JP4098364B2 - Silicon-containing biocompatible membrane - Google Patents

Description

この反応において、グルコースはグルコースオキシダーゼ（GOX）の存在下で酸素と反応してグルコノラクトン及び過酸化水素を生成する。グルコノラクトンは更に水と反応してラクトン環が加水分解され、そしてグルコン酸が生成する。H₂O₂は下記に示す通りに電気化学的に反応する（式２）：

センサー／ポテンシオスタット（Ptブラック電極での＋0.5から＋0.7Ｖに至る酸化）により測定される電流はH₂O₂の酸化により生成される２個の電子に基づく。他方、電流計測定による酸素の減少を測定することができる（Ptブラック電極での−0.5から−１Ｖに至る還元）。
式Ｉの理論化学は移植用グルコースセンサーに関わるいくつかの問題を明示している。式Ｉに関して過剰な酸素があると、H₂O₂は酵素において反応するグルコースの量に化学理論量的に相関する。この場合、究極的な電流もこの酵素と反応するグルコースの量に比例する。全てのグルコースが酵素と反応するための酸素が不十分なとき、電流はグルコース濃度にではなく、酵素濃度に比例するであろう。センサーが真のグルコースセンサーとなるには、グルコースは制約された試薬でなくてはならない。即ち、Ｏ₂濃度はあらゆる潜在的なグルコース濃度に対して過剰でなくてはならない。いくつかの条件のため、この要件は容易に達成されない。例えば、糖尿病患者の身体のグルコース濃度は２〜30mM（１リットル当りのミリモル数、又は36〜540 mg／dl）で変動し、一方組織内の典型的な酸素濃度は0.02〜0.2mMである（Fisherら、Biomed.Biochem.Acta. 48: 965-971 (1989) 参照）。身体におけるこの割合は、センサーがミカエリス・メンテン制約方式で作動し、そしてグルコース濃度のわずかな変化に対して非常に感度が悪くなるであろうことを意味する。この問題は「酸素不足問題」と称されている。従って、GOX膜内のＯ₂を増大させるもしくはグルコース濃度を低下させるように方法又はシステムを考案する、又はＯ₂を利用しないセンサーを考案しなくてはならない。
この不足問題を解決するためのいくつかのアプローチが過去において試まれている。最も単純なアプローチは完全にＯ₂透過性であり、グルコース透過性ではない膜を作製し、そしてグルコースが通過できるほどの小さな孔をそれに機械的に設けることである。ここでの示差的な透過性は小孔面積、対、総膜面積の比により決定される。この方法に関する２つの重要な問題は第一に小孔を再現よく設けることの困難さ、そして第二に且つより重大なことには、Ｏ₂透過性は膜の厚みに著しく相関し、しかも厚みは大量生産ではコントロールしにくいことにある。微孔性膜（引用することで本明細書に組入れるYoungらの米国特許第4,759,828号）も一定の成功をもって試まれている。開孔膜手法及び微孔性膜手法の双方に関わる別の問題は、センサー電極及び酵素層が体液にさらされることにある。体液はセンサーの感度の低下を招く電極を被覆するタンパク質及びセンサーの活性酵素を消化又は分解してしまう酵素（プロテアーゼ）を含む。
酸素不足問題についての別の手法はGoughにより発表されている（引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,484,987号）。この手法は、疎水性膜に埋没した異なる親水性材料膜ドメインの組合せ膜を利用する。この場合、この膜は均質ではなく、従って製造の再現性が困難である。この膜の物理特性も損われる。同様に、Gough（引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,890,620号）は「二次元」システムを発表しており、それではグルコース拡散は一方の次元に制約され、他方、酸素拡散は両次元に由来する。このセンサーは非常に複雑であり、そして大量スケール生産は困難と予測される。
いくつかのその他のグループは比較的疎水性なポリウレタンの均質膜を利用しており、そして良好な結果を報告している。例えば、Shanら、Biosensors and Bioelectronics, 6: 401-406 (1991); Bindraら、Anal. Chem. 63: 1692 (1991); 及びSchichiriら、Horm.Metab.Resl.Suppl.Ser., 20: 17 (1988) を参照のこと。しかしながら、これらの膜による古典的な拡散実験において、グルコース拡散は非常にわずかである。グルコース拡散するこれらのポリウレタン膜の能力は、膜として適用したときのこれらの材料における微小な亀裂又は微小な孔によるものと信じられている。
更にその他の者は、酸素不足問題を解消するために親水性及び疎水性領域を双方をもつ均質膜を開発している。それぞれ引用することで本明細書に組入れるAllenら、米国特許第5,284,140号及び第5,322,063号を参照のこと。これらの特許にはそれぞれアクリルシステム及びポリウレタンシステムが記載されている。双方の膜は酸素及びグルコースの透過の制約された制御を供する親水性及び疎水性成分を分子内に有する。
安定で高感度な酵素バイオセンサーの鍵はセンサーの出力が注目の被検物によってのみ制約され、任意の補助基質又は反応速度論的に制御されたパラメーター、例えば拡散によっては制約されないことにある。バイオセンサーの出力電流（式２）を最大にするため、酸素拡散は、反応表層での酸素過剰を維持しながら最大限とすべきである。皮下組織内のＯ₂の正常な濃度はかなり低いため、Ｏ₂拡散係数を最大にすることが所望される。
上記の論文に記載の膜システムはバイオセンサーの作動電極に対するグルコース拡散量を減少させることにより酸素不足問題を解決することしか試みていない。物理的安定性及び強度、支持体への接着性、加工性（妥当な量及び妥当な値段で合成／製造される能力）、生体適合性、レーザー刃（又はその他の大量スケール加工法）により切断される能力、並びにセンサー上に載っている酵素との適合性を有する膜のニーズがある。本発明はこれらのニーズを満たし、しかしその他の関連の利点を供する。
発明の概要
本発明は生体適合性であり、且つバイオセンサーをコーティングするのに適する組成物を提供する。この組成物は膜へと形成せしめることができ、且つ：
（ａ）ジイソシアネート、
（ｂ）親水性ジオール、親水性ジアミン又はそれらの組合せである親水性ポリマー、
（ｃ）鎖末端において官能基を有するシロキサンポリマー、及び任意的に、
（ｄ）連鎖延長剤、
より調製されうるポリマーである。
上記の成分から調製した膜は約１×10^-9 cm²／sec〜約200×10^-9 cm²／secのグルコース拡散係数、約25％以上の吸水性、及び約５〜約200のＤ_oxygen／Ｄ_glucose比を有するであろう。
一定の好適な態様において、シロキサンポリマー内に存在する官能基はアミノ、ヒドロキシル又はカルボン酸、より好ましくはアミノ又はヒドロキシル基である。その他の好適な態様において、この親水性ポリマーはポリ（エチレン）グリコールであり、それはPEG 200，PEG 400又はPEG 600とする。別のその他の好適な態様において、このジイソシアネートはイソフォロンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート又は４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）であり、そして連鎖延長剤はアルキレンジオール、アルキレンジアミン、アミノアルカノール又はそれらの組合せである。
特に好適な態様において、ジイソシアネートは１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートであり、親水性ポリマーはPEG 400又はPEG 600であり、且つ約17〜約32モル％で存在し（全ての反応体に対して）、そしてシロキサンポリマーは約2000〜約4000の分子量を有し、且つ約17〜約32モル％の量で存在する（全ての反応体に対して）アミノプロピルポリシロキサンである。
本発明は更に被検物、好ましくはグルコースと酸素との反応を測定するための移植用バイオセンサーを提供し、このバイオセンサーは上記の生体適合性膜を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリウレタン又はポリユレアのそれぞれを供するジイソシアネートとポリ（アルキレン）グリコール又はジアミノポリ（アルキレンオキシド）との重合反応を示す。
図２及び３は下記の膜を形成するうえで有用な一定の脂肪族及び芳香族ジイソシアネートの構造を提供する。
図４は下記のポリマーに利用されるポリ（アルキレン）グルコール及びジアミノポリ（アルキレンオキシド）を含むいくつかの親水性ポリマーの構造を提供する。
図５は下記の膜を形成するうえで有用な一定のシリコーンの構造を提供する。
図６及び７は本発明において利用するいくつかのシリコーンポリマーの調製のための合成手順を提供する。
図８は本組成物において有用ないくつかの連鎖延長剤の構造を提供する。これには脂肪族ジオール、ジアミン及びアルカノールアミンが含まれ、そして更にはいくつかの芳香族ジオール及びジアミンが含まれる。
図９は本発明に従って調製したポリユレア組成物の赤外線スペクトルである。
