JP4005745B2 - ポリエステルの製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物が生合成するポリエステル（例えばポリ-3-ヒドロキシアルカン酸）は、熱可塑性を有し、固いものから粘弾性を有するゴム状のものまで多岐にわたる生分解性プラスチックである。
【０００３】
近年、3-ヒドロキシブチレート(3HB)と3-ヒドロキシヘキサノエート(3HH)との２成分共重合ポリエステル P(3HB-co-3HH) およびその製造法について、研究、開発がなされている（例えば特開平5-93049号公報および特開平7-265065号公報）。これらの公報に記載のP(3HB-co-3HH) 共重合体の製造法は、土より単離したアエロモナス・キャビエ (Aeromonas caviae）を用いてオレイン酸やオリーブオイルから発酵生産するものである。エネルギー貯蔵を目的として発酵生産した P(3HB-co-3HH)共重合体は、3HHユニット分率の増加とともに結晶化度が低下するために、柔軟な高分子材料となり、熱安定性や成形性にも優れ、強い糸や透明でしなやかなフィルムにも加工できることが明らかにされている（Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe, Macromolecules 28, 4822-4823 (1995)）。しかも、微生物から生産されたポリエステルは生物分解が可能であることから、環境保護の観点から有用である。従って、微生物により生産、蓄積されたポリエステルは、多岐にわたり応用することができる。
【０００４】
しかしながら、微生物にポリエステルを生産させる場合は、培養装置、培地等の所定の設備が必要であり、またその稼動には石油エネルギーの消費を要するため、生産コストが高くなってしまう。
そこで、微生物の培養手段によることなく、安価で大量に上記特性を有するポリエステルを製造する手段の開発が望まれる。
【０００５】
ところで、真核生物においては、各遺伝子ごとに存在するプロモーターおよびターミネーターがその遺伝子発現を制御しており、転写されて生じるmRNAの3'末端にはポリA配列が付加されることが知られている。これらの遺伝子発現は核内で行われているため、植物の形質転換法を用いて新規の形質を有する植物を作る試みは、主に核染色体に遺伝子を導入する方法によって行われている。
【０００６】
しかし、真核生物の遺伝子はモノシストロン性であるため、一つの遺伝子に対しては一つのプロモーターによって制御されている。従って、複数の遺伝子が1個のプロモーターで制御されるポリシストロン性の発現機構を有する原核細胞の場合は、その遺伝子を真核生物の核染色体に導入するためには、それぞれの導入遺伝子にプロモーターをつける必要があり、操作が煩雑であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ポリエステルの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ポリエステル合成酵素遺伝子を含む複数の遺伝子を有するオペロンを植物のプラスチドに組み込むことにより、植物などの真核生物であってもポリシストロン性の遺伝子発現が可能な植物の形質転換を行い、該形質転換体を培養又は栽培したのち、培養物又は栽培物からポリエステルを採取することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、プロモーター、ポリエステル合成酵素遺伝子、及び該ポリエステル合成酵素遺伝子とは異なる１〜100種類の遺伝子を含むオペロンが連結された組換えベクターをプラスチド染色体に組み込んで植物を形質転換し、得られる形質転換植物を培養又は栽培した後、該培養物又は栽培物からポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法である。さらに、本発明は、プロモーター、ポリエステル合成酵素遺伝子、及び該ポリエステル合成酵素遺伝子とは異なる１〜100種類の遺伝子を含むオペロンがプラスチド染色体に組み込まれた形質転換植物である。
【００１０】
ポリエステル合成酵素遺伝子としては、ポリ-3-ヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子が挙げられ、ポリエステル合成酵素遺伝子とは異なる遺伝子としては、β-ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子が挙げられる。また、植物としては、ナス科（例えばタバコ）、イネ科、アオイ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、ツバキ科、マメ科、ヤシ科、アオギリ科及びアカネ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものが挙げられる。
さらに、ポリエステルとしては、次式Ｉ：
【００１１】
【化２】

【００１２】
（Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
で示される3-ヒドロキシアルカン酸の共重合体が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ポリエステル合成酵素遺伝子を含む複数（2〜100種類）の遺伝子及びプロモーターを有するオペロンをベクターに組み込み、得られた組換えベクターを植物のプラスチド染色体に導入して植物を形質転換し、さらに得られる形質転換体を培養又は栽培し、培養物又は栽培物からポリエステルを採取することを特徴とするものである。
【００１４】
プラスチドとは、植物細胞に特有のDNA含有細胞小器官(オルガネラ)の一種である。植物では、原色素体が、白色体、黄色体、葉緑体、有色体、アミロプラスト、エライオプラストなど、多様な機能（光合成、アミノ酸合成、脂肪酸合成、窒素固定など）を担う構造体になるが、これらの構造体をプラスチドという。
【００１５】
真核生物の細胞において、葉緑体をはじめとするプラスチドは、植物細胞の中の主要かつ独自のオルガネラであり、光合成反応を司るものである。プラスチド、及びエネルギー代謝を行うミトコンドリアは、核に存在する染色体とは別に独自の染色体を有しており、独自に複製を行うことができる。
