JP4085523B2 - 自然形質転換能を有する納豆菌 - Google Patents
自然形質転換能を有する納豆菌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4085523B2 JP4085523B2 JP18080499A JP18080499A JP4085523B2 JP 4085523 B2 JP4085523 B2 JP 4085523B2 JP 18080499 A JP18080499 A JP 18080499A JP 18080499 A JP18080499 A JP 18080499A JP 4085523 B2 JP4085523 B2 JP 4085523B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- operon
- bacillus
- natto
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims description 45
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims description 19
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 title claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 62
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 101150008979 mecA gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101150069319 mecB gene Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 101150020466 comK gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100055267 Dictyostelium discoideum comG gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100060915 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) comF gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 101150100845 comC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150114605 bhsA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150109808 comC1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100162670 Bacillus subtilis (strain 168) amyE gene Proteins 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 101100167448 Bacillus subtilis (strain 168) clpC gene Proteins 0.000 description 13
- 101100456552 Bacillus subtilis (strain 168) mecB gene Proteins 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 9
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 8
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 6
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 6
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 6
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 2
- 101100221537 Bacillus subtilis (strain 168) comK gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010064250 RNA polymerase beta subunit Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 101150023918 comG gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000193398 Bacillus methanolicus Species 0.000 description 1
- 108700039628 Bacillus subtilis mecA Proteins 0.000 description 1
- 241000702194 Bacillus virus SPO1 Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100006766 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) clpX gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100257766 Streptococcus agalactiae serotype III (strain NEM316) strA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043717 Streptomyces griseus aphD gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- -1 chloro-3-indolyl Chemical group 0.000 description 1
- 101150113622 clpC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074451 clpP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043719 clpP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102296 clpP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007562 laser obscuration time method Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自然形質転換可能を獲得したバチルス属細菌に関し、詳しくは、野生株が自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、自然形質転換能を有するバチルス属細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
枯草菌（バチルス・サブチリス）をはじめとするバチルス属細菌は、菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されているばかりでなく、納豆菌（Bacillus subtilis natto）のように食品生産にも古くから用いられているものもある。また、近年では、バチルス属細菌の強い分泌生産能に着目し、大腸菌や酵母と並んで、遺伝子組換えの宿主として利用されている。
【０００３】
バチルス・サブチリスの形質転換法として、自然形質転換法（コンピテントセル法）、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法が主として用いられている。これらの方法のうち、自然形質転換法は、比較的大きなＤＮＡ分子を導入することができる利点があるが、自然形質転換はバチルス・サブチリス マーブルグ（Marburg）系の菌株（168、166、160株）のみで起こり、納豆菌等では自然形質転換の頻度は極めて低く、形質転換能（コンピテンシー）を有しないともいわれている。また、プロトプラスト法及びエレクトロポレーション法は、多くの菌種に応用可能である一方、プロトプラスト法ではプロトプラストが不安定でありバーストしやすい、再現性が低い、さらにはプロトプラストの再生に完全培地を用いるため栄養要求マーカーを使用できない等の欠点がある。さらに、エレクトロポレーション法は、形質転換効率が低いという問題がある（以上、Molecular Biological Method for Bacillus, Edited by Harwood, C. R. et al., John Wiley & Sons, p.98-103）。
【０００４】
バチルス・サブチリス マーブルグ株では、コンピテンスは、早期コンピテンス遺伝子群及び後期コンピテンス遺伝子群によって誘導されることが知られている（Solomon, J. M., et al., Genes & Development, 10, 2014-2024 (1996), Lazazzera, B. A., et al., Genes & Development, 19, 455-458 (1997), Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)）。後期コンピテンス遺伝子群の発現には、早期コンピテンス遺伝子であるｃｏｍＫ産物（ＣｏｍＫ）が必要である。ｃｏｍＫ遺伝子は構成的に発現するが、通常の生育条件では、ＣｏｍＫタンパク質は同じく早期コンピテンス遺伝子であるｍｅｃ（medium independent competence）Ａ、ｍｅｃＢ（ｃｌｐＣ）、ｃｌｐＰの各遺伝子産物によって分解されるため、後期コンピテンス遺伝子群は発現しない。一方、コンピテンスが誘導する条件で培養すると、ｃｏｍＫ遺伝子の発現が促進されるため、活性型ｃｏｍＫが後期コンピテンス遺伝子群の発現を誘導する。その結果、コンピテンスが誘導される。
【０００５】
