄ−アスパラギン酸と結合するレセプターである。ＮＭＤＡレセプターは、ＮＭＤＡＲ１サブユニットおよびＮＭＤＡＲ２グループ（ＮＭＤＡＲ２Ａ、ＮＭＤＡＲ２Ｂ、ＮＭＤＡＲ２Ｃ、ＮＭＤＡＲ２ＤおよびＮＭＤＡＲ２Ｄ）のいずれかのサブユニットから構成された多量体であると考えられている。従って、本発明のポリペプチドも、ＮＭＤＡレセプターを構成するサブユニットとなり得る。
「本発明のタンパク質を多量体の一部として含むＮＭＤＡレセプター」とは、本発明のポリペプチドを構成の一部として含むＮＭＤＡレセプターを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、「配列番号１の１位のＡから３８４３位のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」が例示される。また、本発明のポリヌクレオチドは、「本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチドをコードする配列番号３に記載の塩基配列以外のポリヌクレオチド」も包含される。
ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチド中から選択されるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
本明細書において「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも８６％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターにより宿主を形質転換した形質転換体、該形質転換体を用いた本発明ポリペプチドの製造法が含まれる。また、トランスジェニック動物も本発明により提供される。このような改変動物は、ヒトを除く哺乳類であれば、いずれの動物でもよく、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類が例示される。
「発現ベクター」として、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、該ＤＮＡの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。該ＤＮＡを用いて、組換えＮＭＤＡレセプターを生産するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などの多くの教科書や文献に基づいて実施することができる。具体的には、該ＤＮＡの上流に翻訳開始コドン、下流に翻訳終止コドン、さらに、転写を制御するプロモーター配列、例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーターなどの制御遺伝子を付加し、適当なベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＰＯＲＴ１などに組み込むこむことで、宿主細胞内で複製し、機能する発現ベクターを作製することができる。
「宿主」としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる、好ましくは、哺乳類動物細胞であり、さらに好ましくは、サル由来株細胞のＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）などが例示される。
「ＮＭＤＡＲ１サブユニット」とは、ＮＭＤＡＲ２グループのいずれかと異種多量体を形成することができるＮＭＤＡレセプターを構成するサブユニットタンパク質である。本発明のポリペプチドとＮＭＤＡレセプター多量体を構成できるＮＭＤＡＲ１サブユニットであればいずれのＮＭＤＡサブユニットも用いることができ、ヒトＮＭＤＡＲ１サブユニットとしてＮＲ１_０００、ＮＲ１_１００、ＮＲ１_００１、ＮＲ１_１０１、ＮＲ１_０１０、ＮＲ１_１１０、ＮＲ１_０１１、ＮＲ１_１１１の８種類のスプライスバリアントが存在することが知られていが（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１８，３０６−３１３（１９９５）．）いずれのサブユニットも用いることができるが、好ましくは、ヒトのＮＭＤＡＲ１ＮＲ１_０１１である。
「ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチドの製造方法」とは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を生成蓄積させ、該培養物より該タンパク質を採取することにより、該タンパク質を製造させる方法である。
「ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチドを含むポリペプチド調製物」とは、上記製造方法により得られるポリペプチド調製物であり、「ＮＭＤＡレセプターを構成するタンパク質含む膜調製物」とは、上記ポリペプチド調製物の中の膜画分を意味している。
このようにして得られた形質転換体または形質転換体の膜画分は、ＮＭＤＡレセプターへのアゴニスト、アンタゴニストなどの結合物質や結合活性調節物質などのスクリーニングに用いることが出来る。そのようなスクリーニング方法としては、
（ｉ）組換えＮＭＤＡレセプターと被検物質の結合性を測定することにより、ＮＭＤＡレセプター結合物質として有望な物質を選択する方法、
（ｉｉ）組換えＮＭＤＡレセプターと結合物質の結合性を変化する被検物質の結合調節活性を測定することにより、ＮＭＤＡレセプター結合調節物質として有望な物質を選択する方法、
などが考えられる。
ＮＭＤＡレセプターの結合物質としては、グルタミン酸、ＮＭＤＡ、イボテン酸、グリシンなどが知られている。ＮＭＤＡレセプターは、細胞内へのカルシウム導入経路として機能していることが想定され、まざまな脳現象と関連づけて数多くの研究がなされている。例えば、興奮性シナプス伝達の長期増強への寄与、虚血性神経細胞死における役割、てんかん様神経活動への関与などの研究が例示される。そして、ＮＭＤＡレセプターのアンタゴニストは、興奮性神経伝達物質の過剰放出に起因している状態を治療または予防することが期待されている。上記のような状態には、てんかん発作、脳性麻痺、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病などが例示される。またＮＭＤＡレセプターのアンタゴニストは、鎮痛作用も有しており、従ってこのような物質は疼痛の管理にも有用である。一方、ＮＭＤＡレセプターは、前頭葉皮質ではドーパミン伝達系の抑制に関与しており、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストがドーパミン伝達系の脱抑制を誘発し、精神分裂病様症状を呈することが報告されている。このことはＮＭＤＡレセプター機能を促進する物質あるいは抑制ＮＭＤＡレセプター機能を脱抑制させる物質が、精神分裂病の予防および治療に有効な化合物となりうる事を示唆している。
従って、スクリーニングにより得られた物質は、抗てんかん薬、脳性麻痺治療薬、虚血性脳障害予防薬、抗アルツハイマー病薬、抗パーキンソン病薬、抗ハンチントン舞踏病薬、鎮痛薬、分裂病治療薬として有用であると考えられる。
本発明の「抗体」は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のいずれをも含くむ。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを「特異的に認識する抗体」であり、ＮＭＤＡＲ２Ａサブユニットにおいて本発明のポリペプチドに特有のアミノ酸配列を認識するもので、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２５９位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を認識する抗体である。
モノクローナル抗体の作製にあたっては、まずハイブリドーマを作製する。具体的には、本発明のタンパク質を抗原としてマウスやラットを免疫し、脾臓またはリンパ節からリンパ球を取り出し、ミエローマー細胞と融合させてＫｏｈｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従ってハイブリドーマを作製する。該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を産出させることができる。
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法に従って作製することができる。つまり、精製した本発明のポリペプチドを抗原として用いて、適切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるポリペプチドを特異的に認識する抗体を作製し、精製することができる。また、ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントに対する抗体は、該スプライスバリアントに特異的に結合することにより、ＮＭＤＡレセプター機能を阻害し得る。従って、抗体は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物と同様に、グルタミン酸の過剰放出に起因するてんかん発作、脳性麻痺、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病などの治療に有用である。
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの「検出または定量方法」とは、ｍＲＮＡや遺伝子などの測定を行う分子生物学的測定方法であればいかなる方法でもよく、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などが挙げられる。
「中枢神経系疾患の検出方法」とは、該ポリヌクレオチドが中枢神経系疾患のマーカーとなり得るため、該ポリペプチドのｍＲＮＡや遺伝子の検出または定量方法であればいかなる方法でもよく、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などが挙げられる。また、該ポリペプチドのそれに対する抗体を用いた免疫測定方法による検出または定量方法であればいかなる方法でもよく、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＣＬＩＡ、ウェスタンブロット法、免疫染色法などが挙げられる。
「結合物質」とは、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むＮＭＤＡレセプターに結合する物質であればよく、例えば、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが例示される。「結合物質のスクリーニング方法」とは、当該分野において周知慣用の通常の方法を適宜適応することにより行うことができ、バイオアッセイや結合アッセイなどが例示される。「結合物質のスクリーニング用キット」とは、少なくとも本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むＮＭＤＡレセプターが含まれており、結合物質のスクリーニング方法に基づき、結合物質を生化学的手法によりスクリーニングするためのキットである。
「結合活性調節物質」とは、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むＮＭＤＡレセプターとそれに結合する結合物質との結合活性の増強あるいは減少を引き起こす物質であればよく、例えば、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが例示される。「結合活性調節物質のスクリーニング方法」とは、当該分野において周知慣用の通常の方法を適宜適応することにより行うことができ、バイオアッセイや結合アッセイなどが例示される。「結合活性調節物質のスクリーニング用キット」とは、少なくとも本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むＮＭＤＡレセプターおよびそれの結合物質が含まれており、結合物質のスクリーニング方法に基づき、結合活性調節物質を生化学的手法によりスクリーニングするためのキットである。
「トランスジェニック非ヒト動物」とは、本発明のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えば、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの胚性幹細胞において染色体上の該ポリペプチドをコードする遺伝子を公知の相同組換え手法（Ｎａｔｕｒｅ，３２６（６１１０），２９５（１９８７）．およびＣｅｌｌ，５１（３），５０３（１９８７）．など）により、任意の配列と置換した非ヒト動物を意味する。具体的には、該ポリペプチドの発現時期、発現部位または発現量などが調節された非ヒト動物、より具体的には、該ポリペプチドが過剰に発現された非ヒト動物を意味する。
「医薬」とは、少なくとも、本発明の抗体、結合物質、結合活性調節物質を含有すればよく、特定の疾患、例えば、中枢神経系疾患の予防または治療に用いうる。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、新規ＮＭＤＡレセプタースプライスバリアントに関する。
以下に本発明のポリペプチドの調製、本発明のポリペプチドの調製、発現ベクター、形質転換体、製造方法、抗体および抗体の調製工程、本発明のポリペプチドを用いたＮＭＤＡレセプターの結合物質および結合調節物質のスクリーニング方法を説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。
（１）本発明のポリヌクレオチドの取得
ヒト脳由来の正常細胞より、常法でｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載された方法、あるいはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