【００１６】
プラスチド中で働くσ因子は、核染色体にコードされており、発現後にプラスチドに移動する転写因子の一つである。このσ因子はバクテリア型のものが存在することが知られている。
【００１７】
また、プラスチドの遺伝子がバクテリアに類似した制御を受けていることは、遺伝子の転写機構の研究により明らかにされている。すなわち、プラスチド染色体遺伝子の構造及び発現様式は原核生物の遺伝子と同様であり、複数の遺伝子が直列につながってオペロンを形成している。そして、プラスチド中のオペロン上の遺伝子は一つのプロモーターによって制御されており、これらの遺伝子がすべて同時に転写されて1本のmRNAを生じる。
【００１８】
このように、プラスチド染色体遺伝子はバクテリアと同様のメカニズムで制御されている。従って、本発明においては、微生物の持つ物質生産、難分解物質の分解等の有用な代謝系を植物に導入する際に、従来のように各遺伝子を真核細胞で発現するように設計するのではなく、遺伝子群を原核細胞型の構造のままでプラスチドに導入して形質転換体を作製した。その結果、該形質転換体からポリエステルを採取することに成功した。
【００１９】
本発明において用いられる遺伝子は単一のものではなく、ポリエステル合成酵素遺伝子のほか、該遺伝子とは異なる1個又は複数個の遺伝子が連結されてオペロンを形成するものである。
【００２０】
ポリエステル合成酵素遺伝子としては、ラルストニア・ユートロファ (Ralstonia eutropha)、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）61-3などから単離されたポリエステル合成酵素遺伝子（phbC、phaC_AC、phbC_PS、phaC1_PS、phaC2_PS）が挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子を単独で用いてもよく、複数個を連結して用いてもよい。
【００２１】
ポリエステル合成酵素遺伝子のほかに連結する遺伝子の種類の数は目的に応じて適宜定めることができるが、1〜100種類が好ましく、1〜50種類がより好ましく、1〜10種類がさらに好ましく、1〜3種類が最も好ましい。また、遺伝子の種類には特に限定されるものではなく、公知遺伝子及び新たにクローニングされた遺伝子のいずれを用いてもよい。例えば、β-ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子が挙げられ、以下に記載のものも挙げられる。但し、これらの遺伝子に限定されるものではない。
【００２２】
(1)反応経路に関与する遺伝子（動物、植物、微生物等由来）
解糖系に働く酵素をコードする遺伝子
グリオキシル酸回路に働く酵素をコードする遺伝子
クエン酸回路に働く酵素をコードする遺伝子
尿素回路に働く酵素をコードする遺伝子
還元的ペントースリン酸回路に働く酵素をコードする遺伝子
コレステロールの生合成経路で働く酵素をコードする遺伝子
ポリケチド鎖合成に働く酵素をコードする遺伝子
脂肪酸β酸化経路に働く酵素をコードする遺伝子
炭素数10、15，20のテルペノイド骨格を有する化合物の生合成に関わる遺伝子
【００２３】
(2) 特定の生物由来のもの
Streptomyces wedmorensisのホスホマイシン生合成に関わる遺伝子（群）
Straptomyces hygroscopicusのビアラホス生合成に関わる遺伝子（群）
Streptomyces erythreusのエリスロマイシン生合成に関わる遺伝子（群）
Penicillium sp等のペニシリン生合成にに関わる遺伝子（群）
Arabidopsis thaliana等のジベレリンおよびその類縁体の生合成に関わる遺伝子（群）
植物のアブシジン酸生合成に関わる遺伝子（群）
【００２４】
(3) 反応の基質による分類
炭素数が2-30である化合物を基質とするデヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、デアミナーゼ、エピメラーゼ、ムターゼ等をコードする遺伝子
分子量3000-300000のタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼ
分子量3000-300000のタンパク質を基質とするプロテアーゼ
【００２５】
(4) その他
動物の血清アルブミン遺伝子
乳中のラクトフェリン、ラクトグロブリン、カゼイン遺伝子
Ｇタンパク質α、β、γサブユニットの遺伝子
サブスタンスＰレセプター等、膜７回貫通型のレセプター遺伝子
大腸菌のσ因子遺伝子、
タバコモザイクウイルスのコートタンパクをコードする遺伝子
タバコのＮ遺伝子
トマトのcf4, cf9遺伝子およびそのホモログ
動物、植物のMAPK、MAPKK、MAPKKKをコードする遺伝子
動物、植物のP450スーパーファミリーに属する酵素をコードする遺伝子
アラビドプシスのcpr1 - cpr20
植物のカタラーゼ遺伝子catA, catB, catC
微生物の鞭毛を構成するタンパク質をコードする遺伝子
【００２６】
なお、phbA遺伝子（配列番号3）、phbB遺伝子（配列番号4）、phbC遺伝子（配列番号2）は、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)の菌体（ATCC 17699）から染色体DNAの調製を行い、その後ライブラリーの作製、組換えベクターの作製、宿主微生物への組換えベクターの導入、コロニーハイブリダイゼーション、塩基配列の決定を行うことによって調製することができる。また、phaC遺伝子はアエロモナス・キャビエFA440株から得ることができ、得られたphaC遺伝子は、アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)に導入され(名称：Alcaligens eutrophus AC32)、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成８年８月12日付でFERM P-15786として寄託されている。
さらに、上記遺伝子は、化学合成により、あるいは各遺伝子を鋳型としたPCRにより調製することもできる。
【００２７】
