JP4000671B2 - 非特異的吸着防止剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査、診断薬分野に於て用いられる免疫反応を利用した測定法に使用される、遊離の抗原、抗体又はこれらに標識物を結合させたもの（以下、単に標識体という場合がある）の、抗体或は抗原結合固相（以下、単に「結合固相」と略称する）や免疫反応容器への非特異的吸着防止剤、及びこれを用いた非特異的吸着防止方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床検査、診断薬分野において、免疫反応を利用した測定法が広く行われてきており、微量の生体成分の分析に広く用いられている。本測定法において、検出感度を左右する要因の一つとして、測定に使用される、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の、結合固相や免疫反応容器への非特異的吸着が挙げられる。これらの吸着は検出感度や再現性の低下の原因となっている。
【０００３】
従来、これらの結合固相や免疫反応容器への吸着を防止するための方法として、結合固相や免疫反応容器を、アルブミン等の免疫反応に無関係なタンパク質でブロッキングする方法、ポリビニルアルコールを用いてブロッキングする方法（特開平4-19561号公報）、或は2-メタクリロイルオキシエチルスルホリルコリン重合体を用いてブロッキングする方法（特開平7-83923号公報）等が知られている。
【０００４】
結合固相への非特異的吸着は上記した如きブロッキング剤の測定系内への添加である程度回避することも可能ではあるが、まだ充分とはいえず、反応容器への非特異的吸着は、予め反応容器を上記のようにブロッキング剤で処理しなければならず、操作が煩雑である。
【０００５】
一方、特開平6-66798号公報や特開平9-80048号公報に記載されているような界面活性剤を使用する方法は、直接、測定系に添加して使用することが可能であるが、この方法では反応容器を未処理で使用した場合には充分な効果が得られない、また、測定対象のタンパク質がその構造中に脂質を含んでいる場合には界面活性剤の使用によってその構造を破壊してしまうため使用できない、等の問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き状況に鑑み本発明が解決しようとする課題は、免疫反応に影響を与えず、測定に使用する遊離の抗原、抗体またはその標識体の、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し、高精度で高感度な分析方法を可能にする非特異的吸着防止剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、
(１)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物からなる、抗体又は抗原の非特異的吸着防止剤、
【０００８】
(２)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物を抗体又は抗原を含有する溶液中に共存させることを特徴とする、抗原又は抗体の非特異的吸着防止方法、
【０００９】
(３)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含有する溶液を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法、
【００１０】
(４)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる抗体又は抗原組成物、及び
【００１１】
(５)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる免疫学的測定用試薬、に関する。
【００１２】
即ち、本発明者らは、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し、且つ目的の免疫反応に影響を与えず、高精度で高感度な分析方法を可能にする非特異的吸着防止剤を求めて鋭意研究を重ねた結果、水溶性化合物である、分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテル（以下、本発明に係る水溶性ポリマーと略称することがある）が、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
本発明に係る分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物としては、例えば重量平均分子量１００００〜１０００００、好ましくは１５０００〜５００００、疎水性の二官能性化合物ユニットとポリエチレングリコールユニットの重量比率が２０：１〜１：１、好ましくは１５：１〜３：２のものが挙げられ、スペーサーはポリエチレングリコール鎖の途中の任意の位置に存在すればよい。スペーサーとして用いられる疎水性の二官能性化合物としては、例えば下記の一般式［１］で示される化合物が好ましく挙げられる。
【００１４】
【化１】
（式中、Ｒは結合手又は低級アルキレン基を表わす。）
【００１５】
一般式［１］に於いて、Ｒで示される低級アルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは１〜４のものが挙げられ、直鎖状でも分枝状でも良く、具体的にはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、２−メチルプロピレン基、ペンチレン基、２，２−ジメチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、ヘキシレン基等が挙げられる。
また、その具体例として、例えばビスフェノールＡグリシジルエーテルが挙げられる。
【００１６】
ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）としては、例えば重量平均分子量１００００〜１００００００、好ましくは２００００〜１０００００、ビニルピロリドンユニットとビニルアセテートユニットとの結合比率が８０：２０〜５０：５０、好ましくは７０：３０〜５５：４５のものが挙げられる。
【００１７】
また、ポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルとしては、ポリエチレングリコールの末端にテトラヒドロフルフリル基がエーテル結合した構造を有する化合物であり、例えば分子量２００から２０００、好ましくは２００から５００のものが挙げられる。
【００１８】
尚、これら本発明に係る水溶性ポリマーは、市販のものを用いても良いし、常法に従って合成したものを用いても良い。
【００１９】