合成されたｃＤＮＡはクローニング用ベクターに挿入する。クローニング用ベクターとしては、ｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）ｐＴ７Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（ノバジェン社製）、ｐＮｏＴＡ／Ｔ７（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５ｐｒｉｍｅ社製）、ＰＣＲ−ＴＲＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）．）などが例示される。ｃＤＮＡを挿入したプラスミドをそれに適応した宿主に導入する。宿主としては、各プラスミドに適応したものを用いる。プラスミドで宿主を形質転換することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（インビトロジェン社製）ｃＤＮＡライブラリーシリーズ（宝酒造社製）などの市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
ｃＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクローンを選択する。
ｃＤＮＡライブラリーの各クローンからプラスミドを調製し、目的とするＤＮＡを当該分野において周知慣用な方法で選択することができる。そのような方法として、例えば、本発明のポリペプチドに対する特異的な抗体を使用し、各ｃＤＮＡから産生されるポリペプチドに対して、免疫学的スクリーニングをすることによりｃＤＮＡクローンを選択する方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ，７８，６６１３（１９８１）．）、目的の塩基配列に特異的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションを行うことによりｃＤＮＡクローンを選択する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２，７７８（１９８３）．）、目的の塩基配列に特有のプライマーを設定し、ＰＣＲを行うことによりｃＤＮＡクローンを選択する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）．）、またはそれらの方法を組合わせた方法が挙げられる。
プローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて化学合成されたＤＮＡや取得された本発明のポリヌクレオチドまたはその断片を放射性同位体、蛍光物質やジゴキシゲニンなどで標識されたもの、好ましくは、^３２Ｐで標識したものを用いることができる。プローブの標識方法としては、当該分野において周知慣用な方法またはＲｅｄｉＰｒｉｍｅｒ ＩＩ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）などの市販キットなどを用いる方法が例示される。
プライマーとしては、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などに従い、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいてセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設定し、化学合成したものをＰＣＲに用いることができる。
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａレセプターの塩基配列（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２２３，１５５−１５９（１９９４）．）に基づいてプライマーを設定し、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った。ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによる全長ｃＤＮＡの取得が困難な場合、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ；実験医学，１２（６），３５（１９８８）．）などを用いて全長ｃＤＮＡを取得することができる。増幅されたＤＮＡ断片の単離、精製は、例えば、ゲル電気泳動法などの常法により行なうことができる。
上記の方法により取得されたｃＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素などで処理した後、適当なベクターに組込み、塩基配列を解析する。
塩基配列の解析方法としては、当該分野において周知慣用な方法、例えば、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）．）やマキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）．）などの方法や市販のＤＮＡ配列解析機器、例えば、ＭｅｇａＢＡＣＥ ５００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）や３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）などを用いた方法が挙げられる。
また、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用の常法に従って本発明の遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。さらに、現在、多くの機能未知のヒト遺伝子配列がデータベースに登録されている。本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡ配列と、データベースに登録されているヒト遺伝子配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト遺伝子配列を同定し、その遺伝子の構造を解明できる可能性がある。ｃＤＮＡ配列と一致する遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡ配列と遺伝子配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造をスクリーニングすることができる。プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与する全ての遺伝子配列が挙げられる。
（２）本発明のＮＭＤＡレセプターの調製
本発明のＮＭＤＡレセプターは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）などに記載された方法を用いることによって製造することができる。そのような方法としては、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、翻訳系を用いた遺伝子工学的手法により宿主で発現させることによるペプチドの製造方法が挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１３０，６９２（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８０，５９９０（１９８３）．）。
また、本発明のポリペプチドはアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法やや市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）などにより化学合成することができる。
本発明のＮＭＤＡＲ２Ａバリアントをコードする全長ＤＮＡを含むＤＮＡ断片およびＮＭＤＡＲ１をコードする全長ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターをそれに適応した宿主に導入することにより、本発明のＮＭＤＡレセプターを産生する形質転換体を得ることができる。
宿主としては、各種ベクターに適応するものであればいずれのものも用いることができ、そのような宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、植物細胞などの真核生物が例示され、好ましくは、動物細胞を用いる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）およびＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）およびＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）およびＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）などを例示することができるが、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞を用いる。
発現ベクターは、宿主において自立複製または染色体中への組込みが可能で、新規ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアント遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられ、通常、発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列などを保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していても良い。そのような発現ベクターとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，８５４（１９８１）．）などが例示できる。
（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
新規ＮＭＤＡＲ２Ａバリアント遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規ＮＭＤＡＲ２Ａバリアント遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ、ｐＢＲ３２２（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＵＣ１９（インビトロジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）、ｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）などを例示することができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーターなどの大腸菌やファージに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたＰｔｒｐｘ２プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７、ｌｅｔプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガーノ（ＳＤ：Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば６〜１８塩基、に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などの原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＫ１２株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株およびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株などが、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株などが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株などが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株などが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株などが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株などが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、りん酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法などがあげられる。
（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーター、酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８０，１（１９８３）．）などが挙げられる。
宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種およびＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種などが挙げられる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法などが挙げられる。
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）などを用いることができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｌｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーターおよびメタロチオネインのプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）およびＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）およびＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）ＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）およびＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ（アフリカツメガエル卵母細胞）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）。
（ｉｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）などが、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡなどが挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．などに記載の方法が用いれる。
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクターおよび昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりポリペプチドを発現することができる。
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞などが挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）などが、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｃｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）などを挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）なども用いることができる。
（ｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる場合
宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどを挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーターなどを挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻などの植物細胞が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）などを挙げることができる。
（ｖｉ）製造方法
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、各種宿主に適した当該分野において周知慣用の常法により培養し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、形質転換体または培養液より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した当該分野において周知慣用の常法により飼育または栽培し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規ＮＭＤＡＲ２Ａレセプターを有するポリペプチドを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規ＮＭＤＡＲ２Ａレセプターを有するポリペプチドを製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、細胞膜などを挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規ＮＭＤＡＲ２Ａを有するポリペプチドを該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規ＮＭＤＡＲ２Ａを有するポリペプチドを製造することができる。
宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規ＮＭＤＡＲ２Ａを有するポリペプチドを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の欠失、置換もしくは付加から選ばれる少なくとも一つの変異を有するポリペプチドは、当該分野において周知慣用の部位特異的変異誘発法により作成することができる。そのような変異誘発方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．などに記載の方法に準じて調製することができる。
（ｖｉｉ）培養方法
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクトおよび塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
培養方法は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行う。培養温度、培養時間および培養液のｐＨは、各種宿主に適した範囲に設定し、通常１５〜４０℃、５時間〜７日間、ｐＨ３．０〜９．０で培養を行う。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行うことができる。また、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
形質転換体が植物細胞や組織である場合、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモンを添加した培地を用いることができる。
形質転換体が動物細胞や組織である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）、Ｂａｒｔｈ培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１０），６６４７−６６５２（１９９９）．）またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）などを添加した培地などが用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ ＣＯ_２存在下などの条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）などを用いることができる。
（ｖｉｉｉ）精製方法
本発明のポリペプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリペプチドを単離・精製することにより製造することができる。本発明のポリペプチドの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）．、Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６３，３１３（１９８７）．）により分離・精製できる。例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）、塩析法、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、またこれらを組み合わせて用いることができる。
本発明のポリペプチドが溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離する。本発明のポリペプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体をＳＴＥ溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
本発明のポリペプチドの分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などを含んでいてもよい。
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモウニウムなどによる塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによっても行うことができる。
本発明のポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞または菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧなどが例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、本発明のポリペプチドとプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドととＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。
本発明のポリペプチドは、公知の方法に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）などのペプチド合成機器をにより化学合成することができる。
（３）本発明のＮＭＤＡレセプターの機能解析
本発明のＮＭＤＡＲ２Ａをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターの機能解析は、ＮＭＤＡレセプターの機能解析で通常用いられる方法、例えば、電気生理学的解析方法および生化学的解析方法が挙げられる。
（ｉ）電気生理学的判定
（ａ）ＮＭＤＡレセプターをコードするｍＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）に導入し、レセプターを発現させる。
（ｂ）組換え卵母細胞をＭＢＳ培地（８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ、０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ_３）_２、０．９１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．５、０．０２７５％ Ｎａ−ｐｙｒｕｖａｔｅ）中で培養し、リンゲル溶液（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）中で膜を通る誘発電流を、例えば、グルタミン酸またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸などのリガンドを用い測定することにより電気生理学的解析を行う。
（ｃ）リガンド濃度と誘発電流の関連性からＮＭＤＡレセプター機能を解析する。
（ｉｉ）生化学的判定
（ａ）被検物質の存在下または非存在下で、組換えＮＭＤＡレセプターと放射性同位体で標識したリガンドと反応させる。
（ｂ）ＮＭＤＡレセプターに結合したリガンドの放射活性を測定する。
（ｃ）リガンドの結合活性からＮＭＤＡレセプター機能を解析する。
（４）本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリペプチドの全長、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチド含むポリペプチドをそのアミノ酸配列を基にして化学合成するか遺伝子工学的手法により作製したものを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）や牛チログロブリン（ＢＴＧ）などに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスターなどを用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））などに従って作製することができる。
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムなどによる塩析、カプリル酸沈殿（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーを単独または組み合わせることで行うことができる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
モノクローナル抗体は、（ｉ）で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従って作製することができる。
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを投与して、十分な抗体価を示したマウスに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）．、Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）．）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）．）などが用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ ８−アザグアニンを含む正常培地（１．５ｍＭ グルタミン、５×１０^−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ ジェンタマイシンおよび１０％ ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地））で継代し、細胞融合を行う３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０^７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で調製した抗体産生細胞と（ｂ）で調製した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３９リン酸二ナトリウム、０．２１９リン酸一カリウム、７．６５９ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０^８当たり、ポリエチレングリコール溶液（２ｇポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０^−４Ｍ ヒポキサンチン、１．５×１０^−５Ｍ チミジンおよび４×１０^−７Ｍ アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））などに記載の方法やウェスタンブロット法で、培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限定希釈法などによりハイブリドーマ細胞をクローニングする。