しかし、納豆菌等の自然形質転換能を有しないバチルス属細菌が同様のコンピテンス遺伝子群を有しているか、有していたとしても発現可能であるかについては知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、納豆菌等の、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の形質転換を可能にする技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、納豆菌ではＣｏｍＫタンパク質が活性化されていないために後期コンピテンス遺伝子が誘導されず、その結果、自然形質転換能を有しないことを見い出した。そして、納豆菌のｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を破壊したところ、自然形質転換能を獲得した納豆菌を構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
（１）野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得したバチルス属細菌。
（２）バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である（１）の細菌。
（３）納豆菌（Bacillus subtilis natto）である（２）の細菌。
（４）前記後期コンピテンス遺伝子群が、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる（１）の細菌。
（５）活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する（１）の細菌。
（６）ｃｏｍＫ遺伝子の発現が強化されたことにより活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する請求項５記載の細菌。
（７）ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の一方又は両方が破壊されたことにより活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する（５）の細菌。
（８）実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌に後期コンピテンス遺伝子の発現能を付与することを特徴とするバチルス属細菌に自然形質転換能を付与する方法。
【０００９】
尚、本発明において、自然形質転換とは、特定の条件に培養した細菌の培養液にＤＮＡを加えて培養したときに、該ＤＮＡが細菌細胞に取り込まれて保持されることをいう。「実質的に自然形質転換能を有しない」とは、薬剤耐性等の表現形質の発現頻度が、該表現形質に相当する遺伝子を含むＤＮＡを用いて形質転換を行った場合と、自然突然変異とで有意差がないことをいう。また、自然形質転換能を付与するとは、自然形質転換能を有しない細菌に自然形質転換能を付与すること、及び、非常に低い自然形質転換能を有する細菌において自然形質転換能を高めることをいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得したバチルス属細菌である。
【００１１】
バチルス属細菌としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・メタノリカス（Bacillus methanolicus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amiloliquefaciens）、具体的には納豆菌（Bacillus subtilis natto）が挙げられる。バチルス属細菌で自然形質転換が起こるのはバチルス・サブチリス マーブルグ（Marburg）系の菌株のみであるといわれており、それらの菌株以外のバチルス属細菌は、本発明を適用して自然形質転換能を付与し得る。また、マーブルグ系の菌株であっても、同様にして自然形質転換能を向上させ得る。
【００１２】
マーブルグ系の菌株は、特定の培養条件で培養すると、コンピテンス遺伝子群が誘導され自然形質転換能が発現するが、納豆菌のような自然形質転換能を有しないバチルス属細菌（以下、単に「納豆菌等」ともいう）は、そのような条件で培養しても、後期コンピテンス遺伝群の発現が誘導されない。したがって、後期コンピテンス遺伝子群の発現を可能にすることによって、納豆菌等に自然形質転換能を付与することができる。
【００１３】
後期コンピテンス遺伝子群の発現を可能にするには、納豆菌等が元来保持する後期コンピテンス遺伝子群が発現するように発現制御系を改変するか、発現可能な後期コンピテンス遺伝子群を納豆菌等に導入すればよい。具体的には、例えば、活性型ＣｏｍＫタンパク質を後期コンピテンス遺伝子群の発現を誘導するような量で細胞内に保持させればよい。活性型ＣｏｍＫタンパク質を細胞内に保持させるには、ｃｏｍＫ遺伝子の発現量を増大させるか、あるいはｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を破壊又は変異させ、ＭｅｃＡタンパク質又はＭｅｃＢタンパク質が正常に機能しないようにすればよい。ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊は、いずれか一方でもよく、両方であってもよい。
【００１４】
ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊は、内部に他のＤＮＡ配列を挿入したｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子、あるいは内部を欠失したｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、納豆菌等の培養液に加えて培養することにより納豆菌等細胞を形質転換し、染色体上のｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子と相同組換えを起こさせることにより、行うことができる。
【００１５】
バチルス・サブチリスのｍｅｃＡ遺伝子（Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. L06059）又はｍｅｃＢ遺伝子（Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. U02604）は、それらの塩基配列が報告されており、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参照）により、バチルス属細菌染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００１６】
納豆菌等の形質転換は、枯草菌で通常用いられている自然形質転換法（コンピテントセル法）（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958)）と同様にして、特定の条件に培養した細胞の培養液にＤＮＡを加えて培養することにより、行うことができる。納豆菌等は、対数増殖期から定常期へと移行する時期の生育フェーズにおいて形質転換能が高まる。具体的には例えば、形質転換は次のようにして行うことができる。すなわち、納豆菌等を、実施例に示すコンピテンス誘導培地にＯＤ660が０．０５前後となるように植菌し、３７℃で５時間振盪培養を行った後、菌体をコンピテンス誘導培地に懸濁し、この細胞懸濁液にＤＮＡを加え、さらに３７℃で１．５時間振盪培養した後、ＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間浸透培養を続け、その後、ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養する。
【００１７】
形質転換株の選択は、導入しようとするＤＮＡに薬剤耐性遺伝子等のマーカーを保持させ、形質転換処理後の細胞のマーカー形質を指標として行うことができる。マーカー遺伝子を内部に含むｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子は、これらの遺伝子の破壊に好適に用いることができる。このようなマーカー遺伝子を内部に含むｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を保持するバチルス・ズブチリスとして、mecA欠損株BD2123［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］、及びmecB欠損株BD2243［hisB2 leu-8 metB5 mecBΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)参照）が挙げられる。これらの菌株の染色体ＤＮＡ断片は、そのままｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊に用いることができる。
【００１８】
形質転換が起こったことは、形質転換株からＤＮＡを調製し、同ＤＮＡでバチルス・ズブチリス マーブルグ系の菌株を形質転換し、マーカー遺伝子を保持する形質転換体を得ることにより、確認することができる。
【００１９】
また、上記のようにして得られるｍｅｃＡ欠損株又はｍｅｃＢ欠損株が、活性型ＣｏｍＫタンパク質を細胞内に保持し、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であることは、後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を連結した融合遺伝子をｍｅｃＡ欠損株又はｍｅｃＢ欠損株に保持させ、これらの株のβ−ガラクトシダーゼ活性が発現することにより、確認することができる。前記融合遺伝子としては、例えば、BD2123株［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Liyun Kong and David Dubnau, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5793-5797 (1994)）が染色体ＤＮＡ上に保持する、バチルス・ズブチリスcomG遺伝子の転写調節領域とエシェリヒア・コリＫ１２株由来のβ−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子との融合遺伝子（PcomG-lacZ）が挙げられる。
【００２０】