図10は本発明の膜でコーティングされうるグルコースセンサーの一部を示す。図10Ａは本発明のポリマー組成物で覆われた電極を有するグルコースセンサーの模式上面図である。図10Ｂは本発明の酵素及びポリマー組成物の層で覆われたセンサーの作動電極の側面図である。
図11は時間の関数としての様々なグルコース溶液内でのセンサーアウトプットを示すグラフである。
発明の詳細な説明
下記の略語を本明細書において使用する：dl、デシリットル；DEG、ジエチレングリコール；DMF、ジメチルホルムアミド；PBS、リン酸緩衝食塩水；THF、テトラヒドロフラン；DI、脱イオン；PEG、ポリ（エチレン）グリコール；HDI、１，６−ヘキサンジイソシアネート（１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート）；TMDI、２，２，４，４−テトラメチル−１，６−ヘキサンジイソシアネート及び２，４，４−トリメチル−１，６−ヘキサンジイソシアネート；CHDI、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート；BDI、１，４−シクロヘキサンビス（メチレンイソシアネート）；H₆XDI、１，３−シクロヘキサンビス（メチレンイソシアネート）又はヘキサヒドロメタキシレンジイソシアネート；IPDI、イソフォロンジイソシアネート；及びH₁₂MDI、４，４′−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート。
本明細書において利用する語「ポリウレタン／ポリユレア」はウレタン連結、ユレア連結又はそれらの組合せを含むポリマーを意味する。典型的には、かかるポリマーはジイソシアネートをアルコール及び／又はアミンと組合せることにより形成される。例えば、イソフォロンジイソシアネートをPEG 600及びアミノプロピルポリシロキサンと重合条件下で組合せると、ウレタン（カルバメート）連結及びユレア連結の双方を有するポリウレタン／ポリユレア組成物が供される。
生体適合性膜
前述の通り、in vivo用途を意図するグルコースセンサーのための要件は感知素子付近での酸素の供給が枯渇しないことにある。更に、グルコースはセンサーに一定の割合で拡散すべきである。このことは、グルコースセンサー膜が酸素に対する極端に高い透過性を有さなくてはならないことを意味するのではない。その代わり、この膜はセンサーに対する酸素及びグルコースの拡散の相対速度を、酸素の局所濃度が枯渇しないようにコントロールすべきである。更に、in vivo用途を意図するグルコースセンサーは身体との生体適合性も有さなくてはならず、そしてそれらはセンサーを妨害しうる酸及びタンパク質が存在しうる環境において機能しなくてはならない。即ち、かかるセンサーにおいて利用される酵素は分解又は変性から保護されていなくてはならず、しかもかかるセンサーは経時的にセンサー又はその精度を劣化する分子から保護されていなくてはならない。
一の観点において、本発明は下記の反応混合物から形成された生体適合性膜を提供する：
（ａ）前記混合物中の反応体の約50モル％を占めるジイソシアネート；
（ｂ）親水性ジオール、親水性ジアミン及びそれらの組合せより成る群から選ばれる親水性ポリマー；並びに
（ｃ）鎖末端に官能基を有するシリコーンポリマー。
任意的に、この反応混合物は連鎖延長剤を含むであろう。上記の成分の重合混合物を用いて形成した膜は約１〜約200×10^-9 cm²／secのグルコース拡散係数、25％以上の吸水性、及び約５〜約200のＤ_oxygen／Ｄ_glucose比を有するであろう。
成分の選定に依存して、当該生体適合性膜の形成において使用するポリマーはポリユレア、ポリウレタン又はポリウレタン／ポリユレアの組合せであろう。図１は本発明の組成物を供するいくつかの重合反応を示す。
膜成分
本発明の均質膜は生物学的に許容されるポリマーであってその疎水性／親水性バランスが、酸素の拡散係数、対、グルコースのそれの比をコントロールする、且つin vivo用途を意図する電気化学グルコースセンサーの要件を企案するよう広域にわたって変えてよい。かかる膜は上記のモノマーとポリマーとの重合により慣用の方法によって調製できうる。得られるポリマーはアセトン又はエタノールの如き溶媒に可溶性であり、そして浸漬、スプレー又はスピンコーティングにより溶液から膜として形成されうる。
本発明のこの観点において有用なジイソシアネートは生体適合性ポリウレタンの調製において典型的に利用されているものである。かかるジイソシアネートはSzycher, SEMINAR ON ADVANCES IN MEDICAL GRADE POLYURETHANES, Technomic Publishing, (1995) に詳細されており、そして芳香族及び脂肪族ジイソシアネートの双方が含まれる（図２及び３参照）。適当な芳香族ジイソシアネートの例には、トルエンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタンジイソシアネート、３，３′−ジメチル−４，４′−ビフェニルジイソシアネート、ナフタレンジイソアネート及びパラフェニレンジイソシアネートが含まれる。適当な脂肪族ジイソシアネートには、例えば、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（HDI）、トリメチルヘキサメチレンジイソアネート（TMDI）、trans−１，４−シクロヘキサンジイソシアネート（CHDI）、１，４−シクロヘキサンビス（メチレンイソシアネート）（BDI）、１，３−シクロヘキサンビス（メチレンイソシアネート）（H₆XDI）、イソフォロンジイソシアネート（IPDI）及び４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）（H₁₂MDI）が含まれる。好適な態様において、このジイソシアネートはイソフォロンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジシイソアネート又は４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアソート）である。いくつかのこれらのジイソシアネートは商業的起源、例えばAldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin, USA) より入手可能であるか、又は論文の手順を利用して標準の合成方法により容易に調製できる。
本組成物のための反応混合物において利用されるジイソシアネートの量は典型的には残りの反応体の組合せに対して約50モル％とする。より詳しくは、本組成物の調製において利用されるジイソシアネートの量は残りの反応体のヒドロキシル基又はアミノ基との反応に必要なNCO基の約100％以上を供するのに十分であろう。例えば、ｘモルのジイソシアネートを利用して調製するポリマーはαモルの親水性ポリマー（ジオール、ジアミン又は組合せ）、ｂモルの官能化末端を有するシリコーンポリマー、及びｃモルの連鎖延長剤を利用する（ここでｘ＝ａ＋ｂ＋ｃであり、ｃは０であってよい）。
本明細書に記載の生体適合性膜の調製において利用する第二の反応体は親水性ポリマーである。この親水性ポリマーは親水性ジオール、親水性ジアミン又はそれらの組合せであってよい。親水性ジオールはポリ（アルキレン）グリコール、ポリエステルを基礎とするポリオール、又はポリカーボネートポリオールであってよい（図４参照）。本明細書で用いる語「ポリ（アルキレン）グリコール」とは、低級アルキレングリコールのポリマー、例えばポリ（エチレン）グリコール、ポリ（プロピレン）グリコール及びポリテトラメチレンエーテルグリコール（PTMEG）を意味する。「ポリエステルを基礎とするポリオール」なる語は図４に示すポリマーであって、Ｒ基が低級アルキレン基、例えばエチレン、１，３−プロピレン、１，２−プロピレン、１，４−ブチレン、２，２−ジメチル−１，３−プロピレン等であるものを意味する。当業者は当該ポリマージエステル部が図示の６炭素の二酸から変えてもよいことも理解するであろう。例えば、図４はアジピン酸成分を示しているが、本発明はコハク酸エステル、グルタル酸エステル等の利用も考慮している。「ポリカーボネートポリオール」なる語は鎖末端にヒドロキシル基を有し、そしてポリマー鎖内に炭酸基を有するようなポリマーを意味する（図４参照）。ポリマーのアルキル部は典型的にはＣ２〜Ｃ４脂肪族基より成るか、又はある態様においては、より長い鎖脂肪族基、脂環式基又は芳香族基より成ってよい。「親水性ジアミン」なる語は、任意の上記の親水性ジオールであって、末端ヒドロキシル基が反応性アミン基により置き換えられているもの、又は末端ヒドロキシル基が末端アミン基を有する延長鎖ができるように誘導化されたものを意味する。例えば、好適な親水性ジアミンは「ジアミノポリ（オキシアルキレン）」であって末端ヒドロキシル基がアミノ基で置き換えられているポリ（アルキレン）グリコールである。「ジアミノポリ（オキシアルキレン）」なる語は鎖末端にアミノアルキルエーテル基を有するポリ（アルキレン）グリコールをも意味する。適当なジアミノポリ（オキシアルキレン）の例はポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）である。上記のポリマーのいくつかはAldrich Chemical Companyより入手できる。他方、論文の方法をその合成のために利用してよい。
