JP4079875B2

JP4079875B2 - オリゴヌクレオチドの形成方法

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Publication number: JP4079875B2
Application number: JP2003433247A
Authority: JP
Inventors: エルレットシンガーロバート; エムグリアズノフセルゲイ
Original assignee: ノースウェスターンユニヴァーシティ
Priority date: 1993-04-12
Filing date: 2003-12-26
Publication date: 2008-04-23
Anticipated expiration: 2023-04-23
Also published as: EP0695305A1; JP2005015490A; WO1994024143A1; CA2160016C; US5476930A; EP0695305A4; ATE246702T1; ES2204913T3; DE69433010T2; JP3593344B2; AU684279B2; JPH08508998A; EP0695305B1; AU6626694A; DE69433010D1; CA2160016A1; JP2004129672A

Description

（オリゴヌクレオチドの形成方法発明の分野）
本発明はオリゴヌクレオチドの形成方法に関し、特にウイルス性疾患、ガン、及び遺伝子障害などを処置するのに可能性がある新規な治療方法、並びにオリゴヌクレオチドの診断応用としての使用を有する方法に関する。

（発明の背景）
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ウイルス性疾患、ガン、及び遺伝子障害のような疾患及び障害、並びに他の疾患及び障害を処置する新規なタイプの治療薬としての可能性が示されている^１。広範囲に研究が行われており、工業及び大学の研究室でこの可能性を探求する研究が続けられている^２。

アンチセンス・オリゴヌクレオチドを治療薬として利用するアプローチにおいて生じる問題は、生体での（ｉｎｖｉｖｏ）その治療薬の選択性に関するものである。細胞内に導入することができる細胞内ポリヌクレオチド・ターゲットが低濃度であること、及び細胞内に導入することができる治療オリゴヌクレオチドが低濃度であることを考慮して、高い結合親和力を有するオリゴヌクレオチドが必要であることが理解される。結合親和力は、オリゴヌクレオチドの長さと関連があり、２０量体及びそれ以上であるのが好ましい。しかし、短鎖のオリゴヌクレオチドの場合と比較して、長鎖のオリゴヌクレオチドの場合、塩基対の不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）によって不安定にならない。ゆえに、所望である不安定にする効果が長鎖のオリゴヌクレオチドを用いることによって減少するが、選択性は増加する。

専門家は「高配列特異性（“ｈｉｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”）」及び「高親和性」とは矛盾する要求であると注記している^３。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは完全に一致していないターゲット部位でＲＮＡの開裂を生じさせることができるという程度をベースとして、多くの非ターゲットＲＮＡの部分的な崩壊を少なくとも生じさせないで、試験された系内で、意図したターゲットＲＮＡの特定の開裂を得ることは多分不可能であったと、さらに結論づけている^４。ゆえに、この分野の専門家は、行った研究に基づき、特異性及び親和性という対立する要求は、克服するための大きなハードルであると結論づけている。

オリゴヌクレオチドのブロックを水性溶媒内で共有結合する、いくつかの方法が報告されている^５ａ−１。これらの方法はすべて、安定な連結生成物（ｌｉｇａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔ）を得るために、さらに化学薬品を必要とする。このアプローチによって、加えられた薬品は、水溶性カルボジイミド又はシアノイミダゾール^５ａ−ｋのような「活性化剤」であってもよく、ナトリウム・シアノボロヒドリド^５１のような還元剤であってもよい。そのような化合物は、毒性があり、水と反応し、かつ所望のカップリング反応を引き起こすのに十分な量で生体系内に導入することができないので、いずれの場合も、第３の薬品の必要性により、生体内での化学連結（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｉｇａｔｉｏｎ）を妨げる。

本発明は、低濃度で存在するオリゴヌクレオチドのブロックを、さらに縮合剤又は安定化剤を必要としないで、水性媒体中で共有結合させる新規な方法を提供する。ゆえに、本発明は、生体系内で現場で（ｉｎｓｉｔｕ）化学連結させる門戸を開く。相補的オリゴヌクレオチド配列の存在下で、反応は非常に促進するので、各々のオリゴヌクレオチド・ストランドに相補的で、共役な（ｃｏｎｓｅｃｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列を含むターゲット・ポリヌクレオチド（例えば、ウイルス又はガン細胞からのｍ−ＲＮＡ又はＤＮＡ）が存在する場合、原則として長いオリゴヌクレオチド・ストランドを生体内で（ｉｎｖｉｖｏ）選択的に形成することができる。ターゲット・ヌクレオチドが存在するとき、高い親和力で結合する、長いオリゴヌクレオチド・ストランドを、ゆえに現場で（ｉｎｓｉｔｕ）低い親和力で結合する短いストランドから発生させることができる。ゆえに、本発明は、治療上の応用及び診断の応用において、高い親和力と高い特異性を達成するという矛盾する問題を解決することができる。

項目１．ａ）オリゴマーの塩基単位に相補的な塩基単位を含むオリゴ−又はポリヌクレオチド上の適切な位置に、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを可逆的に結合する工程であって、オリゴヌクレオチドのうち１つは、第１の反応基を有するヌクレオチドを含み、かつ第２の反応基を含む他のオリゴマーのヌクレオチドと近接し、第２の反応基が第１の反応基と共有結合を自発的に形成する工程と、ｂ）ポリヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドの結合においてお互いに近接する第１及び第２の反応基を介してオリゴヌクレオチドを不可逆的に共有結合する工程とによるオリゴヌクレオチドの形成方法。
項目２．前記第１の反応基がα−ハロアシルであり、前記第２の反応基がホスホチオエートであり、前記工程（ｂ）が前記反応基を通して自発的にチオホスホリルアセチルアミノ結合を形成するものとしてさらに定義される項目１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
項目３．オリゴマーの各々が８〜２０ヌクレオチドからなる項目１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
項目４．前記工程（ａ）及び（ｂ）が水溶液中で生じる項目１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
項目５．ａ）オリゴヌクレオチドのうち１つがα−ハロアシル基を含み、他のヌクレオチドがホスホチオエート基を含む、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液に配置する工程と、ｂ）α−ハロアシル基及びホスホチオエート基を通して、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成して、共にオリゴヌクレオチドを共有結合する工程とによるオリゴヌクレオチドの形成方法。
項目６．オリゴヌクレオチドを含む水溶液を凍結させることにより反応を促進し、高い完結度で反応を行う工程（ｃ）をさらに含む項目５記載のオリゴヌクレオチド形成方法。

（発明の概要）
本発明により、オリゴマーの対の配列に相補的なヌクレオチド塩基配列を含むターゲット・ポリヌクレオチド上の適切な位置に水素結合することによりそれら自身可逆的に結合した、少なくとも２つのオリゴマーを非可逆的に共有結合することによるオリゴヌクレオチド形成方法であって、オリゴヌクレオチドのうち１つが他のオリゴマーのヌクレオチドに隣接した第１の反応基を有するヌクレオチドを含み、他のオリゴマーが自発的に第１の反応基と共有結合を形成することができる第２の反応基を含む、オリゴヌクレオチド形成方法が提供される。オリゴヌクレオチドは、第１及び第２の反応基を通じて一緒に結合し、ポリヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドの結合によりお互いに近接することができる。

さらに本発明は、オリゴヌクレオチドのうち１つがα−ハロアシル基を含み、他のヌクレオチドがホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｏａｔｅ）基を有する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液中に配置する（ｄｉｓｐｏｓｅ）ことによる、オリゴヌクレオチド形成方法を提供する。オリゴヌクレオチドはα−ハロアシル基及びホスホチオエート基を通じてともに共有結合され、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成する。

本発明によって、低濃度で存在するオリゴヌクレオチドのブロックを、さらに縮合剤又は安定化剤を必要としないで、水性媒体中で共有結合させる新規な方法が提供され、治療上の応用及び診断の応用において、高い親和力と高い特異性を達成するという矛盾する問題が解決された。