本発明に係る水溶性ポリマーは、夫々単独で用いても、或はこれらを２種以上適宜組合せて用いてもよい。これらの非特異的吸着剤としての使用濃度は、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得、且つ目的の抗原抗体反応を阻害しない濃度であればよい。分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物を単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加され、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）を単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加され、ポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルを単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加される。また、これらを２種以上組み合わせて用いる場合は、その合計が通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加される。
【００２０】
本発明の非特異的吸着防止剤により、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得る抗原としては、例えば血清，血液，血漿，髄液等の生体体液、尿、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖、ホルモン、薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に、具体的には例えばα-フェトプロテイン(AFP)，CA19-9，前立腺特異抗原(PSA)、癌胎児 性抗原(CEA)，癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質等の癌マーカー、例えば免疫グロブリンＡ(IgA)，免疫グロブリンＥ(IgE)，免疫グロブリンＧ(IgG)，免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ），β2-ミクログロブリン，アルブミン，フェリチン等の血清蛋白質、例えばＣ-ペプチド，アンジオテンシン Ｉ等のペプチド、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ(γ-GTP)等の酵素蛋白、例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ATLウイルス，AIDSウイルス等臨床的に注目されているウイルスに由来する抗原、ウイルス等の病原体のデオキシリボ核酸(DNA)やリボ核酸(RNA)或はこれら核酸を構成する１本鎖ポリヌクレオチド、ウイルス等の病原体に由来する抗原性物質、例えばスギその他の草木の花粉や室内塵等のアレルゲン、例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばインシュリン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)，サイロキシン(T4)，トリヨードサイロニン(T3)，プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン(TSH)等のホルモン、例えばジゴキシン， フェニトイン，モルヒネ，ニコチン等の薬物等が挙げられる。
【００２１】
本発明の非特異的吸着防止剤により、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得る抗体としては、上記した如き抗原に対する抗体が挙げられる。
【００２２】
上記抗原又は抗体の標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（EIA）におい て用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダー ゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン 酸脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（RIA）で用いられる99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同 位元素、例えば蛍光免疫測定法（FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル ，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフ ロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4ーアミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメ チルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)ーp-トリルオキシル等のオキシル基を有す る化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明に係る水溶性ポリマーを用いて非特異的吸着を防止するためには、少なくとも免疫反応の際にその系内に、本発明に係る水溶性ポリマーが上記した如き濃度存在するようにすればよく、存在させる方法は特に限定されないが、例えば、免疫反応時に使用される緩衝液、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液或は検体等に本発明に係る水溶性ポリマーを予め添加溶解させておいても、また検体と必要な試液とを混合する際に添加溶解させても良い。尚、非特異的吸着防止効果を考慮すると、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液中に本発明に係る水溶性ポリマーを予め添加しておくことが望ましい。
【００２４】
本発明の組成物は本発明に係る水溶性ポリマーを遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液に溶解して得られる溶液が一般であり、この組成物は、免疫学的測定方法に供されるまで、凍結処理や凍結乾燥処理等を施した状態、或は溶液等の状態等、多種の形態で保存し得る。そして、用時、これらの組成物を測定系に添加すればよい。
【００２５】
本発明の非特異的吸着防止剤により非特異的吸着を防止し得る結合固相に於ける固相の材質及び形状としては特に限定されるものではないが、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，ポリメチルメタクリレート等の合成高分子、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー等から調製された、例えば試験管、タイタープレート、ビーズ、ラテックス、磁性微粒子等や、ニトロセルロース、硝酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、修飾ナイロン、活性基修飾ナイロン、ポリビニリデンジフルオロライド（ＰＶＤＦ）、修飾ＰＶＤＦ、紙、レーヨン、綿糸、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン等から調製された膜状やシート状の吸収性担体（イムノクロマト法等で用いられる）等が挙げられる。
【００２６】
固相に結合させる抗原又は抗体は検体中の測定すべき物質に応じて適宜選択される。固相に対する抗体又は抗原の結合は、化学的結合であっても物理的結合（吸着）であってもよい。
【００２７】
本発明の免疫学的測定方法に於ける検体としては種々のものが使用でき特に限定されないが、例えば、血清、血漿、血液、髄液等の各種体液や尿等の排泄物、糞便等の希釈物から固形分を除去したもの、各種組織の抽出液等が挙げられる。
