JP4058665B2 - ２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２−デオキシリボース５−リン酸を、微生物の菌体又は微生物由来の酵素により高収率で安定的に製造する方法及び該製造に利用しうる酵素を産生する微生物に関する。２−デオキシリボース５−リン酸はデオキシヌクレオシド類の生化学的合成における出発原料である。また、該化合物を脱リン酸することによって２−デオキシリボースを得ることができるが、２−デオキシリボースはヌクレオシド類の化学合成の出発原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
２−デオキシリボース５−リン酸は、ＤＮＡの酵素による加水分解又は２-デオキシリボースの化学的リン酸化により調製されてきた。しかし、前者の方法は原料となるＤＮＡが高価でかつ分離・精製の工程が多く、後者はデオキシリボースを位置選択的にリン酸化することが困難で、安価に２−デオキシリボース５−リン酸を調製することはできなかった。
【０００３】
生体内では、２−デオキシリボース５−リン酸は、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドから２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ、ＥＣ４．１．２．４）の触媒作用により生成することが知られている。しかし、この反応による２−デオキシリボース５−リン酸の調製は、基質となるグリセルアルデヒド３−リン酸の化学的合成が容易でなく、合成原料となるグリセルアルデヒドが不安定で、より安定な異性体であるジヒドロキシアセトンへ異性化しやすいという問題を有する。
【０００４】
一方、グリセルアルデヒド３−リン酸は、生体内で、ジヒドロキシアセトンリン酸のトリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＥＣ５．３．１．１）による異性化反応により生成することが知られている。この反応の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸は化学的及び生化学的に合成することが可能である（例えば、Ｉｔｏｈ，Ｎ．，Ｔｕｊｉｂａｔａ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ．；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５１巻，１９３−２００頁，１９９９年）。
【０００５】
しかしながら、上記報告は学術的にペントースの生体内代謝を明らかにしたり、アルドラーゼの立体特異的作用を解明しようとしたものであって、グリセルアルデヒド３−リン酸や２−デオキシリボース５−リン酸の工業的生産を目的にしたものではない。また、従来、２−デオキシリボース５−リン酸の工業的製法は全く報告されていない。
【０００６】
更に下記のとおり、学術文献において、酵素又は酵素試薬による２−デオキシリボース５−リン酸の生成が数例報告されている。
【０００７】
その一つとして、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドを基質として、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼにより２−デオキシリボース５−リン酸を生成させたとの報告（Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．； Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２巻，２０１３−２０１４頁，１９９０年）が存在する。しかしながら、本報告には生成物の量が示されていないために、原料基質に対する２−デオキシリボース５−リン酸の生成収率を知ることができない。
【０００８】
また、別の報告として、ジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドを基質として、市販の生化学試薬のトリオースリン酸イソメラーゼと、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子（ｄｅｏ Ｃ ｇｅｎｅ）を保持するプラスミドにより形質転換した大腸菌から調製した２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ粗酵素を用いて、ホスファターゼ阻害剤であるＥＤＴＡと窒素ガスの存在下で２−デオキシリボース５−リン酸を得たとの報告（Ｃｈｅｎ，Ｌ，Ｄｕｍａｓ，Ｄ．Ｐ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．； Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４巻，７４１−７４８頁，１９９２年）がある。しかしながら、これら学術文献記載の内容は、起源を異にする試薬レベルの精製された酵素を用い、また、ホスファターゼによる脱リン酸を阻害するために著量のＥＤＴＡを用いるが完全にその影響を除去できないなど、工業的生産には適さないものであった。
【０００９】