（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液中に配置する工程であって、オリゴヌクレオチドのうち１つがα−ハロアシル基を含み、他のヌクレオチドがホスホチオエート基を含み、その後、α−ハロアシル基及びホスホチオエート基を通じてオリゴヌクレオチドが共有結合し、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成する工程による、オリゴヌクレオチド形成方法を提供する。
本明細書で記述するカップリング反応は、非常に希釈な水溶液では非常に遅いが、鋳型ポリヌクレオチドの存在下では速いという事実を本方法は活用する。即ち、プローブ・オリゴマーに相補的な配列部分を有するターゲット・ポリヌクレオチドの存在下で、反応は促進される。本発明は、治療薬として、ターゲット・ポリヌクレオチド上の適切な位置に結合した後、自発的にともに共有結合することができる、２つの短いオリゴマー（例えば、８〜２０量体）を使用する。この系で、１６〜４０量体のような長いオリゴマー・プローブの結合親和力及び認識特性に近づくが、短いプローブ（８〜２０量体）の依存性及び塩基対特質を保持する。換言すれば、本発明は、長いポリヌクレオチドの効果を保持しながら短いポリヌクレオチドの選択性を提供する。

反応基が空間的にお互いに近接しているとき、自発的に反応して反応基の間に共有結合を形成する反応基を含むポリヌクレオチドの必要性及び使用は、本発明に固有のものである。特に、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを利用し、オリゴヌクレオチドの第１のセットは第１の反応基を含み、オリゴヌクレオチドの第２のセットはお互いに近接するように第２の反応基を含み、これらの反応基は、自発的に反応して、安定な共有結合を形成する。そのような反応基のペアとして、エステル＋ヒドラジン、ＲＣ（Ｏ）Ｓ⁻＋ハロアルキル及びＲＣＨ_２Ｓ⁻＋α−ハロアシルが挙げられる。好ましくは、本発明は、ブロモアセチルアミノ基のようなα−ハロアシル基及びチオホスホリル基を利用し、それらは希釈水性媒体中で、チオホスホリルアセチルアミノ架橋を効率的、選択的、非可逆的に形成する。以下に示すように、生成物は水中で安定で、相補的なポリヌクレオチドとよくハイブリッドする。

オリゴマーが１μＭ未満のような低濃度で、かつ相補的鋳型が存在しないとき、反応は非常に遅いが、その溶液を凍結することによって、２〜３日以内で高転化率で行うことができる。凍結の技術は、以下に詳細に記述する。鋳型として働く相補的なオリゴヌクレオチドの存在下の溶液内でカップリングが行われると、カップリングは極めて速い（２０分間に９０％の転化率より大きい）。以下の実施例のセクションでこれについて示す。

本発明の診断応用において、及び一般にオリゴヌクレオチドの使用において、選択性も大きな関心事である。本発明の新規な化学的性質により治療への応用に魅力的である本発明の特徴の同じ部分が、診断での使用にも魅力である。例えば、本発明は次の診断システムに利用することができる。

図１を参照すると、Ａは例えば鎖中にマーカー（＊）及び３’−末端にブロモアセチルアミノ基を有する１０量体からなるオリゴマーである。Ｂは、５’末端にチオホスホリル基を有する他の短いオリゴマーである。Ｃは、Ａ＋Ｂに相補的な配列を有するターゲット・オリゴヌクレオチド配列である。希釈溶液で、鋳型の存在下のカップリングと比較して、鋳型の不存在下、ＡとＢとのカップリングは十分に遅く、単に鋳型上のカップリングのみが重要となる。ゆえに、この化学連結系は、酵素連結系（リガーゼ連鎖反応（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）即ち、ＬＣＲ）に類似した増幅及び検知に用いることができる。ある非特異的なカップリングは、酵素機構中に誤りの源を導くので、優れている可能性がある。オリゴヌクレオチドが非常に低い濃度で（即ち、診断応用に興味がある範囲で）、鋳型の不存在下での化学連結の速度が極度に遅くなるという事実は、鋳型不存在に従った（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）カップリングが本ケースでは重要ではないことを示す。