【００２８】
本発明の免疫学的測定方法は、本発明に係る吸着防止剤を免疫反応系内に存在させる以外は、自体公知の免疫学的測定方法、例えば、酵素免疫測定方法（EIA）、放射免疫測定方法（RIA）、蛍光免疫測定方法（FIA）等の免疫学的測定方法に準じて行えば良い。また、その測定原理としては、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等種々のものが挙げられる。
【００２９】
本発明に於て、免疫反応容器としては種々のものが使用でき、例えばガラス又はプラスチック製のチューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マイクロタイタープレート、或いはイムノクロマト法で用いられる吸収性担体等が挙げられる。
【００３０】
尚、固相としてマイクロタイタープレート、チューブ、吸収性担体（イムノクロマト法の場合等）等を用いる場合は、固相自体を免疫反応容器とすることができるが、固相化担体とは別途に各種の反応容器を用いても良い。
【００３１】
本発明に係る試薬、組成物又は溶液中には、共存する試薬等の安定性や抗原と抗体との反応等を阻害しないものであれば通常この分野で用いられるその他の試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。またその濃度も、通常、この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００３２】
本発明に係る試薬、組成物又は溶液に於て用いることのできる緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常免疫比濁法、免疫比ろう法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測 定方法(RIA)、蛍光免疫測定方法(FIA)等に用いられている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０である。
【００３３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１
(１)抗HBeモノクローナル抗体の作製
HBe抗原（スクリプス社製）をフロイント完全アジュバントとともにBALB/cマ ウス（雌）に免疫（２回）後、摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞（F0）とをポリエチレングリコールを用いる常法（特開平5-244983号公報に記載された方法）により融合させた。その後、常法により抗HBeモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別し、これを培養して抗HBeモノクローナル抗体を得た。得られた抗HBeモノクローナル抗体を常法（石川栄治著、「酵素標識法」、学会出版センター、1991年、ｐ．62の方法）によりペルオキシダーゼ（POD、ベーリンガーマンハイム社製）標識し、標識抗体を作製した。
【００３５】
(２)POD標識抗体溶液
上記(１)で得た標識抗体を2.5μgAb/mLとなるように２％BSAを含む50mM ２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（MES）緩衝液（ｐＨ6.5）に溶解後、分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物［シグマアルドリッチ社製、分子量；１５０００〜２００００、２分子のポリエチレングリコール（分子量７０００〜９０００）をビスフェノールＡグリシジルエーテルで結合したもの］、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）又はポリエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテル（フルカ社製、ジエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテルとトリエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテルとの混合物）を、夫々0.5W/V％の濃度になるように溶解したものをPOD標識抗体液とした。
尚、比較として、非特異的吸着防止剤を加えないもの、並びに、非特異的吸着剤として公知のポリビニルアルコール（和光純薬工業社製、分子量；平均重合度１５００〜２０００、けん化率 ７５％）を０．５w/v％、又はスペーサーを含まないポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、分子量；４０００〜２００００）を０．５w/v％含むものも同時に調製した。
これらのPOD標識抗体溶液を用い、以下に示す方法で測定を行って非特異的吸着 防止効果を調べた。
【００３６】
(３)吸着防止効果の検討
ポリスチレンボール（イムノケミカル社製）を、上記(１)で得たＰＯＤ未標識抗HBeモノクローナル抗体 20μg/mLを含む50mM ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPS）緩衝液（ｐＨ7.5）中に浸漬し、４℃で一夜静置後、１％ BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5）中に浸漬して、さらに４℃で一夜静置し、抗HBeモノクローナル抗体固定化ボールを作製した。
ポリプロピレンチューブに１％BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5） 200μLを分注し、上記のように調製した抗HBeモノクローナル抗体固定化ボール１個を加えて37℃で７分間反応させた。次いで該ボールを生理食塩液１mLで３回洗浄後、所定のPOD標識抗体溶液200μLを加えて37℃で７分間反応させた。該ボールを 生理食塩液 １ｍLで３回洗浄後、５mMルミノール（和光純薬工業社製）及び0.02％過酸化水素を含む50mMトリス緩衝液（ｐＨ8.5）200μLを加え、化学発光計（ベルトールド社製、オートルマットLB953）にて１秒間の化学発光積算量を測定した。
【００３７】
尚、非特異的吸着防止能(％)は下式１により算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
【式１】
注；Samボール：非特異的吸着防止剤添加ＰＯＤ標識抗体溶液中で反応させて得 られたボール
Refボール：非特異的吸着防止剤無添加ＰＯＤ標識抗体溶液中で反応させて 得られたボール
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１の結果から、本発明の非特異的吸着防止剤を添加すると、従来から免疫アッセイ用ブロッキング剤として用いられているポリビニルアルコールと比べて明らかに優れた非特異的吸着防止効果が得られることが判る。
【００４１】
実施例２
本発明の非特異的吸着防止剤添加による免疫反応への影響を調べるため、以下のような実験を行った。