ある酵素を触媒として特定の物質を植物に生産させようとする場合は、その酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の基質をコードする遺伝子を連結することができる。例えばポリエステル合成酵素遺伝子としてポリ-3-ヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子を用い、これにβ-ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子を連結すると、アセチルCoAはβ-ケトチオラーゼの触媒によりアセトアセチルCoAとなり、アセトアセチルCoAはアセトアセチルCoAリダクターゼの触媒により3-ヒドロキシブチリルCoAとなる。そして、ポリ-3-ヒドロキシブタン酸合成酵素によりポリ-3-ヒドロキシブタン酸を得ることができる（図１）。
【００２８】
本発明において、プロモーターは、プラスチド由来のもの、原核生物（バクテリア）のオペロン由来のもの又はファージ等由来のものであって、プラスチド染色体上でプロモーターとして機能することが可能なものを使用することができる。例えば、プラスチド由来のプロモーターとしてはプラスチド16s rRNAプロモーター、psbD light-responsive プロモーター、アラビドプシスtRNA-Cysプロモーター、ホウレンソウpsaAプロモーター又はトウモロコシtrnCプロモーター等が挙げられ、バクテリア又はファージ由来のプロモーターとしてはlac プロモーター、avrD プロモーター(Pseudomonas syringae pv. Tomato)、ORF1-ntrB-ntrCオペロンプロモーター（Rhizobium leguminosarum）、ファージT7 gene 10 プロモーターが挙げられる。プロモーターの数は1〜２個が好ましい。
【００２９】
複数の目的遺伝子同士を連結するには、リガーゼを用いて直接連結する方法のほか、４〜100ヌクレオチドの長さを有する適当なリンカーを化学合成し、該リンカーを橋渡しとしてリガーゼにより連結する方法を採用することができる。あるいは、各遺伝子のそれぞれを別個のベクターにつないだ後、制限酵素処理して当該遺伝子を含む断片を作製し、リガーゼを用いてそれぞれの断片同士を連結する方法を採用することもできる。この場合、目的遺伝子を鋳型とし、その遺伝子に特異的なプライマー（15〜50ヌクレオチド長）を調製してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により断片を増幅しておくことが好ましい。増幅のためのDNAポリメラーゼとしてはLA Taq DNAポリメラーゼ(Takara)、AmpliTaq (Perkin Elmer)、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene社）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。増幅は、80℃〜100℃で5秒〜3分、好ましくは94℃で5秒〜2分の変性工程、40℃〜72℃で5秒〜5分、好ましくは50℃で5秒〜2分のアニーリング工程、及び65℃〜75℃で30秒〜10分、好ましくは72℃で30秒〜3分の伸長工程を１サイクルとしてこれを10〜40サイクル行う。但し、鋳型DNA及びプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に80℃〜100℃（好ましくは94〜95℃）で１〜3分の変性工程を加えてもよく、また、増幅されたDNAを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に72℃で２〜10分の伸長工程を加えてもよい。
【００３０】
上記の通り得られた遺伝子群の上流にプロモーターを連結し、1個又は数個のプロモーターで複数の遺伝子が制御されるオペロンを形成させる。連結の方法は特に限定されるものではなく、制限酵素部位をリガーゼで処理するなど、あらゆる手法を用いることができる。
【００３１】
上記の通り形成したオペロンを、植物のプラスチドに導入するためのベクターに連結する。本発明において用いられるベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター等が挙げられるが、プラスミドベクターが好ましい。プラスミドベクターとしては、pUC18(宝酒造社製）、pUC119(宝酒造社製）などのpUC系プラスミド、pBI121、pBI101などのpBI系プラスミド、pBluescript SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega 社製)、pGEM-3、pGEM-4、pCR2.1(Invitrogen社製)等が挙げられ、コスミドベクターとしては、pJB8、c2RB、pcos1EMBL等が挙げられ、ファージベクター（例えばλファージ）としては、Charon4A、Charon21A、Charon32、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
ここで、発現の目的となる複数の遺伝子は、いずれもその遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、上記オペロンには、プロモーター及び目的遺伝子のほか、ターミネーター、オペレーター、アテニュエーター、薬物耐性遺伝子等を組み込むことができる。この場合、ターミネーターとしてはプラスチドpsbA遺伝子の3'調節領域が挙げられ、オペレーターとしては大腸菌のラクトースオペレーター等が挙げられ、アテニュエーターとしては大腸菌のトリプトファン合成系オペロンのアテニュエーター等が挙げられ、薬物耐性遺伝子としてはスペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３３】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物が挙げられる。これらの科に属する植物として例えば以下に記載するものが挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００３４】