本組成物において利用する親水性ポリマーの量は典型的には使用するジイソシアネートに対して約10〜約80モル％であろう。好ましくは、その量はジイソシアネートに対して約20〜約60モル％である。少なめの親水性ポリマーを使用する場合、連鎖延長剤を含ませることが好ましい（下記参照）。
本発明において有用なシリコーンポリマーは典型的には線形であり、優れた酸素透過性を有し、そして本質的にグルコース非透過性である。好ましくは、シリコーンポリマーは２個の反応性官能基を有する（即ち、二価）ポリジメチルシロキサンである。官能基は例えばヒドロキシル基、アミノ基又はカルボン酸基であるが、好ましくはヒドロキシル基又はアミノ基である（図５参照）。ある態様において、シリコーンポリマーの組合せをヒドロキシル基を含んで成る第一領域及びアミノ基を含んで成る第二領域に使用してよい。好ましくは、これらの官能基はシリコーンポリマーの鎖末端に位置する。いくつかの適当なシリコーンポリマーがDow Chemical Company (Midland, Michigan, USA) 及びGeneral Electric Company (Silicones Division, Schenectady, New York, USA) の如き起源より商業的に入手できる。更なるその他は商業的に入手できるシロキサン（United Chemical Technologies, Bristol, Pennsylvania, USA）で出発し、図６及び７に示すような一般的な合成方法により調製できうる。本発明における利用のため、シリコーンポリマーは好ましくは約400〜約10,000の分子量を有するもの、より好ましくは約2000〜約4000の分子量を有するものであろう。反応混合物の中に組込むシリコーンポリマーの量は生体適合性膜が由来する得られるポリマーの所望の特性に依存するであろう。低めのグルコース透過性が所望される組成物にとっては、多めの量のシリコーンポリマーを使用してよい。他方、より高めのグルコース透過率が所望される組成物にとっては、少なめの量のシリコーンポリマーを利用してよい。典型的には、グルコースセンサーのため、シリコーンポリマーの量はジイソシアネートに対して10〜90モル％であろう。好ましくは、その量はジイソシアネートに対して約20〜60モル％とする。
一群の態様において、生体適合性膜の調製のための反応混合物は脂肪族もしくは芳香族ジオール、脂肪族もしくは芳香族ジアミン、アルカノールアミン又はそれらの組合せである連鎖延長剤を含むであろう（図８参照）。適当な脂肪族連鎖延長剤の例には、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、エタノールアミン、エチレンジアミン、ブタンジアミン、１，４−シクロヘキサンジメタノールが含まれる。芳香族連鎖延長剤には、例えばpara−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）ベンゼン、meta−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）ベンゼン、Ethacure 100（商標）（２，４−ジアミノ−３，５−ジエチルトルエンの２種類の異性体の混合物）、３，３′−ジクロロ−４，４′−ジアミノジフェニルメタン、Polacure（商標）740M（トリメチレングリコールビス（para−アミノベンゾエート）エステル）及びメチレンジアニリンが含まれる。一又は複数種の上記の連鎖延長剤の組込みは典型的には更に強い物理強度を有するが、ポリマーのグルコース透過率が実質的に上昇していない生体適合性膜を供する。好ましくは、連鎖延長剤は少なめの量の親水性ポリマー（即ち、10〜40モル％）を使用したときに利用する。特に好適な組成物において、この連鎖延長剤はジエチレングリコールとし、それはジイソシアネートに対して約40〜60モル％で存在させる。
膜の調製
上記の反応体の重合はバルク又は溶媒方式で実施してよい。触媒の利用が好ましいが、必須ではない。適当な触媒にはジブチル錫ビス（２−エチレンヘキサノエート）、ジブチル錫ジアセテート、トリエチルアミン及びそれらの組合せが含まれる。好ましくは、ジブチル錫ビス（２−エチルヘキサノエート）を触媒として使用する。バルク重合は典型的には約25℃（室温）〜約50℃で実施し、反応体の適当な混合を確保する。反応体を混合すると典型的には発熱反応が起こり、温度は約90〜120℃へと上昇する。一次発熱反応の後、反応フラスコを75℃〜125℃で加熱してよく、90℃〜100℃が好適な温度範囲である。加熱は１〜２時間通常実施される。溶液重合は同じように実施してよい。溶液重合のために適当な溶媒にはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ハロゲン化溶媒、例えば１，２，３−トリクロロプロパン及びケトン、例えば４−メチル−２−ペンタノンが含まれる。好ましくは、THFを溶媒として用いる。重合を溶媒の中で実施する場合、反応混合物の加熱は典型的には３〜４時間実施する。
バルク重合により調製するポリマーを典型的にはジメチルホルムアミドの中に溶かし、そして水から沈殿させる。溶媒の中で調製され、水と混和性でないポリマーは溶媒の真空除去により水から単離できうる。これらのポリマーを次にジメチルホルムアミドの中に溶かし、そして水から沈殿させる。水でよく洗った後、ポリマーを真空で約50℃で乾かし、定常重量にしてよい。
膜の調製は乾燥ポリマーを適当な溶媒に溶かし、そしてガラスプレート上にフィルムを流延させることにより完了し得る。流延のために適する溶媒の選定は典型的には特定のポリマー及び溶媒の揮発性に依存するであろう。好ましくは、この溶媒はTHF，CHCl₃，CH₂Cl₂，DMF又はそれらの組合せとする。より好ましくは、この溶媒はTHF又はDMF／CH₂Cl₂（２／98容量％）とする。溶媒をフィルムから除去した後、得られる膜を完全に水和させ、その厚みを測定し、そして吸水性を決定する。本発明に有用な膜は典型的には約20〜約100重量％、好ましくは30〜約90重量％、そしてより好ましくは40〜約80重量％であろう。
酸素及びグルコース拡散係数も本発明の膜のために測定されうる。拡散係数を測定するための方法は当業者に公知であり、その例を以下に示す。本明細書に記載の生体適合性膜は好ましくは約0.1×10^-6cm²／sec〜約2.0×10^-6cm²／secの酸素拡散係数（Ｄ_oxygen）及び約１×10^-9cm²／sec〜約500×10^-9cm²／secのグルコース拡散係数（Ｄ_glucose）を有するであろう。より好ましくは、グルコース拡散係数は約10×10^-9cm²／sec〜約200×10^-9cm²／secである。
上記の説明から、当業者にとって本発明の基礎となる発見が生体適合性膜の形成における珪素含有ポリマー、例えばシロキサンの利用にあることが明らかであろう。珪素含有ポリマーは、被検物及び反応性物質（例えば酸素及びグルコース）の移動が各成分の量を変えることによりコントロールできうる膜の調製のため、親水性ポリマーと一緒に（共有結合されて）使用される。このような成分から製造した膜は均質であり、そして数多くのバイオセンサー及び皮下移植のために考案された物品のコーティングのために有用である。膜コーティング化バイオセンサー
グルコースと酸素との反応を及ぼすのに利用される如きグルコースセンサーは公知であり、そしてその作業は当業界の技術の範囲に属する。例えば開示内容を本明細書に引用して組込む米国特許第5,165,407、4,890,620、5,390,671及び5,391,250号を参照のこと。本発明はバイオセンサーの形状ではなく、センサー素子を包被又は封入するための本発明の膜の利用に依存する。
詳しくは、本発明の生体適合性膜は様々なバイオセンサーに利用でき、それは感知素子に対する被検物／反応体の拡散をコントロールするのに有利である。かかる様々なバイオセンサーは当業界公知である。例えば、糖尿病のグルコース濃度をモニターするためのその他のセンサーはShichiri，ら：「In Vivo Characteristics of Needle-Type Glucose Sensor-Measurements of Subcutaneous Glucose Concentrations in Human Volunteers,」Horm.Metab.Res., Suppl.Ser. 20: 17-20 (1988); Bruckel,ら：「In Vivo Measurement of Subcutaneous Glucose Concentrations with an Enzymatic Glucose Sensor and a Wick Method,」Klin.Wochenschr. 67: 491-495 (1989); 及びPickup，ら：「In Vivo Molecular Sensing in Diabetes Mellitus: An Implantable Glucose Sensor with Direct Electron Transfer,」Diabetologia 32: 213-217 (1989)に記載されている。
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
実施例
本実施例に使用する材料は下記の起源より入手した：イソフォロンジイソシアネート
一般手法
（ａ）膜調製