先ず、HBe抗原（スクリプス社製）と１％BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5）を用いて調製したHBe抗原溶液（含有量；０または0.2 U/ｍL）200μLをポリプロピレンチューブに分注し、実施例１の（３）で調製した抗HBeモノクローナル抗体固定化ボール１個を加えて37℃で７分間反応させた。次いで該ボールを生理食塩水１mLで３回洗浄後、１％ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、重量平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）と、実施例１の（１）で調製したPOD標識抗体を2.5μgAb/mL含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ6.5）200μLを加えて37℃で７分間反応させた。該ボールを生理食塩水１mLで３回洗浄後、５mMルミノール（和光純薬工業社製）及び0.02％過酸化水素水を含む50mM トリス緩衝液（ｐＨ8.5）200μLを加え、化学発光計（ベルトールド社製、オートルマットLB953）にて１秒間の化学発光積算量を測定した。結果を表２に示す。
【００４２】
また、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を下式２により算出した。その結果も表２に併せて示す。
【００４３】
【式２】
【００４４】
【表２】
【００４５】
表２の結果から、本発明の非特異的吸着防止剤の添加によって、免疫反応に影響を与えず、Ｓ／Ｎ比が良くなることが判る。
【００４６】
実施例３
(1)金コロイド標識抗体溶液の調製)
常法により自製した抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（蛋白濃度：20mg/ml）10μｌと、フレンス（Frens）の方法［Nature Phys.Sci.,vol.241,20-22(1973)］で調製し0.1M K2CO3でpHを6.5に調整した金コロイド溶液（金コロイドの平均粒経：30nm。ＯＤ520nm＝1.2）6mlとを混合し1時間反応させた後、反応液に分散剤としてポリエチレングリコール（シグマ社製。商品名：カーボワックス20M）を終濃度で0.05％となるように添加した。その後、反応液を15000rpm×20分で遠心分離処理し、上清を除き、得られた残渣を50mMリン酸緩衝液(pH7.4) 3mlに懸濁し、金コロイド標識抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液を調製した。
【００４７】
(2)ブロッキング効果の検討
上記(1)で得た金コロイド標識抗体溶液に、本発明の非特異的吸着防止剤である、分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物［シグマアルドリッチ社製、分子量；１５０００〜２００００、２分子のポリエチレングリコール（分子量７０００〜９０００）をビスフェノールＡグリシジルエーテルで結合したもの］又はポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）を１%添加したものを、ブロッキング処理していないニトロセルロース膜(ミリポア社製。10mm×6mm)の中央に2μl 滴下して乾燥させた後、当該膜の下端を血清に浸漬して展開した場合の金コロイド標識抗体の展開状態を調べた。
【００４８】
その結果、何れの非特異的吸着防止剤を用いた場合も、金コロイド標識抗体溶液を滴下乾燥した位置での金コロイド標識抗体の残存は見られず、ニトロセルロース膜に於いても非特異的吸着防止効果を奏することが判った。
【００４９】
実施例４
(1)判定部位を有する展開膜の調製
40mm×6mmのニトロセルロース膜（ミリポア社製）の端から20mmの位置に、自製した抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（蛋白濃度：20mg/ml）0.5μLを線状に塗布後、乾燥して固定化して、判定部を有する展開膜を調製した。
【００５０】
(2)金コロイド標識抗体含浸膜の調製
実施例３の(1)で調製した金コロイド標識抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液に、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）を0.5又は１%添加したものに不織布(商品名：ロープロソーブ。日本ポール（株）製。)に含浸後、乾燥して金コロイド標識抗体含浸膜を調製した。
【００５１】
(3)試験用具の組立
塩化ビニルシート60mm×6mmの中央部に展開膜を両面テープで接着し、次いで、当該展開膜の一端に10mm×6mmの金コロイド標識抗体含浸膜を展開膜と1〜2mm重なるように両面テープで接着した。また、金コロイド標識抗体含浸膜の展開膜と接していない端に10mm×6mmの不織布(商品名；ロープロソーブ。日本ポール（株）製)を金コロイド標識抗体含浸膜と1〜2mm重なるように両面テープで接着して検体吸収部とした。更に、展開膜の金コロイド標識抗体含浸膜と接していない端に10mm×6mmの濾紙を両面テープで接着して試験用具とした。
【００５２】
(4)測定
HBs抗原を含まない陰性血清に既知濃度のHBs抗原を添加して0-80ng/mlの標準を作製した。これらの標準を上記試験用具の検体吸収部に50μl滴下した後、検体の展開に要する時間経過後、判定部の着色を観察した。
結果を表３に示す。尚、表３中、＋は判定部に着色が見られたことを表し、−は判定部に着色が見られなかったことを示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３の結果から、HBs抗原含有量が０の試料を用いた場合には判定部に着色が見られず、HBs抗原含有試料を用いると判定部に着色が見られることが判る。即ち、本発明の非特異的吸着防止剤は、イムノクロマト法に於いても有効に働き、金コロイド標識抗体の非特異的吸着を防止し得ることが判る。
【００５５】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は免疫反応に影響を与えず、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の抗原或は抗体結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止する非特異的吸着防止剤並びに非特異的吸着防止方法を提供するものであり、本発明の方法によれば、免疫反応系に本発明の非特異的吸着防止剤を存在させるだけで結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止することができ、高精度で高感度な分析が可能となる。
本発明は、臨床検査、診断薬分野に於て用いられる免疫反応を利用した測定法に使用される、遊離の抗原、抗体又はこれらに標識物を結合させたもの（以下、単に標識体という場合がある）の、抗体或は抗原結合固相（以下、単に「結合固相」と略称する）や免疫反応容器への非特異的吸着防止剤、及びこれを用いた非特異的吸着防止方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床検査、診断薬分野において、免疫反応を利用した測定法が広く行われてきており、微量の生体成分の分析に広く用いられている。本測定法において、検出感度を左右する要因の一つとして、測定に使用される、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の、結合固相や免疫反応容器への非特異的吸着が挙げられる。これらの吸着は検出感度や再現性の低下の原因となっている。