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum)、ジャガイモ（Solanum tuberosum)
イネ科：トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativa)
アオイ科：ワタ(Gossypium hirsutum) 、オクラ(Abelmoscus esculentum)
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ナタネ(Brassica napu s)
キク科：ヒマワリ(Helianthus annuus) 、キク(Crysanthimum indicum)
ゴマ科：ゴマ(Sesame indica) 、ヒマ(Ricinus communis)
モクセイ科：オリーブ(Olea europaea) 、
フトモモ科：ユーカリ(Eucalyptus globulus)、グアバ(Psidium guava)
バラ科：バラ(Rosa sinnis)
ツバキ科：ツバキ(Camellia japonica)
マメ科：レンゲソウ(Astragalus sinicus)、ダイズ(Glycine max)
ヤシ科：ココナツ(Cocos nucifera)
アオギリ科：ココア(Theobroma cacao)
アカネ科：コーヒーの木(Coffea arabica)
【００３５】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばパーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物のプラスチド中に導入することができる。例えばパーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBiolistic PSD-1000/He (BIO-RAD社)等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は100〜2000psi程度の圧力、0.5〜20cm程度の距離で行う。
【００３６】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
形質転換後のプラスチド中では、導入された遺伝子は、相同組み換えによってプラスチド染色体遺伝子に挿入される。
【００３７】
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３８】
一方、プラスチドに組み込まれたポリエステル合成酵素遺伝子が発現しているか否かは、該遺伝子の発現により得られるポリエステルを適当な手法により検出すればよい。例えば、マススペクトル分析、ガスクロマトグラフィー等により、ポリエステルが合成されているか否かを確認することができる。
【００３９】
本発明の方法は、プラスチド染色体中の遺伝子を用いた相同組み換えを利用して外来遺伝子を導入しているため、プラスチド染色体中の遺伝子をベクターに連結することにより、形質転換のための遺伝子の挿入位置を正確に制御することが可能である。例えば、プラスチドにおいては、rbcLと呼ばれる遺伝子と、ORF512と呼ばれる遺伝子とが隣接して染色体に存在する。そこで、これら2つの遺伝子をベクターに連結し、rbcLとORF512との間に本発明に用いるオペロンを挿入すると、形質転換後の相同組換えにより、当該オペロンはプラスチド染色体中、本来rbcL及びORF512が存在する位置に組み込まれることとなる。また、rbcL又はORF512のいずれかの遺伝子の配列の途中にオペロンを挿入すると、rbcL又はORF512遺伝子はオペロンによって分断されるため、当該遺伝子の機能を失わせることができる。このようにして、プラスチド中に存在する遺伝子の選択の仕方により、オペロンを組み込む位置を任意に設定することができ、さらに、本来のプラスチドの機能を損なわないよう、又は損なうようにオペロンを組み込むことが可能である。また、微生物由来のオペロンでなくても、動物、植物の核染色体由来の遺伝子を複数導入する際に、これまでのように各々の遺伝子ごとにプロモーターを連結することなく簡易に発現させることが可能である。
【００４０】
さらに、プラスチドは母性遺伝するため、花粉などを経由して導入遺伝子が環境中に拡散することを防ぐことができるという利点がある。すなわち、野生株の花粉により受精させた場合には種子中に外来遺伝子は遺伝するが、逆に形質転換体の花粉で野生株を受粉させた場合には外来遺伝子は種子には遺伝しない。これは、今後様々な形質転換植物を作出していく上で環境への影響の軽減、またハイブリッド後代の作出にとって非常に有利である。
【００４１】
前記のようにして得られた形質転換体を培養又は栽培すれば、ポリエステルを生産することができる。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS基本培地(Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473)、LS基本培地(Linsmaier, E. M. & Skoog, F. (1965) Physiol. Plant. 18: 100)、プロトプラスト培養培地(LS培地を改変したもの)等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
【００４２】
上記培地に、細胞、組織又は器官を0.5〜40g新鮮重/l接種し、必要によりNAA、2,4-D、BA、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地の pH は5.6〜5.8に調節し、培養は通常25〜30℃、好ましくは25℃前後で、20〜120rpm攪拌で1〜8週間培養する。
形質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養することができる。
【００４３】
培養終了後、培養物ポリエステルを採取するには、ポリエステルの通常の精製手段を用いることができる。そして、培養細胞又は培養組織、植物器官又は植物体の状態に応じて50％エタノール又はメタノールで洗浄した後ポリエステルの精製を行う。
【００４４】