膜はフィルムを適当な溶媒からガラスプレート上に、平行アームGardnerナイフ（Gardner Labs）を用いて流延することにより調製した。選定の溶媒はポリマーの特殊な化学構造に依存するであろう。典型的には、THF又はDMF／CH₂Cl₂（２／98容量％）を使用するが、クロロホルムを、容易に揮発するため、有用である。溶媒の除去後、乾燥膜を脱イオン水で30〜60分水和させる。次いで膜を除去し、そしてMylar（商標）支持シートに移す。ウェットフィルム厚みを支持体から外す前にマイクロメーターで測定した。フィルムを既知の厚みの濾過膜の上にも溶液から流延した。下記の測定のため、膜材料は濾過膜の孔を完全にふさぎ、そして濾過媒体の厚みは膜の厚みであると仮定した。
（ｂ）拡散定数
拡散定数は37℃に維持した標準透過性セル（Crown Glass Co., Inc.）において、Fick’sの関係
Ｊ＝−DdC／dx
（ここでＪは総線束、Ｄは注目の被検物の拡散定数、そしてdC／dxは膜を横断する濃度勾配である）を利用して測定した。拡散係数は注目の被検物及びそれが拡散する材料の双方の物理特性である。即ち、Ｄは評価するシステムの特性である。
酸素拡散定数（Do）は、膜を37℃で維持した２片の拡散セルの間の２個のゴムガスケットで固定し、そしてこの２片を結合させることにより測定した。セルの各側にはリン酸緩衝食塩水（PBS、0.15ＭのNaCl、0.05Ｍのリン酸塩、pH 7.4）を満たした。片側はHPLC級ヘリウムで飽和にし、そして他方の側は室内空気（20％のＯ₂と仮定）で飽和にした。較正済酸素電極（Microelectrodes, Inc.）を各セルに入れた。酸素電極アウトプットをマイクロコンピューターコントロール型データー獲得システムにつなぎ、そして双方のセルに由来する酸素濃度を時間の関数として記録した。濃度、対、時間の曲線をプロットし、そして拡散係数を曲線全体を使って計算した。曲線フィットは一般に0.95より大きい相関係数（Ｒ²）を有した。
グルコース拡散定数（Da）は上記の通りに測定したが、ただしセルの片方には400mg／dlのグルコースを含むリン酸緩衝食塩水で満たした。セルの各片のグルコース濃度を平衡が達成されるまでYSIグルコース分析器を用いて５分置きに測定した。上記の通りにして、濃度、対、時間の曲線をプロットし、そして拡散係数を計算した。
（ｃ）吸水性
吸水性は重力的に、室温にて、厚み0.5mmより薄いフィルム上で測定した。流延用溶媒の蒸発後、フィルムを50℃で真空にて定常重量となるまで乾かし、秤量し、脱イオン水に24時間浸し、取り出し、そして濾紙でぬぐい、そして秤量した。％吸水性を次式から決定した：
％吸水性＝（Ww−Wd）／Wd×100
（ここでWwは膨潤フィルムの重量であり、そしてWdは乾燥フィルムの重量である）。
例１
本例はイソフォロンジイソシアネート、PEG 600、ジエチレングリコール及びアミノプロピル末端化ポリジメチルシロキサンにより実施するバルク重合法ポリマー形成を例示する。
イソフォロンジイソシアネート（4.44ｇ、20mmol、100mol％）をモレキュラーシーブで乾かし、そして窒素パージライン及び還流コンデンサーの付いた100mlの丸底フラスコに移した。PEG 600（2.40ｇ、4.0mmol、20mol％）、ジエチレングリコール（1.06ｇ、10mmol、50mol％）及びアミノプロピル末端化ポリジメチルシロキサン（15ｇ、6.0mmol、30mol％、2500平均分子量を基礎）をフラスコに加える。加熱用マントルを用いて50℃の温度となるまで加熱し始めた。ジブチル錫ビス（２−エチルヘキサノエート）（15mg）を加え、そして温度を約95℃に上げた。溶液を65℃の温度で４hr連続撹拌し、その間に混合物の粘度は上昇しはじめた。得られるポリマーを50mlの高温THFに溶かし、そしてさました。冷却後、その溶液を５ｌの撹拌DI水に注ぎ入れた。沈殿ポリマーを断片にちぎり、そして定常重量となるまで50℃で乾燥した。
例２
本例は１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、PEG 200及びアミノプロピル末端化ポリジメチルシロキサンを用いる溶液重合方法を例示する。
乾燥した１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート（1.34ｇ、８mmol、100mol％）を20mlのドライTHFを含む100mlの三つ口フラスコに加えた。PEG 200（0.8ｇ、4.0mmol、500mol％）を撹拌しながら加え、次いでアミノプロピル末端化ポリジメチルシロキサン（10ｇ、4.0mmol、50mol％）を加えた。得られる溶液を50℃に温め、そしてジブチル錫（２−エチルヘキサノエート）（約15mg）を加えた。83℃への一次温度上昇の後、この混合物を温め、そして70℃に12hr保ち、その間に混合物は非常に粘稠となりはじめた。冷却後、この混合物をすばやく撹拌したDI水に注ぎ入れた。沈殿ポリマーを集め、DI水で洗い（３回）、小片にちぎり、そして定常重量となるまで50℃で乾かした。
膜を前の通りに調製した。製品の赤外線スペクトルを得、そして図９に再現し、予測の吸収バンドを示している（cm^-1）。
例３
本例は代表的な膜の組成及び特性を示す。
表１は膜へと形成する代表的なポリマーの５通りの組成を示す。ポリマーは溶液重合により調製した。

表２は上記のポリマーの所定の物理及び化学特性を示す。

例４
本例は本発明に従って構築した膜コーティング化バイオセンサーの評価を示す。
上記で３と表示したポリマーから調製した膜は優れた機械特性並びに適度な酸素及びグルコース拡散能を有することが見い出された。膜は図10Ａに示すプロトタイプグルコースセンサーを用いて評価した。図10Ａによると、センサー10はポリマーシート19上に載った対照電極12、作動電極14、カウンター電極16を有するように構築されている。一式の結合パッドがセンサー10を完成させている。図10Ｂに示すように、作動電極14は酵素グルコースオキシダーゼの層20で覆われ、そして電極アレー全体は当該ポリマー３の５重量％のTHF溶液に２回浸漬コーティングすることを介してこのポリマーの層22で覆われている。このセンサーは商業的なポテンシオスタット（BAS装置、図示せず）に接続され、そして作動電極と対照電極との間の＋0.6ボルトの電位で作動する。
グルコース応答を図11に示す。図11に示すように、電極システムの応答は生理学的なグルコース域で直線性をもち、局所的なＯ₂濃度の相対的な独立性を示唆する。試験したその他のポリマーは全て３と表示したポリマーに似た挙動を示し、そしてバイオセンサー用途のための膜として許容された。Field of Invention
The present invention is in the field of polymer chemistry to produce polymers that can be formed into membranes suitable for in vivo applications.
Background of the Invention
A biosensor is a small article that utilizes biological recognition properties for specific analysis of various analytes or biomolecules. Typically, the sensor produces a signal that is quantitatively related to the analyte concentration. In order to achieve a quantitative signal, the recognition molecule or combination of molecules is often anchored to an appropriate transducer that converts the biological recognition phenomenon into a quantitative response.
Various biosensors have been developed for use with a wide variety of analytes. The electronic enzyme biosensor converts the concentration of the analyte into an electrical signal. An immunological biosensor relies on, for example, molecular recognition of an analyte by an antibody. Chemoreceptor biosensor is 10^-9Chemoreceptor arrays such as those of the olfactory or nervous system derived from the small antennae of blue crab (Callinectes sapidus) that detect the presence of amino acids at concentrations as low as M are utilized. For some biosensors, see Bergveld et al., ADVANCES IN BI0SENSORS, Appendix 1, p31-91, edited by Turner and Collson et al., Anal. Chem. 62: 425-437 (1990).