更に、グリセルアルデヒド３−リン酸は、解糖系、ペントースリン酸回路などの糖代謝の重要な中間体である（例えば、東京化学同人、生化学辞典、第３版、４１１頁、１９９８年）。したがって、グリセルアルデヒド３−リン酸は細胞内で各種の酵素によって多方向に代謝される。また、ホスファターゼによって、容易にリン酸部位が切断されるという問題を有する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、２−デオキシリボース５−リン酸を高収率で安定して生産する方法を提供することである。本発明において、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドを基質として、又はジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドを基質として高収率で２−デオキシリボース５−リン酸を得るために、本物質の合成に関与する酵素を著量含有し、かつホスファターゼなどの不必要な解糖系酵素を極微量しか含まない微生物を見い出すことを第一の目的とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、多種の膨大な量の菌株について、三次に亘り上述の条件を満たす微生物の探索を行った。その結果、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドとを基質として、又はジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドとを基質として、高収率で２−デオキシリボース５−リン酸を生成する微生物を見い出し本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１６】
（１）グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドとを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有するクレブシエラ属の微生物の菌体又は該微生物に由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させることを特徴とする２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【００１７】
（２）ジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドとを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼとトリオースリン酸イソメラーゼとを含有するクレブシエラ属の微生物の菌体又は該微生物に由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させることを特徴とする２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【００１８】
（３）前記微生物がクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）である上記（１）記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
（４）前記微生物がクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）である上記（２）記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【００１９】
（５）２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼとトリオースリン酸イソメラーゼを産生し、かつホスファターゼを実質的に産生しない微生物であるクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
＜酵素反応による２−デオキシリボース５−リン酸の合成＞
本発明の方法では、下記（１）式に示すように、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドを原料として、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（以下、ＤＥＲＡと略す）を含有する微生物の菌体又は該微生物由来の酵素の触媒作用により、２−デオキシリボース５−リン酸を製造する。（１）式の反応は平衡反応であるが、平衡は２−デオキシリボース５−リン酸の生成側に片寄っている。
【００２２】
【化１】

【００２３】
また、下記（２）式に示すように、ジヒドロキシアセトンリン酸をトリオースリン酸イソメラーゼ（以下、ＴＰＩと略す）を含有する微生物の菌体又は該微生物由来の酵素の触媒作用により異性化させ、グリセルアルデヒド３−リン酸を製造する。
【００２４】
【化２】

【００２５】
本発明において、トリオースリン酸イソメラーゼと２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが同時に存在する場合には、ジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドを原料として、該微生物の菌体又は該微生物由来の酵素の触媒作用により、（２）式の異性化とそれに続く（１）式のアルドラーゼ反応が連続的に起こり、２−デオキシリボース５−リン酸を生成することができる。
【００２６】
本発明のように、（１）式及び（２）式の反応において微生物がホスファターゼを実質的に含有しておらず、ホスファターゼによるリン酸基の除去など不必要な代謝が生じない場合はその分だけ、２−デオキシリボース５−リン酸の生成は理論値に近づくことになる。
【００２７】
＜原料＞
本発明で原料として使用する、アセトアルデヒド、グリセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸は全て市販されている(例えば、シグマ・アルドリッチ・ジャパン社、１９９９年総合カタログ参照)。本発明の原料として用いられる化合物は、通常工業原料として用いられる程度の純度以上であれば十分である。
【００２８】
グリセルアルデヒド３−リン酸は、ＤＬ−グリセルアルデヒド３−リン酸を使用することができるが、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸がより好ましい。
【００２９】