培養細胞又は培養組織からポリエステルを採取する場合は、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊し、続いて濾過又は遠心分離等により不溶物を除去し、粗ポリエステル溶液を得る。
【００４５】
上記粗ポリエステル溶液からポリエステルをさらに精製するには、クロロホルム、酢酸エチル等の溶媒抽出のほか、通常の精製法を使用することができる。例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析、NMR等を、単独又は適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４６】
植物器官又は植物体からポリエステルを採取する場合は、超音波破砕処理、磨砕処理等を行って上記ポリエステルの抽出液を調製し、クロロホルムを用いて抽出を行い、その後は上記の精製手法と同様にしてポリエステルを得ることができる。
以上のようにして得られたポリエステルは、次式I:
【００４７】
【化３】

【００４８】
（Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
で示される3-ヒドロキシアルカン酸の共重合体（重合度1〜1,000,000）である。
例えば、上記共重合体は、次式II：
【００４９】
【化４】

【００５０】
（ｎは1〜1,000,000の整数を表す。）
で示されるポリ-3-ヒドロキシブタン酸、あるいは次式III:
【００５１】
【化５】

【００５２】
（ｘは0〜1,000,000の整数を表し、ｙは０〜1,000,000の整数を表し、ｚは０〜1,000,000の整数を表す。但し、ｘ、ｙ及びｚは同時に０になることはない。）で示されるポリヒドロキシアルカン酸の構造を有するものである。
ポリエステル合成酵素が生産されたか否かの確認は、マススペクトル分析、ガスクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００５３】
ポリエステル合成酵素遺伝子を核染色体に導入した場合は、発現したタンパク質は予め付加したトランジットペプチドによりプラスチドヘ局在化される。この場合、細胞中に数十個存在するプラスチドの特定のプラスチドにポリエステル生産に必要な3種のタンパク質が効率よく移動することは稀である。従って、各プラスチド中でのこれら3種のタンパク質の比率が異なり、またプラスチドヘの移動中に損失する可能性もある。
【００５４】
これに対し、ポリエステル合成酵素遺伝子をプラスチド染色体に導入した場合は、プラスチドヘ導入したオペロン中の遺伝子は一つのプロモーターに制御されているため、一つのプラスチドの中で3種のタンパク質が発現し、しかも発現比率は常に1:1:1であり、微生物中で発現させたときの比率と同じである。従って、タンパク質の発現に対するポリエステル生産効率は非常に高い。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例1〕ポリエステル合成酵素遺伝子を含むオペロンの調製及び形質転換
本実施例では、プラスチドにバクテリア由来のポリエステル生合成遺伝子オペロンを相同組み換えにより導入し、プラスチド中でポリエステル生合成を行う植物の作出を試みた。すなわち、ポリ-3-ヒドロキシブタン酸エステルを生産する3個の酵素（ポリ-3-ヒドロキシブタン酸合成酵素(phbC)、β-ケトチオラーゼ(phbA)及びアセトアセチルCoAリダクターゼ(phbB)）をそれぞれコードしているphbオペロンを用いて、プラスチド形質転換による微生物遺伝子群の導入を行い、その発現により、植物が徴生物由来の代謝系を新たな形質として獲得できるか否かの試験を行った。
【００５７】
植物としてタバコ、形質転換の薬剤選抜マー力ーとしてスペクチノマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド-3-アデニルトランスフェラーゼ（aadA）遺伝子）、オペロンを制御するプロモーターとしてプラスチド16S rRNAプロモーター(Prrn; 配列番号16)、ターミネーターとしてプラスチドpsbA 3'調節領域（配列番号17)をそれぞれ使用した。プラスチド染色体中での相同組換えを確実に行わせるため、プラスチド中の遺伝子rbcL及びORF512 (rbcL-ORF512; 配列番号18)を用いた。なお、aadA遺伝子はATCCから以下の番号で入手可能である。
【００５８】
1: ATCC Number: 67113 Designations: pMON30 [SR20] Organis
2: ATCC Number: 77185 Designations: pAM34 Sites: Polyl
3: ATCC Number: 77186 Designations: pAM35 Sites: Polyl
4: ATCC Number: 87150 Designations: pBSL175 Sites: Pol
5: ATCC Number: 87119 Designations: pIC552 Sites: Poly
6: ATCC Number: 87626 Designations: pHP45omegavph Sites
【００５９】
また、配列番号18の配列中、rbcLは第227番目から1660番目の領域であり、ORF512は第2425番目から第3963番目の領域である。
phbオペロンの上流にプロモーター及びaadAを連結し、プラスミドpPT12を作製した（図3）。
【００６０】
ところで、転写されたmRNAからタンパク質に翻訳するのに必要なリボソーム結合部位がプラスチド中で働くかどうかは明らかでない。そこで、phbオペロンの各遺伝子(phbC，phbA，phbB）の翻訳開始点の上流に、プラスチド遺伝子rbcLのリボソーム結合部位の配列（AGGGAGGGA）を付加したオペロンを作製した。これをアミノグリコシド-3-アデニルトランスフェラーゼ（aadA）と順方向につないで新たなオペロンを形成させ、形質転換用プラスミドpPT06を作製した（図4）。
【００６１】
以下、各プラスミドの調製方法について説明する。
１．プラスミドの調製
(1) pPL1の調製
アミノグリコシド-3-アデニルトランスフェラーゼ（aadA）をコードする遺伝子（配列番号5）から、プライマーSPEC-U及びSPEC-Lを用いたPCRによって増幅した。