Regardless of the type of biosensor, each functions in vivo and has certain characteristics that provide the correct signal. First, the biosensor element must be compatible with the tissue to which it is attached and must be properly shielded from adjacent tissues so that allergic or toxic effects are not exerted. Furthermore, this sensor should be isolated from the environment to suppress the drift of the generated signal. Finally, the sensor should accurately measure the analyte in the presence of interfering proteins, electrolytes and pharmaceuticals.
The prototype biosensor is an ammeter glucose sensor. There are several reasons for increasing interest in glucose sensors. In health care settings, glucose sensors are useful for monitoring glucose in patients with diabetes mellitus. Furthermore, there is a need for an effective glucose sensor for the development of a closed loop artificial pancreas implanted with an insulin pump. Commercial interest is directed to sensors that can be used to monitor fermentation reactions in the biotechnological field. From a scientific standpoint, interest has arisen from the availability of the very robust enzyme glucose oxidase that can be used to monitor glucose, and the desire to develop model sensors for a wide variety of analytes. Yes.
O as an optional ammeter glucose sensor or auxiliary substrate₂And oxido-reductase enzymes designed for subcutaneous or intravenous applications require both outer and anti-interference membranes. The need for two types of membranes is based on the basic qualitative nature of the sensor and the environment in which the measurements are made.
The glucose sensor operates according to the following chemical reaction (formula I):

In this reaction, glucose reacts with oxygen in the presence of glucose oxidase (GOX) to produce gluconolactone and hydrogen peroxide. Gluconolactone further reacts with water to hydrolyze the lactone ring and produce gluconic acid. H₂O₂Reacts electrochemically as shown below (Formula 2):

The current measured by the sensor / potentiostat (oxidation from +0.5 to +0.7 V at the Pt black electrode) is H₂O₂Based on two electrons produced by oxidation of On the other hand, the decrease in oxygen by ammeter measurements can be measured (reduction from -0.5 to -1 V at a Pt black electrode).
The theoretical chemistry of Formula I demonstrates several problems associated with implanted glucose sensors. If there is an excess of oxygen with respect to Formula I, H₂O₂Is stoichiometrically correlated to the amount of glucose that reacts in the enzyme. In this case, the ultimate current is also proportional to the amount of glucose that reacts with the enzyme. When there is insufficient oxygen for all glucose to react with the enzyme, the current will be proportional to the enzyme concentration, not to the glucose concentration. In order for the sensor to be a true glucose sensor, glucose must be a constrained reagent. That is, O₂The concentration must be excessive for any potential glucose concentration. Because of some conditions, this requirement is not easily achieved. For example, the glucose concentration in the body of a diabetic patient varies from 2 to 30 mM (mmoles per liter, or 36 to 540 mg / dl), while the typical oxygen concentration in the tissue is 0.02 to 0.2 mM ( Fisher et al., Biomed. Biochem. Acta. 48: 965-971 (1989)). This percentage in the body means that the sensor will operate in a Michaelis-Menten constrained manner and will be very insensitive to slight changes in glucose concentration. This problem is called the “oxygen deficiency problem”. Therefore, O in the GOX membrane₂Devise a method or system to increase or decrease glucose concentration, or O₂We must devise a sensor that does not use the sensor.
Several approaches to solve this shortage problem have been tried in the past. The simplest approach is completely O₂Making a membrane that is permeable and not glucose permeable, and mechanically providing it with pores that are small enough to allow glucose to pass through. The differential permeability here is determined by the ratio of the pore area to the total membrane area. Two important problems with this method are, firstly, the difficulty of reproducibly providing small holes, and secondly, and more importantly, O₂The permeability is remarkably correlated with the thickness of the membrane, and the thickness is difficult to control in mass production. Microporous membranes (Young et al. US Pat. No. 4,759,828, incorporated herein by reference) have also been tried with certain success. Another problem with both the open membrane technique and the microporous membrane technique is that the sensor electrode and enzyme layer are exposed to body fluids. The body fluid contains a protein that coats the electrode that causes a decrease in sensitivity of the sensor and an enzyme (protease) that digests or degrades the active enzyme of the sensor.
Another approach to the oxygen deficiency problem has been published by Gough (US Pat. No. 4,484,987, incorporated herein by reference). This approach utilizes a combination membrane of different hydrophilic material membrane domains embedded in a hydrophobic membrane. In this case, the membrane is not homogeneous and therefore reproducible for production is difficult. The physical properties of the membrane are also impaired. Similarly, Gough (US Pat. No. 4,890,620, which is incorporated herein by reference), presents a “two-dimensional” system in which glucose diffusion is constrained to one dimension, while oxygen diffusion is both dimensions. Derived from. This sensor is very complex and mass scale production is expected to be difficult.
Several other groups have utilized homogeneous membranes of relatively hydrophobic polyurethane and have reported good results. For example, Shan et al., Biosensors and Bioelectronics, 6: 401-406 (1991); Bindra et al., Anal. Chem. 63: 1692 (1991); and Schichiri et al., Horm. Metab. Resl. Suppl. Ser., 20: 17 (1988). However, in classical diffusion experiments with these membranes, glucose diffusion is very slight. The ability of these polyurethane membranes to diffuse glucose is believed to be due to microcracks or micropores in these materials when applied as a membrane.
Still others have developed homogeneous membranes with both hydrophilic and hydrophobic regions to overcome the oxygen deficiency problem. See Allen et al., US Pat. Nos. 5,284,140 and 5,322,063, each incorporated herein by reference. Each of these patents describes an acrylic system and a polyurethane system. Both membranes have hydrophilic and hydrophobic components in the molecule that provide limited control of oxygen and glucose permeation.
The key to a stable and sensitive enzyme biosensor is that the output of the sensor is limited only by the analyte of interest, not by any auxiliary substrate or kinetically controlled parameters such as diffusion. In order to maximize the output current of the biosensor (Equation 2), oxygen diffusion should be maximized while maintaining excess oxygen at the reaction surface. O in the subcutaneous tissue₂The normal concentration of O is so low that O₂It is desirable to maximize the diffusion coefficient.
The membrane system described in the above paper only attempts to solve the oxygen deficiency problem by reducing the amount of glucose diffusion to the working electrode of the biosensor. Cutting by physical stability and strength, adhesion to support, processability (capability to be synthesized / manufactured at reasonable volume and reasonable price), biocompatibility, laser blade (or other mass scale processing method) There is a need for membranes that have the ability to be compatible, as well as compatibility with the enzymes on the sensor. The present invention fulfills these needs, but provides other related advantages.
Summary of the Invention
The present invention provides compositions that are biocompatible and suitable for coating biosensors. The composition can be formed into a film and:
(A) diisocyanate,
(B) a hydrophilic polymer which is a hydrophilic diol, a hydrophilic diamine or a combination thereof,
(C) a siloxane polymer having functional groups at the chain ends, and optionally,
(D) a chain extender,
It is a polymer that can be more prepared.
A membrane prepared from the above ingredients is approximately 1 x 10^-9 cm²/ Sec ~ about 200 × 10^-9 cm²/ Sec glucose diffusion coefficient, greater than about 25% water absorption, and about 5 to about 200 D_oxygen/ D_glucoseWill have a ratio.
In certain preferred embodiments, the functional group present in the siloxane polymer is an amino, hydroxyl or carboxylic acid, more preferably an amino or hydroxyl group. In other preferred embodiments, the hydrophilic polymer is poly (ethylene) glycol, which is PEG 200, PEG 400 or PEG 600. In another other preferred embodiment, the diisocyanate is isophorone diisocyanate, 1,6-hexamethylene diisocyanate or 4,4'-methylene bis (cyclohexyl isocyanate), and the chain extender is an alkylene diol, alkylene diamine, amino alkanol. Or a combination thereof.
In a particularly preferred embodiment, the diisocyanate is 1,6-hexamethylene diisocyanate, the hydrophilic polymer is PEG 400 or PEG 600, and is present in about 17 to about 32 mole percent (for all reactants). And the siloxane polymer is an aminopropyl polysiloxane having a molecular weight of about 2000 to about 4000 and present in an amount of about 17 to about 32 mole percent (relative to all reactants).