また、後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターを、発現にＣｏｍＫタンパク質を必要としないプロモーターに置換した融合遺伝子を作製し、同融合遺伝子を納豆菌等に導入することによっても、自然形質転換能を付与することができる。また、納豆菌等の染色体上の後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターを、発現にＣｏｍＫタンパク質を必要としないプロモーターに置換することによっても、自然形質転換能を付与することができる。染色体上の遺伝子のプロモーターを置換する技術は、特開平１−２１５２８０号公報に開示されている。
【００２１】
後期コンピテンス遺伝子群としては、ｃｏｍＣ遺伝子、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞納豆菌の単離
タカノフーズ株式会社の納豆（「おかめ納豆」（同社の登録商標））より納豆菌を分離した。前記納豆の希釈液をＬＢ寒天培地に塗布して単一コロニー分離を行い、２種の納豆菌を単離した。１種は非常にラフなコロニーを形成し、バチルス・サブチリス ナットウ（Bacillus subtilis natto） OK1と命名し、他の１種はバチルス・サブチリス マーブルグ168に似たコロニーを形成し、バチルス・サブチリス ナットウ OK2と命名した。これらの株は、数十ｋｂ（７０ｋｂ以下）と約６ｋｂの２つのプラスミドを保持し、その生育にビオチン（ビタミンＨ）を要求した。
【００２３】
＜２＞PcomG-lacZ融合遺伝子をもつバチルス・サブチリスＯＫ２株の構築
comG遺伝子の転写調節領域とエシェリヒア・コリＫ１２株由来のβ−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子との融合遺伝子（PcomG-lacZ）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がアミラーゼ遺伝子（amyE）に挿入されたＤＮＡ断片（amyE::comG-lacZ(cat)が、バチルス・サブチリス168系統株の染色体上のamyE領域に挿入されたBD2123株［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Liyun Kong and David Dubnau, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5793-5797 (1994)）から染色体ＤＮＡを、斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で抽出し、得られたＤＮＡを用いて通常の形質転換法（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958)）により、バチルス・サブチリス168株に導入した。
【００２４】
目的とする融合遺伝子を含むＤＮＡ断片がamyE遺伝子間に挿入された株は、クロラムフェニコールを５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地（Luria-Bertani培地： Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に塗布し、出現したコロニーを選択することによって得た。
【００２５】
さらに、ＯＫ２株に、上記PcomG-lacZ融合遺伝子を導入した株を構築した。上記で得られたPcomG-lacZ融合遺伝子を持つバチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡを前記と同様にして抽出した。一方、ＯＫ２株を０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えたコンピテンス誘導培地［ＣＩ液体培地：Spizizen最少培地（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958）に0.05% Yeast Extract (Difco)及び０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えた培地］にＯＤ660が０．０５前後となるように植菌し、３７℃で５時間振盪培養を行った後、０．５ｍｌの培養液を分取し、８０００rpm、４℃で２分遠心分離して集菌し、１ｍｌのＣＩ培地［Spizizen最少培地に0.025% Yeast Extract (Difco)及び０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えた培地］に懸濁した。この細胞懸濁液０．１ｍｌに、前記のPcomG-lacZ融合遺伝子を持つバチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡ０．２μｇを加え、さらに３７℃で１．５時間振盪培養した後、０．３ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間浸透培養を続け、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。その結果、２つのコロニーを得た。
【００２６】
上記の２株を用いて、ＣＩ培地中での後記コンピテンス遺伝子の発現をlacZ活性（β−ガラクトシダーゼ活性）をレポーターとして調べたところ、全く発現が認められなかった。このことは、これらの形質転換株に、完全なPcomG-lacZ融合遺伝子が導入されていないか、納豆菌では後記コンピテンス遺伝子の誘導系に何らかの欠陥があるものと考えられた。このことを確かめるために、上記形質転換体から抽出したＤＮＡでバチルス・サブチリス168株を通常の形質転換法により形質転換し、得られたＣｍrの形質転換株をＣＩ培地で培養し、lacZ活性を調べた。その結果、Ｃｍr株のすべて（５０株中の５０株）においてPcomG-lacZの発現がみられた。以上のことから、ＯＫ２株に導入されたPcomG-lacZ融合遺伝子は目的通りの構造を有していることが確認され、後記コンピテンス遺伝子の誘導系に欠陥があることが示唆された。
【００２７】
＜３＞mecA変異又はmecB変異の導入によるコンピテンス遺伝子の発現回復
（１）amyE::comG-lacZ(cat)を持つバチルス・サブチリス168株へのmecA、mecB変異の導入
上記でcomGオペロンが誘導されないのは、このオペロンの正の転写因子であるComKタンパク質が活性化されていないためではないかと考え、OK2株にバチルス・サブチリス168株のmecA変異及びmecB変異を導入した。バチルス・サブチリス168系統のmecA欠損株BD2123［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］、及びmecB欠損株BD2243［hisB2 leu-8 metB5 mecBΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］よりＤＮＡを抽出し、通常の形質転換法によりamyE::comG-lacZ(cat)を持つバチルス・サブチリス168（trpC2）株に導入した。BD2123株及びBD2243は、それぞれmecA遺伝子及びmecB遺伝子の内部にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されている。これらの変異株では、ComKタンパク質の分解が起こらず、構成的に後期コンピテンス遺伝子群が発現していることが報告されている（Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)）。
【００２８】
上記のようにして、PcomG-lacZを持つmecA変異株バチルス・サブチリス［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］、及びPcomG-lacZを持つmecB変異株バチルス・サブチリス［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］を構築した。これらの形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択し、かつＸ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−（クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）］を１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地上で青色を呈する、すなわちPcomG-lacZ遺伝子が構成的に発現していることで、目的のＤＮＡが導入されていることを確認した。
【００２９】
（２）OK2株のmecA及びmecB欠損株の構築
上記で得られたバチルス・サブチリス168株のmecA変異株［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びmecB変異株［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］よりＤＮＡを調製し、＜２＞で構築したPcomG-lacZを持つOK2株に導入した。具体的には、＜２＞で述べたのと同様に形質転換を行った。尚、mecA変異株［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］由来のＤＮＡは２３μｇ／ｍｌ、及びmecB変異株［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］由来のＤＮＡは４３μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、それぞれ細胞懸濁液０．１ｍｌに対して３μｌ加えた。
【００３０】
１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布することにより形質転換株の選択を行い、スペクチノマイシン及びクロラムフェニコール耐性（Ｓｐｃr、Ｃｍr）株を取得した。こうして、形質転換可能な納豆菌OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ及びOK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZを得た。形質転換株の出現頻度は、表１に示すとおりであった。
【００３１】
【表１】
【００３２】
（３）形質転換株のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