図２に示されるように、オリゴマー１及び２との式１で示される連結は、ホスホロチオエートとα−ハロアシル誘導体との容易な反応を活用する。特に、図２の化合物１（配列番号１）は、３’−末端に３’−（ブロモアセチルアミノ）−３’−デオキシチミジン単位を有する。化合物１の調製で、０．４Ｍ水性Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）１５μＬ（キャルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）より得た）を、３’−アミノデオキリボ−オリゴヌクレオチド前駆体の４．９Ａ_２６０単位、ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ−ＮＨ_２に加えた。調製方法は、グリアズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ）ら（１９９２年）に記載されている^６。室温、０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液１０μＬ中で反応を行った。３５分後、混合物を水０．５ｍＬで希釈し、ＮＡＰ−５カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）上のゲル濾過により脱塩化し、ＲＰＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーによって精製し、再度脱塩化して、化合物１の４Ａ_２６０単位を得た。溶出時間は、次の通りである。ＲＰＨＰＬＣ，１７．４分；ＩＥＨＰＬＣ，１７．４分。
上記で行われたＩＥＨＰＬＣ、及び以下で行われる同様な手順は、ダイオネクス・オムニ・パックＮＡ１００（ＤｉｏｎｅｘＯｍｎｉＰａｋＮＡ１００）４×２５０ｍｍカラム上、ｐＨ１２（水酸化ナトリウム１０ｍＭ）で、１０Ｍ水酸化ナトリウムに１分間に２％の割合で１．０Ｍ塩化ナトリウムを濃度勾配をつけて行った。ＲＰＨＰＬＣの場合、ハイパージルＯＤＳ（ＨｙｐｅｒｓｉｌＯＤＳ）カラム（４．６×２００ｍｍ）をｐＨ７のトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液０．０３Ｍに、アセトニトリルを毎分１％の割合で濃度勾配をつけて行った。
化合物２（配列番号２）を、ミリゲン／バイオサーチ・サイクロン・ＤＮＡシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／ＢｉｏｓｅａｒｃｈＣｙｃｌｏｎｅＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシンを担持したＬＣＡＡＣＰＧを用いて、１μモルのスケールで合成した。標準シアノエチルホスホルアミダイト（ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の化学的性質を用いた。鎖の伸びが完了したとき、末端５’−ヒドロキシル基を、アセトニトリル中「ホスフェートＯＮ（登録商標ＰｈｏｓｐｈａｔｅＯＮ）」試薬（クルアケム（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）製）０．１Ｍ溶液１５０μＬ及びアセトニトリル中０．５Ｍテトラゾール１５０μＬで亜リン酸化した。得られた亜リン酸塩を、ピリジン／二硫化炭素（１：１、ｖ／ｖ、室温で４５分）のイオウ５％溶液で処理することによって、硫化した。ＤＭＴ基（ジクロロメタン中ＤＣＡ３％、１．５分）の開裂後、担持されたポリマーを、化合物１のケースとして取り上げた。
ＤＭＳ及び水中でのハロアセチルアミノ芳香族誘導体とチオホスホリル−オリゴヌクレオチドとの反応が、染料−オリゴヌクレオチド共役体（ｄｙｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製するのに用いられた^７。
本発明の使用及び所望の速度論に依存して、オリゴヌクレオチドのカップリングは、上述したように、水溶液中、氷中の凍結状態、又は鋳型の存在下での水溶液中のいずれかで行われ、それについて以下に示す。

最初の実験で、化合物１（０．３９Ａ_２６０単位、４μＭ）を含む溶液１．０ｍＬ（ｐＨ７．０５、リン酸塩１５ｍＭ、ＮａＣｌ８５ｍＭ）を調製し、０℃で５日間貯蔵した。溶液を５０℃まで２．５時間あたため、最後に凍結し、−１８℃でさらに５日間貯蔵した。
２時間後及び４８時間後のサンプルのＩＥＨＰＬＣの分析により、ゆっくり溶出する生成物、オリゴマー３（図２）が、各々約２５％及び８０％の収率で形成したことがわかった。０℃又は５０℃にあたためてさらに３日経過後も著しい変化は観察されなかった。しかし、反応は凍結状態でさらに進行し、図３に示すように、５日以内に高い転化率で化合物３（配列番号３）を得た。氷のマトリクス中での反応の増大の程度は、氷の穴の中にオリゴヌクレオチド反応体が高い局所濃度で存在することによるものである。他の反応も、氷のマトリクス中で同様に行われた^８。

この結果から、同じ緩衝液中の化合物１及び２の当モル量の混合物（各々２μＭ）を直接凍結し、−１８℃に保った。５時間後及びその後の日毎の、サンプルから得られたＨＰＬＣプロファイルから、５日中３日で高い収率が得られる進行が見られ、図４に代表的なデータを示す。