The present invention further provides an implantable biosensor for measuring the reaction of an analyte, preferably glucose and oxygen, which biosensor has the biocompatible membrane described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the polymerization reaction of a diisocyanate and a poly (alkylene) glycol or diaminopoly (alkylene oxide), each of which provides polyurethane or polyurea.
Figures 2 and 3 provide certain aliphatic and aromatic diisocyanate structures useful in forming the following films.
FIG. 4 provides the structure of several hydrophilic polymers including poly (alkylene) glycol and diamino poly (alkylene oxide) utilized in the following polymers.
FIG. 5 provides a silicone structure useful in forming the following films.
Figures 6 and 7 provide synthetic procedures for the preparation of several silicone polymers utilized in the present invention.
FIG. 8 provides the structure of several chain extenders useful in the present composition. This includes aliphatic diols, diamines and alkanolamines, and even some aromatic diols and diamines.
FIG. 9 is an infrared spectrum of a polyurea composition prepared according to the present invention.
FIG. 10 shows a portion of a glucose sensor that can be coated with a membrane of the present invention. FIG. 10A is a schematic top view of a glucose sensor having an electrode covered with the polymer composition of the present invention. FIG. 10B is a side view of the working electrode of a sensor covered with a layer of the enzyme and polymer composition of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing sensor output in various glucose solutions as a function of time.
Detailed Description of the Invention
The following abbreviations are used herein: dl, deciliter; DEG, diethylene glycol; DMF, dimethylformamide; PBS, phosphate buffered saline; THF, tetrahydrofuran; DI, deionized; PEG, poly (ethylene) glycol; 1,6-hexane diisocyanate (1,6-hexamethylene diisocyanate); TMDI, 2,2,4,4-tetramethyl-1,6-hexane diisocyanate and 2,4,4-trimethyl-1,6-hexane Diisocyanate; CHDI, 1,4-cyclohexane diisocyanate; BDI, 1,4-cyclohexanebis (methylene isocyanate); H₆XDI, 1,3-cyclohexanebis (methylene isocyanate) or hexahydrometaxylene diisocyanate; IPDI, isophorone diisocyanate; and H₁₂MDI, 4,4'-dicyclohexylmethane diisocyanate.
As used herein, the term “polyurethane / polyurea” means a polymer comprising urethane linkages, urea linkages, or combinations thereof. Typically such polymers are formed by combining diisocyanates with alcohols and / or amines. For example, combining isophorone diisocyanate with PEG 600 and aminopropyl polysiloxane under polymerization conditions provides a polyurethane / polyurea composition having both urethane (carbamate) linkages and urea linkages.
Biocompatible membrane
As mentioned above, a requirement for a glucose sensor intended for in vivo applications is that the supply of oxygen near the sensing element is not depleted. Furthermore, glucose should diffuse into the sensor at a constant rate. This does not mean that the glucose sensor membrane must have an extremely high permeability to oxygen. Instead, the membrane should control the relative rate of oxygen and glucose diffusion to the sensor so that the local concentration of oxygen is not depleted. In addition, glucose sensors intended for in vivo applications must also be biocompatible with the body and they must function in an environment where acids and proteins can exist that can interfere with the sensor. That is, the enzymes utilized in such sensors must be protected from degradation or denaturation, and such sensors must be protected from sensors or molecules that degrade their accuracy over time.
In one aspect, the present invention provides a biocompatible membrane formed from the following reaction mixture:
(A) a diisocyanate occupying about 50 mole percent of the reactants in the mixture;
(B) a hydrophilic polymer selected from the group consisting of hydrophilic diols, hydrophilic diamines and combinations thereof; and
(C) A silicone polymer having a functional group at the chain end.
Optionally, the reaction mixture will contain a chain extender. The film formed using the polymerization mixture of the above components is about 1 to about 200 × 10^-9 cm²/ Sec glucose diffusion coefficient, greater than 25% water absorption, and about 5 to about 200 D_oxygen/ D_glucoseWill have a ratio.
Depending on the choice of ingredients, the polymer used in forming the biocompatible membrane will be a polyurea, a polyurethane or a polyurethane / polyurea combination. FIG. 1 illustrates several polymerization reactions that provide the compositions of the present invention.
Membrane component
The homogeneous membrane of the present invention is a biologically acceptable polymer whose hydrophobic / hydrophilic balance controls the ratio of oxygen diffusion coefficient to that of glucose and is intended for in vivo applications. It may be varied over a wide area to plan the requirements for chemical glucose sensors. Such membranes can be prepared by conventional methods by polymerization of the above monomers and polymers. The resulting polymer is soluble in solvents such as acetone or ethanol and can be formed as a film from solution by dipping, spraying or spin coating.
The diisocyanates useful in this aspect of the invention are those typically utilized in the preparation of biocompatible polyurethanes. Such diisocyanates are described in detail in Szycher, SEMINAR ON ADVANCES IN MEDICAL GRADE POLYURETHANES, Technomic Publishing, (1995) and include both aromatic and aliphatic diisocyanates (see FIGS. 2 and 3). Examples of suitable aromatic diisocyanates include toluene diisocyanate, 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, 3,3'-dimethyl-4,4'-biphenyl diisocyanate, naphthalene diisocyanate and paraphenylene diisocyanate. Suitable aliphatic diisocyanates include, for example, 1,6-hexamethylene diisocyanate (HDI), trimethylhexamethylene diisocyanate (TMDI), trans-1,4-cyclohexane diisocyanate (CHDI), 1,4-cyclohexanebis ( Methylene isocyanate) (BDI), 1,3-cyclohexanebis (methylene isocyanate) (H₆XDI), isophorone diisocyanate (IPDI) and 4,4'-methylenebis (cyclohexyl isocyanate) (H₁₂MDI). In a preferred embodiment, the diisocyanate is isophorone diisocyanate, 1,6-hexamethylene disiocyanate or 4,4'-methylene bis (cyclohexyl isocyanate). Some of these diisocyanates are available from commercial sources such as Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin, USA), or can be readily prepared by standard synthetic methods utilizing article procedures.
The amount of diisocyanate utilized in the reaction mixture for the composition is typically about 50 mole percent based on the remaining reactant combinations. More particularly, the amount of diisocyanate utilized in preparing the composition will be sufficient to provide about 100% or more of the NCO groups required for reaction with the remaining reactant hydroxyl or amino groups. For example, polymers prepared using x moles of diisocyanate utilize α moles of hydrophilic polymer (diol, diamine or combination), b moles of silicone polymer with functionalized ends, and c moles of chain extender ( Here, x = a + b + c, and c may be 0).
The second reactant utilized in the preparation of the biocompatible membrane described herein is a hydrophilic polymer. The hydrophilic polymer may be a hydrophilic diol, a hydrophilic diamine or a combination thereof. The hydrophilic diol may be a poly (alkylene) glycol, a polyester based polyol, or a polycarbonate polyol (see FIG. 4). As used herein, the term “poly (alkylene) glycol” refers to polymers of lower alkylene glycols such as poly (ethylene) glycol, poly (propylene) glycol and polytetramethylene ether glycol (PTMEG). The term “polyester-based polyol” is the polymer shown in FIG. 4 where the R group is a lower alkylene group such as ethylene, 1,3-propylene, 1,2-propylene, 1,4-butylene, 2, It means what is 2-dimethyl-1,3-propylene or the like. One skilled in the art will also appreciate that the polymer diester moiety may be varied from the 6 carbon diacid shown. For example, FIG. 4 shows an adipic acid component, but the present invention also considers the use of succinic acid esters, glutaric acid esters and the like. The term “polycarbonate polyol” means a polymer having a hydroxyl group at the chain end and a carbonate group in the polymer chain (see FIG. 4). The alkyl portion of the polymer typically consists of C2-C4 aliphatic groups, or in some embodiments, may consist of longer chain aliphatic groups, alicyclic groups, or aromatic groups. The term “hydrophilic diamine” refers to any of the above hydrophilic diols in which the terminal hydroxyl group is replaced by a reactive amine group or an extended chain in which the terminal hydroxyl group has a terminal amine group. It means that is derivatized. For example, a suitable hydrophilic diamine is “diaminopoly (oxyalkylene)”, a poly (alkylene) glycol in which the terminal hydroxyl group is replaced with an amino group. The term “diaminopoly (oxyalkylene)” also refers to a poly (alkylene) glycol having an aminoalkyl ether group at the chain end. An example of a suitable diaminopoly (oxyalkylene) is poly (propylene glycol) bis (2-aminopropyl ether). Some of the above polymers are available from Aldrich Chemical Company. On the other hand, the article method may be used for the synthesis.