SPEC-U ：TCTGGATCCATGGCTAGTGAAGCGGTTATC（配列番号6）
SPEC-L：TTGAGATCTAGACTGCAGTTATTTGCCGACTACCTTGG（配列番号7）
PCRの条件は以下の通りである。
【００６２】
反応液組成：

【００６３】
反応サイクル
94℃で１分反応させた後、94℃で30秒の変性、50℃で30秒のアニーリング及び72℃で2分の伸長工程を１サイクルとして30サイクル行った。30サイクル終了後、72℃で5分の反応を行った。
PCR後、増幅産物をpUC18にクローニングして、aadA遺伝子を含むプラスミドpPL1を得た。
【００６４】
(2) pPL2の調製
ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)（ATCC 17699）からphbC遺伝子をクローニングした。
まず、ラルストニア・ユートロファ（ATCC 17699）を100ml のLB培地（１％イーストエキス、0.5％トリプトン、0.5％塩化ナトリウム、0.1％グルコース、pH7.5 ）中、30℃で終夜培養した後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法（Currnt Protocols in Molecular Biology,1巻, 2.4.3.頁, 1994年; John Wiley & Sons 出版）により染色体DNAを得た。
【００６５】
次に、ラルストニア・ユートロファphbC、phbA及びphbCBを含むDNA断片を得るためのオリゴヌクレオチド（プライマーphb-U及びphb-L）を化学合成した。
phb-U: ATGGATCCCGGGCAAGTACCTTGCCGACAT （配列番号8）
phb-L: TCCGGATCCTATGCCCAACAAGGCACTAAGA （配列番号9）
【００６６】
これらのプライマーを用い、ラルストニア・ユートロファの染色体DNAを鋳型としたPCR法によってphbC遺伝子を部分増幅した。PCRは、94℃で1分、63℃で2分及び72℃で4分の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。得られたPCR産物はphbC、phbA及びphbCBを含むphbオペロン遺伝子を構成しており(配列番号１；4984bp)、これをpUC18にクローニングした。
【００６７】
phbオペロン(配列番号１)において、phbCは842番目から2611番目、phbAは2696番目から3877番目、phbBは3952番目から4692番目の配列を有するものである。
上記の通り得られたphbC、phbA及びphbCBを含むphbオペロン遺伝子から、rbs-CU及びrbs-CLを用いたPCRによりphbCを増幅した。
【００６８】
rbs-CU : ATCGGATCCAGGGAGGGAATCATGGCGACCGGCAAAGGCGCG（配列番号10）
rbs-CL: AGCAAGCTTTTCAATGGAAACGGGAGGGAACCTG（配列番号11）
PCRの条件は以下の通りである。反応液組成は、プライマーを変えたこと以外、(1)と同様である。
【００６９】
反応サイクル：
▲１▼ 95℃ 1分
▲２▼ (94℃ 1分、63℃ 2分、72℃ 4分)×30サイクル
▲３▼ 72℃ 5分
得られた増幅産物をpUC18にクローニングし、phbC遺伝子（配列番号2）を含むプラスミドpPL2を得た。
【００７０】
(3) pPL3の調製
(2)により得られたphbBオペロンから以下のプライマーを用いて増幅し、phbAをコードするDNAを調製した。
rbs-AU: ATCAAGCTTAGGGAGGGAACAATGACTGACGTTGTCATCG（配列番号12）
rbs-AL: AGAGAATTCCCTTGATTGGCTTCGTTATCGTCGC（配列番号13）
PCRの条件は以下の通りである。
反応液組成：プライマーを変えたこと以外、(1)と同様である。
【００７１】
反応サイクル：
▲１▼ 94℃ 1分
▲２▼ (94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル
▲３▼ 72℃ 5分
その結果、1.2kbpのphbA遺伝子の塩基配列が決定された（配列番号3）。
得られた増幅産物をpUC18にクローニングし、phbA遺伝子を含むプラスミドpPL3を得た。
【００７２】
(4) pPL4の調製
以下のプライマーを用い、phbA遺伝子を調製したのと同様にして0.8kbのphbB遺伝子（配列番号4）を得た。
rbs-BU: ATCGAATTCAGGGAGGGAACATGACTCAGCGCATTGCGTATGTG（配列番号14）
rbs-BL : AGAGGATCCCAGGCCGGCAGGTCAGCCCATATGC（配列番号15）
PCRの反応液組成：プライマーを変えたこと以外、(1)と同様である。
反応サイクル：(3)と同様である。
得られた増幅産物をpUC18のEcoR-BamHI部位にクローニングし、phbB遺伝子(配列番号4)を含むプラスミドpPL4を得た。
【００７３】
(5) pPL5の調製
pPL1のaadAを含むBamHI-BglII断片を、pPL2に含まれるphbCの上流のBamHI部位に挿入して、aadA及びphbCが順方向に並ぶプラスミドpPL5を作製した。
(6) pPL6の調製
pPL3のphbAを含むHindIII-EcoRI断片と、pPL4のphbBを含むEcoRI-KpnI断片とを結合し、これをpUC18のHindIII- KpnI部位に挿入し、phbA及びphbBが順方向に並ぶプラスミド pPL6を作製した。
【００７４】
(7) pPL7の調製
pPL5のBamHI-HindIII断片と、pPL6の HindIII- KpnI断片とを結合し、これをpUC18のBamHI-Kpn1部位に挿入し、aadA、phbC、phbA及びphbBがこの順で順方向に並んでいるプラスミドpPL7を作製した。
【００７５】
(8) pPL8の作製
ラルストニア・ユートロファから調製したDNAを鋳型として、プライマーphb-U及びphb-L((2)参照)を用いてphbオペロンを増幅した。PCR条件は(2)と同様である。