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を培養し、モノクローナル抗体を収穫する。
（５）本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法
本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドに対する抗体を直接または間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックスなどに結合した標識体を用いることにより該ポリペプチドまたはその部分ペプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法やＣＬＩＡ法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光標識を検出するＦＩＡ法、^１２５Ｉなどの放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法やＩＲＭＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法などが例示される。
また、そのような測定方法として、ウェスタンブロット法および免疫組織染色なども例示される。
さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドを定量することもできる。
（６）ｍＲＮＡの定量方法
本発明のポリヌクレオチドより調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法やＲＴ−ＰＣＲ法などによりｍＲＮＡを定量することで本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを測定することができる。具体的には、正常あるいは疾患モデル動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどでｍＲＮＡを定量する場合、必要によって抗癌剤などの薬剤などを投与し、一定時間経過後に、血液、脳、胃、腎臓などの臓器または組織を単離し、細胞を調製する。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ノーザンハイブリダイゼーション法やＲＴ−ＰＣＲ法などでｍＲＮＡを定量することができる。また、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体からのｍＲＮＡを定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ノーザンハイブリダイゼーション法やＲＴ−ＰＣＲ法などでｍＲＮＡを定量することができる。
（７）中枢神経系疾患検出方法
中枢神経系疾患の検出方法としては、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリペプチドを認識する抗体を直接または間接的に酵素や放射性同位体などで標識したものを用いる免疫組織染色法やウェスタンブロット法などが例示される。このような検出方法によりＮＭＤＡレセプターが関連する疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、てんかん、精神分裂病などの検出に利用することができる。
（８）中枢神経系疾患診断用キット
本発明の抗体を用いて免疫学的手法によってＮＭＤＡレセプターが関連する疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、てんかん、精神分裂病などの中枢神経系疾患の診断を行なうことができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いて検出できることからＮＭＤＡレセプターが関連する疾患に利用することが可能である。
免疫学的手法による診断の場合、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更に、キット中には標準曲線が含まれていてもよい。また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合は、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。
（９）結合物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターは、本発明のポリペプチドに対するアゴニストなどの結合物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその塩、本発明の部分ペプチドもしくはその塩または本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリペプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、例えば、天然または化学的に合成された化学物質、タンパク質、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養物などが用いられる。これらの被験物質を本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターに添加し、結合活性などを測定しながら分画し、最終的に単一の結合物質を得ることができる。
具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドもしくは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを用いるか、組換えポリペプチド発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いるか、本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターに結合して細胞刺激活性、例えば、細胞膜電位変動、リン酸化、電流応答を促進する活性または抑制する活性を測定してスクリーニングすることができる。
結合物質のスクリーニング方法に用いるポリペプチドとしては、本発明のポリペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、好ましくは、本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを動物細胞を用いて発現させたポリペプチドを用いる。そのようなＮＭＤＡレセプターの製造方法は前述の発現方法が用いられるが、好ましくは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＮＭＤＡＲ１サブユニットをコードするＤＮＡを動物細胞で同時に発現させたＮＭＤＡレセプターを用いる。
本発明の結合物質のスクリーニング方法に用いるＮＭＤＡレセプターは、精製されたものを用いてもよいが、該レセプターを発現する細胞を用いることもできる。該レセプターを発現する細胞としては、本発明のポリペプチドおよびＮＭＤＡＲ１サブユニットを同時に発現した宿主または天然に本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを言うが、該宿主としては動物細胞などが用いられる。
本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターに対する結合物質をスクリーニングするためには、適当なレセプターを含む画分と、標識した被験物質が必要である。レセプター画分としては、天然型のレセプター画分またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプター画分を用いることが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等の結合物質結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した被験物質としては、放射性同位体、例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３５Ｓなどで標識した、例えば、グルタミン酸またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸などが挙げられる。
本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターに対する結合物質のスクリーニング方法として、具体的には、該ＮＭＤＡレセプターを含有する膜画分を測定に適したスクリーニング用溶液に添加した本発明のポリペプチドを含む試料を調製する。スクリーニング用溶液としては、結合物質と該ＮＭＤＡレセプターとの結合を阻害しない溶液であれば何れのものも用いることができ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳなどが例示される。該試料０．０１ｍｌから１０ｍｌを容器などに分注し、一定量（５０００ｃｐｍから５００００ｃｐｍ）の標識被験物質を添加したものおよび非特異的結合量（ＮＳＢ）測定のために大過剰の未標識物質を添加した被験物質を添加したものを調製する。各試料を０℃から５０℃、好ましくは４℃から３７℃で約１０分間から２４時間、好ましくは約３０分間から３時間反応を行う。反応液はガラス繊維濾紙などで濾過し、適量のスクリーニング用溶液で反応容器を洗浄したものも濾過し、残渣を回収する。ガラス繊維濾紙などに残存する残渣の放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターなどで計測し、全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を差し引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを超える被験物質を結合物質として選択することができる。
本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターに対する結合物質をスクリーニングするためには該レセプターを介する細胞刺激活性、例えば、細胞膜電位変動、リン酸化などを促進または抑制する活性などを測定することもできる。具体的には、まず、本発明のポリペプチドおよびＮＭＤＡＲ１をコードするｍＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）に同時に導入し、機能的タンパク質を発現させた細胞を用いる。ＮＭＤＡレセプターを構成する、ＮＭＤＡＲ１サブユニットおよびＮＭＤＡＲ２のいずれかのサブユニット遺伝子を適当なベクター内に組み込み、組み込まれた遺伝子がベクターにより付与される隣接するＲＮＡ転写プロモーター、好ましくは、Ｔ３バクテリオファージまたはＴ７バクテリオファージプロモーターを介して容易にｃＲＮＡへと転写されるようにする。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＮＭＤＡＲ１サブユニットおよびＮＭＤＡＲ２のいずれかのサブユニット遺伝子をコードするｃＲＮＡを単離、精製した後、アフリカツメガエル卵母細胞に該ｍＲＮＡを注入し、２時間から数日間、好ましくは、１８時間から２４時間ＭＢＳ培地で培養を行う。結合物質のスクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、試験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、膜電位を−１００ｍＶから−２０ｍＶ、好ましくは−８０ｍＶから−６０ｍＶに固定し、被験物質を添加しながら膜を通る誘発電流を測定し、電気生理学的解析を行う。
（１０）結合物質のスクリーニング用キット
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターへの結合物質のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを含有する細胞または細胞から分離・精製された物などを含んでいる。本発明の結合物質スクリーニング用キットとしては次のものが例示される。
（ｉ）結合物質のスクリーニング用試薬
（ａ）スクリーニング溶液および洗浄溶液
ハンクス平衡塩（インビトロジェン社製）に０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ｂ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター
本発明のポリペプチドおよびＮＭＤＡＲ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞を１２穴プレートに５×１０^５個／穴となるよう分注し、３７℃、５％ ＣＯ_２で２４時間培養したもの。
（ｃ）標識被験物質
市販の^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３５Ｓなどで標識した被検物質溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、スクリーニング溶液にて用時１μＭに希釈して調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｄ）非標識被検物質
被験物質を標識被験物質濃度の１００〜１０００倍濃度で調製する。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現ＨＥＫ２９３細胞を、洗浄溶液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌのスクリーニング溶液を各穴に加える。
（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２Ｍ ＮａＯＨ（１％ ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
