JP4051421B2 - 等電点電気泳動によるダルバヘプチド抗生物質の精製 - Google Patents

Description

本発明は、等電点電気泳動として知られている電気泳動技術によるダルバヘプチド（dalbaheptide）族の抗生物質化合物の精製方法に関する。
より明確には、本精製法は、固定膜、特に両性イオン膜を有する多仕切りの（ｍｕｌｔｉｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）電解槽におけるダルバヘプチド抗生物質の等電点電気泳動（ＩＥＦ）に関する。
本発明のさらなる目的は、本方法により得ることができる純粋な抗生物質化合物、特に抗生物質Ａ４０９２６の純粋な６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）−Ｎ⁶³−３−（ジメチルアミノ）プロピルアミド誘導体である。
固定膜を有する多仕切りの電解槽におけるＩＥＦの原理及び方法の完全な記述を参考文献５に見いだすことができる。
この技術により精製される化合物は、確定した等電点（ｐＩ）及びそのｐＩ値での優れた緩衝特性を有することを特徴とする両性物質である（参考文献１０２を参照）。精製される混合物は液体路（ｌｉｑｕｉｄ ｖｅｉｎ）に含まれ、そして所望する化合物のｐＩを包含している等電点を有する２枚の固定膜により境界を定められている一組の仕切り（ｃｈａｍｂｅｒ）の一つの中に分離される。従って、連続する電気泳動滴定工程により、等電でないかまたは異なるｐＩ値を有するかのいずれかの全ての他の夾雑物は、より陽極または陰極の仕切りへ向かって仕切りから移動させられ、一方、精製された化合物は最初の仕切りに残される。
この精製技術は、エグリンＣ（参考文献５）、エイズウイルスのｇｐ−４１に対するモノクローナル抗体（参考文献１０３）、組み換えヒト成長ホルモン（参考文献１０４）、上皮成長因子レセプター（参考文献１０５及び１０６）、組み換えスーパーオキシドジスムターゼ（参考文献１０７）、インターロイキン（参考文献１０８）及びグルコアミラーゼ（参考文献１０９）のような多数のタンパク質に適用されている。
本発明は、そのようなＩＥＦ精製技術を約１８００ダルトンの分子量を有するいくぶん小さい分子に、そして特にダルバヘプチド族の抗生物質化合物に適応するために適した方法論を初めて開示する。
ダルバヘプチドという用語は、通常、５個が常にアリール−及びアリールメチル−アミノ酸である７個のアミノ酸からなる非常に修飾された直鎖状のヘプタペプチド構造を共通に有し、該構造が共通の作用機構、すなわち、細胞破壊をもたらす細胞壁合成の一つまたはそれより多い中間体のＤ−アラニル−Ｄ−アラニン末端との特異的な錯形成反応の決定因である全ての抗生物質を定義する。従って、ダルバヘプチドという用語は、ヘプタペプチド構造を有するＤ−アラニル−Ｄ−アラニン結合抗生物質という表現に由来する。
通常、ダルバヘプチド抗生物質を以下の一般式Ｉ、

式中、
Ｗ、Ｚ、Ｘ₁、Ｘ₂及びＴは、ダルバヘプチド群の抗生物質の相対的な部分を表し、そしてＹはカルボン酸基またはその機能的誘導体を表す、
により表すことができる。
一般式Ｉは、酸及び塩基とダルバヘプチド抗生物質の塩、並びにそれらの内部塩を含む。
式Ｉにより表される一般構造において、上記の５個の基本となるアリール−及びアリールメチルアミノ酸は、部分Ｚ及びＷと結合したものである。それぞれのアリール部分の置換のわずかな違いは別として、これらの５個のアリール−及びアリールメチルアミノ酸はダルバヘプチド抗生物質群の全てのメンバーに実質的に共通であり、一方、置換基Ｘ₁及びＸ₂を保有する２個の残りのアミノ酸部分の異なる型及び構造により、これまで知られているダルバヘプチドは４つの異なる亜群へさらに分類され、これらの亜群の各々は、実際的な理由で、以前の科学文献において糖ペプチド抗生物質として通常同定されているその群のよく知られた抗生物質で呼ばれる。
該４つの亜群をそれぞれリストセチン型、バンコマイシン型、アボパルシン型及びシンモニシン型抗生物質と定義することができる。
ダルバヘプチド抗生物質の詳細な分類に関しては、参考文献１及び２を参照。
本明細書の用語及び定義により、ダルバヘプチド抗生物質及び現在これらが分類される４つの亜群は、微生物株の代謝物質として生成される生成物及びこれらの半合成誘導体の両方を含む。
発酵生成物は、通常、５個の基本となるアミノ酸のアリールもしくはアリールメチル部分に、またはＸ₁及び／もしくはＸ₂部分がヒドロキシル化した芳香環部分を含む場合これらの部分に位置するヒドロキシ基と結合した糖部分を有する。少数の場合において、一つのフェノールのヒドロキシ官能基を硫酸部分とエステル化することができる。発酵生成物において、記号Ｙにより表される官能基は、通常、カルボン酸または低級アルキルカルボキシエステルであり、一方、記号Ｔは、通常、アミノまたは低級アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ）部分を表す。
特許及び科学文献に記述された半合成誘導体は、例えば、糖部分の完全または部分加水分解に由来し、従ってアリールまたはアリールメチル部分に遊離したヒドロキシ基を有する生成物、アリールメチル部分のベンジルのヒドロキシ基の除去に由来する生成物、フェノールのヒドロキシ官能基への特定の糖部分または脂肪族もしくは脂環式部分の導入に由来する生成物、機能的誘導体、例えばエステル、アミドもしくはヒドラジン誘導体を形成するカルボキシル部分Ｙの修飾に由来する生成物または（例えば、アルキル化もしくはアシル化により）様々に置換されたアミノ基を生じるもしくは該アミノ官能基の保護基の導入の結果生じる部分Ｔの修飾に由来する生成物またはアミノ糖部分のアミノ部分のアシル化に由来する生成物、あるいは最初にハロ置換基を含んでいるアリール部分の脱ハロゲン化の結果生じる生成物またはアリール部分へのハロ（好ましくはクロロ、ブロモ及びヨード）の導入に由来する生成物である。該半合成誘導体は、天然の生成物の基本構造の一つより多い上記の修飾を含むことができる。