あるいは、ジヒドロキシアセトンリン酸は合成により入手可能であり、例えば、工業原料として用いられるジヒドロキシアセトンとオキシ塩化燐から合成することができる。また、ジヒドロキシアセトンとアセチルリン酸を原料とし、ジヒドロキシアセトン・キナーゼ（ＥＣ２．７．１．２９）を触媒として生化学的に合成することができる（例えば、Ｉｔｏｈ，Ｎ．，Ｔｕｊｉｂａｔａ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ．； Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５１巻，１９３−２００頁，１９９９年）。
【００３０】
＜微生物及び酵素＞
本発明に用いられるデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ；ＥＣ４．１．２．４）及びトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ；ＥＣ５．３．１．１）は原理的にはいかなる微生物の起源のものでもかまわない。本発明で使用する微生物は、基質としてグリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドを使用する場合には、ＤＥＲＡを含有する微生物であれば限定されない（微生物がＴＰＩを含有していても差し支えない）。また、基質としてジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドを使用する場合には、ＤＥＲＡとＴＰＩを含有する微生物であれば特に限定されない。何れの基質を使用する場合にも、微生物は、ホスファターゼを実質的に含有しないものが好ましい。なお、本発明においてホスファターゼを実質的に含有しないとは、当該酵素を含有しないか、又は含有していても当該酵素が本発明の製造方法に影響を及ばさない微弱な活性しか示さないことを意味する。
この条件を満たす微生物として何れも、好ましくは腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。具体的にはクレブシエラ属、エンテロバクター属又はエシェリヒア属に属する微生物が挙げられる。更に具体的菌株として何れも、好ましくはクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）である。
本菌株は財団法人発酵研究所（Institute for Fermentation, Osaka；2-17-85, juso-honmachi, yodogawa-ku, Osaka, 532-8686, Japan）に寄託されている（平成１３年３月１日）。なお、本菌株は、国立感染症研究所が作成した微生物のバイオセーフティーレベルによれば、レベル２に属するものであるため、ブダペスト条約上の国際寄託当局である産業技術総合研究所（旧工業技術院）生命工学工業技術研究所により受託を拒否され、平成１３年２月２７日付けでその旨証明されている。
【００３１】
本発明において、微生物の菌体又は該微生物に由来の酵素によりとは、微生物を含有する懸濁液（菌体懸濁液）、又は該微生物から産生される酵素を用いて反応を行うことを意味する。すなわち、本発明は、菌体懸濁液そのものを用いて反応を行ってもよく、また微生物から産生される酵素を取り出して該反応を行ってもよい。
【００３２】
＜反応条件及び生成物の分離精製と定量＞
次に、２−デオシキリボース５−リン酸の生成反応における反応条件について記す。なお、特段の記載がない限り、以下の反応条件は、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドを反応基質として使用した反応、およびジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドを反応基質として使用した反応についての両条件をいう。
【００３３】
本発明において、原料のリン酸化合物としてグリセルアルデヒド３−リン酸を使用する場合、ジヒドロキシアセトンリン酸を使用する場合の何れも、その初期濃度は５〜５００ｍＭであり、好ましくは２５〜１５０ｍＭである。アセトアルデヒドの初期濃度は１５〜１０００ｍＭであり、好ましくは１５０〜４００ｍＭである。また、基質となるリン酸化合物に対するアセトアルデヒドの濃度が高い方が、２−デオキシリボース５−リン酸のリン酸化合物に対する収率は増大する。
【００３４】
反応液のｐＨは４．０〜１２．５であり、好ましくは８．５〜９．５である。反応温度は２０〜６０℃であり、好ましくは２５〜４０℃である。反応時間は反応条件によって左右されるが、通常２〜６時間で終了する。
【００３５】
反応液として使用する緩衝液は、上記ｐHに調整することが可能な任意の緩衝液および水が使用可能である。基質としてグリセルアルデヒド３−リン酸を使用した場合は、100〜400ｍMの緩衝液（ｐH８．５〜９．５）が好ましく、200ｍMのトリス−塩酸緩衝液（ｐH９．０）がより好ましく、ジヒドロキシアセトンリン酸を使用した場合は、水が好ましい。
【００３６】
反応に使用する微生物は、好ましくは、保存微生物を予めＤＲ培地等の栄養培地で、３〜２５時間培養したものが使用され、より好ましくは８〜２０時間培養したものが使用される。
【００３７】
また、反応に使用する菌体濃度は、好ましくは、１.０〜２０重量％であるが、菌体濃度が高いほど２−デオキシリボース５−リン酸の生成の上で好ましい。
【００３８】
なお、反応液からの生成物の採取は、限外ろ過、イオン交換分離、吸着クロマトグラフィーなどにより行うことができる。
【００３９】
反応生成物の定量は２つの方法により行った。第１の方法はバートン（Ｂｕｒｔｏｎ）法である（例えば、東京化学同人、生化学辞典・第３版、６６４頁、１９９８年）。本法は、ジフェニルアミン・酢酸・硫酸反応により、鋭敏に２−デオキシリボースを検出する特異性の高い定量法で、２−デオキシリボース５−リン酸の吸光係数は２−デオキシリボースのそれと等しい。
【００４０】