（１１）結合活性調節物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターは、本発明のポリペプチドと結合物質の結合性を変化させるアンタゴニストなどの結合活性調節物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその塩、本発明の部分ペプチドもしくはその塩または本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター、結合物質および被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリペプチドに対する結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、例えば、天然または化学的に合成された化学物質、タンパク質、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養物などが用いられる。これらの被験物質を本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質を含む試料中に添加し、結合物質の結合活性などを測定しながら分画し、最終的に単一の結合活性調節物質を得ることができる。
具体的には、本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドもしくは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを用いるか、組換えポリペプチド発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いることによって、結合物質との結合性を変化させる物質、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド物質、化学合成物質、醗酵生産物などを効率よくスクリーニングすることができる。そのような物質には、（ａ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質との結合を介する細胞刺激活性、例えば、細胞膜電位変動、リン酸化、電流応答を促進する活性または抑制する活性などを増強あるいは減少させる物質、（ｂ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質の結合力を増強あるいは減少させる物質が挙げられる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質を接触させた場合、および（ｉｉ）本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質に被験物質を接触させた場合における結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の場合において、本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターと結合物質の結合量を、例えば、細胞刺激活性などを測定することにより比較することを特徴とする。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法として、具体的には、（ａ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターなどと標識結合物質を接触させた場合、および標識結合物質ならびに被験物質を接触させた場合における該レセプターなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と該レセプターなどとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、（ｂ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターなどを含有する細胞または細胞培養液と標識結合物質を接触させた場合、および、標識結合物質ならびに被験物質を接触させた場合における、該細胞または細胞培養液における該レセプターなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と該レセプターなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法などが挙げられる。
（１２）結合活性調節物質のスクリーニング用キット
グリシンやグルタミン酸に例示される結合物質と本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプターを含有する細胞などである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）結合活性調節物質のスクリーニング用試薬
（ａ）スクリーニング溶液および洗浄溶液
ハンクス平衡塩（インビトロジェン社製）に０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ｂ）本発明のポリペプチドをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター
本発明のポリペプチドおよびＮＭＤＡＲ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞を１２穴プレートに５×１０^５個／穴に分注し、３７℃、５％ ＣＯ_２で２４時間培養したもの。
（ｃ）標識結合物質
市販の^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３５Ｓなどで標識した結合物質溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、スクリーニング溶液にて用時１μＭに希釈して調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｄ）非標識結合物質
結合物質と同じものを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存するかまたは用時調製する。
（ｅ）被験物質
被検物質をスクリーニング溶液にて１０^−３Ｍから１０^−１０Ｍの濃度となるよう用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解した溶液をスクリーニング溶液にて希釈する。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現ＨＥＫ２９３細胞を、洗浄溶液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌのスクリーニング溶液を各穴に加える。
（ｂ）被検物質を５μｌ加えた後、標識結合物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには被検物質の代わりに１ｍＭの結合物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識結合物質を０．２Ｍ ＮａＯＨ（１％ ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
（１３）非ヒトトランスジェニック動物の作製
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウスなどの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍｃｅｌｌ）において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６（６１１０），２９５（１９８７）．、Ｃｅｌｌ，５１（３），５０３（１９８７）．などに記載の公知の相同組換えの手法により、Ｎａｔｕｒｅ、３５０（６３１５），２４３（１９９１）．などに記載のような不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法などの手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基の置換、欠失、挿入などの変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
また、その発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性などを改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、該領域での目的遺伝子欠失（Ｃｅｌｌ，８７（７），１３１７（１９９６）．）やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に臓器特異的な目的遺伝子欠失（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５（１９９７）．）などが知られている。従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御または任意の欠失、置換、付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することが可能である。
このようなトランスジェニック非ヒト動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。従って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬などの評価用モデルとして非常に有用である。
（１４）医薬
本発明の抗体、結合物質、結合活性調節物質を含有する医薬は、治療薬または予防薬として該物質単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と混合し、製剤学の技術分野において良く知られている任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定され、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与が例示される。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質またはその塩とは、結合物質、結合活性調節物質および発現調節物質であり、医薬的に許容される塩も包含される。かかる塩には、周知の方法により調製される、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびアンモニウムなどとの塩が包含される。具体的には、（ａ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、細胞膜電位変動、リン酸化、などを促進する活性または抑制する活性などを増強あるいは減少させる物質、あるいは（ｂ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合活性を増強あるいは減少させる物質である。
該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよいく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。本発明のポリペプチドなどに対するアゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のポリペプチドなどに対するアンタゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を増強する物質は、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を減少させる物質は、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。該物質を本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ヴィヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含むＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどの等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのアルコール類、ポリソルベート８０やＨＣＯ−５０など非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどの安定剤、ベンジルアルコール、フェノールなどの保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。該物質またはその塩の１回の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであり、非経口的に投与、例えば、注射剤の場合は、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
実施例
以下に実施例を示す。特に断りの無い限り、遺伝子操作手段として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法を用いた。
実施例１
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントの単離
（１）ヒトＮＭＤＡＲ２ＡスプライスバリアントｃＤＮＡの単離
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａレセプターをコードする塩基配列（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２２３，１５５−１５９（１９９４）．）に基づいてＰＣＲに用いるプライマー２種類を合成し、市販のヒト全脳ｃＤＮＡライブラリーＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｗｈｏｌｅ（クロンテック社製）を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマー０１には制限酵素Ａｆｌ ＩＩが認識する配列を、プライマー０２にはＸｈｏ Ｉが認識する配列を付加した。
０１：（配列番号７）
５’−ＣＡＧＣＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧ−３’
０２：（配列番号８）
５’−ＣＡＧＣＴＣＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧ−３