The amount of hydrophilic polymer utilized in the composition will typically be from about 10 to about 80 mole percent based on the diisocyanate used. Preferably, the amount is about 20 to about 60 mole percent based on diisocyanate. When using less hydrophilic polymer, it is preferable to include a chain extender (see below).
Silicone polymers useful in the present invention are typically linear, have excellent oxygen permeability, and are essentially glucose impermeable. Preferably, the silicone polymer is a polydimethylsiloxane having two reactive functional groups (ie, divalent). The functional group is, for example, a hydroxyl group, an amino group or a carboxylic acid group, but is preferably a hydroxyl group or an amino group (see FIG. 5). In some embodiments, a combination of silicone polymers may be used for the first region comprising hydroxyl groups and the second region comprising amino groups. Preferably, these functional groups are located at the chain ends of the silicone polymer. Several suitable silicone polymers are commercially available from sources such as the Dow Chemical Company (Midland, Michigan, USA) and the General Electric Company (Silicones Division, Schenectady, New York, USA). Further others can be prepared by general synthetic methods as shown in FIGS. 6 and 7, starting with commercially available siloxanes (United Chemical Technologies, Bristol, Pennsylvania, USA). For use in the present invention, the silicone polymer will preferably have a molecular weight of about 400 to about 10,000, more preferably a molecular weight of about 2000 to about 4000. The amount of silicone polymer incorporated into the reaction mixture will depend on the desired properties of the resulting polymer from which the biocompatible membrane is derived. For compositions where lower glucose permeability is desired, higher amounts of silicone polymer may be used. On the other hand, for compositions where higher glucose permeability is desired, a lower amount of silicone polymer may be utilized. Typically, for glucose sensors, the amount of silicone polymer will be 10-90 mol% based on diisocyanate. Preferably, the amount is about 20-60 mol% with respect to the diisocyanate.
In one group of embodiments, the reaction mixture for the preparation of the biocompatible membrane will include a chain extender that is an aliphatic or aromatic diol, an aliphatic or aromatic diamine, an alkanolamine, or combinations thereof (FIG. 8). reference). Examples of suitable aliphatic chain extenders include ethylene glycol, propylene glycol, 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol, ethanolamine, ethylenediamine, butanediamine, 1,4-cyclohexanedimethanol. . Aromatic chain extenders include, for example, para-di (2-hydroxyethoxy) benzene, meta-di (2-hydroxyethoxy) benzene, Ethacure 100 ™ (2,4-diamino-3,5-diethyltoluene. A mixture of two isomers), 3,3'-dichloro-4,4'-diaminodiphenylmethane, Polacure ™ 740M (trimethylene glycol bis (para-aminobenzoate) ester) and methylenedianiline. Incorporation of one or more of the above chain extenders typically has a stronger physical strength, but provides a biocompatible membrane in which the glucose permeability of the polymer is not substantially increased. Preferably, the chain extender is utilized when a small amount of hydrophilic polymer (i.e., 10-40 mol%) is used. In a particularly preferred composition, the chain extender is diethylene glycol, which is present at about 40-60 mol% relative to the diisocyanate.
Membrane preparation
Polymerization of the above reactants may be carried out in bulk or solvent mode. The use of a catalyst is preferred but not essential. Suitable catalysts include dibutyltin bis (2-ethylenehexanoate), dibutyltin diacetate, triethylamine and combinations thereof. Preferably, dibutyltin bis (2-ethylhexanoate) is used as the catalyst. Bulk polymerization is typically conducted at about 25 ° C. (room temperature) to about 50 ° C. to ensure proper mixing of the reactants. When the reactants are mixed, an exothermic reaction typically occurs and the temperature rises to about 90-120 ° C. After the primary exothermic reaction, the reaction flask may be heated at 75 ° C to 125 ° C, with 90 ° C to 100 ° C being the preferred temperature range. Heating is usually performed for 1-2 hours. Solution polymerization may be carried out in the same way. Suitable solvents for solution polymerization include dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dimethylacetamide, halogenated solvents such as 1,2,3-trichloropropane and ketones such as 4-methyl-2-pentanone. Preferably, THF is used as the solvent. When the polymerization is carried out in a solvent, heating of the reaction mixture is typically carried out for 3 to 4 hours.
Polymers prepared by bulk polymerization are typically dissolved in dimethylformamide and precipitated from water. Polymers prepared in a solvent and not miscible with water can be isolated from water by vacuum removal of the solvent. These polymers are then dissolved in dimethylformamide and precipitated from water. After washing well with water, the polymer may be dried at about 50 ° C. in vacuo to a constant weight.
Membrane preparation can be completed by dissolving the dried polymer in a suitable solvent and casting the film onto a glass plate. The selection of a suitable solvent for casting will typically depend on the particular polymer and solvent volatility. Preferably, the solvent is THF, CHCl_Three, CH₂Cl₂, DMF or a combination thereof. More preferably, the solvent is THF or DMF / CH.₂Cl₂(2/98% by volume). After removing the solvent from the film, the resulting membrane is fully hydrated, its thickness is measured, and water absorption is determined. Membranes useful in the present invention will typically be about 20 to about 100% by weight, preferably 30 to about 90% by weight, and more preferably 40 to about 80% by weight.
Oxygen and glucose diffusion coefficients can also be measured for the membranes of the present invention. Methods for measuring the diffusion coefficient are known to those skilled in the art, examples of which are given below. The biocompatible membrane described herein is preferably about 0.1 × 10^-6cm²/ Sec ~ about 2.0 × 10^-6cm²/ Sec oxygen diffusion coefficient (D_oxygen) And about 1 × 10^-9cm²/ Sec ~ about 500 × 10^-9cm²/ Sec glucose diffusion coefficient (D_glucose). More preferably, the glucose diffusion coefficient is about 10 × 10^-9cm²/ Sec ~ about 200 × 10^-9cm²/ Sec.
From the above description, it will be apparent to those skilled in the art that the discovery underlying the present invention is the use of silicon-containing polymers, such as siloxanes, in the formation of biocompatible membranes. Silicon-containing polymers are combined (covalently bonded) with hydrophilic polymers for the preparation of membranes in which the movement of analytes and reactive substances (eg oxygen and glucose) can be controlled by varying the amount of each component. used. Membranes made from such components are homogeneous and useful for the coating of numerous biosensors and articles designed for subcutaneous implantation. Membrane-coated biosensor
Glucose sensors such as those utilized to effect the reaction of glucose and oxygen are known and their work is within the skill of the art. See, for example, US Pat. Nos. 5,165,407, 4,890,620, 5,390,671, and 5,391,250, the disclosures of which are incorporated herein by reference. The present invention relies not on the shape of the biosensor but on the use of the membrane of the present invention to encapsulate or encapsulate the sensor element.
In particular, the biocompatible membranes of the present invention can be used in a variety of biosensors, which are advantageous for controlling analyte / reactant diffusion relative to the sensing element. Various such biosensors are known in the art. For example, another sensor for monitoring diabetes glucose levels is Shichiri, et al .: “In Vivo Characteristics of Needle-Type Glucose Sensor-Measurements of Subcutaneous Glucose Concentrations in Human Volunteers,” Horm. Metab. Res., Suppl. Ser. 20: 17-20 (1988); Bruckel, et al .: “In Vivo Measurement of Subcutaneous Glucose Concentrations with an Enzymatic Glucose Sensor and a Wick Method,” Klin. Wochenschr. 67: 491-495 (1989); and Pickup, et al. : "In Vivo Molecular Sensing in Diabetes Mellitus: An Implantable Glucose Sensor with Direct Electron Transfer," Diabetologia 32: 213-217 (1989).
The following examples are illustrative and do not limit the present invention.
Example
The materials used in this example were obtained from the following sources: isophorone diisocyanate.