より詳細な表示において、記号Ｗが部分構造、

式中、Ｒ₁は水素、糖部分、脂肪族または脂環式炭化水素部分であり、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は各々独立して水素またはハロゲン、好ましくはクロロもしくはブロモであり、そして最も好ましくはエーテル結合に関してオルトの位置にあり、Ｒ₅及びＲ₆は各々独立して水素またはＲ₇が水素もしくは糖部分であるＯＲ₇である、を表し、上の式Ｉに示すように基Ｗが、ダルバヘプチドのヘプタペプチド鎖の（右から始めて）第２、第４及び第６番目のアミノ酸部分に同時に結合し、そして記号Ｚが部分構造、

式中、基ＯＲ₈及びＯＲ₉は、好ましくは２個のフェニル環を連結している結合に関してそれぞれパラ及びオルトの位置にあり、そして基Ｒ₈及びＲ₉は各々独立して水素または糖部分を表し、最も好ましくはＲ₈が水素であり、基ＯＲ₁₀は、好ましくは２個のフェニル環を連結している結合に関してオルトの位置にあり、そして基Ｒ₁₀は水素または糖部分を表し、基Ｒ₁₁は、好ましくは２個のフェニル環を連結している結合に関してメタの位置にあり、そして水素またはハロゲン、最も好ましくは水素またはクロロを表す、を表し、式Ｉに示すように基Ｚが、ダルバヘプチドのヘプタペプチド鎖の（右から始めて）第５及び第７番目のアミノ酸部分に結合する、式Ｉによりこれまでに構造が決定されている大部分のダルバペプチド抗生物質を表すことができる。
これまでに知られているダルバヘプチド抗生物質の４つの亜群への区分を可能にする記号Ｘ₁及びＸ₂の意味は、それぞれ以下のものである。
Ｘ₁は、フェニル環がハロゲン、好ましくはクロロ、低級アルキル、好ましくはメチル及び場合によってはヒドロキシ基をアセタール結合により糖部分と結合するかもしくは硫酸残基とエステル化することができるヒドロキシから選択された１もしくは２個の置換基を場合によっては保有することができるフェニルもしくはベンジル基を表し、またはＸ₁は、カルボキシルもしくはカルボキサミド官能基、チオメチルもしくはメチルスルフィニル基で置換された（Ｃ₁−Ｃ₂）脂肪族部分を表すこともでき、
Ｘ₂は、ハロゲン、好ましくはクロロ、低級アルキル、好ましくはメチル及び場合によってはヒドロキシ基をアセタール結合により糖部分と結合することができるヒドロキシから選択された１もしくは２個の置換基を場合によっては保有することができるフェニル基を表し、またはＸ₂は、（Ｃ₁−Ｃ₄）脂肪族部分、好ましくはメチルもしくはイソブチルを表すことができ、
あるいは、Ｘ₁及びＸ₂は一緒に、一つまたは両方のフェニル環を場合によっては上に示したように置換することができるオキシビス（フェニレン）部分を表す。
（半合成誘導体を含む）これまでに知られている式Ｉのダルバヘプチド抗生物質の大部分のより詳細な表示により、記号Ｔは、好ましくは、１個またはそれより多い置換基を場合によっては同様に保有することができる１ないし１２個の炭素原子のアルキル基により、（Ｃ₄−Ｃ₇）シクロアルキルにより、アシル残基により、またはアミン官能基の適当な保護基により一つまたは両方の水素原子を場合によっては置換することができるアミン基を同定し、あるいはＴは、プラスの電荷が強酸または内部酸官能基のいずれかに由来する陰イオン、例えば記号Ｙにより表されるカルボン酸に由来するカルボキシラート陰イオンにより中和されるトリ（低級アルキル）アンモニオ基も表すことができる。いくつかの場合においてＴは、水素（例えば、テイコプラニン半合成誘導体）またはヒドロキシ、オキソまたはオキシミノ部分（例えば、リストセチン誘導体）も表すことができる。従ってＴが二価の基である場合、式Ｉの点線はさらなる結合を表す。
記号Ｙは、カルボキシ基、カルボキシエステル、カルボキサミド、カルボヒドラジン基のようなその機能的誘導体またはヒドロキシメチル部分を表す。この定義は、天然に生じる低級アルキルエステル並びにアルコール、例えば脂肪鎖に置換基を保有する脂肪族アルコールとカルボキシル官能基の反応により形成されたエステルを含み、そして脂肪族、脂環式及び複素環式アミンとカルボキシ基の反応により形成される広く一連の置換されたアミドも含む。特に、脂肪族アミンは、脂肪鎖上にアミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、カルバミル、置換されたカルバミルなどのような置換基を含むことができる。
式Ｉの最終化合物の塩は、分子の塩基性官能基、例えば記号Ｔにより同定されるアミン官能基、あるいは記号Ｙにより表されるカルボキシエステル、カルボキサミドもしくはカルボヒドラジド部分または糖部分（例えば、バンコマイシン、アボパルシン）に置換基として含まれたアミン官能基を酸で塩に変えることに由来するものであることができる。代わりに、記号Ｙにより表されるカルボン酸官能基、またはカルボキシエステルもしくはカルボキサミド部分に置換基として含まれた酸性官能基または分子のあらゆる他の部分に存在することができるあらゆる酸性官能基を適切な塩基で塩に変えることにより塩を形成することができる。内部塩は、ダルバヘプチド前駆体及び／またはペンタペプチド最終化合物中に十分な強度の塩基性（例えばアミン）及び酸性（例えばカルボキシル）の官能基が同時に存在する場合に内部の塩への化合により形成されるものである。
ダルバヘプチド抗生物質において、ヒドロキシ基に結合することができる糖部分は、ヒドロキシル基の１つにおいてアセチル化もしくはメチル化するか、または１または２つの位置で脱酸素することができ、そして例えば脂肪酸基によりアシル化することができるカルボキシルもしくはアミン置換基を保有することができる単または多糖類のいずれかである。芳香環に遊離したヒドロキシ基を有するダルバヘプチド基質に化学または微生物学的反応により特定の糖部分を導入することができる。
基本的なダルバヘプチド構造のヒドロキシ基に結合した未置換の単糖部分の典型的な例は、例えばグルコース（例えば、アクタプラニンＢ₂）、ガラクトース（例えば、抗生物質Ａ ４１０３０Ｃ）、マンノース（例えば、テイコプラニンＡ₂）、フコース（例えば、抗生物質Ａ ３５５１２ Ｂ）、ラムノース（例えば、アボパルシン）及びアセチルマンノース（例えば、パルボジシンＣ₃）のようなヘキソース及びペントースの両方を含む。