第２の方法は、ＤＮＡの比色定量法であるシステイン・硫酸（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｓｕｌｆａｔｅ）法の応用である（例えば、Ｓｔｕｍｐｆ，Ｐ．Ｋ．； Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１６９巻，３６７−３７１頁，１９４７年）。本法により２−デオキシリボース５−リン酸を定量した。
【００４１】
＜培養条件と酵素の調製＞
本微生物は通常の細菌用培地によく生育し、該酵素を生産するが、培地に２−デオキシリボース、フルクトース、フルクトース−１，６−二リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸などを０.１〜２.０重量％添加することは、酵素活性を高めるうえで有効である。
【００４２】
炭素源および窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトンなどを、無機塩としては、塩化アンモニウム、硝酸カリウムなどを用いることができる。
【００４３】
培養した菌体はそのまま本酵素反応に利用することが可能であるが、通常の方法に（超音波又はミルによる破砕、遠心分離、硫安分離、膜分離など）より微生物由来の酵素を得てこれを用いることもできる。
【００４４】
＜菌学的性質＞
寄託菌株の菌学的性質を、バージェイス・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻（１９８４年）及びバージェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第９版（１９９４年）に準じて検討した結果は、次のようである。なお、実験は主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。
【００４５】
クレブシエラ・ニュモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）［以下、Ｂ−４４株と略す］。
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．８×０．８〜３．２μｍ
（２）グラム染色性： 陰性
（３）細胞の多形性の有無： なし
（４）運動性： なし
（５）鞭毛の着生状態： なし
（６）胞子の有無： なし
（７）抗酸性： なし
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養： 円形、全縁滑らか、低凸状、表層滑らか、乳黄色
（２）肉汁寒天斜面培養： 乳黄色、不透明で培地全体に拡がり生育は良好である。
（３）肉汁液体培養： 濁りは中程度で均一、色なし
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 変化なし
（５）リトマスミルク： やや酸性、凝固、ガス発生
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元： 陽性
（２）脱窒反応： 陰性
（３）ＭＲテスト： 陽性
（４）ＶＰテスト： 陰性
（５）インドールの生成： 陰性
（６）硫化水素の生成： 陰性
（７）デンプンの加水分解： 陰性
（８）クエン酸の利用
・コーザー（Ｋｏｓｅｒ）培地： 陽性
・クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培地： 陽性
（９）無機窒素源の利用：
・硝酸塩： 陽性（弱い）
・アンモニウム塩： 陽性（弱い）
（10）色素の産生： 陰性
（11）ウレアーゼ： 陰性
（12）オキシダーゼ： 陰性
（13）カタラーゼ： 陽性
（14）生育の範囲
・ｐＨ： ３．５〜１０．２（至適５．０〜８．０）
・温度域： １０〜４０℃（至適２２〜３０℃）
（15）酸素に対する態度： 均一に生育、ガス発生
（16）Ｏ−Ｆテスト
・グルコース： Ｆ
４．その他種の特徴を示すに必要なもの
（１）各種炭素源の利用
・ラクトース： ＋
・マルトース： ＋
・Ｄ−キシロース： ＋
・Ｄ−マンニトール： ＋
・ラフィノース： ＋
・Ｄ−ソルビトール： ＋
・シュークロース： ＋
・イノシトール： ＋
・アドニトール： ＋
・Ｌ−ラムノース： ＋
・Ｌ−アラビノース： ＋
・Ｄ−マンノース： ＋
（２）β−ガラクトシダーゼ： ＋
（３）アルギニン脱炭酸： −
（４）リジン脱炭酸： ＋
（５）オルニチン脱炭酸： −
（６）エスクリン加水分解： ＋
（７）有機酸の利用
・マロン酸： ＋
・クエン酸： ＋
・グルコン酸： ＋
・ｎ−カプリン酸： −
・アジピン酸： −
・ＤＬ−リンゴ酸： ＋
（８）アセトアミド利用： −
（９）インドール・ピルビン酸産生： −
（10）アルギニンデヒドロラーゼ： −
（11）ゼラチン加水分解： −
（12）酢酸フェニル資化能： −
５．化学分類学的性質
（１）ＧＣ含量： ５０〜５２mol％（ＨＰＬＣ法）
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はクレブシエラ・ニュモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と判明した。
【００４６】
【実施例】
以下、実験例及び実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００４７】
なお、実験例及び実施例において、２−デオキシリボースおよび２−デオキシリボース５−リン酸の分析はともに、下記のＴＬＣ、バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）法及びシステイン・硫酸法により行った。実際に、後述の実験例３に示すＤＲ培地に標品化合物を添加し、バートン法及びシステイン・硫酸法により同定、定量を行った結果、秤込み量と定量値はよく一致した。
【００４８】