168［amyE::comG-lacZ(cat)］及びOK2［amyE::comG-lacZ(cat)］は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で、また、OK2［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びOK2［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地で、それぞれ３７℃で一晩培養し、ビオチン０．１μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＩ培地（mecA変異株及びmecB変異株はさらに５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む）５ｍｌに、ＯＤ660が約０．１になるように植菌し、３７℃で振盪培養した。培養開始から１時間毎にＯＤ660を測定し、同時に１５０００rpm、２分間の遠心で集菌し、活性測定まで−３０℃に保存した。０、１、２時間目は１ｍｌ、３、４、５、６、７時間目は０．５ｍｌの培養液を分取した。
【００３３】
上記のようにして集菌した細胞をＺバッファー（60mM Na2HPO4, 40mM NaHPO4・2H2O, 10mM KCl, 1mM MgSO4・7H2O, 50mM 2-メルカプトエタノール）５００μｌに懸濁し、トルエンを４滴加え、２０秒間ボルテックスし、２８℃の恒温槽で２分間プレインキュベートし、反応液の温度を２８℃とした。次に、基質として、分解されると黄色の生成物を生じるＯＮＰＧ（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を４ｍｇ／ｍｌ含むＺバッファーを２００μｌ加えて混合し、２８℃で反応を開始させた。薄く黄色く色づいたら、１Ｍの炭酸ナトリウム溶液を５００μｌ加え、反応を停止させ、氷中に保存した。反応開始から停止までの時間をＴ（分）とする。尚、色づかなかったサンプルは、最大２０分間２８℃で反応させてから、反応を停止させた。反応溶液を１５０００rpm、４℃で５分遠心した後、上清をキュベットに移し、分光光度計でＡ420を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、次のようにして算出した（Wang, P-Z and Doi, R.H., J. Biol. Chem., 259, 8619-8625 (1984)）。結果を、図１に示す。図中、活性を縦軸に、サンプリングした時間を横軸に示す。
【００３４】
【数１】
活性（unit）＝A420×1000／Ｔ(分)×ＯＤ660×Ｖ(ml)
【００３５】
＜４＞形質転換可能な納豆菌の形質転換能の評価
納豆菌自身の薬剤耐性マーカー遺伝子を得るために、納豆菌より自然突然変異によるリファンピシン耐性変異（rifr）株をまず単離し、OK2SR21株と命名した。このリファンピシン耐性変異が、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット遺伝子の変異であることは、３０ＳリボゾームＳ１２タンパク質遺伝子（rpsL）内のストレプトマイシン耐性変異（strA）との同時形質転換（co-transformation）頻度により確認した。
【００３６】
バチルス・サブチリス168株のstrA47変異は、rpsL遺伝子内の変異であり、同株でたった一つのコドンの変異のみが知られている。また、rif1728は、168株のＲＮＡポリメラーゼβサブユニット遺伝子内の変異であり、多くのrifrが同じ変異であることが知られている。OK2株で取得した自然突然変異（rifr）が、既知のこれらの遺伝子内の変異であるか否かを、互いにマッピングすることにより推定した。その結果、OK2で得られたrifr（rif21と命名した）はrpoBの変異であり、strAもrpsL（strA）の変異であることがわかった。
【００３７】
OK2SR21株（rif21）及び168株のrifr株（rif1728）から調製したＤＮＡを用いて、＜３＞で得た形質転換可能な納豆菌OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ株、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ、及び168株を、通常の形質転換法により形質転換した。OK2SR21株由来のＤＮＡは２３μｇ／ｍｌ、168株のrifr株由来のＤＮＡは４３μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、それぞれ細胞懸濁液０．１ｍｌに対して３μｌ加えた。形質転換株の出現頻度は、表２に示すとおりであった。
【００３８】
【表２】
【００３９】
＜５＞OK2誘導株の制限・修飾系の有無の確認
バチルス・サブチリスには多くの制限・修飾系が知られているので、プラスミドpUB110（カナマイシン耐性（Kmr）マーカーを含む）を用いて、OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZの制限・修飾系の有無を調べた。
【００４０】
168株を用いて増殖させたpUB110、及びOKSR21株由来のＤＮＡを用いて、OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ株、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ168株、OK2株、及び168株を、通常の形質転換法により形質転換した。結果を表３に示す。この結果から、納豆菌には、168株と異なる制限・修飾系は存在しないことがわかる。
【００４１】
【表３】
【００４２】
＜６＞comK遺伝子の発現強化によるコンピテンス遺伝子の発現回復
枯草菌のファージSPO1の強力なプロモーター及びエシェリヒア・コリのlacプロモーターとの融合プロモーターであるPspac（Methods in Enzymology, vol.185, 185- (1990)）を含むプラスミドpAG58をEcoRI及びBamHIで切断し、Pspacを含む断片を切り出した。バチルス属細菌のプラスミドpUB110をEcoRI及びBamHIで切断し、前記断片と連結し、プラスミドpULI7を得た（図２）。
【００４３】
一方、バチルス・ズブチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有し、末端にXbaIの認識配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、comK遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この断片をXbaIで消化し、XbaIで消化したpUL17に連結し、プラスミドpULI7SK27を得た（図２）。同プラスミドは、Pspacの制御下で発現するcomK遺伝子を有しており、同遺伝子はIPTGにより誘導され得る。尚、上記の各プラスミドの構築は、バチルス・ズブチリス168株を用いて行った。
【００４４】
OK2［amyE::comG-lacZ(cat)］を上記プラスミドpULI7SK27で形質転換した。形質転換株を、カナマイシン7.5μg/mlを含むLB培地で培養し、各種濃度のIPTGを添加してcomK遺伝子の誘導を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。また、同様にして培養した形質転換株を、OK2SR21株の染色体ＤＮＡで形質転換し、rifrを指標として形質転換効率を評価した。結果を表４に示す。この結果から、comK遺伝子の発現を増強することによって、納豆菌の形質転換能を示すことがわかる。
【００４５】
【表４】
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、納豆菌等の、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の形質転換を可能にすることができる。本発明によれば、自然突然変異に比べて有意に高い頻度で納豆菌等の形質転換を行うことが可能となるので、納豆菌等の分子育種に好適に利用することができる。
【配列表】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 168［amyE::comG-lacZ(cat)］、OK2［amyE::comG-lacZ(cat)］、OK2［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びOK2［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図。活性を縦軸に、サンプリングした時間を横軸に示す。
【図２】 IPTGで発現が誘導されるcomK遺伝子を有するプラスミドpULI7SK27の構築過程を示す図。
【図３】 IPTGで発現が誘導されるcomK遺伝子を有するプラスミドpULI7SK27を含む納豆菌形質転換体のβ−ガラクトスシダーゼ活性のIPTGによる誘導を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、自然形質転換可能を獲得したバチルス属細菌に関し、詳しくは、野生株が自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、自然形質転換能を有するバチルス属細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
枯草菌（バチルス・サブチリス）をはじめとするバチルス属細菌は、菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されているばかりでなく、納豆菌（Bacillus subtilis natto）のように食品生産にも古くから用いられているものもある。また、近年では、バチルス属細菌の強い分泌生産能に着目し、大腸菌や酵母と並んで、遺伝子組換えの宿主として利用されている。
【０００３】
バチルス・サブチリスの形質転換法として、自然形質転換法（コンピテントセル法）、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法が主として用いられている。これらの方法のうち、自然形質転換法は、比較的大きなＤＮＡ分子を導入することができる利点があるが、自然形質転換はバチルス・サブチリス マーブルグ（Marburg）系の菌株（168、166、160株）のみで起こり、納豆菌等では自然形質転換の頻度は極めて低く、形質転換能（コンピテンシー）を有しないともいわれている。また、プロトプラスト法及びエレクトロポレーション法は、多くの菌種に応用可能である一方、プロトプラスト法ではプロトプラストが不安定でありバーストしやすい、再現性が低い、さらにはプロトプラストの再生に完全培地を用いるため栄養要求マーカーを使用できない等の欠点がある。さらに、エレクトロポレーション法は、形質転換効率が低いという問題がある（以上、Molecular Biological Method for Bacillus, Edited by Harwood, C. R. et al., John Wiley & Sons, p.98-103）。