ヒドロキシ基に結合したカルボキシまたはアミノ置換された単糖部分の典型的な例は、Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、テイコプラニンＡ₂複合体）、Ｎ−（Ｃ₉−Ｃ₁₂）脂肪族アシルグルコサミン（例えば、テイコプラニンＡ₂複合体）、リストサミン（例えば、リストセチンＡ）、アクチノサミン（例えば、アクチノイジンＡ）、Ｎ−（Ｃ₉−Ｃ₁₂）脂肪族アシル−２−アミノ−２−デオキシ−グルクロン酸（例えば、アルダシン）を含む。
多糖部分の典型的な例は、少なくとももう一つの糖単位に結合した、グルコース（例えば、アクタプラニンＡ）、マンノース（例えば、リストセチンＡ）、ラムノース（例えば、リストセチンＢ）、オリボース（例えば、オリエンチシンＢ）、バンコサミン（例えば、バンコマイシン）、エピバンコサミン（例えば、オリエンチシンＡ、Ｃ及びＤ）、アコサミン（例えば、アクチノイジン）並びにリストサミン（例えば、アボパルシン）のような未置換及びカルボキシまたはアミノ置換の両方の糖単位を含むことができる。これまでに知られそしてその構造が決定されているダルバヘプチドにおいて、４個までの糖単位を含んでいる多糖が同定されている。
これまでに知られているダルバヘプチドの４つの亜群へのさらなる分類を可能にする特性は、本発明のＩＥＦ法により精製することができるダルバヘプチド抗生物質の一般的な分類に入る新規な天然の生成物及びそれらの誘導体を得、そして同定することができる点において、本発明の範囲を少しも制限しない。しかしながら、本発明の方法により精製することができる代表的な化合物のより正確な同定のために、以下に上記の４つの亜群及び対応する代表的な化合物をさらに詳細に説明する。
上の式Ｉに関して、リストセチン型ダルバヘプチドとして同定される亜群は、記号Ｘ₁及びＸ₂が一緒に、１個または両方のフェニル環がハロゲン、好ましくはクロロ、低級アルキル、好ましくはメチル、及び場合によってはヒドロキシ基をアセタール結合により糖部分と結合するかまたは硫酸残基とエステル化することができるヒドロキシから選択された１または２個の置換基を場合によっては保有するオキシビス（フェニレン）部分を表すことを特徴とする。
この亜群に特定することができるダルバヘプチド抗生物質は、以下のもの、リストセチン（参考文献６）、アクタプラニン（参考文献７、８）、テイコプラニン（参考文献９、１０、１１）、抗生物質Ａ３５５１２（参考文献１２、１３）、抗生物質Ａ４１０３０（参考文献１４、１５）、抗生物質Ａ４７９３４（参考文献１６、１７）、アルダシンＡ、Ｂ、Ｃ（参考文献１８、１９、２０）、抗生物質Ａ４０９２６（参考文献２１、２２、２３）、キブデリン（参考文献２４）、パルボジシン（参考文献２５）及び抗生物質ＵＫ６８５９７（参考文献２６）を含む。
上記の天然の生成物の半合成誘導体もこの亜群に含まれる。例えば、以下に詳細な記述がなされる、アルダシンのアグリコン及びプソイドアグリコン（参考文献２７）並びにＹがカルボキサミドまたはカルボヒドラジド部分であるその誘導体（参考文献２８）、パルボジシンのアグリコン及びプソイドアグリコン（参考文献２９）、アクタプラニンの加水分解生成物（参考文献３０）、リストセチンＡ、抗生物質Ａ ３５５１２、Ａ ４１０３０及びＡ ４７９３４の１番目のアミノ酸部分の対応するケト類似体への転化生成物（参考文献３１及び３２）、リストセチン、アクタプラニン及びこれらのプソイドアグリコンのアシル化誘導体（参考文献３３）、アクタプラニンの臭素類似体（参考文献３４）、リストセチンの芳香族アルデヒド誘導体（参考文献３５）、テイコプラニン及び抗生物質Ａ ４０９２６の誘導体を参照。
バンコマイシン型ダルバヘプチドとして同定されるダルバヘプチド抗生物質亜群は、式Ｉにおいて、記号Ｘ₁がカルボキシルまたはカルボキサミド官能基で置換された（Ｃ₁−Ｃ₂）脂肪族残基を表し、そして記号Ｘ₂が（Ｃ₁−Ｃ₄）脂肪族残基を表すということを特徴とする。特に、この亜群に入る抗生物質の最も一般的な例において、Ｘ₁がアスパラギン酸、アスパラギンまたはグルタミンに由来する残基であり、一方、Ｘ₂がアラニンまたはロイシンに由来する残基である。
いくつかのバンコマイシン型ダルバヘプチド（例えば、Ｍ４３Ａ、Ｂ及びＣ、参考文献５５）は、Ｔが、プラスの電荷を記号Ｙにより表されるカルボキシル基により形成されたカルボキシラート陰イオンにより中和されるトリメチルアンモニオ基を表すということをさらに特徴とする。
この亜群に特定することができる他のダルバヘプチド抗生物質は、以下のもの、すなわちＯＡ−７６５３（参考文献５１、５２）、Ａ５１５６８Ａ及びＢ（参考文献５３、５４）、オリエンチシン（参考文献５６、５７）、エレモマイシン（参考文献５８、５９、６０、６１）、Ａ ４２８６７（参考文献５０、６２）、Ａ ８２８４６（参考文献６３、６４）、クロロオリエンチシン（参考文献６５）、ＭＭ ４７７６１及びＭＭ ４９７２１（参考文献９４）、デカプラニン（参考文献９５）、ＭＭ ４５２８９及びＭＭ４７７５６（参考文献９６）を含む。
上記の天然の生成物の半合成誘導体は、この亜群に含まれる。例えば、バンコマイシンの加水分解生成物の様々にグリコシル化された誘導体、Ａ ５１５６８Ａ及びＢ並びにＭ４３Ｄ（参考文献６６）、バンコマイシンのデスバンコサミニル及びデス（バンコサミニル−Ｏ−グルコシル）−誘導体、Ａ ５１５６８Ａ、Ａ ５１５６８Ｂ、Ｍ ４３Ａ及びＭ ４３Ｂ（参考文献６７）、Ａ ８２８４６の誘導体（参考文献９３）、アルデヒド及びケトンといくつかのバンコマイシン型ダルバヘプチドのアミン残基の反応生成物並びに対応する水素化生成物（参考文献６８、６９）、バンコマイシン型抗生物質のＮ−アシル誘導体（参考文献７０、７１）、モノ−及びジデクロロバンコマイシン（参考文献７２）及びエレモマイシンの加水分解生成物（参考文献６０）を参照。