【０００３】
従来、これらの結合固相や免疫反応容器への吸着を防止するための方法として、結合固相や免疫反応容器を、アルブミン等の免疫反応に無関係なタンパク質でブロッキングする方法、ポリビニルアルコールを用いてブロッキングする方法（特開平4-19561号公報）、或は2-メタクリロイルオキシエチルスルホリルコリン重合体を用いてブロッキングする方法（特開平7-83923号公報）等が知られている。
【０００４】
結合固相への非特異的吸着は上記した如きブロッキング剤の測定系内への添加である程度回避することも可能ではあるが、まだ充分とはいえず、反応容器への非特異的吸着は、予め反応容器を上記のようにブロッキング剤で処理しなければならず、操作が煩雑である。
【０００５】
一方、特開平6-66798号公報や特開平9-80048号公報に記載されているような界面活性剤を使用する方法は、直接、測定系に添加して使用することが可能であるが、この方法では反応容器を未処理で使用した場合には充分な効果が得られない、また、測定対象のタンパク質がその構造中に脂質を含んでいる場合には界面活性剤の使用によってその構造を破壊してしまうため使用できない、等の問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き状況に鑑み本発明が解決しようとする課題は、免疫反応に影響を与えず、測定に使用する遊離の抗原、抗体またはその標識体の、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し、高精度で高感度な分析方法を可能にする非特異的吸着防止剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、
(１)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物からなる、抗体又は抗原の非特異的吸着防止剤、
【０００８】
(２)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物を抗体又は抗原を含有する溶液中に共存させることを特徴とする、抗原又は抗体の非特異的吸着防止方法、
【０００９】
(３)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含有する溶液を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法、
【００１０】
(４)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる抗体又は抗原組成物、及び
【００１１】
(５)分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる免疫学的測定用試薬、に関する。
【００１２】
即ち、本発明者らは、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し、且つ目的の免疫反応に影響を与えず、高精度で高感度な分析方法を可能にする非特異的吸着防止剤を求めて鋭意研究を重ねた結果、水溶性化合物である、分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）及びポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテル（以下、本発明に係る水溶性ポリマーと略称することがある）が、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
本発明に係る分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物としては、例えば重量平均分子量１００００〜１０００００、好ましくは１５０００〜５００００、疎水性の二官能性化合物ユニットとポリエチレングリコールユニットの重量比率が２０：１〜１：１、好ましくは１５：１〜３：２のものが挙げられ、スペーサーはポリエチレングリコール鎖の途中の任意の位置に存在すればよい。スペーサーとして用いられる疎水性の二官能性化合物としては、例えば下記の一般式［１］で示される化合物が好ましく挙げられる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
一般式［１］に於いて、Ｒで示される低級アルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは１〜４のものが挙げられ、直鎖状でも分枝状でも良く、具体的にはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、２−メチルプロピレン基、ペンチレン基、２，２−ジメチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、ヘキシレン基等が挙げられる。
また、その具体例として、例えばビスフェノールＡグリシジルエーテルが挙げられる。
【００１６】
ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）としては、例えば重量平均分子量１００００〜１００００００、好ましくは２００００〜１０００００、ビニルピロリドンユニットとビニルアセテートユニットとの結合比率が８０：２０〜５０：５０、好ましくは７０：３０〜５５：４５のものが挙げられる。
【００１７】
また、ポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルとしては、ポリエチレングリコールの末端にテトラヒドロフルフリル基がエーテル結合した構造を有する化合物であり、例えば分子量２００から２０００、好ましくは２００から５００のものが挙げられる。
【００１８】
尚、これら本発明に係る水溶性ポリマーは、市販のものを用いても良いし、常法に従って合成したものを用いても良い。
【００１９】
本発明に係る水溶性ポリマーは、夫々単独で用いても、或はこれらを２種以上適宜組合せて用いてもよい。これらの非特異的吸着剤としての使用濃度は、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得、且つ目的の抗原抗体反応を阻害しない濃度であればよい。分子中にスペーサーとして疎水性の二官能性化合物を導入してなるポリエチレングリコール化合物を単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加され、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）を単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加され、ポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルを単独で用いる場合は、反応系内に通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加される。また、これらを２種以上組み合わせて用いる場合は、その合計が通常０．０１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜１w/v％となるように添加される。
【００２０】