ｃＤＮＡ５μｌに、各プライマーを５０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を５μｌ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）を２．５ｕｎｉｔｓ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を最終濃度で１００ｍＭとなるよう添加し、滅菌蒸留水を全量が５０μｌに成るよう添加しＰＣＲ用試料を調製した。ＰＣＲ用試料を９４℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを５回、９４℃で３０秒間、７０℃で４分間のサイクルを５回、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間のサイクルを２５回でＴｏｕｃｈ Ｄｏｗｎ Ｙｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応生成物を０．８％ アガロースゲルで電気泳動し確認した。その結果、ヒトＮＭＤＡＲ２ＡレセプターをコードするｃＤＮＡと推定される４．４ｋｂに加え、４．０ｋｂ付近に増幅されたｃＤＮＡが確認された。これらのＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから回収、精製した後、プラスミドベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｐ）（ストラタジーン社製）に挿入しサブクローンを作製し、３７３ ＤＮＡ シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を解析した。
（２）ヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントの性状解析
複数のクローンを用いた性状解析により、単離されたｃＤＮＡの内、４．４ｋｂの増幅産物はヒトＮＭＤＡＲ２Ａレセプターであったが、４．０ｋｂの増幅産物はヒトＮＭＤＡＲ２Ａレセプターが異なったスプライスを受けた転写物に相当することが明らかとなった（第１図）。これまでにＮＭＤＡＲ２Ａにおいて、スプライスバリアントが存在することは報告されておらず、この配列によりコードされるレセプターはＣ末端に新規な配列を含有することが明らかとなった。得られたヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントの塩基配列を配列番号１に示す。このスプライス変異は、Ｃ末端側細胞内領域の３７７５位と３７７６位の間において起こっていることから、そのスプライスサイトより上流は、開始コドンを含みヒトＮＭＤＡＲ２Ａと同様な配列を使用している。ヒトＮＭＤＡＲ２Ａの塩基配列を配列番号３に示す。このスプライスバリアントは、ヒトＮＭＤＡＲ２Ａの３９３０位から４２７２位までの３４３ｂｐのエキソンがスプライス変異で欠落することにより産生される。その結果、スプライスサイトにおいてアミノ酸に翻訳される読み枠がずれ新たに停止コドンが生じている。このスプライスバリアントのアミノ酸配列を配列番号２に示す。このタンパク質は１２８１個のアミノ酸残基からなり、予想される分子量は１４４４２３．９２Ｄａであった。単離されたスプライシングバリアントのアミノ酸配列の１２５８番目のＧｌｙまではヒトＮＭＤＡＲ２Ａの塩基配列と同一であるが、１２５９番目のＭｅｔから１２８１番目のＡｒｇは新規なアミノ酸配列である。このスプライスバリアントの新規アミノ酸配列の特徴は、第一にＰＳＤ９５などのタンパク質と会合するＣ末端側が欠失していることから、ＰＳＤ９５などのタンパク質との会合能を欠き、精神分裂病の発症にも関与していると考えられる。第二に、ＮＭＤＡレセプターの機能の一つである長期増強現象（ＬＴＰ）において、その発現に必須の１２３６番目のＴｙｒがＡｓｎに変異していることからＬＴＰを障害し、学習記憶障害を引き起こすことが考えられる。さらに、痴呆の発症にも関与していると考えられる。
実施例２
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアント特異的抗体の調製
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントは、スプライス変異によりＣ末端側に新たな停止コドンを含む２３個の新規なアミノ酸配列が産生されることが明らかとなったことから、その配列を特異的に認識する抗体を作製した。免疫にはＫｂｌ−ｊｗ種ウサギ（北山ラベス社製）を用い、抗原には配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち１２６７位のＡｓｎから１２８１位のＡｒｇまでの１５アミノ酸残基からなるポリペプチドを合成し（サワディーテクノロジー社製）、５０ｍＭ 酢酸にて３ｍｇ／ｍｌとなるよう調製した。ペプチド溶液８００μｌに１ｍｇ／ｍｌのＴｈｙｒｏｇｌｏｂｌｉｎｅ溶液（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｌｉｎｅ（シグマ社製）／０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．６）を１００μｌおよび０．２％ グルタルアルデヒドを１２０μｌを添加し、室温で一晩攪拌した。その後、該ペプチド溶液に３倍量のＡｄｊｙｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（ベクトンディッキンソン社製）を加え、連結注射器を用いて乳化するまで混合した。該乳化混合溶液をＫｂｌ−ｊｗ種ウサギの腹腔内に１ｍｌと皮下に３ｍｌを数箇所に分けて投与した。その後、３週、７週および１１週間目に同乳化混合溶液を調製し、ウサギの腹腔内に０．５ｍｌと皮下に１．５ｍｌを数箇所に分けて投与し、最終投与後３週間目にウサギ耳静脈より約２０ｍｌ採血した。該血液から血清を調製し、５ｍＭアジ化ナトリウムを添加後、４℃で保存した。
実施例３
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントを含むＮＭＤＡレセプターの調製（１）ヒトＮＭＤＡＲ２ＡおよびヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントの哺乳類動物細胞における発現ベクターの構築
哺乳類動物細胞でヒトＮＭＤＡＲ２ＡおよびヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを発現させるため、公知のヒトＮＭＤＡＲ２ＡｃＤＮＡ配列およびヒトＮＭＤＡＲ２ＡスプライスバリアントｃＤＮＡ配列を哺乳類動物細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（インビトロジェン社製）に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
実施例１で単離したヒトＮＭＤＡＲ２ＡおよびヒトＮＭＤＡＲ２ＡスプライスバリアントをコードするｃＤＮＡを用いた。発現ベクターに挿入するためのＤＮＡ断片はプライマー０１おとび０２を用いてＰＣＲにより増幅した。該ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫ（＋）ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社製）に挿入しサブクローンを作製した。該サブクローンおよび発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）を制限酵素Ａｆｌ ＩＩおよびＸｈｏ Ｉで消化した後、ライゲーションを行うことにより、発現プラスミドに挿入し、ヒトＮＭＤＡＲ２Ａをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入した発現ベクターをｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２ＡおよびヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２Ａ−Ｖａｒｉを構築した。
（２）ヒトＮＭＤＡＲ１ｃＤＮＡの単離および哺乳類動物細胞における発現ベクターの構築
ヒトＮＭＤＡＲ１遺伝子には３箇所のエクソンが変動することにより８種類のスプライスバリアントが存在することが明らかになっており、そのエキソンの有無によりＮＲ１_０００、ＮＲ１_１００、ＮＲ１_００１、ＮＲ１_１０１、ＮＲ１_０１０、ＮＲ１_１１０、ＮＲ１_０１１およびＮＲ１_１１１と命名されている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１８，３０６−３１３（１９９５）．）。
公知のヒトＮＭＤＡＲ１レセプター遺伝子配列（Ｇｅｎｅ，１３１（２），２９３−２９８（１９９３）．：配列番号５）を基に、ＮＲ１_００１、ＮＲ１_１０１、ＮＲ１_０１１およびＮＲ１_１１１を増幅可能なプライマー２種類を合成し、市販のヒト全脳ｃＤＮＡライブラリーＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｗｈｏｌｅ（クロンテック社製）を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマー０３には制限酵素ＢａｍＨ Ｉが認識する配列を、プライマー０４にはＥｃｏＲ Ｉが認識する配列を付加した。
０３：配列番号９
５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＧＣ−３’
０４：配列番号１０
５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’
ｃＤＮＡ５μｌに、各プライマーを５０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を５μｌ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）を２．５ｕｎｉｔｓ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を最終濃度で１００ｍＭとなるよう添加し、滅菌蒸留水を全量が５０μｌに成るよう添加しＰＣＲ用試料を調製した。ＰＣＲ用試料を９４℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを５回、９４℃で３０秒間、７０℃で４分間のサイクルを５回、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間のサイクルを２５回で、Ｔｏｕｃｈ Ｄｏｗｎ Ｙｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応生成物を０．８％ アガロースゲルで電気泳動し確認した。
ＰＣＲにより得られた約２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社製）にサブクローニングし、塩基配列の決定を行なった。
その結果、ヒトＮＲ１_００１、ＮＲ１_１０１、ＮＲ１_０１１およびＮＲ１_１１１をコードする塩基配列を有するクローンが同定された。これらのＤＮＡ断片のうちＮＲ１_０１１を哺乳類動物細胞で発現させるため、哺乳類動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（インビトロジェン社製）に挿入し、発現プラスミドを構築する。
ＮＲ１_０１１を含むサブクローンプラスミドおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を制限酵素ＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、発現ベクターにＮＲ１_０１１を含むＤＮＡ断片を挿入することにより発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１を構築した。
（３）ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＮＭＤＡＲ２ＡあるいはヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを含むＮＭＤＡレセプターの発現
ヒトＮＭＤＡＲ１とヒトＮＭＤＡＲ２ＡあるいはヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントから構成されるＮＭＤＡレセプターをＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）で発現させるため、各発現プラスミドを精製し、同時に形質転換させて組換え体を作製した。
具体的には、形質転換に用いるＨＥＫ２９３細胞を７５ｃｍ^２フラスコ当たり４×１０^６個になるようダルベッコ変法イーグル培地（ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ ＦＣＳを含む）で、３７℃、５〜８％ ＣＯ_２存在下で一晩培養を行った。形質転換には培養細胞から培地を除去し、ＰＢＳで洗浄したものを用いた。
各発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１、ｐＣＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２ＡおよびｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２Ａ−Ｖａｒｉを各サブクローンから単離し、それぞれをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のマニュアルに従って精製し、１００ｍｇ／ＬとなるようＴＥ緩衝液に溶解した。各プラスミド溶液１００μｌに３００μｌのダルベッコ変法イーグル培地および６０μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）をよく混和し、２０分間静置した。