アボパルシン型ダルバヘプチド亜群は、式Ｉにおいて記号Ｘ₁が、フェニル環がヒドロキシ及びハロゲン、好ましくはクロロから選択される１または２個の置換基を場合によっては保有することができるフェニルまたはベンジル基を表し、記号Ｘ₂が、ハロゲン、好ましくはクロロ及び場合によっては糖部分（例えば、ラムノース）と結合することができるヒドロキシから選択される１または２個の置換基を場合によっては保有することができるフェニル基を表すということを特徴とする。
この群に特定することができる他のダルバヘプチドは、以下のもの、すなわちアクチノイジンＡ、Ｂ（参考文献３、７５、７６）、クロロポリスポリンＡ、Ｂ、Ｃ（参考文献７７、７８、７９）、アクチノイジンＡ₂（参考文献８０、７６）及びヘルベカルジンＡ、Ｂ（参考文献２６）、ＭＭ ４７７６７、ＭＭ ５５２５６（参考文献９２）を含む。
ダルバヘプチド抗生物質のアボパルシン型亜群の半合成誘導体は、例えば、デマンノシルクロロポリスポリンＢ誘導体、クロロポリスポリンプソイドアグリコン、デルハムノシル（ｄｅｒｈａｍｎｏｓｙｌ）アルファ及びべータアボパルシン（参考文献８１）、アボパルシン（ＬＬ−ＡＶ２９０）のマンノシルアグリコン及び一つまたはそれより多い糖部分が加水分解される他の誘導体（参考文献８４）である。
シンモニシン型抗生物質として同定されたダルバヘプチド抗生物質亜群は、式Ｉにおいて記号Ｘ₁が、末端の炭素上でチオメチルまたはメチルスルフィニル基で置換されたＣ₂アルキル残基を表し、そして記号Ｘ₂が、糖部分と結合することができるヒドロキシ置換基を保有しているフェニル基を表すということを特徴とする。シンモニシン（ＣＷＩ−７８５）複合体、その成分及びその加水分解生成物のいくつか（参考文献８６、８７、８８）が、今のところこの亜群の唯一のメンバーであると思われる。
上に述べたように、リストセチン型ダルバヘプチドに特定することができる特定の化合物は、一般式、

式中、Ａ、Ｂ及びＭは天然の生成物の分子コアに結合した糖部分を表す、のテイコプラニンＡ₂複合体である。
「テイコプラニン」という用語の範囲内には、発酵複合体の単一成分（参考文献９）及び関連した物質（参考文献３６、３７）並びにアグリコン、プソイドアグリコン（参考文献４、３８、３９、４０）及びそれらの半合成誘導体を含んでなる。
生物学的活性に関して特に興味深いテイコプラニンの半合成誘導体の化学構造は、Ｃ⁶³カルボキシ基または／及びＣ¹⁵のアミン残基のいずれか／両方の修飾を有するテイコプラニン主成分、関連物質、アグリコン及びプソイドアグリコンと同じ基本構造を有する。特に、上の式Ｉの記号Ｙに対応するＣ⁶³カルボキシ残基が、参考文献４１により対応するエステルに、そして参考文献７３、７４、８２及び８３にそれぞれ述べられた意図によりカルボキサミド基ＣＯＮＲ₁₄Ｒ₁₅に修飾されている。
半合成誘導体において、Ｃ¹⁵のアミン残基は、保護基との反応により、または参考文献８５、８９、９０及び９１によりアルキル部分がさらなる置換基を保有することができる対応するアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ基への転化により修飾されたアミン基を同定する。Ｃ⁶³カルボキシル基及びＣ¹⁵のアミン残基の両方に修飾を示しているテイコプラニン誘導体並びにこれらの製造方法は、参考文献８３及び９８に記述されている。
先行する当該技術分野において記述された他の半合成テイコプラニン誘導体は、Ｃ⁶³カルボキシ基のエステル及びヒドラジド（参考文献４１及び４２）、デ−アセチルグルコサミニル−デオキシテイコプラニン（参考文献４３）及び対応するＣ⁶³カルボキシアミド（参考文献４４）、テイコプラニンのモノ及びジ−デクロロ誘導体（参考文献４５）、テイコプラニンアグリコン及びプソイドアグリコンのＯ⁵⁶アルキル及びシクロアルキル誘導体（参考文献４６及び９７）並びに３８−デカルボキシ−３８−ヒドロキシメチル誘導体（参考文献９９）を含む。
リストセチン型ダルバヘプチド亜群の範囲内に入るさらなる化合物は、以下の一般式、

式中、Ａ及びＭは天然の生成物の分子コアに結合した糖部分を表す、により定義された抗生物質Ａ ４０９２６複合体及びその主因子（参考文献２１、２２、２３）である。
テイコプラニンに対してと同様に、抗生物質Ａ ４０９２６の多数の誘導体が開示されており、それらの中には、そのアグリコン（参考文献４８）、マンノシルアグリコン（参考文献４７）、Ｎ−アシルアミノ−デオキシ−グリクロニルアグリコン（参考文献４８）、デアシル誘導体（参考文献４９）、Ｃ⁶³−エステル誘導体（参考文献１００）及びＣ⁶³−アミド誘導体（参考文献１０１）がある。
参考文献１０１は、とりわけ、抗生物質Ａ ４０９２６の６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）−Ｎ⁶³−３−（ジメチルアミノ）プロピルアミド誘導体の調製を開示している。この化合物は、縮合剤ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス−（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）の存在下で６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）抗生物質Ａ ４０９２６をジメチルプロピルアミンと反応させることにより調製される。しかしながら、そのようにして得られた生成物は、通常のクロマトグラフィー法により除去することができないいくらかの不適切な夾雑物を含む。
上に述べたように、本発明の一つの目的は、不適切な夾雑物から上のダルバヘプチド抗生物質を精製するための等電点電気泳動に基づく精製方法を提供することである。
分離される該夾雑物は、発酵工程から得られた抗生物質複合体混合物の微量成分または抗生物質化合物がその半合成誘導体を得るために供せられた化学反応の副産物のいずれかであることができる。