【０００４】
バチルス・サブチリス マーブルグ株では、コンピテンスは、早期コンピテンス遺伝子群及び後期コンピテンス遺伝子群によって誘導されることが知られている（Solomon, J. M., et al., Genes & Development, 10, 2014-2024 (1996), Lazazzera, B. A., et al., Genes & Development, 19, 455-458 (1997), Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)）。後期コンピテンス遺伝子群の発現には、早期コンピテンス遺伝子であるｃｏｍＫ産物（ＣｏｍＫ）が必要である。ｃｏｍＫ遺伝子は構成的に発現するが、通常の生育条件では、ＣｏｍＫタンパク質は同じく早期コンピテンス遺伝子であるｍｅｃ（medium independent competence）Ａ、ｍｅｃＢ（ｃｌｐＣ）、ｃｌｐＰの各遺伝子産物によって分解されるため、後期コンピテンス遺伝子群は発現しない。一方、コンピテンスが誘導する条件で培養すると、ｃｏｍＫ遺伝子の発現が促進されるため、活性型ｃｏｍＫが後期コンピテンス遺伝子群の発現を誘導する。その結果、コンピテンスが誘導される。
【０００５】
しかし、納豆菌等の自然形質転換能を有しないバチルス属細菌が同様のコンピテンス遺伝子群を有しているか、有していたとしても発現可能であるかについては知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、納豆菌等の、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の形質転換を可能にする技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、納豆菌ではＣｏｍＫタンパク質が活性化されていないために後期コンピテンス遺伝子が誘導されず、その結果、自然形質転換能を有しないことを見い出した。そして、納豆菌のｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を破壊したところ、自然形質転換能を獲得した納豆菌を構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
（１）野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得したバチルス属細菌。
（２）バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である（１）の細菌。
（３）納豆菌（Bacillus subtilis natto）である（２）の細菌。
（４）前記後期コンピテンス遺伝子群が、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる（１）の細菌。
（５）活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する（１）の細菌。
（６）ｃｏｍＫ遺伝子の発現が強化されたことにより活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する請求項５記載の細菌。
（７）ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の一方又は両方が破壊されたことにより活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する（５）の細菌。
（８）実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌に後期コンピテンス遺伝子の発現能を付与することを特徴とするバチルス属細菌に自然形質転換能を付与する方法。
【０００９】
尚、本発明において、自然形質転換とは、特定の条件に培養した細菌の培養液にＤＮＡを加えて培養したときに、該ＤＮＡが細菌細胞に取り込まれて保持されることをいう。「実質的に自然形質転換能を有しない」とは、薬剤耐性等の表現形質の発現頻度が、該表現形質に相当する遺伝子を含むＤＮＡを用いて形質転換を行った場合と、自然突然変異とで有意差がないことをいう。また、自然形質転換能を付与するとは、自然形質転換能を有しない細菌に自然形質転換能を付与すること、及び、非常に低い自然形質転換能を有する細菌において自然形質転換能を高めることをいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の変異株又は組換え株であって、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得したバチルス属細菌である。
【００１１】
バチルス属細菌としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・メタノリカス（Bacillus methanolicus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amiloliquefaciens）、具体的には納豆菌（Bacillus subtilis natto）が挙げられる。バチルス属細菌で自然形質転換が起こるのはバチルス・サブチリス マーブルグ（Marburg）系の菌株のみであるといわれており、それらの菌株以外のバチルス属細菌は、本発明を適用して自然形質転換能を付与し得る。また、マーブルグ系の菌株であっても、同様にして自然形質転換能を向上させ得る。
【００１２】
マーブルグ系の菌株は、特定の培養条件で培養すると、コンピテンス遺伝子群が誘導され自然形質転換能が発現するが、納豆菌のような自然形質転換能を有しないバチルス属細菌（以下、単に「納豆菌等」ともいう）は、そのような条件で培養しても、後期コンピテンス遺伝群の発現が誘導されない。したがって、後期コンピテンス遺伝子群の発現を可能にすることによって、納豆菌等に自然形質転換能を付与することができる。
【００１３】
後期コンピテンス遺伝子群の発現を可能にするには、納豆菌等が元来保持する後期コンピテンス遺伝子群が発現するように発現制御系を改変するか、発現可能な後期コンピテンス遺伝子群を納豆菌等に導入すればよい。具体的には、例えば、活性型ＣｏｍＫタンパク質を後期コンピテンス遺伝子群の発現を誘導するような量で細胞内に保持させればよい。活性型ＣｏｍＫタンパク質を細胞内に保持させるには、ｃｏｍＫ遺伝子の発現量を増大させるか、あるいはｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を破壊又は変異させ、ＭｅｃＡタンパク質又はＭｅｃＢタンパク質が正常に機能しないようにすればよい。ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊は、いずれか一方でもよく、両方であってもよい。
【００１４】
ｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊は、内部に他のＤＮＡ配列を挿入したｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子、あるいは内部を欠失したｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、納豆菌等の培養液に加えて培養することにより納豆菌等細胞を形質転換し、染色体上のｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子と相同組換えを起こさせることにより、行うことができる。
【００１５】
バチルス・サブチリスのｍｅｃＡ遺伝子（Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. L06059）又はｍｅｃＢ遺伝子（Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. U02604）は、それらの塩基配列が報告されており、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参照）により、バチルス属細菌染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００１６】
納豆菌等の形質転換は、枯草菌で通常用いられている自然形質転換法（コンピテントセル法）（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958)）と同様にして、特定の条件に培養した細胞の培養液にＤＮＡを加えて培養することにより、行うことができる。納豆菌等は、対数増殖期から定常期へと移行する時期の生育フェーズにおいて形質転換能が高まる。具体的には例えば、形質転換は次のようにして行うことができる。すなわち、納豆菌等を、実施例に示すコンピテンス誘導培地にＯＤ660が０．０５前後となるように植菌し、３７℃で５時間振盪培養を行った後、菌体をコンピテンス誘導培地に懸濁し、この細胞懸濁液にＤＮＡを加え、さらに３７℃で１．５時間振盪培養した後、ＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間浸透培養を続け、その後、ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養する。
【００１７】
形質転換株の選択は、導入しようとするＤＮＡに薬剤耐性遺伝子等のマーカーを保持させ、形質転換処理後の細胞のマーカー形質を指標として行うことができる。マーカー遺伝子を内部に含むｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子は、これらの遺伝子の破壊に好適に用いることができる。このようなマーカー遺伝子を内部に含むｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子を保持するバチルス・ズブチリスとして、mecA欠損株BD2123［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］、及びmecB欠損株BD2243［hisB2 leu-8 metB5 mecBΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)参照）が挙げられる。これらの菌株の染色体ＤＮＡ断片は、そのままｍｅｃＡ遺伝子又はｍｅｃＢ遺伝子の破壊に用いることができる。
【００１８】