相補的オリゴヌクレオチド鋳型（ＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＴ、化合物４（配列番号４））の存在下、溶液中での化合物１及び２をカップリングするデータを図５を示す。この系は、鋳型４が存在すること（４μＭ）を除いて、最初の実験と同じであった。この場合、反応は２０分以内に＞９０％完了するまで進行し、本質的に２時間以内で完了した。

化合物３とした構造は、モデル化合物（Ｔ−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２−ＳＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−Ｔ、化合物３に用いるものより大きな規模で溶液中で調製した）の特性、ゲル電気泳動上の化合物３の移動度（化合物１、２及び４のそれぞれＲｍ０．８９、０．９５及び０．６１と比較して、Ｒｍ０．５８）、及び相補的なオリゴヌクレオチド４と形成した複合体の安定性によって支持されている。保持時間、ＲＰＨＰＬＣ１０．５分；ＦＡＢ＋質量分析スペクトル、Ｍ＋Ｈ^＋６２０、Ｍ＋Ｎａ^＋６４２；^３１ＰＮＭＲ、Ｄ_２Ｏ中のδ１８．７ｐｐｍ、先行文献にはアルキルチオホスフェート基の特質が開示されている^９。

Ｒｍ値は、２０％ポリアクリルアミド／５％ビスアクリルアミド・ゲル中のブロモフェノール・ブルーに関する。Ｔｍ値は０．１ＭＮａＣｌ中５６℃で、対応するすベてのホスホジエステル２０量体と化合物４（６０℃）とから形成される複合体の値に近づき^１０、化合物１又は２と化合物４（３７℃及び３１℃）とから形成される複合体の値とは著しく異なる。さらに、ヌクレオチド内−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ_２ＳＰ（Ｏ）（Ｏ−）−結合は、ＫＩ_３ ^９での酸化で選択的に開裂することがわかった（図５）。特に、水１００μＬ中の化合物３及び４（各々０．３Ａ_２６０単位）を含む二本鎖分子を０．２ＭＫＩ_３ａｑ．１００μＬで１５分間、５０℃で処理した。その後、１ＭＤＴＴａｑ．１０μＬを溶液に加えた。５分後、混合物をＮＡＰ−５カラム上で脱塩化し、ＩＥＨＰＬＣで分析した。

上記の実験から、本発明は、水溶液中で、オリゴマー濃度４μＭ以上の範囲で、選択的かつ不可逆的にオリゴヌクレオチドをカップリングする簡易な手段をもたらす新規の化学的性質を提供するという証拠をもたらす。生成物は、中性溶液中で安定であり、室温ｐＨ１２であっても数時間安定であることがわかった。１μＭ以下の濃度では液相での速度は極めて遅くなる。しかし、凍結状態で反応を完了近くまでに行わせることができる。カップリングの速度は、相補的オリゴヌクレオチド鋳型の存在によって著しく促進される。これらの特性は、化学増幅系（ｃｈｅｍｉｃａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）の設計、及びアンチセンス応用における現場での（ｉｎｓｉｔｕ）連結、並びに既知の化学的性質に基づき、オリゴヌクレオチド・ブロックから複合体構造を建てるのに可能性をもたらす。
本発明を例を挙げて説明したが、用いられる用語は、限定のためというよりむしろ説明のための言語として用いられるものと理解すべきである。
本発明の多くの改良及び変形が、上記の教示から可能であることが明らかである。
（参考文献）

本発明の他の利点は、添付図面に関連して考慮すると、上記の詳細な説明を参照することによって、よく理解できるようになり、そのとき、本発明の他の利点は即座に評価されるであろう。