ヒトＮＭＤＡＲ１およびヒトＮＭＤＡＲ２Ａから構成されるＮＭＤＡレセプターを発現させる場合は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１およびｐＣＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２Ａを、ヒトＮＭＤＡＲ１およびヒトＮＭＤＡＲ２Ａバリアントから構成されるＮＭＤＡレセプターを発現させる場合は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１およびｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２Ａ−Ｖａｒｉを用いてＨＥＫ２９３細胞を同時に形質転換し、組換え体を作製した。
各プラスミド溶液を７ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（１０％ ＦＣＳを含む）で希釈し、５μｇ相当量を形質転換用のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で３時間振盪させた後、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の細胞にダルベッコ変法イーグル培地（ペニシリン、ストレプトマイシン、２００μＭ Ｄ−ＡＰ５（ＴＯＣＲＩＳ社製）および１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む）７．５ｍｌを添加し、３７℃、５〜８％ ＣＯ_２存在下で、２４〜４８時間培養を行った後、培養液から細胞を回収した。
実施例４
免疫沈降法によるヒトＮＭＤＡレセプター複合体の性状解析
（１）ヒトＮＭＤＡレセプターの調製
塩野義製薬油日ラボラトリーズ内において飼育されているアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）の脳を摘出し、海馬の重量を測定し、その２０倍量の膜調製緩衝液Ａ（０．３２Ｍ しょ糖、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加え、氷上にてポリトロンを用い破砕懸濁した後、４℃、８００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清を得た。各上清を４℃、９，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、沈殿物を得た。各沈殿物を膜調製緩衝液Ａで懸濁し、再び４℃、９，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、沈殿物を得た。各沈殿物を、膜調製緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０、１０μＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁し、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｉ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を用いてタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍｌになるよう膜調製緩衝液Ｂで再調整し膜画分溶液に、等量の膜調製緩衝液Ｂ（２％ デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）を含む）を加え、３７℃で３０分間緩やかに攪拌しながら可溶化を行った。その後、４℃、１００，０００×ｇにて３０分間遠心分離し、上清を得た。各上清のタンパク質濃度をＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｉを用いて測定し、４００μｇ相当量にその１０倍量の膜調製緩衝液Ｃ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２、０．１５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇＬｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加えた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓに対する非特異的吸着を防ぐために膜調製緩衝液Ｃで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）２５μｌを添加し、４℃で１時間緩やかに遠心混和した。反応液を、４℃、１５００×ｇにて５分間遠心分離し、上清を得た。各上清に、膜調製緩衝液Ｃで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを２５μｌを添加し、ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＭＤＡＲ１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ベクトンディッキンソン−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）を１０μｌ、Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−ＮＭＤＡＲ２Ａ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）１μｌ、実施例２で調製した抗ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアント抗体１０μｌまたは正常ウサギ血清を１０μｌを添加し、４℃で一晩緩やかに回転混和して免疫沈降反応を行った。免疫沈降後の各反応液を４℃、１，５００×ｇにて５分間遠心分離し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｅａｄｓを回収した。回収されたビーズを、膜調製緩衝液Ｃにて４回洗浄し、タンパク質変性緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｗ／ｖ）グリセロール、５％ ２ＭＥＴ）を１００μｌ添加し、１００℃で１０分間加熱変性を行なった後、室温、１５，０００×ｇで１分間遠心分離を行い上清を得た。各上清２０μｌをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ＴＲＩＳ−ＡＣＥＴＡＴＥ ＧＥＬ（３−８％）（インビトロジェン社製）を用い、泳動緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ，ｐＨ８．２５、３．５ｍＭ ＳＤＳ）中、１５０Ｖの負荷電圧にて１時間電気泳動をおこなった。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを転写装置パンサーセミドライエレクトロブロッター（Ｑｗｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作を行い、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐトランスファーメンブレン（日本ミリポア社製）に転写した。転写後のナイロン膜を、ブロッキング溶液（ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）、５％（ｖ／ｖ）スキムミルクおよび１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む）に浸し、室温で１時間振盪しブロッキングを行った後、ＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった。（ａ）ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＭＤＡＲ１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ベクトンディッキンソン−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）、（ｂ）Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−ＮＭＤＡＲ２Ａ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）および（ｃ）実施例２で作製した抗ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアント抗体を抗体希釈液（ＴＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）スキムミルク、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で希釈した各種抗体溶液にブロッキング後のナイロン膜を浸し、室温で、１時間振盪を行った後、ＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった。検出抗体にはＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、該抗体を抗体希釈液で５０００倍希釈した標識抗体溶液にナイロン膜を浸し、室温で１時間振盪を行なった後、ＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった。該ナイロン膜はＥＬＣ Ｐｌｕｓ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって操作し、シグナルを検出した。陽性対照区として可溶化膜画分を陰性対照区として正常ウサギ血清免疫沈降画分を用いた。
その結果、抗ＮＭＤＡＲ１抗体および抗ＮＭＤＡＲ２Ａ抗体により沈降される複合体であるＮＭＤＡＲレセプターに、ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントタンパク質が含まれ、抗ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアント抗体により沈降される複合体にＮＭＤＡＲ１およびＮＭＤＡＲ２Ａが含まれていることが確認された。
実施例５
ＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントペプチドのサル脳内における分布
実施例２で作製したポリクローナル抗体を用い、ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントポリペプチドのサル脳内における分布をウェスタンブロット法により解析を行なった。
塩野義製薬油日ラボラトリーズ内において飼育されているアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）の脳を摘出し、側頭葉、頭頂葉、後頭葉、前頭葉、小脳、海馬、線状体、視床、橋および延髄の領域に分離後、各組織の重量を測定し、その１０倍量の膜調製緩衝液Ａ（０．３２Ｍ しょ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加え、氷上にてポリトロンを用い破砕懸濁した。この懸濁液を４℃、８００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清を得た。この上清を４℃、９０００×ｇにて１５分間遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物を膜調製緩衝液Ａで懸濁し、再び４℃、９０００×ｇにて１５分間遠心分離し、得られた沈殿物を粗シナプス膜画分とした。各組織より調製した膜画分を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）に懸濁し、タンパク質濃度をＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｉ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定し、２０μｇ相当量に、等量のタンパク質変性緩衝液（０．２５Ｍ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８；１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む）を加え、１００℃にて１０分間加熱変性を行なった。その後、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ＴＲＩＳ−ＡＣＥＴＡＴＥ ＧＥＬ（３−８％）（インビトロジェン社製）を用い、泳動緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ，ｐＨ８．２５、３．５ｍＭ ＳＤＳ）中で、１５０Ｖ、１時間電気泳動をおこなった。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを転写装置パンサーセミドライエレクトロブロッター（Ｑｗｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作を行い、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐトランスファーメンブレン（日本ミリポア社製）に転写した。転写後のナイロン膜をブロッキング溶液（ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）、５％（ｖ／ｖ）スキムミルクおよび１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む）に浸し、室温で１時間振盪反応を行った。ブロッキング後ナイロン膜をＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった後、実施例２で作製したウサギ血清を抗体希釈液（ＴＢＳ；０．５％（ｖ／ｖ）スキムミルクおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む））で１０００倍希釈した抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪反応を行なった。該ナイロン膜をＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった後、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を抗体希釈液で５０００倍希釈した標識抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪反応を行なった。該ナイロン膜をＴＢＳで、室温にて１５分間の洗浄を３回行なった後、ＥＬＣ Ｐｌｕｓ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって操作を行っい、シグナルを検出した。