本発明の非特異的吸着防止剤により、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得る抗原としては、例えば血清，血液，血漿，髄液等の生体体液、尿、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖、ホルモン、薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に、具体的には例えばα-フェトプロテイン(AFP)，CA19-9，前立腺特異抗原(PSA)、癌胎児 性抗原(CEA)，癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質等の癌マーカー、例えば免疫グロブリンＡ(IgA)，免疫グロブリンＥ(IgE)，免疫グロブリンＧ(IgG)，免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ），β2-ミクログロブリン，アルブミン，フェリチン等の血清蛋白質、例えばＣ-ペプチド，アンジオテンシン Ｉ等のペプチド、例えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ(γ-GTP)等の酵素蛋白、例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ATLウイルス，AIDSウイルス等臨床的に注目されているウイルスに由来する抗原、ウイルス等の病原体のデオキシリボ核酸(DNA)やリボ核酸(RNA)或はこれら核酸を構成する１本鎖ポリヌクレオチド、ウイルス等の病原体に由来する抗原性物質、例えばスギその他の草木の花粉や室内塵等のアレルゲン、例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばインシュリン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)，サイロキシン(T4)，トリヨードサイロニン(T3)，プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン(TSH)等のホルモン、例えばジゴキシン， フェニトイン，モルヒネ，ニコチン等の薬物等が挙げられる。
【００２１】
本発明の非特異的吸着防止剤により、結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止し得る抗体としては、上記した如き抗原に対する抗体が挙げられる。
【００２２】
上記抗原又は抗体の標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（EIA）におい て用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダー ゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン 酸脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（RIA）で用いられる99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同 位元素、例えば蛍光免疫測定法（FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル ，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフ ロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4ーアミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメ チルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)ーp-トリルオキシル等のオキシル基を有す る化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明に係る水溶性ポリマーを用いて非特異的吸着を防止するためには、少なくとも免疫反応の際にその系内に、本発明に係る水溶性ポリマーが上記した如き濃度存在するようにすればよく、存在させる方法は特に限定されないが、例えば、免疫反応時に使用される緩衝液、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液或は検体等に本発明に係る水溶性ポリマーを予め添加溶解させておいても、また検体と必要な試液とを混合する際に添加溶解させても良い。尚、非特異的吸着防止効果を考慮すると、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液中に本発明に係る水溶性ポリマーを予め添加しておくことが望ましい。
【００２４】
本発明の組成物は本発明に係る水溶性ポリマーを遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体を含有する試液に溶解して得られる溶液が一般であり、この組成物は、免疫学的測定方法に供されるまで、凍結処理や凍結乾燥処理等を施した状態、或は溶液等の状態等、多種の形態で保存し得る。そして、用時、これらの組成物を測定系に添加すればよい。
【００２５】
本発明の非特異的吸着防止剤により非特異的吸着を防止し得る結合固相に於ける固相の材質及び形状としては特に限定されるものではないが、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，ポリメチルメタクリレート等の合成高分子、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー等から調製された、例えば試験管、タイタープレート、ビーズ、ラテックス、磁性微粒子等や、ニトロセルロース、硝酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、修飾ナイロン、活性基修飾ナイロン、ポリビニリデンジフルオロライド（ＰＶＤＦ）、修飾ＰＶＤＦ、紙、レーヨン、綿糸、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン等から調製された膜状やシート状の吸収性担体（イムノクロマト法等で用いられる）等が挙げられる。
【００２６】
固相に結合させる抗原又は抗体は検体中の測定すべき物質に応じて適宜選択される。固相に対する抗体又は抗原の結合は、化学的結合であっても物理的結合（吸着）であってもよい。
【００２７】
本発明の免疫学的測定方法に於ける検体としては種々のものが使用でき特に限定されないが、例えば、血清、血漿、血液、髄液等の各種体液や尿等の排泄物、糞便等の希釈物から固形分を除去したもの、各種組織の抽出液等が挙げられる。
【００２８】
本発明の免疫学的測定方法は、本発明に係る吸着防止剤を免疫反応系内に存在させる以外は、自体公知の免疫学的測定方法、例えば、酵素免疫測定方法（EIA）、放射免疫測定方法（RIA）、蛍光免疫測定方法（FIA）等の免疫学的測定方法に準じて行えば良い。また、その測定原理としては、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等種々のものが挙げられる。
【００２９】