（１）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による糖類の検出・同定
薄層クロマトグラフィー用プレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４、メルク社製）に、標品の２−デオキシリボース５−リン酸、２−デオキシリボース、アセトアルデヒド、グリセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸と試料をスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）で展開後、ｐ−アニスアルデヒド・硫酸（ｐ−アニスアルデヒド０．５ｍＬを酢酸５０ｍＬに溶かし、濃硫酸１ｍＬを加える）を噴霧して加熱し、そのＲｆ値と呈色状態から生成物の検出同定を行った。
【００４９】
（２）バートン法による２−デオキシリボース５−リン酸の定量
ジフェニルアミン１．５ｇを１．５ｍＬの濃硫酸を含む再蒸留氷酢酸１００ｍＬに溶解しておく。使用前に、この溶液２０ｍＬに対して０．１ｍＬのアセトアルデヒド水溶液（１６ｍｇ/ｍＬ）を加えた試薬２ｍＬを、２−デオキシリボース５〜１００μｇを含む試料１ｍＬに加え、３０℃で１６〜２０時間放置し、６００ｎｍの吸光度を測定した。スケールは適宜縮小できた。ＴＬＣによって、２-デオキシリボースが検出されなければ、定量値はすべて２−デオキシリボース５−リン酸の生成量である。
【００５０】
（３）システイン・硫酸法による２−デオキシリボース５−リン酸の定量
２−デオキシリボース５−リン酸５〜１００μｇを含む標準試料液を作成調製しておく。１７．５μＬの試料液に、１７．５μＬの５％（ｗ／ｖ）システイン−塩酸溶液を加え、更に１７５μＬの７０％硫酸を加える。素早く撹拌し、１０分間２５℃室温に放置し、４９０ｎｍで吸光度を測定する。
【００５１】
実験例１：２−デオキシリボース分解能を指標とした１次スクリーニング
細菌約７００株、放線菌１００株、黴１００株、担子菌１００株、及び２−デオキシリボース資化性土壌細菌約５００株を常法により振盪又は静置培養し、湿菌体を得た。各菌体を２−デオキシリボース（２０ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に加え、２８℃で１〜２日間振盪した。ろ過液の所定量をＴＬＣプレートにスポットし、２−デオキシリボースの分解状態を分析した。その結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】

【００５３】
実験例２：細胞抽出液による２−デオキシリボースからのアセトアルデヒドの生成を指標とした２次スクリーニング
実験例１で２−デオキシリボース分解能の認められた菌株を、常法により培養し、超音波で菌体を破砕し、遠心分離により上清を得た。上清２０μＬを、１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２０μＬ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）１０μＬ、３０Ｕのアルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン社製、１．０μｍｏｌのエタノールをｐＨ８．８、２５℃で１分間にアルデヒドへ変換する活性を１Ｕとする）、２−デオキシリボース５−リン酸又は２−デオキシリボース１０μＬを加え、３０℃で放置し、経時的に３４０ｎｍでの吸光度の変化を測定した。
【００５４】
【化３】

【００５５】
これは、アセトアルデヒドのエタノールへの還元に伴って起こるＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって、２−デオキシリボース５−リン酸又は２−デオキシリボースが２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼにより分解されて生じたアセトアルデヒドを定量したことを意味する。
【００５６】
アセトアルデヒド生成量から得られた、各菌株の２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの活性の強さは表２のようであった。表２において、「−」は酵素活性が検出されなかったことを、「＋」は活性が検出され、＋数が多いほど活性が強いことを意味する。
【００５７】
【表２】

【００５８】
実験例３：菌体培養培地の選定
下記の各培地に、実験例２において強い活性を示した土壌分離菌８株を２８℃で１夜振盪培養し、湿菌体を得た。実験例２と同様にして、２−デオキシリボース５−リン酸分解活性を測定した結果、一般にＤＲ培地に培養した場合、他の２種の培地に比べて活性が２〜数倍上昇することが分かった。ＤＲ培地の２−デオキシリボースの代わりに、フルクトース、フルクトース−１，６−二リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸などをそれぞれ加えた場合も、２−デオキシリボースに比べ若干効果は低いが活性の上昇が認められた。
【００５９】
＜培地＞
（１）ＮＢ培地：０．１％酵母エキス添加ニュートリエント・ブロス（ＤＩＦＣＯ社製）
（２）ＴＧＹ培地：０．５％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ製）、０．５％酵母エキス、０．１％グルコース、０．１％リン酸二カリ（ｐＨ７．０）
（３）ＤＲ培地：０．５％２−デオキシリボース、０．２％塩化アンモニウム、０．１％リン酸一カリ、０．１％リン酸二カリ、０．０３％硫酸マグネシウム・七水塩、０．０１％酵母エキス（ｐＨ７．０）
【００６０】
実験例４：アセトアルデヒドとグリセルアルデヒド３−リン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸の合成能を指標とした３次スクリーニング