（配列表）
配列表（１）一般的な情報（ｉ）出願人：レットシンガー・ロバート・エル（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ＲｏｂｅｒｔＬ．）
グリアズノフ・セルゲイ・エム（Ｇｒｙａｚｎｏｖ，ＳｅｒｇｅｉＭ．）
（ｉｉ）発明の名称：オリゴヌクレオチドの形成方法（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ）通信住所：（Ａ）住所：ライジング、エシントン、バーナード、ペリー・アンド・ミルトン（Ｒｅｉｓｉｎｇ，Ｅｔｈｉｎｇｔｈｏｎ，Ｂａｒｎａｒｄ，Ｐｅｒｒｙ＆Ｍｉｌｔｏｎ）
（Ｂ）街：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ４３９０（Ｃ）市：トロイ（Ｔｒｏｙ）
（Ｄ）州：ミシガン（Ｍｉｃｈｉｇａｎ）
（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４８０９９（ｖ）コンピュータ読取りフォーマット：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピー（登録商標）ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０，バージョン＃１．２５（ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５）
（ｖｉ）出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０４６，０３２（Ｂ）出願日：１９９３年４月１２日（Ｃ）クラス：（ｖｉｉｉ）代理人（ＡＴＴＯＲＮＥＹ／ＡＧＥＮＴ）情報：（Ａ）名前：コーン、ケネス・アイ（Ｋｏｈｎ，ＫｅｎｎｅｔｈＩ．）
（Ｂ）登録番号：３０．９５５（Ｃ）参照／事件番号（ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ／ＤＯＣＫＥＴＮＵＭＢＥＲ）：ＮＵ９３１０（ｉｘ）テレコニュニケーション情報：（Ａ）電話：（３１３）６８９−３５５４（Ｂ）テレファックス：（３１３）６８９−４０７１（２）配列番号１の情報（ｉ）配列の性質：（Ａ）配列の長さ：１１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：両形態（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／ＫＥＹ：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｂ）存在位置：置換（１．．１１、””）
（Ｄ）他の情報：／注記＝”Ｎはブロモアセチルアミノ基である”（ｘｉ）配列：配列番号１

（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の性質：（Ａ）配列の長さ：１１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：両形態（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／ＫＥＹ：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｂ）存在位置：置換（１．．２、””）
（Ｄ）他の情報：／注記＝”Ｎはチオホスホリル基である”（ｘｉ）配列：配列番号２

（２）配列番号３の情報（ｉ）配列の性質：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：両形態（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／ＫＥＹ：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｂ）存在位置：置換（１１．．１２、””）
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＮＮはチオホスホリルアセチルアミノ基である”（ｘｉ）配列：配列番号３

（２）配列番号４の情報（ｉ）配列の性質：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：両形態（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／ＫＥＹ：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｂ）存在位置：１．．２０（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＮＮのない配列番号３に相補的である”（ｘｉ）配列：配列番号４

図１は、ターゲット鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を利用する、本発明の２つの短いオリゴマーのカップリングを示す。図２は、本発明による、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートとα−ハロアシル・オリゴヌクレオチド誘導体との容易な（ｆａｃｉｌｅ）反応を示す。図３は、実験１による生成物のイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＨＬＰＣ）の結果を示す。ここで、Ａ、０℃で溶液中２時間後；Ｂ、０℃で２日後；Ｃ、溶液を凍結し−１８℃で５日間貯蔵した最終工程後であり、ピークは約１７分、２１分、及び２４分で、それぞれ化合物１、化合物２、及び化合物３に対応する。図４は、第２の実験（凍結、全体が−１８℃）による生成物のＩＥＨＰＬＣを示す。ここで、Ａ、０℃で溶液中２時間後；Ｂ、０℃で２日後；Ｃ；Ａ、５時間後、Ｂ、２日後、Ｃ、５日後であり、ピークは約１７分、２１分、及び２４分で、それぞれ化合物１、化合物２、及び化合物３に対応し、２７分のピークは、空気酸化により製造された化合物２の２量体誘導体に対応する。図５は、次のものを示す。Ａ、鋳型４の存在下、０℃で２時間後、化合物１及び２の反応による生成物のＩＥＨＰＬＣで、主なピークはカップリング生成物３及び鋳型４に対応し、化合物１（ピークが１７分）はほとんど完全に消費されたことを注記する；Ｂ、ＫＩ_３で処理した後、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）によって処理した同じ生成物；化合物３は２つのオリゴヌクレオチド開裂生成物により置換され、１８分及び２２分で溶出した。