本発明に於て、免疫反応容器としては種々のものが使用でき、例えばガラス又はプラスチック製のチューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マイクロタイタープレート、或いはイムノクロマト法で用いられる吸収性担体等が挙げられる。
【００３０】
尚、固相としてマイクロタイタープレート、チューブ、吸収性担体（イムノクロマト法の場合等）等を用いる場合は、固相自体を免疫反応容器とすることができるが、固相化担体とは別途に各種の反応容器を用いても良い。
【００３１】
本発明に係る試薬、組成物又は溶液中には、共存する試薬等の安定性や抗原と抗体との反応等を阻害しないものであれば通常この分野で用いられるその他の試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。またその濃度も、通常、この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００３２】
本発明に係る試薬、組成物又は溶液に於て用いることのできる緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常免疫比濁法、免疫比ろう法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測 定方法(RIA)、蛍光免疫測定方法(FIA)等に用いられている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０である。
【００３３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１
(１)抗HBeモノクローナル抗体の作製
HBe抗原（スクリプス社製）をフロイント完全アジュバントとともにBALB/cマ ウス（雌）に免疫（２回）後、摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞（F0）とをポリエチレングリコールを用いる常法（特開平5-244983号公報に記載された方法）により融合させた。その後、常法により抗HBeモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別し、これを培養して抗HBeモノクローナル抗体を得た。得られた抗HBeモノクローナル抗体を常法（石川栄治著、「酵素標識法」、学会出版センター、1991年、ｐ．62の方法）によりペルオキシダーゼ（POD、ベーリンガーマンハイム社製）標識し、標識抗体を作製した。
【００３５】
(２)POD標識抗体溶液
上記(１)で得た標識抗体を2.5μgAb/mLとなるように２％BSAを含む50mM ２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（MES）緩衝液（ｐＨ6.5）に溶解後、分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物［シグマアルドリッチ社製、分子量；１５０００〜２００００、２分子のポリエチレングリコール（分子量７０００〜９０００）をビスフェノールＡグリシジルエーテルで結合したもの］、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）又はポリエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテル（フルカ社製、ジエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテルとトリエチレングリコールモノテトラヒドロフルフリルエーテルとの混合物）を、夫々0.5W/V％の濃度になるように溶解したものをPOD標識抗体液とした。
尚、比較として、非特異的吸着防止剤を加えないもの、並びに、非特異的吸着剤として公知のポリビニルアルコール（和光純薬工業社製、分子量；平均重合度１５００〜２０００、けん化率 ７５％）を０．５w/v％、又はスペーサーを含まないポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、分子量；４０００〜２００００）を０．５w/v％含むものも同時に調製した。
これらのPOD標識抗体溶液を用い、以下に示す方法で測定を行って非特異的吸着 防止効果を調べた。
【００３６】
(３)吸着防止効果の検討
ポリスチレンボール（イムノケミカル社製）を、上記(１)で得たＰＯＤ未標識抗HBeモノクローナル抗体 20μg/mLを含む50mM ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPS）緩衝液（ｐＨ7.5）中に浸漬し、４℃で一夜静置後、１％ BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5）中に浸漬して、さらに４℃で一夜静置し、抗HBeモノクローナル抗体固定化ボールを作製した。
ポリプロピレンチューブに１％BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5） 200μLを分注し、上記のように調製した抗HBeモノクローナル抗体固定化ボール１個を加えて37℃で７分間反応させた。次いで該ボールを生理食塩液１mLで３回洗浄後、所定のPOD標識抗体溶液200μLを加えて37℃で７分間反応させた。該ボールを 生理食塩液 １ｍLで３回洗浄後、５mMルミノール（和光純薬工業社製）及び0.02％過酸化水素を含む50mMトリス緩衝液（ｐＨ8.5）200μLを加え、化学発光計（ベルトールド社製、オートルマットLB953）にて１秒間の化学発光積算量を測定した。
【００３７】
尚、非特異的吸着防止能(％)は下式１により算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
【式１】
Refボール：非特異的吸着防止剤無添加ＰＯＤ標識抗体溶液中で反応させて 得られたボール
【００３９】
【表１】
表１の結果から、本発明の非特異的吸着防止剤を添加すると、従来から免疫アッセイ用ブロッキング剤として用いられているポリビニルアルコールと比べて明らかに優れた非特異的吸着防止効果が得られることが判る。
【００４１】
実施例２
本発明の非特異的吸着防止剤添加による免疫反応への影響を調べるため、以下のような実験を行った。
先ず、HBe抗原（スクリプス社製）と１％BSAを含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ7.5）を用いて調製したHBe抗原溶液（含有量；０または0.2 U/ｍL）200μLをポリプロピレンチューブに分注し、実施例１の（３）で調製した抗HBeモノクローナル抗体固定化ボール１個を加えて37℃で７分間反応させた。次いで該ボールを生理食塩水１mLで３回洗浄後、１％ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、重量平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）と、実施例１の（１）で調製したPOD標識抗体を2.5μgAb/mL含む50mM MOPS緩衝液（ｐＨ6.5）200μLを加えて37℃で７分間反応させた。該ボールを生理食塩水１mLで３回洗浄後、５mMルミノール（和光純薬工業社製）及び0.02％過酸化水素水を含む50mM トリス緩衝液（ｐＨ8.5）200μLを加え、化学発光計（ベルトールド社製、オートルマットLB953）にて１秒間の化学発光積算量を測定した。結果を表２に示す。
【００４２】