例えば、（天然または半合成のいずれかの）ダルバヘプチド抗生物質複合体は、患者に投与された時にヒスタミン放出を引き起こすいくらかの夾雑物を含むことができ、すなわち、特定のダルバヘプチド抗生物質により該ヒスタミン放出を多かれ少なかれ示すことができることが知られている（参考文献１１４を参照）。そのようなヒスタミン放出は、例えば、抗生物質Ａ ４０９２６複合体の６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）−Ｎ⁶³−３−（ジメチルアミノ）プロピルアミド誘導体の場合においても見られている。
これらの夾雑物は、通例、ほとんど検出することができず、従ってほとんど個々に除くことができないので、活性物質から全ての夾雑物を分離することができる方法は非常に望ましい。
従って、本ＩＥＦ精製は、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む一連の通常のクロマトグラフィー法により除くことができなかった夾雑物を除去するための効果的な手段である。さらにこれは、工業規模でのダルバヘプチド抗生物質の精製のために適用することができる方法である。
全ての等電点電気泳動方法論と同様に、ダルバヘプチド抗生物質の精製のためにＩＥＦ技術を適用することにおける主な障害は、精製される化合物がそのｐＩ値で非常に限られた可溶性を示すことである。従って、精製される化合物の可溶性をそのｐＩ値で比較的高い濃度でも維持することができる被検体の適当な支持溶液の調製が解決すべき主要な問題の一つであり、実際、沈殿時には夾雑物も主画分と共沈する。
今回、尿素及び両性イオン洗剤の水溶液がダルバヘプチド抗生物質化合物を可溶化するために適していることが見いだされ、特に適しているのは、ＣＨＡＰＳ族の洗剤、すなわちコール酸のスルホベタイン両性イオン誘導体、例えば｛３−［３−（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］｝−１−プロパンスルホン酸塩または｛３−［３−（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］｝−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸塩、それらの中で好ましくは｛３−［３−（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］｝−１−プロパンスルホン酸塩と尿素の混合物であることが見いだされた。
混合物中の尿素／ＣＨＡＰＳ比及びこれらの濃度は、精製する特定のダルバヘプチド化合物による。通例、溶液中の尿素の濃度を約４Ｍから８Ｍまでの範囲で変えることができ、例えば、抗生物質Ａ ４０９２６の６３−アミド誘導体を含んでいる混合物が本発明のＩＥＦ精製に含まれる場合、尿素の好ましい濃度は約８Ｍであることが見いだされた。ＩＥＦ支持溶液中のＣＨＡＰＳ洗剤の適当な濃度は、約１％から５％（ｗ／ｖ）までであることができ、好ましくは、その濃度は２％から４．５％までである。抗生物質Ａ ４０９２６のアミド化から得られた混合物を精製するために特に好ましいのは、約３．５％の濃度である。
分析用固定ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧゲル）上の電気泳動によるような一般的な分析方法により、各ダルバヘプチド抗生物質のｐＩ値を容易に測定することができる。ＩＰＧゲルを用いたｐＩ値の測定のために適した方法論は、参考文献１１２に記述されている。
抗生物質分子の酸性及び／または塩基性基のｐＫ値に基づくｐＩ値の理論的計算は、単一部分の実際のｐＫ値を修正することができる酸性及び塩基性部分の可能な相互作用のために、正しくない結果をもたらす可能性がある。
ダルバヘプチド抗生物質の適当な支持溶液がいったん調製されると、当該技術分野において知られているものと同様の方法論によりＩＥＦ精製を成し遂げることができる。
従って、一組の仕切りが用意され、そしてこれらの仕切りは増加するｐＩ値を有する多数の等電膜により境界を定められる。これらの膜のｐＩ値の範囲は、精製する化合物の測定されたｐＩ値及び分離する夾雑物のｐＩ値により設定される。精製する特定のダルバヘプチドにより、膜のｐＩ値を約３から約９まで変えることができる。通例、ｐＩ値の範囲は、精製する化合物のｐＩ値±約２である。膜を調製するために適した方法は、参考文献５及び１１３に開示されている。
従って、精製される混合物の成分は、それらの特異的なｐＩ値により等電勾配に沿って分離され、この工程の最後に各仕切りは、その仕切りの境界を定めている２枚の等電膜のｐＩ値の間を含んでなるｐＩ値を有する物質（夾雑物または主要な化合物）を含む。優れた精製結果を得るためには、もちろん、精製される化合物のｐＩ値が夾雑物のｐＩ値と少なくとも最低限異ならなければならないが、しかしながら、単一の仕切りの境界を定めているｐＩ値が互いに非常に接近していることが可能であり、従って非常に高いレベルの精製ができる。
複合体の単一の抗生物質因子（または少なくともその主因子）が類似したｐＩ値を有する場合、不適切な夾雑物が抗生物質因子のｐＩの範囲の外側のｐＩ値を有するなら全てのこれらの因子を単一の仕切り中に集めることが可能であり、このようにして活性のある抗生物質化合物を、各単一因子を分離する必要なしに不適切な夾雑物から全体として分離することができることに注目すべきである。従って、本明細書の以下において「主成分」という表現は、抗生物質複合体の単一因子及び類似したｐＩ値を有する因子の混合物をいう。
本ＩＥＦ精製を行うために適した装置は、参考文献１１３に記述されている。
本発明により、主成分が等電である仕切りに精製される化合物を連続して添加することができ、このようにして、電気泳動滴定法の条件下で、所望する化合物はその仕切り中に動かないままであり、一方、異なるｐＩ値を有するまたは非等電である夾雑物はより陽極または陰極の仕切りへ向かってその仕切りから移動させられる。必要な場合、生成物の不適切な沈殿を回避するために適した仕切りのリサイクリングを行うために、各仕切りを液体貯蔵容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）と連結することができる。このオプションは、主成分の仕切りに適用する場合に特に適しており、実際ＩＥＦ工程を行う場合、（比較的少量の容量を有する）仕切り中の生成物の濃度は沈殿値まで増加することができ、上に述べたように主成分と共に夾雑物も共沈するので、このことは断固として回避しなければならない。一方、他の仕切り中の夾雑物の濃度は適切であることができ、従って上のリサイクリングは必要ない。