増幅断片をpUC18のBamHI部位にクローニングし、phbC、phbA及びphbBのそれぞれの上流にrbsが連結されていないオペロンを含むプラスミドpCAB3を得た。
次に、pCAB3のphbオペロンを含むBamHI-BamIII断片をpPL1のBglII部位に、aadA、phbC、phbA、phbBの順となるように挿入し、pPL8を作製した。
【００７６】
(9) pPT05の作製
(9-1) pCT11の作製
aadAの上流にタバコプラスチド16S rRNAプロモーター配列（約0.12kb）(Prrn)、下流にタバコプラスチドpSBA 3'調節領域（ターミネーター）（約0.4kb ）を付加したものをpUC18上で作成した。なお、プロモーター配列の5'末端、ターミネーターの3'末端には、それぞれNotI、SalI認識部位が付加されているため、NotI及びSalIで処理した。このNotI-SalI断片を平滑末端化処理し、rbcLとORF512の間に存在する２つのBamHI部位（配列番号18記載の塩基配列の1926番目と1946番目）を平滑末端化処理して上記NotI-SalI断片をその間に挿入し、rbcL、Prrn、aadA、psbA 3'、ORF512の順に並べたものをpUC19(EcoRI-SalI間)上で構築し、pCT11を得た(Svab, Z. and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917、Shikanai, T. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9705-9709 )(図２)。
ここで用いたrbcL-ORF512遺伝子断片は、タバコプラスチド染色体中(Gene Bank accession # Z00044)で、塩基番号57361-61620の遺伝子断片である。
【００７７】
(9-2) pPT05の作製
pCT11のrbcL中のSphI部位（1122）と、ORF512の3'側のベクター上のSphI部位で切り出したものを、pUC18のSphI部位に挿入してpPT01を作製した。
pPT01のaadAの両側のBamHIを酵素処理してaadAを除去したのち、自己結合反応によって閉環化して、rbcL、Prrn、psbA 3'、ORF512の順に並んだ遺伝子を持つpPT05を作製した。
【００７８】
(10) pPT06及びpPT12の作製
pPL7のBamIII-BamHI断片をpPT05のBamHI部位にPrrnの後ろにaadAが来るように挿入し、pPT06を作製した（図４）。
pPL8のBamHI-BamHI断片を、pPT05のBamHI部位に、Prrnの後ろにaadAが来るように挿入し、pPT12を作製した（図３）。
【００７９】
２．形質転換
本実施例では、形質転換のためにパーティクルガンを用いた。
宿主として用いたタバコは、種子から無菌的にMS培地上で培養を行って植物体まで成長させたものであり、直径が2-7cm程度の葉又は切片を用いた。プラスミドDNAを金又はタングステン等の微粒子にコーティングした。これらの葉又は切片をRMOP培地（Svab, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 8526）上に裏向きに（表も可）置き、金属微粒子を撃ち込んだ（1350psi, 距離5〜15cm）。その後RMOP培地上で2日間、明所（約3000lux）、25℃の条件下で培養した。2日後に、この葉を5-10mm程度の小切片に切り、スペクチノマイシン（500μg/ml）を含むRMOP培地上で2日間、明所(約3000lux)、25℃の条件下で培養を行った。3-6週間培養を続けた後に、生じたカルスまたは再分化植物を新しいスペクチノマイシン（500μg/ml）を含むRMOP培地に植え継ぎ、さらに2-3週間培養した。これをスペクチノマイシン（500μg/ml）を含むMS培地に植え継いで培養を行い、発根を促した。
【００８０】
こうして得られた再分化個体は、形質転換されたプラスチド及び形質転換されていない野生型のプラスチドの両方を有していた。そこで、この再分化個体の葉を切片にしてスペクチノマイシン（500μg/ml）を含むRMOP培地上に置き、再度再分化を行った。再分化個体を、上記と同様にしてスペクチノマイシン（500μg/ml）を含むMS培地(Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473)上で発根させた。これを、土を入れた植木鉢に植えかえて馴化させた後、栽培を行い、再分化個体（形質転換植物；地上茎45〜80cm）を得た。
【００８１】
〔実施例2〕導入遺伝子の確認
(1) PCRによる確認
スペクチノマイシン耐性遺伝子および3つのポリエステル生合成酵素遺伝子が再分化個体中に存在することをPCR法により確認した。
再分化個体（6個体）の葉よりCATB法により、それぞれ鋳型DNAを抽出した。各遺伝子に特異的なプライマーは、プラスミドの構築に用いたのと同じプライマーを用いた。
PCRの反応条件：各遺伝子ともそれぞれ前記と同様。
【００８２】
PCR後、反応産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色して各遺伝子の存在を確認した。
その結果、6個体すべてにおいて、導入された4種類の遺伝子のいずれもバンドが確認された（図５）。これらの遺伝子は、プラスチド特異的なプロモーターの制御下で発現させ、スペクチノマイシンで選択選別された個体から得られたものである。従って、形質転換体はスペクチノマイシン耐性遺伝子の活性を有するものであり、上記4種類の遺伝子はプラスチド中に導入されたことが示された。
【００８３】
(2) ガスクロマトグラフィー-マススペクトル（GC-MS）によるポリエステル生産性の確認
再分化個体中に導入したオペロンが発現していることを確認するために、導入した3つのポリエステル生合成関連遺伝子の発現産物によるポリエステル（ポリ-3-ヒドロキシブタン酸エステル）の生産性を検討した。
【００８４】