また、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を下式２により算出した。その結果も表２に併せて示す。
【００４３】
【式２】
【表２】
表２の結果から、本発明の非特異的吸着防止剤の添加によって、免疫反応に影響を与えず、Ｓ／Ｎ比が良くなることが判る。
【００４６】
実施例３
(1)金コロイド標識抗体溶液の調製)
常法により自製した抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（蛋白濃度：20mg/ml）10μｌと、フレンス（Frens）の方法［Nature Phys.Sci.,vol.241,20-22(1973)］で調製し0.1M K2CO3でpHを6.5に調整した金コロイド溶液（金コロイドの平均粒経：30nm。ＯＤ520nm＝1.2）6mlとを混合し1時間反応させた後、反応液に分散剤としてポリエチレングリコール（シグマ社製。商品名：カーボワックス20M）を終濃度で0.05％となるように添加した。その後、反応液を15000rpm×20分で遠心分離処理し、上清を除き、得られた残渣を50mMリン酸緩衝液(pH7.4) 3mlに懸濁し、金コロイド標識抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液を調製した。
【００４７】
(2)ブロッキング効果の検討
上記(1)で得た金コロイド標識抗体溶液に、本発明の非特異的吸着防止剤である、分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物［シグマアルドリッチ社製、分子量；１５０００〜２００００、２分子のポリエチレングリコール（分子量７０００〜９０００）をビスフェノールＡグリシジルエーテルで結合したもの］又はポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）を１%添加したものを、ブロッキング処理していないニトロセルロース膜(ミリポア社製。10mm×6mm)の中央に2μl 滴下して乾燥させた後、当該膜の下端を血清に浸漬して展開した場合の金コロイド標識抗体の展開状態を調べた。
【００４８】
その結果、何れの非特異的吸着防止剤を用いた場合も、金コロイド標識抗体溶液を滴下乾燥した位置での金コロイド標識抗体の残存は見られず、ニトロセルロース膜に於いても非特異的吸着防止効果を奏することが判った。
【００４９】
実施例４
(1)判定部位を有する展開膜の調製
40mm×6mmのニトロセルロース膜（ミリポア社製）の端から20mmの位置に、自製した抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（蛋白濃度：20mg/ml）0.5μLを線状に塗布後、乾燥して固定化して、判定部を有する展開膜を調製した。
【００５０】
(2)金コロイド標識抗体含浸膜の調製
実施例３の(1)で調製した金コロイド標識抗HBs抗原モノクロ−ナル抗体溶液に、ポリ（ビニルピロリドン／ビニルアセテート）（シグマアルドリッチ社製、平均分子量；５００００、ビニルピロリドンユニット：ビニルアセテートユニット＝６０：４０）を0.5又は１%添加したものに不織布(商品名：ロープロソーブ。日本ポール（株）製。)に含浸後、乾燥して金コロイド標識抗体含浸膜を調製した。
【００５１】
(3)試験用具の組立
塩化ビニルシート60mm×6mmの中央部に展開膜を両面テープで接着し、次いで、当該展開膜の一端に10mm×6mmの金コロイド標識抗体含浸膜を展開膜と1〜2mm重なるように両面テープで接着した。また、金コロイド標識抗体含浸膜の展開膜と接していない端に10mm×6mmの不織布(商品名；ロープロソーブ。日本ポール（株）製)を金コロイド標識抗体含浸膜と1〜2mm重なるように両面テープで接着して検体吸収部とした。更に、展開膜の金コロイド標識抗体含浸膜と接していない端に10mm×6mmの濾紙を両面テープで接着して試験用具とした。
【００５２】
(4)測定
HBs抗原を含まない陰性血清に既知濃度のHBs抗原を添加して0-80ng/mlの標準を作製した。これらの標準を上記試験用具の検体吸収部に50μl滴下した後、検体の展開に要する時間経過後、判定部の着色を観察した。
結果を表３に示す。尚、表３中、＋は判定部に着色が見られたことを表し、−は判定部に着色が見られなかったことを示す。
【００５３】
【表３】
表３の結果から、HBs抗原含有量が０の試料を用いた場合には判定部に着色が見られず、HBs抗原含有試料を用いると判定部に着色が見られることが判る。即ち、本発明の非特異的吸着防止剤は、イムノクロマト法に於いても有効に働き、金コロイド標識抗体の非特異的吸着を防止し得ることが判る。
【００５５】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は免疫反応に影響を与えず、遊離の抗原、抗体又はこれらの標識体の抗原或は抗体結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止する非特異的吸着防止剤並びに非特異的吸着防止方法を提供するものであり、本発明の方法によれば、免疫反応系に本発明の非特異的吸着防止剤を存在させるだけで結合固相や反応容器への非特異的吸着を防止することができ、高精度で高感度な分析が可能となる。
Claims (6)
- 分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物、ビニルピロリドン及びビニルアセテートの共重合体並びにポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物からなる、抗体又は抗原の非特異的吸着防止剤。
- 分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物、ビニルピロリドン及びビニルアセテートの共重合体並びにポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物を抗体又は抗原を含有する溶液中に共存させることを特徴とする、抗原又は抗体の非特異的吸着防止方法。
- 分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物、ビニルピロリドン及びビニルアセテートの共重合体並びにポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含有する溶液を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法。
- 分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物、ビニルピロリドン及びビニルアセテートの共重合体並びにポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる抗体又は抗原組成物。
- 抗体又は抗原組成物が溶液である、請求項４に記載の組成物。
- 分子中にスペーサーとしてビスフェノールＡグリシジルエーテルを導入してなるポリエチレングリコール化合物、ビニルピロリドン及びビニルアセテートの共重合体並びにポリエチレングリコールテトラヒドロフルフリルエーテルから選ばれた少なくとも１つの水溶性化合物と、抗体又は抗原とを含んでなる免疫学的測定用試薬。
【０００１】
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