Claims

診断のためのオリゴヌクレオチドプローブを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的オリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドの隣接位置に少なくとも第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを可逆的に結合する工程であって、これによって、添加試薬の非存在下で、該第１のオリゴヌクレオチド上の第１の反応基および第２のオリゴヌクレオチド上の第２の反応基が、互いに近接するように与えられ、その結果、チオホスホリルアセチルアミノ共有結合が、該第１のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のブロモアセチルアミノと該第２のオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のホスホロチオエートと間に自発的に形成され；
ここで、該第１のオリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、該３’末端または５’末端のブロモアセチルアミノを含む第１の反応基を有し、該第１のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第１の配列に実質的に相補的であり；そして
ここで、該第２のオリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、該５’末端または３’末端のホスホロチオエートを含む第２の反応基を有し、該第２のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第２の配列に実質的に相補的であり、ここで、該第１の塩基配列および該第２の塩基配列は該標的ヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの隣接した位置にある、工程
を包含する、
方法。
請求項１に記載の方法であって、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々は、本質的に、８〜２０のヌクレオチド塩基からなる、方法。
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記ブロモアセチルアミノが前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に提供され、かつ、前記ホススホロチオエートが前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に提供される、方法。
請求項３に記載の方法であって、前記第１のオリゴヌクレオチドがＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ− ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒであり、そして、前記第２のオリゴヌクレオチドがＳＰＯ_３ − ＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧである、方法。
オリゴヌクレオチドプローブとしての用途のための、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む生成物であって、該生成物は、以下：
該第１のオリゴヌクレオチドが、複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、３’末端または５’末端のブロモアセチルアミノを含む第１の反応基を有し、該第１のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、標的オリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第１の配列に実質的に相補的であり；
該第２のオリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、５’末端または３’末端のホスホロチオエートを含む第２の反応基を有し、該第２のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第２の配列に実質的に相補的であり、ここで、該第１の塩基配列および該第２の塩基配列は該標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの隣接した位置にあり；
その結果、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドは、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの隣接した位置に可逆的結合し得、それによって、該第１の反応基および該第２の反応基が互いに近接して与えられ、その結果、チオホスホリルアセチルアミノ共有結合が、添加試薬の非存在下で、該第１のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端ブロモアセチルアミノと該第２のオリゴヌクレオチドの該５’末端または３’末端のホスホロチオエートと間に自発的に形成され得ること；
によって、特徴付けられる、生成物。
請求項５に記載の生成物であって、ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、本質的に、８〜２０ヌクレオチド塩基からなる、生成物。
請求項５または６に記載の生成物であって、前記ブロモアセチルアミノが、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に提供され、かつ、前記ホスホロチオエートが前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に提供される、生成物。
前記請求項７に記載の生成物であって、ここで、該第１のオリゴヌクレオチドがＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒであり、そして、前記第２のオリゴヌクレオチドがＳＰＯ_３−ＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧである、生成物。
インビトロで、診断用オリゴヌクレオチドプローブを形成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的オリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドの隣接位置に少なくとも第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを可逆的に結合する工程であって、ここで、
該第１のオリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、該３’末端または５’末端のブロモアセチルアミノを含む第１の反応基を有し、該第１のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第１の配列に実質的に相補的であり；そして
該第２のオリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチド塩基単位を含み、そして、該５’末端または３’末端のホスホロチオエートを含む第２の反応基を有し、該第２のオリゴヌクレオチドの該ヌクレオチド塩基単位が、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの塩基単位の第２の配列に実質的に相補的であり、ここで、該第１の塩基配列および該第２の塩基配列は該標的ヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドの隣接した位置にある、工程；
（ｂ）添加試薬の非存在下で、該標的オリゴヌクレオチドまたは該標的ポリヌクレオチドに対する、該第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの結合の際に互いに隣接して与えられた、該第１の反応基および該第２の反応基を介して該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドを一緒にして共有結合させて、チオホスホリルアセチルアミノ結合を自発的に形成する工程
を包含する、
方法。
工程（ａ）および工程（ｂ）が水溶液中で生じる、請求項９に記載の方法。
前記第１のオリゴンヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、本質的に、８〜２０ヌクレオチド塩基からなる、請求項９または１０に記載の方法。
請求項９〜１１のいずれかに記載の方法であって、前記ブロモアセチルアミノが、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に提供され、そして、前記ホスホロチオエートが前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に提供される、方法。
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドがＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ− ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｂｒであって、そして、前記第２のオリゴヌクレオチドがＳＰＯ_３−ＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧである、方法。