実験例２において、強いデオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を示した土壌分離菌８株の活性比較を下記条件により行った。２−デオキシリボース５−リン酸は検出されたが、２−デオキシリボースは検出されなかった。定量値から、Ｂ−４４株が、最も優れた菌株であることが分かった。また、ｐＨ７．０よりもｐＨ８．５においてより多くの２−デオキシリボース５−リン酸が生成することが分かった。
【００６１】
＜湿菌体（ｗｅｔ−ｃｅｌｌｓ）の調製＞
５ｍＬのＤＲ培地を試験管（１６×１６５ｍｍ）に入れ、土壌分離菌株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間、３００ｒｐｍで振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＤＲ培地を含む２Ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃で２日間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。８０００ｒｐｍで遠心分離し、０．８５％（ｗ／ｖ）の食塩水で２度洗浄して、湿菌体を得た。
【００６２】
＜反応条件＞
１６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）又は１６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３３３ｍＭアセトアルデヒド、１００ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド３−リン酸になるように調合した６０μＬの水溶液に、２０％（ｗ／ｖ）の湿菌体を加え、３０℃で３時間撹拌した。遠心分離により上清を得て、生成した２−デオキシリボース５−リン酸を定量した。
【００６３】
実施例１：Ｂ−４４株の酵素系が２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの生成に利用可能な基質
１５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）又は１６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に、アセトアルデヒドが３３３ｍＭ、表３記載の基質を加えた各溶液に、２０％（ｗ／ｖ）のＢ−４４株湿菌体（実験例３に示したＤＲ培地に２８℃で１夜振盪培養した）を加え、それぞれ３０℃で３時間撹拌した。遠心分離により上清を得て、生成した２−デオキシリボース５−リン酸を分析した。
【００６４】
結果を表３に示す。２−デオキシリボース５−リン酸の生成はアルカリ側で有利であり、ＤＬ−グリセルアルデヒド３−リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸が良好な基質であることが示された。なお、表３において、「−」は２−デオキシリボース５−リン酸の生成はゼロか痕跡程度であったことを、「＋」は２−デオキシリボース５−リン酸が生成され、＋数の多いほど生成量は大きかったことを意味する。
【００６５】
【表３】

【００６６】
実施例２：至適菌体培養時間
下記条件によりＢ−４４株を培養し、経時的に湿菌体を得て、２−デオキシリボース５−リン酸の生成能を測定した。
【００６７】
結果を図１に示す。グリセルアルデヒド３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸のいずれを基質とした場合にも、培養時間１０〜１２時間後の菌体が、最も高い活性を示した。そこで、これ以降の実施例は、全て培養１０〜１２時間後の湿菌体を用いることにした。なお、図１において、「−○−」はグリセルアルデヒド３−リン酸を基質とした場合の２−デオキシリボース５−リン酸の生成量（ｍＭ）を、「−△−」はジヒドロキシアセトンリン酸を基質とした場合の２−デオキシリボース５−リン酸の生成量（ｍＭ）を、「−□−」はＢ−４４株の生育度（濁度）を意味する［図２以降の図中の記号「−○−」、「−△−」も同様の意味を有する］。
【００６８】
＜培養条件と湿菌体（ｗｅｔ−ｃｅｌｌｓ）の調製＞
５ｍＬのＤＲ培地を試験管（１６×１６５ｍｍ）に入れ、Ｂ−４４株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間、３００ｒｐｍで振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＤＲ培地を含む２Ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで振盪培養した。経時的に培養液を採取して８０００ｒｐｍで遠心分離し、０．８５％（ｗ／ｖ）の食塩水で２度洗浄して、湿菌体を得た。別に、Ｂ−４４株湿菌体と濁度との関係を求め、換算式を作成した。
【００６９】
＜反応条件＞
（１）グリセルアルデヒド３−リン酸を基質にした場合
グリセルアルデヒド３−リン酸：８７．５ｍＭ
アセトアルデヒド：２００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液：２００ｍＭ、ｐＨ９．０
湿菌体：１２．５％（ｗ／ｖ）
反応：３０℃、３時間振盪
（２）ジヒドロキシアセトンリン酸を基質にした場合
ジヒドロキシアセトンリン酸：１１６．６ｍＭ
アセトアルデヒド：２００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液：２００ｍＭ、ｐＨ９．０
湿菌体：１６．６％（ｗ／ｖ）
反応：３０℃、３時間振盪
【００７０】
＜定量方法＞
反応終了後、直ちに遠心分離により上清を得て、生成した２−デオキシリボース５−リン酸を定量した。
【００７１】
実施例３：至適反応ｐＨ