形質転換が起こったことは、形質転換株からＤＮＡを調製し、同ＤＮＡでバチルス・ズブチリス マーブルグ系の菌株を形質転換し、マーカー遺伝子を保持する形質転換体を得ることにより、確認することができる。
【００１９】
また、上記のようにして得られるｍｅｃＡ欠損株又はｍｅｃＢ欠損株が、活性型ＣｏｍＫタンパク質を細胞内に保持し、後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であることは、後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を連結した融合遺伝子をｍｅｃＡ欠損株又はｍｅｃＢ欠損株に保持させ、これらの株のβ−ガラクトシダーゼ活性が発現することにより、確認することができる。前記融合遺伝子としては、例えば、BD2123株［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Liyun Kong and David Dubnau, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5793-5797 (1994)）が染色体ＤＮＡ上に保持する、バチルス・ズブチリスcomG遺伝子の転写調節領域とエシェリヒア・コリＫ１２株由来のβ−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子との融合遺伝子（PcomG-lacZ）が挙げられる。
【００２０】
また、後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターを、発現にＣｏｍＫタンパク質を必要としないプロモーターに置換した融合遺伝子を作製し、同融合遺伝子を納豆菌等に導入することによっても、自然形質転換能を付与することができる。また、納豆菌等の染色体上の後期コンピテンス遺伝子群のオペロンのプロモーターを、発現にＣｏｍＫタンパク質を必要としないプロモーターに置換することによっても、自然形質転換能を付与することができる。染色体上の遺伝子のプロモーターを置換する技術は、特開平１−２１５２８０号公報に開示されている。
【００２１】
後期コンピテンス遺伝子群としては、ｃｏｍＣ遺伝子、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞納豆菌の単離
タカノフーズ株式会社の納豆（「おかめ納豆」（同社の登録商標））より納豆菌を分離した。前記納豆の希釈液をＬＢ寒天培地に塗布して単一コロニー分離を行い、２種の納豆菌を単離した。１種は非常にラフなコロニーを形成し、バチルス・サブチリス ナットウ（Bacillus subtilis natto） OK1と命名し、他の１種はバチルス・サブチリス マーブルグ168に似たコロニーを形成し、バチルス・サブチリス ナットウ OK2と命名した。これらの株は、数十ｋｂ（７０ｋｂ以下）と約６ｋｂの２つのプラスミドを保持し、その生育にビオチン（ビタミンＨ）を要求した。
【００２３】
＜２＞PcomG-lacZ融合遺伝子をもつバチルス・サブチリスＯＫ２株の構築
comG遺伝子の転写調節領域とエシェリヒア・コリＫ１２株由来のβ−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子との融合遺伝子（PcomG-lacZ）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がアミラーゼ遺伝子（amyE）に挿入されたＤＮＡ断片（amyE::comG-lacZ(cat)が、バチルス・サブチリス168系統株の染色体上のamyE領域に挿入されたBD2123株［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］（Liyun Kong and David Dubnau, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5793-5797 (1994)）から染色体ＤＮＡを、斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で抽出し、得られたＤＮＡを用いて通常の形質転換法（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958)）により、バチルス・サブチリス168株に導入した。
【００２４】
目的とする融合遺伝子を含むＤＮＡ断片がamyE遺伝子間に挿入された株は、クロラムフェニコールを５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地（Luria-Bertani培地： Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に塗布し、出現したコロニーを選択することによって得た。
【００２５】
さらに、ＯＫ２株に、上記PcomG-lacZ融合遺伝子を導入した株を構築した。上記で得られたPcomG-lacZ融合遺伝子を持つバチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡを前記と同様にして抽出した。一方、ＯＫ２株を０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えたコンピテンス誘導培地［ＣＩ液体培地：Spizizen最少培地（J. Spizizen, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958）に0.05% Yeast Extract (Difco)及び０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えた培地］にＯＤ660が０．０５前後となるように植菌し、３７℃で５時間振盪培養を行った後、０．５ｍｌの培養液を分取し、８０００rpm、４℃で２分遠心分離して集菌し、１ｍｌのＣＩ培地［Spizizen最少培地に0.025% Yeast Extract (Difco)及び０．１μｇ／ｍｌのビオチンを加えた培地］に懸濁した。この細胞懸濁液０．１ｍｌに、前記のPcomG-lacZ融合遺伝子を持つバチルス・サブチリス168株の染色体ＤＮＡ０．２μｇを加え、さらに３７℃で１．５時間振盪培養した後、０．３ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間浸透培養を続け、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。その結果、２つのコロニーを得た。
【００２６】
上記の２株を用いて、ＣＩ培地中での後記コンピテンス遺伝子の発現をlacZ活性（β−ガラクトシダーゼ活性）をレポーターとして調べたところ、全く発現が認められなかった。このことは、これらの形質転換株に、完全なPcomG-lacZ融合遺伝子が導入されていないか、納豆菌では後記コンピテンス遺伝子の誘導系に何らかの欠陥があるものと考えられた。このことを確かめるために、上記形質転換体から抽出したＤＮＡでバチルス・サブチリス168株を通常の形質転換法により形質転換し、得られたＣｍrの形質転換株をＣＩ培地で培養し、lacZ活性を調べた。その結果、Ｃｍr株のすべて（５０株中の５０株）においてPcomG-lacZの発現がみられた。以上のことから、ＯＫ２株に導入されたPcomG-lacZ融合遺伝子は目的通りの構造を有していることが確認され、後記コンピテンス遺伝子の誘導系に欠陥があることが示唆された。
【００２７】
＜３＞mecA変異又はmecB変異の導入によるコンピテンス遺伝子の発現回復
（１）amyE::comG-lacZ(cat)を持つバチルス・サブチリス168株へのmecA、mecB変異の導入
上記でcomGオペロンが誘導されないのは、このオペロンの正の転写因子であるComKタンパク質が活性化されていないためではないかと考え、OK2株にバチルス・サブチリス168株のmecA変異及びmecB変異を導入した。バチルス・サブチリス168系統のmecA欠損株BD2123［hisB2 leu-8 metB5 mecAΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］、及びmecB欠損株BD2243［hisB2 leu-8 metB5 mecBΔ(spc) amyE::comG-lacZ(cat)］よりＤＮＡを抽出し、通常の形質転換法によりamyE::comG-lacZ(cat)を持つバチルス・サブチリス168（trpC2）株に導入した。BD2123株及びBD2243は、それぞれmecA遺伝子及びmecB遺伝子の内部にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されている。これらの変異株では、ComKタンパク質の分解が起こらず、構成的に後期コンピテンス遺伝子群が発現していることが報告されている（Dubnau, D., Gene, 192, 191-198 (1997)）。
【００２８】
上記のようにして、PcomG-lacZを持つmecA変異株バチルス・サブチリス［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］、及びPcomG-lacZを持つmecB変異株バチルス・サブチリス［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］を構築した。これらの形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択し、かつＸ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−（クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）］を１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地上で青色を呈する、すなわちPcomG-lacZ遺伝子が構成的に発現していることで、目的のＤＮＡが導入されていることを確認した。
【００２９】
（２）OK2株のmecA及びmecB欠損株の構築
上記で得られたバチルス・サブチリス168株のmecA変異株［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びmecB変異株［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］よりＤＮＡを調製し、＜２＞で構築したPcomG-lacZを持つOK2株に導入した。具体的には、＜２＞で述べたのと同様に形質転換を行った。尚、mecA変異株［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］由来のＤＮＡは２３μｇ／ｍｌ、及びmecB変異株［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］由来のＤＮＡは４３μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、それぞれ細胞懸濁液０．１ｍｌに対して３μｌ加えた。