本精製法の代わりの態様において、主成分が等電ではない仕切りへ精製される化合物を連続して添加することができ、従って主成分はその等電の仕切りへ向かって移動させられる。この代わりの方法は、主成分のものに非常に近いｐＩを有する夾雑物を分離するために特に適している。実際、精製される混合物をその等電の仕切りへ添加する場合、主成分のものに近いｐＩ値を有する夾雑物が等電であるそれぞれ隣接した陽極または陰極の仕切りへ向かって移動する代わりにその仕切りにとどまることが起こる可能性がある。従って、精製される化合物を主成分が等電ではない仕切り、例えば隣接する陽極の仕切りへ添加することにより、主成分はその等電の仕切りへ移動し、一方、より陽極のｐＩ値を有する夾雑物は最初の仕切りに残される。
上のように、液体貯蔵容器を各仕切りと連結することができ、もちろん、主成分の沈殿を回避するためにこの場合主成分が等電である仕切りとも貯蔵液体容器を連結しなければならない。
かける電圧は、精製される物質の型、存在する夾雑物の量、添加される物質の量、支持溶液の組成並びに陽極液及び陰極液の組成、並びにＩＥＦ装置の構造（例えば、大きさ、等電膜の数、電極の距離など）のような多数の因子により決定され、例えば、より高い電圧での精製工程を始める前にサンプル中の余分な塩を除くために、通例、低い電圧をかけ、例えば、１２ｃｍの距離の電極に対して４００Ｖから６００Ｖまでの初電圧をかけることができ、そしてその後１０００Ｖから５０００Ｖまで、好ましくは約１５００Ｖの電圧で工程を行う。
電気泳動工程中に発生する熱をそれ自体既知の技術により消散することができ、弱い発熱に対しては室温での空気中の消散で十分であり、より激しい発熱に対しては水のような循環する冷却剤が好ましくあることができる。
工程の時間は、主に添加した物質の量及びかける電圧による。
ＩＥＦ精製が行われた後、それ自体既知の技術により所望する化合物を支持溶液から回収する。例えば、尿素／ＣＨＡＰＳ混合物からの精製した化合物の分離をシラン化した（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ）シリカゲルカラムで行うことができる。
以下の実施例は本発明をより詳細に例示する。
この特定の実施例は、参考文献１０１に開示されたアミド化法に従って、縮合剤ＰｙＢＯＰの存在下で６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）抗生物質Ａ ４０９２６をジメチルプロピルアミンと反応させることにより得られた抗生物質Ａ ４０９２６の６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）−Ｎ⁶³−３−（ジメチルアミノ）プロピルアミド誘導体（以下「アミド誘導体」）の精製に関する。薬理学的研究の間に、そのようなアミド誘導体複合体がヒスタミン放出効果を引き起こすことができる不適切な夾雑物を含むことが見いだされた。本発明の方法により該不適切な夾雑物を除去し、従ってヒスタミン放出効果を示さない精製した生成物を得ることが可能である。
知られているように、発酵工程から得られた抗生物質Ａ ４０９２６（参考文献２１を参照）は、主因子が因子Ｂ₀及び因子Ｂ₁である単一の関連した因子の混合物である。発酵条件を修正することにより、単一因子の割合を変えることができる（例えば、参考文献１１５を参照）。さらに必要な場合、Ａ ４０９２６の単一因子をまず分離することができ、そして次に所望する割合の単因子の混合物を調製することができる。
明らかなように、Ａ ４０９２６複合体の関連するアミド誘導体は、従って、特定の抗生物質Ａ ４０９２６開始材料の組成による、単一因子のアミド誘導体の対応する混合物である。
この明細書の以下において、因子Ｂ₀及びＢ₁のアミド誘導体の混合物を扱う場合、それはあらゆる割合のこれらの２つの因子の混合物と考えられる。
上のＡ ４０９２６因子Ｂ₀及び因子Ｂ₁のアミド誘導体を以下の式、

式中、Ｍはマンノシル部分を表し、そしてＲ₁は因子Ｂ₀に対して−ＣＨ（ＣＨ₃）₂基をまたは因子Ｂ₁に対して−（ＣＨ₂）₂ＣＨ₃基を表す、により表すことができる。
従って、本発明により、上のＡ ４０９２６のアミド誘導体を因子Ｂ₀及びＢ₁のアミドの混合物として不適切な夾雑物を実質的に含まずに得ることができる。因子Ｂ₀及びＢ₁のアミドの実質的に純粋な混合物は、あらゆる割合の該２つの化合物の混合物であり、この混合物は、８Ｍ尿素及び３．５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳの溶液中で測定される約８．４０から約８．６５までの範囲内のｐＩ値を有する不適切な夾雑物を含んでいない。該精製混合物を得るために、集める仕切りの２枚の境界を定める膜をそれぞれ８．４１及び８．６５のｐＩ値に設定することができ、一方、精製される混合物をこの電界槽の仕切りへ添加する。
必要な場合、微量因子Ｂ₁を主因子Ｂ₀から分離することができ、従って、因子Ｂ₀の実質的に純粋なアミド誘導体を得ることができる。因子Ｂ₀の実質的に純粋なアミド誘導体は、８Ｍ尿素及び３．５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳの溶液中で測定される約８．４５から約８．６５までの範囲内のｐＩ値を有する不適切な夾雑物を含んでいない化合物であると考えられる。上の純粋な化合物を得るために、集める仕切りの２枚の境界を定める膜をそれぞれ８．４５及び８．６５のｐＩ値に設定することができ、この場合精製される混合物は、好ましくは最も近い陽極の仕切りに添加される。
図面は、
図１：未分画サンプルの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ；主要なピークは、因子Ｂ₀及びＢ₁のアミド誘導体に対応する。