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応液の至適ｐＨを求めた。反応条件はｐＨ及び緩衝液をｐＨ６．０〜８．５（１５０ｍＭリン酸緩衝液）、ｐＨ７．５〜１０．０（１５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液）のように変化させた以外は、実施例２と同様の条件に従った。結果を図２に示す。グリセルアルデヒド３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸のいずれを基質とした場合にも、至適ｐＨは９．０であった。
【００７２】
実施例４：反応用緩衝液の至適濃度
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応用緩衝液の至適濃度を求めた。反応条件はｐＨ９．０のトリス−塩酸緩衝液の濃度を０〜９００ｍＭまで変化させた以外は、実施例２と同様の条件に従った。結果を図３に示す。グリセルアルデヒド３−リン酸を基質にした場合は緩衝液濃度が２００ｍＭのときに最大活性を示した。一方、ジヒドロキシアセトンリン酸を基質にした場合は、緩衝液濃度が低いほど活性は上昇し、緩衝液なし（水だけ）の場合に活性は最大になった。
【００７３】
実施例５：反応液中の至適菌体濃度
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応液中の至適菌体濃度を求めた。反応条件はジヒドロキシアセトンリン酸を基質とした場合に、反応液に水を用いた以外は、実施例２と同様の条件に従った。結果を図４に示す。グリセルアルデヒド３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸のいずれを基質とした場合にも、調査した菌体濃度、０．７５〜１６．６％（ｗ／ｖ）、の範囲で菌体濃度が高いほど多くの２−デオキシリボース５−リン酸が生成した。調査した範囲で菌体濃度と生成する２−デオキシリボース５−リン酸量の間にはほぼ直線的比例関係が認められた。
【００７４】
実施例６：反応液中の至適アセトアルデヒド濃度
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応液中のアセトアルデヒドの至適濃度を求めた。反応条件はアセトアルデヒドの濃度を０〜１０００ｍＭまで変化させ、基質がジヒドロキシアセトンリン酸の場合は緩衝液の代わりに水を用いた以外は、実施例２と同様の条件に従った。結果を図５に示す。８７．５ｍＭのグリセルアルデヒド３−リン酸、１１６．６ｍＭのジヒドロキシアセトンリン酸のいずれを基質とした場合も、アセトアルデヒドの至適濃度は２００ｍＭであった。
【００７５】
実施例７：至適基質濃度
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応液中の基質の至適濃度を求めた。反応条件は基質であるグリセルアルデヒド３−リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸の濃度を０〜１２５ｍＭまで変化させ、基質がジヒドロキシアセトンリン酸の場合は緩衝液の代わりに水を用いた以外は、実施例２と同様の条件に従った。
【００７６】
結果を図６に示す。２００ｍＭアセトアルデヒド存在下において、両者とも濃度が高いほど２−デオキシリボース５−リン酸の生成量は多くなった。しかし、調べた範囲でジヒドロキシアセトンリン酸の場合は濃度の増大につれてほぼ比例して直線的に２−デオキシリボースの生成量が増したのに反し、グリセルアルデヒド３−リン酸の場合は２５ｍＭ付近から生成量に頭打ちの傾向が認められた。
【００７７】
実施例８：至適反応温度
培養時間１０〜１２時間後の湿菌体を用いて、反応液の至適温度を求めた。反応条件は温度を変化させ、ジヒドロキシアセトンリン酸を基質とする場合は緩衝液の代わりに水を用いた以外は、実施例２と同様の条件に従った。結果を図７に示す。グリセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸のいずれを基質とした場合も、至適温度は３０℃であった。
【００７８】
実施例９：至適条件下でのグリセルアルデヒド３−リン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸生産の経時変化
実施例８までに得られた結果を基に、下記の至適条件下でのグリセルアルデヒド３−リン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸の生産の経時変化を追跡した。結果を図８に示す。反応開始５時間後に最も高い収率が得られ、２００ｍＭのアセトアルデヒドと８７．５ｍＭのグリセルアルデヒド３−リン酸から７０．８ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸が得られた。グリセルアルデヒド３−リン酸に対する収率は８０．９％であった。
【００７９】
＜培養条件と湿菌体（ｗｅｔ−ｃｅｌｌｓ）の調製＞
５ｍＬのＤＲ培地を試験管（１６×１６５ｍｍ）に入れ、Ｂ−４４株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間、３００ｒｐｍで振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＤＲ培地を含む２Ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで１０〜１２時間振盪培養した。０．８５％（ｗ／ｖ）の食塩水で２度洗浄して、湿菌体を得た。
【００８０】
＜反応条件＞
グリセルアルデヒド３−リン酸：８７．５ｍＭ
アセトアルデヒド：２００ｍＭ
トリス／塩酸緩衝液：２００ｍＭ、ｐＨ９．０
湿菌体：１２．５％（ｗ／ｖ）
反応：３０℃、３時間振盪
【００８１】
実施例１０：至適条件下でのジヒドロキシアセトンリン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸生産の経時変化