【００３０】
１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布することにより形質転換株の選択を行い、スペクチノマイシン及びクロラムフェニコール耐性（Ｓｐｃr、Ｃｍr）株を取得した。こうして、形質転換可能な納豆菌OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ及びOK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZを得た。形質転換株の出現頻度は、表１に示すとおりであった。
【００３１】
【表１】
（３）形質転換株のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
168［amyE::comG-lacZ(cat)］及びOK2［amyE::comG-lacZ(cat)］は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で、また、OK2［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びOK2［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地で、それぞれ３７℃で一晩培養し、ビオチン０．１μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＩ培地（mecA変異株及びmecB変異株はさらに５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む）５ｍｌに、ＯＤ660が約０．１になるように植菌し、３７℃で振盪培養した。培養開始から１時間毎にＯＤ660を測定し、同時に１５０００rpm、２分間の遠心で集菌し、活性測定まで−３０℃に保存した。０、１、２時間目は１ｍｌ、３、４、５、６、７時間目は０．５ｍｌの培養液を分取した。
【００３３】
上記のようにして集菌した細胞をＺバッファー（60mM Na2HPO4, 40mM NaHPO4・2H2O, 10mM KCl, 1mM MgSO4・7H2O, 50mM 2-メルカプトエタノール）５００μｌに懸濁し、トルエンを４滴加え、２０秒間ボルテックスし、２８℃の恒温槽で２分間プレインキュベートし、反応液の温度を２８℃とした。次に、基質として、分解されると黄色の生成物を生じるＯＮＰＧ（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を４ｍｇ／ｍｌ含むＺバッファーを２００μｌ加えて混合し、２８℃で反応を開始させた。薄く黄色く色づいたら、１Ｍの炭酸ナトリウム溶液を５００μｌ加え、反応を停止させ、氷中に保存した。反応開始から停止までの時間をＴ（分）とする。尚、色づかなかったサンプルは、最大２０分間２８℃で反応させてから、反応を停止させた。反応溶液を１５０００rpm、４℃で５分遠心した後、上清をキュベットに移し、分光光度計でＡ420を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、次のようにして算出した（Wang, P-Z and Doi, R.H., J. Biol. Chem., 259, 8619-8625 (1984)）。結果を、図１に示す。図中、活性を縦軸に、サンプリングした時間を横軸に示す。
【００３４】
【数１】
活性（unit）＝A420×1000／Ｔ(分)×ＯＤ660×Ｖ(ml)
【００３５】
＜４＞形質転換可能な納豆菌の形質転換能の評価
納豆菌自身の薬剤耐性マーカー遺伝子を得るために、納豆菌より自然突然変異によるリファンピシン耐性変異（rifr）株をまず単離し、OK2SR21株と命名した。このリファンピシン耐性変異が、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット遺伝子の変異であることは、３０ＳリボゾームＳ１２タンパク質遺伝子（rpsL）内のストレプトマイシン耐性変異（strA）との同時形質転換（co-transformation）頻度により確認した。
【００３６】
バチルス・サブチリス168株のstrA47変異は、rpsL遺伝子内の変異であり、同株でたった一つのコドンの変異のみが知られている。また、rif1728は、168株のＲＮＡポリメラーゼβサブユニット遺伝子内の変異であり、多くのrifrが同じ変異であることが知られている。OK2株で取得した自然突然変異（rifr）が、既知のこれらの遺伝子内の変異であるか否かを、互いにマッピングすることにより推定した。その結果、OK2で得られたrifr（rif21と命名した）はrpoBの変異であり、strAもrpsL（strA）の変異であることがわかった。
【００３７】
OK2SR21株（rif21）及び168株のrifr株（rif1728）から調製したＤＮＡを用いて、＜３＞で得た形質転換可能な納豆菌OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ株、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ、及び168株を、通常の形質転換法により形質転換した。OK2SR21株由来のＤＮＡは２３μｇ／ｍｌ、168株のrifr株由来のＤＮＡは４３μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、それぞれ細胞懸濁液０．１ｍｌに対して３μｌ加えた。形質転換株の出現頻度は、表２に示すとおりであった。
【００３８】
【表２】
＜５＞OK2誘導株の制限・修飾系の有無の確認
バチルス・サブチリスには多くの制限・修飾系が知られているので、プラスミドpUB110（カナマイシン耐性（Kmr）マーカーを含む）を用いて、OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZの制限・修飾系の有無を調べた。
【００４０】
168株を用いて増殖させたpUB110、及びOKSR21株由来のＤＮＡを用いて、OK2 mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ株、OK2 mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ168株、OK2株、及び168株を、通常の形質転換法により形質転換した。結果を表３に示す。この結果から、納豆菌には、168株と異なる制限・修飾系は存在しないことがわかる。
【００４１】
【表３】
＜６＞comK遺伝子の発現強化によるコンピテンス遺伝子の発現回復
枯草菌のファージSPO1の強力なプロモーター及びエシェリヒア・コリのlacプロモーターとの融合プロモーターであるPspac（Methods in Enzymology, vol.185, 185- (1990)）を含むプラスミドpAG58をEcoRI及びBamHIで切断し、Pspacを含む断片を切り出した。バチルス属細菌のプラスミドpUB110をEcoRI及びBamHIで切断し、前記断片と連結し、プラスミドpULI7を得た（図２）。
【００４３】
一方、バチルス・ズブチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有し、末端にXbaIの認識配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、comK遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この断片をXbaIで消化し、XbaIで消化したpUL17に連結し、プラスミドpULI7SK27を得た（図２）。同プラスミドは、Pspacの制御下で発現するcomK遺伝子を有しており、同遺伝子はIPTGにより誘導され得る。尚、上記の各プラスミドの構築は、バチルス・ズブチリス168株を用いて行った。
【００４４】
OK2［amyE::comG-lacZ(cat)］を上記プラスミドpULI7SK27で形質転換した。形質転換株を、カナマイシン7.5μg/mlを含むLB培地で培養し、各種濃度のIPTGを添加してcomK遺伝子の誘導を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。また、同様にして培養した形質転換株を、OK2SR21株の染色体ＤＮＡで形質転換し、rifrを指標として形質転換効率を評価した。結果を表４に示す。この結果から、comK遺伝子の発現を増強することによって、納豆菌の形質転換能を示すことがわかる。
【００４５】
【表４】
【発明の効果】
本発明により、納豆菌等の、野生株が実質的に自然形質転換能を有しないバチルス属細菌の形質転換を可能にすることができる。本発明によれば、自然突然変異に比べて有意に高い頻度で納豆菌等の形質転換を行うことが可能となるので、納豆菌等の分子育種に好適に利用することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 168［amyE::comG-lacZ(cat)］、OK2［amyE::comG-lacZ(cat)］、OK2［mecAΔ(spc)amyE::comG-lacZ］及びOK2［mecBΔ(spc)amyE::comG-lacZ］のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図。活性を縦軸に、サンプリングした時間を横軸に示す。
【図２】 IPTGで発現が誘導されるcomK遺伝子を有するプラスミドpULI7SK27の構築過程を示す図。
【図３】 IPTGで発現が誘導されるcomK遺伝子を有するプラスミドpULI7SK27を含む納豆菌形質転換体のβ−ガラクトスシダーゼ活性のIPTGによる誘導を示す図。
Claims (5)
- ｃｏｍＫ遺伝子の発現が強化され、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得した納豆菌（ Bacillus subtilis natto ）。
- ｍｅｃＡ遺伝子とｍｅｃＢ遺伝子の一方もしくは両方が破壊され、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる後期コンピテンス遺伝子群が発現可能であり、かつ、自然形質転換能を獲得した納豆菌（ Bacillus subtilis natto ）。