General method
(A) Membrane preparation
The membrane was prepared by casting the film from a suitable solvent onto a glass plate using a parallel arm Gardner knife (Gardner Labs). The solvent chosen will depend on the specific chemical structure of the polymer. Typically THF or DMF / CH₂Cl₂(2/98% by volume) is used, but chloroform is useful because it volatilizes easily. After removal of the solvent, the dried membrane is hydrated with deionized water for 30-60 minutes. The membrane is then removed and transferred to a Mylar ™ support sheet. The wet film thickness was measured with a micrometer before it was removed from the support. A film was also cast from the solution over a filter membrane of known thickness. For the following measurements, it was assumed that the membrane material completely blocked the pores of the filtration membrane and the thickness of the filtration media was the membrane thickness.
(B) Diffusion constant
Fick ’s relationship in a standard permeable cell (Crown Glass Co., Inc.) maintained at 37 ° C.
J = -DdC / dx
(Where J is the total flux, D is the diffusion constant of the analyte of interest, and dC / dx is the concentration gradient across the membrane). The diffusion coefficient is a physical property of both the analyte of interest and the material from which it diffuses. That is, D is a characteristic of the system to be evaluated.
The oxygen diffusion constant (Do) was measured by fixing the membrane with two rubber gaskets between two pieces of diffusion cells maintained at 37 ° C. and bonding the two pieces. Each side of the cell was filled with phosphate buffered saline (PBS, 0.15 M NaCl, 0.05 M phosphate, pH 7.4). One side is saturated with HPLC grade helium and the other side is room air (20% O₂Saturated). A calibrated oxygen electrode (Microelectrodes, Inc.) was placed in each cell. The oxygen electrode output was connected to a microcomputer controlled data acquisition system, and the oxygen concentration from both cells was recorded as a function of time. A concentration vs. time curve was plotted and the diffusion coefficient was calculated using the entire curve. A curve fit is generally a correlation coefficient (R²).
The glucose diffusion constant (Da) was measured as described above except that one side of the cell was filled with phosphate buffered saline containing 400 mg / dl glucose. The glucose concentration of each piece of cell was measured every 5 minutes using a YSI glucose analyzer until equilibrium was achieved. Concentration vs. time curves were plotted and diffusion coefficients were calculated as described above.
(C) Water absorption
Water absorption was measured gravimetrically at room temperature on a film thinner than 0.5 mm. After evaporation of the casting solvent, the film was dried at 50 ° C. under vacuum to a constant weight, weighed, soaked in deionized water for 24 hours, removed, wiped with filter paper, and weighed. % Water absorption was determined from the following formula:
% Water absorption = (Ww−Wd) / Wd × 100
(Where Ww is the weight of the swollen film and Wd is the weight of the dry film).
Example 1
This example illustrates bulk polymerization polymer formation performed with isophorone diisocyanate, PEG 600, diethylene glycol and aminopropyl terminated polydimethylsiloxane.
Isophorone diisocyanate (4.44 g, 20 mmol, 100 mol%) was dried with molecular sieves and transferred to a 100 ml round bottom flask equipped with a nitrogen purge line and reflux condenser. PEG 600 (2.40 g, 4.0 mmol, 20 mol%), diethylene glycol (1.06 g, 10 mmol, 50 mol%) and aminopropyl-terminated polydimethylsiloxane (15 g, 6.0 mmol, 30 mol%, based on 2500 average molecular weight) are added to the flask. . Heating was started using a heating mantle until the temperature reached 50 ° C. Dibutyltin bis (2-ethylhexanoate) (15 mg) was added and the temperature was raised to about 95 ° C. The solution was continuously stirred at a temperature of 65 ° C. for 4 hours, during which time the viscosity of the mixture began to rise. The resulting polymer was dissolved in 50 ml of hot THF and then put. After cooling, the solution was poured into 5 l of stirred DI water. The precipitated polymer was broken into pieces and dried at 50 ° C. until constant weight.
Example 2
This example illustrates a solution polymerization process using 1,6-hexamethylene diisocyanate, PEG 200 and aminopropyl terminated polydimethylsiloxane.
Dry 1,6-hexamethylene diisocyanate (1.34 g, 8 mmol, 100 mol%) was added to a 100 ml three-necked flask containing 20 ml of dry THF. PEG 200 (0.8 g, 4.0 mmol, 500 mol%) was added with stirring, followed by aminopropyl-terminated polydimethylsiloxane (10 g, 4.0 mmol, 50 mol%). The resulting solution was warmed to 50 ° C. and dibutyltin (2-ethylhexanoate) (about 15 mg) was added. After the primary temperature rise to 83 ° C., the mixture was warmed and kept at 70 ° C. for 12 hours, during which time the mixture began to become very viscous. After cooling, the mixture was poured into rapidly stirred DI water. The precipitated polymer was collected, washed with DI water (3 times), torn into small pieces, and dried at 50 ° C. until constant weight.
Membranes were prepared as before. An infrared spectrum of the product was obtained and reproduced in FIG. 9, showing the expected absorption band (cm^-1).
Example 3
This example shows the composition and properties of a typical film.
Table 1 shows the five compositions of typical polymers that form into the film. The polymer was prepared by solution polymerization.

Table 2 shows the predetermined physical and chemical properties of the above polymers.

Example 4
This example demonstrates the evaluation of a membrane coated biosensor constructed in accordance with the present invention.
It has been found that membranes prepared from the polymers labeled 3 above have excellent mechanical properties and moderate oxygen and glucose diffusivity. The membrane was evaluated using the prototype glucose sensor shown in FIG. 10A. According to FIG. 10A, the sensor 10 is constructed to have a reference electrode 12, a working electrode 14 and a counter electrode 16 mounted on a polymer sheet 19. A set of bond pads completes the sensor 10. As shown in FIG. 10B, the working electrode 14 is covered with a layer 20 of enzyme glucose oxidase, and the entire electrode array is coated with this polymer layer via dip coating twice in a 5 wt% THF solution of the polymer 3. Covered with 22. This sensor is connected to a commercial potentiostat (BAS device, not shown) and operates at a potential of +0.6 volts between the working and reference electrodes.
The glucose response is shown in FIG. As shown in FIG. 11, the response of the electrode system is linear in the physiological glucose range, and local O₂Suggests relative independence of concentrations. All other polymers tested behaved similarly to the polymer labeled 3 and were accepted as membranes for biosensor applications.

Claims (7)

An implantable biosensor for measuring the reaction between an analyte and oxygen having a biocompatible membrane formed from the following reaction mixture:
(A) a diisocyanate occupying about 50 mole percent of the reactants in the mixture;
(B) a hydrophilic polymer selected from the group consisting of hydrophilic polymer diols, hydrophilic polymer diamines and combinations thereof;
(C) a siloxane polymer having a functional group at the chain end;
(D) a chain extender selected to enhance the physical strength of the biocompatible membrane, but not substantially increase the glucose permeability of the membrane;
Wherein the membrane has a glucose diffusion coefficient of about 1 × 10 ⁻⁹ cm ² / sec to about 200 × 10 ⁻⁹ cm ² / sec, a water absorption of 25% or more and a D _oxygen / D of about 5 to about 200. _A biosensor for transplantation having a _glucose ratio. The biosensor for transplantation according to claim 1, wherein the test substance comprises glucose. The biosensor for transplantation according to claim 1 or 2, wherein the functional group is selected from the group consisting of amino, hydroxyl and carboxylic acid. The biosensor for transplantation according to any one of claims 1 to 3, wherein the hydrophilic polymer is poly (ethylene) glycol selected from the group consisting of PEG 200, PEG 400, and PEG 600. The biosensor for transplantation according to any one of claims 1 to 4, wherein the diisocyanate is selected from the group consisting of isophorone diisocyanate, 1,6-hexamethylene diisocyanate, and 4,4'-methylenebis (cyclohexyl isocyanate). The biosensor for transplantation according to any one of claims 1 to 5, wherein the chain extender is selected from the group consisting of alkylene diols, alkylene diamines, aminoalkanols, and combinations thereof. The diisocyanate is 1,6-hexamethylene diisocyanate, the hydrophilic polymer is selected from the group consisting of PEG 200 and PEG 600 and is present in an amount of about 17 to about 32 mole percent, and the siloxane polymer is about 7. The implantable biosensor of any one of claims 1-6, wherein the biosensor is an aminopropyl polysiloxane having a molecular weight of 2000 to about 4000 and present in an amount of about 17 to about 32 mole percent.

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