図２：実施例１による未分画サンプルの分析用ＩＰＧ；トラック当たり８０（右側）から６００（左側）μｇまでのサンプル添加範囲。
図３：実施例２によるＩＥＦ精製工程後の仕切り３（ｐＩ ８．４１÷８．６５、主要な精製画分が集められる仕切り）の中身の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ。主要なピークは、因子Ｂ₀のアミド誘導体に対応し、このピークに重なっているより小さいピークは、因子Ｂ₁のアミド誘導体に対応する。
図４−６：実施例２によるＩＥＦ精製工程後の仕切り１、２及び４（夾雑物が集められる仕切り）の中身の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ。
図７：実施例３によるＩＥＦ精製工程後の仕切り３（ｐＩ ８．４６÷８．６５、因子Ｂ₀の精製されたアミド誘導体が集められる仕切り）の中身の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ。主要なピークは、因子Ｂ₀の純粋なアミド誘導体に対応する。
を示す。
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ系
-装置：２ユニット（Ｍｏｄ．）の３０５ポンプ、１ユニットの２３２オートサンプラー、１ユニットの８０５マノメーター、１ユニットの８１１Ｂダイナミック（ｄｙｎａｍｉｃ）ミキサー（全てＧｉｌｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＷＩ、ＵＳＡから）、
-カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４−ＡＭＰ ５μｍ、２０ｎｍ、２５０ ｘ ４．６ｍｍ（ＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｓｈｉｎ−Ａｒａｍｉ Ｔａｉ Ｋｕｍｉｊａｍａ−ｃｈｏ、Ｋｕｓｅ−ｇｕｎ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）、
-溶出：
相Ａ：水／アセトニトリル／リン酸（９５／５／０．０５）、
相Ｂ：水／アセトニトリル／リン酸（５／９５／０、０５）、

注入容量：１００μｌ、
流速：１．８ｍｌ／分、
オーブン温度：３０℃、
-検出：１ユニットの１１６ＵＶ検出器（Ｇｉｌｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で２５４ｎｍでのＵＶ吸収
実施例１
主成分及び夾雑物のｐＩ値を測定するための分析用固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルの調製
ゲルの大きさ：２５ｘ１０ｃｍ、０．５ｍｍの厚さ、ｐＨ間隔：７．０ないし１０．０
参考文献１１０に開示された調製法により、ＩＰＧの範囲を５％Ｔ、４％Ｃポリアクリルアミドマトリックス中に設定する。２つの境界を定める酸性及び塩基性混合物を調製した後、これらを中性に近いｐＨ値まで（弱酸及び弱塩基で）滴定する。これは、前もって形成されたｐＨ勾配にわたる均一な重合及び効率よいモノマー転化を保証するために重要である。ゲルを蒸留水で洗浄時（３ｘ３０分）に、全ての添加した滴定剤（並びに触媒及び未グラフトモノマー）を効率よく除去する。次に、ゲルを２％グリセロール溶液中で３０分間平衡化し、空気乾燥し、そして８Ｍ尿素及び３．５％ＣＨＡＰＳの混合物中で一晩再膨張させる。サンプルを８０から６００μｇ／トラックまでの濃度で陽極のゲル側で表面のウェルに添加する。５００Ｖで最初の１時間の後、２０℃で２５００Ｖで６時間電気泳動を続ける。
ゲル染色のために、ロイコ形態で、１２．５％ＴＣＡ中のクーマシーブリリアントブルーＧ．２５０のコロイド状分散（参考文献１１１を参照）を一晩採用した。純粋な蒸留水中ですすぐことにより色の増強を得る。
図２は、分析用ＩＰＧの結果を示す。
因子Ｂ₀及び因子Ｂ₁のアミド誘導体のｐＩ値を正確に測定するために、８Ｍ尿素及び１％ＣＨＡＰＳの混合物を用いて８．０から９．０までのｐＨ間隔で上の方法を同じ条件下で繰り返す。そのようにして測定された因子Ｂ₀のアミド誘導体のｐＩ値は８．５６であり、一方、因子Ｂ₁のアミド誘導体のｐＩ値は８．４０である。
実施例２
サンプル（抗生物質Ａ ４０９２６因子Ｂ₀及びＢ₁のアミド）のＩＥＦ精製
等電緩衝膜と組み立てられる多仕切りの電解槽からなるＩｓｏ−ＰｒＩＭＥ装置（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を用いてＩＥＦ精製を行う。
Ａ）等電固定膜の調製
主因子及び夾雑物の正確なｐＩ値を上の分析用ゲルで測定した後、以下のｐＩ値、すなわち７．００、８．３１、８．４１、８．４６、８．６５及び９．５０を有する６枚の等電膜を調製する。全ての膜を４．７ｃｍ直径及び約１ｍｍの厚さの円盤の形態で１０％Ｔ、４％Ｃマトリックスとして入れ、これらの膜をガラス繊維フィルターにより支える（特性及び調製の詳細な記述に関しては参考文献５及び１１３を参照）。
Ｂ）実験条件
-陽極液：８Ｍ尿素及び０．１％ ＣＨＡＰＳ中５ｍＭの酢酸（ｐＨ４．８４、伝導度：８５．５μｍｈｏｓ）、
-仕切り中の支持溶液：８Ｍ尿素及び３．５％ ＣＨＡＰＳの混合物、
-電極貯蔵容器中の支持溶液：８Ｍ尿素及び０．１％ ＣＨＡＰＳ、サンプル中の余分な塩を除くための最初の低電圧（５００Ｖ）での泳動後、（１２ｃｍの電極距離にわたって）１５００Ｖで３０時間で精製を得る。循環する冷却剤を用いず、ジュール熱を室温（２２℃）で空気中に消散させた。上の条件下で、電解槽の溶液の温度上昇は定常状態で３℃だけであった。
Ｃ）精製工程