また、実施例２で作製したウサギ血清の代わりにＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−ＮＭＤＡＲ２Ａ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いて、上記と同様にしてウェスタンブロット法による解析を行った。
陽性対照区として実施例４で作製したＮＭＤＡＲ２Ａのスプライスバリアントをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター発現細胞の膜画分を、陰性対照区としてＮＭＤＡＲ２Ａをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター発現細胞の膜画分を用いた。
その結果、ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントは、陽性対照区と同じ分子量（１６０Ｄｋａ）付近にシグナルが検出され、タンパク質レベルでの発現が確認された。ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントタンパク質は、海馬、後頭葉、側頭葉、前頭葉、頭頂葉の順に高発現しており、小脳、線状体、視床、橋および延髄では発現量は低かった。
また、ＮＭＤＡＲ２Ａをサブユニットとして含むＮＭＤＡレセプター発現ＨＥＫ２９３細胞においてＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントサブユニットが検出されていることから、ＮＭＤＡＲ２ＡからＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントが産生されていることが明らかとなった。
実施例６
ヒトＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを含むＮＭＤＡレセプターの電気生理学的解析
ヒトＮＭＤＡＲ１およびヒトＮＭＤＡＲ２からなるＮＭＤＡレセプター発現細胞から各サブユニットをコードするＲＮＡを調製し、アフリカツメガエルの卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）に導入し、機能的ヒトＮＭＤＡレセプタータンパク質を発現させ、２電極の電位固定法を用いて、卵母細胞膜貫通電流の電気生理的解析を行なった。
（１）ヒトＮＭＤＡレセプター遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写体の調製
実施例４において調製したｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２ＡおよびｐｃＤＮＡ３．１ＨｈＮＲ２Ａ−Ｖａｒｉから各ＮＭＤＡレセプターサブユニットをコードするｃＤＮＡのＣａｐ構造含有転写物（ｍ’Ｇ Ｃａｐ−ｃＲＮＡ）を、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）およびＲｉｂｏ ｍ^７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（プロメガ社製）を用いて、線状化したプラスミドから合成した。
ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ／ｈＮＲ１_０１１、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈ／ｈＮＲ２ＡおよびｐｃＤＮＡ３．１ＨｈＮＲ２Ａ−Ｖａｒｉを制限酵素Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉでそれぞれ消化することにより線状化し、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７およびＲｉｂｏ ｍ^７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇを用い、キット添付のマニュアルに従って操作を行いＣａｐ−ｃＲＮＡを合成した。Ｃａｐ−ｃＲＮＡはｍ^７Ｇ Ｃａｐ−ｃＲＮＡを紫外吸光度法による定量およびアガロースゲル電気泳動による精度測定を行った。
（２）電気生理学的測定
卵母細胞の調製はＤａｓｃａｌの方法（ＣＲＣ Ｃｉｒｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，３１７−３８７（１９８７）．）に従って行った。
卵母細胞一個あたり、ＮＭＤＡＲ１およびＮＭＤＡＲ２の各サブユニット由来ｍ^７Ｇ Ｃａｐ−ｃＲＮＡをそれぞれ２５ｎｇ注入し、３から５日後に２電極電位固定法を用いて卵母細胞を試験した。卵母細胞をリンゲル溶液（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）に浸し、膜電位を−６０ｍＶに固定した状態でＮＭＤＡレセプターアゴニストであるグリシンおよびグルタミン酸の１０μＭ溶液を流速８ｍｌ／分でリンゲル溶液に１５秒間添加した。
その結果、ＮＭＤＡＲ１およびＮＭＤＡＲ２ＡスプライスバリアントからなるＮＭＤＡレセプターは、ＮＭＤＡＲ１およびＮＭＤＡＲ２ＡからなるＮＭＤＡレセプターと同様にリガンド依存的なレセプターチャンネルを形成していることが明らかとなった（第２図）。
（３）ＮＭＤＡレセプターのリン酸化による増強効果
各ＮＭＤＡレセプターを発現させた卵母細胞を１μＭ ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含むリンゲル液に１０分間浸した後、膜電位を−６０ｍＶに固定した状態でＮＭＤＡレセプターアゴニストであるグリシンおよびグルタミン酸の１０μＭ溶液を流速８ｍｌ／分でリンゲル溶液に１５秒間添加した。ＰＭＡ処理による増強効果は処理前の電流応答に対する処理後の電流応答の比率を算出することで比較した。
その結果、ＮＭＤＡＲ１とＮＭＤＡＲ２Ａを発現させた卵母細胞の増強効果は４．８８±０．７２倍であったのに対し、ＮＭＤＡＲ１とＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを発現させた卵母細胞の増強効果は１．９１±０．４３倍であった。ＮＭＤＡ受容体はリン酸化により機能調節されており、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の活性化剤であるＰＭＡなどのホルボールエステル処理により活性化されていることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，３５８，３６（１９９２）．）。この事からＮＭＤＡＲ１およびＮＭＤＡＲ２ＡスプライスバリアントからなるＮＭＤＡレセプターはＰＫＣによる活性化が抑制されていることが確認された（第３図）。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規ＮＭＤＡレセプタースプライスバリアント、該バリアントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換体、該形質転換体を用いたＮＭＤＡレセプターの製造方法が提供される。
本発明のＮＭＤＡレセプターを用いることで、ＮＭＤＡレセプターが関与する疾病の解析手段を提供するとともに、本レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの探索手段をも提供するものである。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ＮＭＤＡＲ２Ａおよび新規ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントの構造を表した模試図である。
第２図は、新規ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを構成に含むＮＭＤＡレセプターのチャンネル機能を電気生理学的手法により解析したものを示している。
第３図は、新規ＮＭＤＡＲ２Ａスプライスバリアントを構成に含むＮＭＤＡレセプターおよびＮＭＤＡＲ２Ａを構成に含むＮＭＤＡレセプターについてＰｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅによるチャンネル機能の増強効果を電気的性学的手法により解析したものを示している。

Claims (22)

1. 配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
2. 配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列から成る請求の範囲１に記載のポリペプチド。
3. 配列番号２に記載の１位のＭｅｔから１２８１位のＡｒｇまでのアミノ酸配列において１から１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加から選ばれる少なくとも一つの変異を有するＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチド。
4. 請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドを多量体の一部として含むＮＭＤＡレセプター。
5. 請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
6. 配列番号１に記載の１位のＡから３８４３位のＧまでの塩基配列から成る請求の範囲５記載のポリヌクレオチド。
7. 請求の範囲５または６に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＮＭＤＡレセプターを構成するポリペプチドをコードする配列番号３に記載の塩基配列以外のポリヌクレオチド。
8. 請求の範囲５から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
9. 請求の範囲８に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
10. 請求の範囲８に記載の発現ベクターおよびＮＭＤＡＲ１サブユニットを発現する発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
11. ＮＭＤＡＲ１Ａサブユニットが配列番号５に記載の１０９４位のＡから３７４８位のＧまでの塩基配列から成る請求の範囲１０に記載の形質転換体。
12. 宿主が哺乳類細胞株である請求の範囲９から１１のいずれかに記載の形質転換体。
13. 請求の範囲９から１１のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程、および生産されたポリペプチドを培養培地から回収する工程を含む、ＮＭＤＡレセプターを構成する請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
14. 請求の範囲９から１１のいずれかに記載の形質転換体の培養物に由来するＮＭＤＡレセプターを構成する請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチド調製物。
15. 請求の範囲９から１１のいずれかに記載の形質転換体の培養物に由来するＮＭＤＡレセプターを構成する請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチド含む膜調製物。
16. 請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
17. 下記の工程を含む、請求の範囲１６に記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドの検出または定量方法；
    （ａ）該ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程、および
    （ｂ）該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程。
18. 請求の範囲１７に記載の方法を用いることを特徴とする請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドが関連するアルツハイマー病の検出方法。
19. 下記の工程を含む、請求の範囲５から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはその断片を検出用ポリヌクレオチドとして用いることを特徴とする請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出または定量方法；
    （ａ）該ポリヌクレオチドと検出用ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
    （ｂ）該ポリヌクレオチドと検出用ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程。
20. 請求の範囲１９に記載の方法であって PCR 法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から３のいずれかに記載のポリペプチドが関連するアルツハイマー病の検出方法。
21. 下記の工程を含む、ＮＭＤＡレセプターの結合物質のスクリーニング方法；
    （ａ）請求の範囲９から１２に記載の形質転換体または請求の範囲１４もしくは１５に記載の調整物のいずれかと被検物質とを接触させる工程、および
    （ｂ）該形質転換体または該調整物と被検物質との結合を検出する工程。
22. 請求の範囲１から３に記載のポリペプチドまたは請求の範囲４に記載のＮＭＤＡレセプターのいずれかをコードする遺伝子を発現または変異させたトランスジェニック非ヒト動物。

Images