- 活性型ＣｏｍＫタンパク質を保持する請求項１または２に記載の納豆菌。
- ｃｏｍＫ遺伝子の発現を強化することにより、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる後期コンピテンス遺伝子の発現能を納豆菌に付与することを特徴とする、納豆菌に自然形質転換能を付与する方法。
- ｍｅｃＡ遺伝子とｍｅｃＢ遺伝子の一方もしくは両方を破壊することにより、ｃｏｍＣオペロン、ｃｏｍＥオペロン、ｃｏｍＦオペロン又はｃｏｍＧオペロンから選ばれる後期コンピテンス遺伝子の発現能を納豆菌に付与することを特徴とする、納豆菌に自然形質転換能を付与する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18080499A JP4085523B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | 自然形質転換能を有する納豆菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18080499A JP4085523B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | 自然形質転換能を有する納豆菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001008686A JP2001008686A (ja) | 2001-01-16 |
| JP4085523B2 true JP4085523B2 (ja) | 2008-05-14 |
Family
ID=16089646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18080499A Expired - Lifetime JP4085523B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | 自然形質転換能を有する納豆菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4085523B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104619721A (zh) * | 2012-09-27 | 2015-05-13 | 诺维信股份有限公司 | 具有改进的转化效率的细菌突变体 |
| JP7025325B2 (ja) * | 2015-10-30 | 2022-02-24 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増強およびその方法 |
-
1999
- 1999-06-25 JP JP18080499A patent/JP4085523B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001008686A (ja) | 2001-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Reverchon et al. | Characterization of kdgR, a gene of Erwinia chrysanthemi that regulates pectin degradation | |
| JP4139561B2 (ja) | 新規ｄｎａクローニング方法 | |
| Goldenberg et al. | Role of Escherichia coli cspA promoter sequences and adaptation of translational apparatus in the cold shock response | |
| Lokman et al. | Regulation of expression of the Lactobacillus pentosus xylAB operon | |
| Yang et al. | Translation of trpG in Bacillus subtilis is regulated by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP) | |
| CA2619989C (en) | Regulation of heterologous recombinant protein expression in methylotrophic and methanotrophic bacteria | |
| La Roche et al. | Identification of dcmR, the regulatory gene governing expression of dichloromethane dehalogenase in Methylobacterium sp. strain DM4 | |
| Giel et al. | A Mutation in a New Gene, bglJ Activates the bgl Operon in Escherichia coli K-12 | |
| HK1217111A1 (en) | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker | |
| Guerrero et al. | Directed mutagenesis of a regulatory palindromic sequence upstream from the Brevibacterium lactofermentum tryptophan operon | |
| JPS60149390A (ja) | 生合成の方法およびその細胞 | |
| KR100546823B1 (ko) | 박테리아에서 단백질 발현을 억제하는 방법과 구조물 | |
| Kulik et al. | Regulation of the activity of the type ICEcoR124I restriction enzyme | |
| HU201116B (en) | Process for producing plasmids having uncontrolled replication conduct under given circumstances | |
| JP4312834B2 (ja) | タンパク質の改良原核発現 | |
| Solioz et al. | Operon of vacuolar-type Na (+)-ATPase of Enterococcus hirae | |
| NO319058B1 (no) | Gener for butyrobetain/krotonobetain-L-carnitinstoffskiftet og deres anvendelse for mikrobiologisk fremstilling av L-carnitin. | |
| JP4085523B2 (ja) | 自然形質転換能を有する納豆菌 | |
| Quiñones et al. | Expression of the dnaA gene of Escherichia coli is inducible by DNA damage | |
| US6100063A (en) | Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene | |
| Gomelsky et al. | The Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1 rho gene: expression and genetic analysis of structure and function | |
| KR20220149567A (ko) | 이. 콜라이 및 바실루스에서의 발현을 위한 셔틀 벡터 | |
| KR20220150328A (ko) | 낮은 내지 중간 발현을 부여하는 구성적 박테리아 프로모터를 생산하는 방법 | |
| Lubys et al. | Cloning and analysis of translational control for genes encoding the Cfr9I restriction-modification system | |
| Van De Guchte et al. | tRNATrp as a key element of antitermination in the Lactococcus lactis trp operon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040824 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070220 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070417 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070731 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070919 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080129 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080211 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110228 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110228 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110228 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120229 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120229 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120229 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130228 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130228 Year of fee payment: 5 |