再分化個体の葉を凍結乾燥後、破砕し、ソックスレー抽出器を用いてクロロホルム抽出を行った。これを、1M食塩水で2度洗浄した後、濃縮後、10-15倍量のメタノールを添加した。沈殿をフィルターにより回収し、クロロホルムに溶解した。これを濃縮したものをサンプルとし、塩酸酸性中でエタノール分解（エタノリシス）を行った（サンプル0.1ml、エタノール0.34ml、塩酸0.04ml、100℃、4時間）。反応液を1M食塩水1.2mlで洗浄後、クロロホルム画分を回収した。硫酸ナトリウムで脱水した後、ガスクロマトグラフィー-マススペクトル(GC-MS)により分析した。
【００８５】
GC-MSの条件：キャピラリーカラムHP5(25m)、45℃→250℃（5℃/分）
その結果、形質転換体にはPHB由来の3-ヒドロキシブタン酸エチルエステルのピークが検出された（GCについては図６Aの5.8分のピーク、MSについては図６Bの117, 103, 87, 71, 60, 43のピーク）。しかし、非形質転換体にはそのようなピークは認められなかった。従って、微生物由来ポリエステル生合成オペロンが植物のプラスチド中に組み込まれ、正常に機能していることが明らかとなった。
【００８６】
(3) 蛍光顕微鏡観察によるポリエステル生産の確認
4種類の遺伝子が導入されたタバコの再分化個体の葉を約0.5cm角に切り、固定液(2.5％グルタルアルデヒド, 100mM リン酸ナトリウムバッファー, pH7.4）に浸して減圧を行い、2-4時間静置して固定液を浸透させた。このサンプルから剃刀を用いて薄片を作り、ナイルブルーA染色を行った後、蛍光顕微鏡にて観察した。
【００８７】
460nmで励起した結果、葉緑体全体が赤色を呈したがポリエステルを含む葉緑体は赤みが強く観察された。また、546nmで励起したところ、組織全体は緑色を呈したが、ポリエステルを含有した葉緑体はオレンジがかった黄色を呈した。
このことから、ポリエステルが葉緑体中に効率よく生産されていることが明らかとなり、導入したポリエステル生合成オペロンが機能していることが確かめられた。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、ポリエステルの製造方法が提供される。本発明の方法によれば、各々の遺伝子にプロモーターをつけることなく簡易に発現させることができ、高収率でポリエステルを得ることができる。
【００８９】
【配列表】

【００９０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号6：合成DNA
配列番号7：合成DNA
配列番号8：合成DNA
配列番号9：合成DNA
配列番号10：合成DNA
配列番号11：合成DNA
配列番号12：合成DNA
配列番号13：合成DNA
配列番号14：合成DNA
配列番号15：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】アセチルCoAからポリエステル生成までの反応を示す図である。
【図２】プラスミドpCT11の構築図である。
【図３】プラスミドpPT12の構築図である。
【図４】プラスミドpPT06の構築図である。
【図５】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】ガスクロマトグラフィー及びマススペクトルの結果を示す図である。

Claims (11)

1. プロモーター、ポリエステル合成酵素遺伝子、該ポリエステル合成酵素遺伝子とは異なる２〜１０種類の複数のポリエステル生合成酵素遺伝子、並びに該ポリエステル合成酵素遺伝子及び複数のポリエステル生合成酵素遺伝子の各々の翻訳開始点の上流に結合されたプラスチド由来リボソーム結合部位を含むオペロンが連結された組換えベクターをプラスチド染色体に組み込んで植物を形質転換し、得られる形質転換植物を培養又は栽培した後、該培養物又は栽培物からポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
2. ポリエステル合成酵素遺伝子が、ポリ‐3‐ヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子である請求項１記載の製造方法。
3. 複数のポリエステル生合成酵素遺伝子がβ‐ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子である、請求項１又は２記載の製造方法。
4. 植物が、ナス科、イネ科、アオイ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、ツバキ科、マメ科、ヤシ科、アオギリ科及びアカネ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. ナス科に属する植物がタバコである請求項４記載の製造方法。
6. ポリエステルが3‐ヒドロキシブタン酸の単重合体である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の製造方法。
7. プロモーター、ポリエステル合成酵素遺伝子、該ポリエステル合成酵素遺伝子とは異なる２〜１０種類の複数のポリエステル生合成酵素遺伝子、並びに該ポリエステル合成酵素遺伝子及び複数のポリエステル生合成酵素遺伝子の各々の翻訳開始点の上流に結合されたプラスチド由来リボソーム結合部位を含むオペロンがプラスチド染色体に組み込まれた形質転換植物。
8. ポリエステル合成酵素遺伝子がポリ‐3‐ヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子である請求項７記載の形質転換植物。
9. 複数のポリエステル生合成酵素遺伝子がβ‐ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子である、請求項７又は８記載の形質転換植物。
10. 植物が、ナス科、イネ科、アオイ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、ツバキ科、マメ科、ヤシ科、アオギリ科及びアカネ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである請求項７〜９のいずれか1項に記載の形質転換植物。
11. ナス科に属する植物がタバコである請求項１０記載の形質転換植物。

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