多仕切りの電解槽の（ｐＩ ８．４１及びｐＩ ８．６５の膜の間にあり、主成分が等電的に分離される）仕切り３に（１００ｍｌの８Ｍ尿素及び３．５％ ＣＨＡＰＳに溶解した）５００ｍｇのサンプルを添加することにより、予備泳動を行う。この仕切りの中身を貯蔵容器からリサイクルし、一方、全ての隣接する仕切りをいかなる貯蔵容器にも連結しなかった。電解槽の各仕切りの液体含有量は５ｍｌであり、一方、仕切り３（仕切りに加えて貯蔵容器）では１００ｍｌであるので、これは、隣接する仕切りにおいて２０倍に濃縮された夾雑物の収集をもたらす。
各仕切りのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す図３ないし６に予備泳動の結果を要約する。
図１は、主成分の多量の過剰添加のもとで見られる成分の全スペクトルを示す。ＲＰ−ＨＰＬＣにおける溶出順序をｐＩスペクトルと完全に比較することは可能ではないけれども、成分Ｂ₁を成分Ｂ₀に関して最も近い陽極性のｐＩ値を有する化合物とはっきりと同定できる。
（ｐＩ ７．０及びｐＩ ８．３１の膜の間にある）電解槽の仕切り１に集まっている成分のスペクトルを図４に示し、仕切り２（ｐＩ ８．３１ないしｐＩ ８．４１の膜）に濃縮された夾雑物を図５に示し、（番号４、ｐＩ ８．６５及びｐＩ ９．５の膜の間にある）最後の仕切りに濃縮された夾雑物を図６に示す。
（ｐＩ ８．４１及びｐＩ ８．６５の膜の間にある仕切り３に集まっている）主成分を図３に示し、主要なピークに接近したより小さいピークは、因子Ｂ₁のアミド誘導体に対応する。
実施例３
Ａ ４０９２６因子Ｂ₀の純粋なアミド誘導体
仕切り３のｐＩの範囲が今回は８．４６÷８．６５であり、そしてサンプル（５００ｍｇ）を仕切り３の代わりに最も近い陽極の仕切り（仕切り２）に添加するという違いだけで、同じ実験条件の下で実施例２を繰り返し、（主成分が移動させられ、そして等電的に分離される）仕切り３の中身を貯蔵容器からリサイクルする。
図７はこの精製の結果を示し、Ａ ４０９２６因子Ｂ₀のアミド誘導体の主要なピークに接近したより小さいピークがなく、従って、Ａ ４０９２６のＢ₁アミド誘導体が存在しないことを示している。
実施例４
尿素／ＣＨＡＰＳ支持混合物からのＡ ４０９２６因子Ｂ₀のアミド誘導体の分離
実施例３により得られた仕切り３に含まれた最終溶液（５０ｍｌ中に２００ｍｇ）を０．５Ｍ ＴＲＩＳ（４５０ｍｌ、ｐＨ ９）で希釈し、そしてシラン化したシリカゲルカラム（１６ ｘ ２５０ｍｍ）の上に４ｍｌ／分の流速でＭｉｎｉｐｌｕｓ ３ペリスタポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて添加し、メタノールを溶離剤として用いる。
溶液を添加する前に、カラムをＴＲＩＳバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ ９）で洗浄する。
溶液を添加した後、カラムを０の光学密度までまずＴＲＩＳバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ ９）で、そして次に塩を除去するために蒸留水で洗浄する。
溶出溶液のモニターを２８０ｎｍでＵＶ検出器ユニット２１３８ ｕｎｉｃｏｒｄｓ（ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行う。
０と異なる光学密度を示している画分を集め、そしてＲＰ−ＨＰＬＣ（上の方法論を参照）及びシリカゲルＦ２５４（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＴＬＣ、移動相ＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨ／ＮＨ₄ＯＨ（５０／４７／３）またはＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＯＯＨ／ＣＨ₃ＯＨ（５０／２０／１５／５）、ＵＶランプまたはヨウ素蒸気での可視化により分析した。
Ａ ４０９２６因子Ｂ₀の純粋なアミド誘導体を含んでいる画分をプールし、真空下で濃縮し、そして凍結乾燥する。

Claims (13)

1. 支持溶液が、尿素及びコール酸のスルホベタイン両性イオン誘導体である洗剤の水性混合物であることを特徴とする、固定両性イオン膜を有する多仕切りの電解層における等電点電気泳動によるダルバヘプチド族の抗生物質化合物の精製方法。
2. 洗剤が｛３−［３−（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］｝−１−プロパンスルホン酸塩である請求の範囲１に記載の方法。
3. 尿素の濃度が４Ｍから８Ｍまでである請求項１に記載の方法。
4. 尿素の濃度が８Ｍである請求項１に記載の方法。
5. 洗剤の濃度が１％から５％（ｗ／ｖ）までである請求項１に記載の方法。
6. 洗剤の濃度が２％から４．５％（ｗ／ｖ）までである請求項１に記載の方法。
7. 洗剤の濃度が３．５％（ｗ／ｖ）である請求項１に記載の方法。
8. ダルバヘプチド抗生物質がリストセチン型亜群に属する請求項１に記載の方法。
9. 精製されるダルバヘプチド抗生物質が、リストセチン、アクタプラニン、テイコプラニン、抗生物質Ａ３５５１２、抗生物質Ａ４１０３０、抗生物質Ａ４７９３４、アルダシンＡ、Ｂ、Ｃ、抗生物質Ａ４０９２６、キブデリン、パルボジシン、抗生物質ＵＫ ６８５９７または該抗生物質の天然もしくは半合成の誘導体である請求項１に記載の方法。
10. 精製されるダルバヘプチド抗生物質が、抗生物質Ａ４０９２６複合体またはその天然もしくは半合成の誘導体である請求項１に記載の方法。
11. 精製されるダルバヘプチド抗生物質が、抗生物質Ａ４０９２６複合体の６^B−デカルボキシ−６^B−（ヒドロキシメチル）−Ｎ⁶³−３−（ジメチルアミノ）プロピルアミド誘導体である請求項１に記載の方法。
12. 精製された生成物が集められる仕切りの２枚の境界を定める膜が、それぞれ８．４１及び８．６５のｐＩ値で設定される請求項１１記載の方法。
13. 精製された生成物が集められる仕切りの２枚の境界を定める膜が、それぞれ８．４５及び８．６５のｐＩ値で設定される請求項１１記載の方法。

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