実施例８までに得られた結果を基に、下記の至適条件下でのジヒドロキシアセトンリン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸の生産の経時変化を追跡した。結果を図９に示す。反応開始５時間後に最も高い収率が得られ、２００ｍＭのアセトアルデヒドと１１６．６ｍＭのジヒドロキシアセトンリン酸から９８．７ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸が得られた。ジヒドロキシアセトンリン酸に対する収率は８４．６％であった。
【００８２】
＜培養条件と湿菌体（ｗｅｔ−ｃｅｌｌｓ）の調製＞
５ｍＬのＤＲ培地を試験管（１６×１６５ｍｍ）に入れ、Ｂ−４４株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間、３００ｒｐｍで振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＤＲ培地を含む２Ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで１０〜１２時間振盪培養した。０．８５％（ｗ／ｖ）の食塩水で２度洗浄して、湿菌体を得た。
【００８３】
＜反応条件＞
ジヒドロキシアセトンリン酸：１１６．６ｍＭ
アセトアルデヒド：２００ｍＭ
水溶液：緩衝液は用いず、蒸留水を用いた。
湿菌体：１６．６％（ｗ／ｖ）
反応：３０℃、３時間振盪
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドとから、又はジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドとから、微生物の酵素反応により、２−デオキシリボース５−リン酸を高収率で安定的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する培養時間の効果を示すグラフ。
【図２】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する反応液ｐＨの効果を示すグラフ。
【図３】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対するトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）の濃度効果を示すグラフ。
【図４】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する反応液中の菌体濃度の効果を示すグラフ。
【図５】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する反応液中のアセトアルデヒド濃度の効果を示すグラフ。
【図６】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する反応液中の基質であるグリセルアルデヒド３−リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸濃度の効果を示すグラフ。
【図７】 ２−デオキシリボース５−リン酸の生成に対する反応液温度の効果を示すグラフ。
【図８】 至適条件下でのグリセルアルデヒド３−リン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸生産の経時変化を示すグラフ。
【図９】 至適条件下でのジヒドロキシアセトンリン酸からの２−デオキシリボース５−リン酸生産の経時変化を示すグラフ。

Claims (5)

1. グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドとを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有するクレブシエラ属の微生物の菌体又は該微生物に由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させることを特徴とする２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
2. ジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアルデヒドとを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼとトリオースリン酸イソメラーゼとを含有するクレブシエラ属の微生物の菌体又は該微生物に由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させることを特徴とする２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
3. 前記微生物がクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）である請求項１記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
4. 前記微生物がクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）である請求項２記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
5. ２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼとトリオースリン酸イソメラーゼを産生し、かつホスファターゼを実質的に産生しない微生物であるクレブシエラ・ニュモニエ Ｂ−４４（ＩＦＯ １６５７９）。

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