JP3976351B2

JP3976351B2 - 免疫寛容プロトロンビン複合体の調製

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Publication number: JP3976351B2
Application number: JP54213398A
Authority: JP
Inventors: シュヴァルツ，ハンス−ペーター; トゥレツェック，ペーター
Original assignee: バクスター・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2018-04-06
Also published as: DE59800935D1; AU737566B2; AU6812198A; NO994822L; SK139099A3; ES2160410T3; ATE202483T1; CA2285935C; WO1998044942A1; NO994822D0; EP0973544A1; JP2001524953A; CA2285935A1; EP0973544B1; DK0973544T3; US6358534B1; PT973544E; BR9807936A

Description

本発明は、血液凝固障害を処置するための、特に因子ＶＩＩＩ阻害剤患者を処置するための医薬組成物に関する。さらに本発明はそのような組成物の調製方法ならびにその使用に関する。
血液凝固は、種々のタンパク質および酵素それぞれの一連の連続反応によって引き起こされる。血液凝固因子の欠如により、フィブリノーゲンからのフィブリンの形成、つまり傷口の閉塞が妨げられ；結果として出血する。血友病Ａはそのようなケースである。これは最も広範な出血疾患であり、因子ＶＩＩＩの欠如によって生じるものである。血友病Ａの置換処置用には、因子ＶＩＩＩを含む調製物を用いる。これらの調製物での処置では、ほとんどの場合、迅速な止血を導く。
しかし、因子ＶＩＩＩの欠如を被っているだけでなく、因子ＶＩＩＩに対する阻害剤を発達させている患者も存在する。さらなる患者の集団は、血友病Ａを患わずに、因子ＶＩＩＩ阻害剤を有する。存在する因子ＶＩＩＩ阻害剤の量に依存して、供給された因子ＶＩＩＩは中和され、その効果は阻害される。
現在、凝固因子の混合物を含む血漿フラクションに基づく調製物が因子ＶＩＩＩ阻害剤の患者の処置用に提案されている。例えば、この血漿フラクションはプロトロンビン複合体の因子（因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ）を含むかもしれない。例えば、ＡＴ−Ｂ０３６８８８３にしたがい、クリオ上清を処理することによって、因子ＶＩＩＩ阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢ活性）を有する血液凝固促進調製物（FEIBA▲Ｒ▼ S-TIM 4, from IMMUNO AG）を得る。また、この調製物は凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸを含む。
ＦＥＩＢＡ（ファイバ）調製物の作用はその複雑な組成ゆえ多種多様である。Marianiら（Thrombosis Res. 31, 475-488（1983））は、活性因子として、活性化形態の因子ＶＩＩを記載している。ＦＥＩＢＡ調製物の注入後、血友病患者の血漿中、因子ＶＩＩａ含量が増大することが認められた。
同様に、Teitel（Thrombosis and Haemostasis 66（5）559-564（1991））は、因子ＶＩＩＩバイパス化活性を有する、プロトロンビン複合体濃縮物中の因子ＶＩＩａの役割を論考している。同時に、このような調製物中の活性因子である因子Ｘａもまた論考されている。アッセイされたプロトロンビン複合体濃縮物は、因子ＶＩＩ抗原に対する因子ＶＩＩ活性が２．１および２．５の割合で発現される因子ＶＩＩａを含んでいた。
ＥＰ００４４３４３−Ｂ１にしたがって調製されたプロトロンビン含有治療組成物は凝固因子阻害剤の処置に適当であり、因子が一部活性化されている活性化プロトロンビン複合体を含む。因子ＶＩＩａ含量は８−８０ユニット／ｍＬである。因子ＩＸ濃度は１５から１１２ユニット／ｍＬの範囲である。したがって、因子ＩＸを基準にする因子ＶＩＩａ含量は因子ＶＩＩａ０．０７−５．３Ｕ／因子ＩＸＵである。Vinazzer（Thromb. Res. 26:21-29（1982））は、ＥＰ００４４３４３にしたがって調製された調製物ＡＵＴＯＰＬＥＸおよびＦＥＩＢＡの相違を示す。ここに示されるように、ＡＵＴＯＰＬＥＸは、ＦＥＩＢＡと比較し、ＮＩＨユニットで測定されるトロンビンの含量がより高いことによって特徴付けられる（第１７頁の表１参照）。
しかしまた、凝固阻害剤症状の治療用に、高度に精製された因子ＶＩＩａ調製物が提案された。（例えば、ＥＰ００８２１８２−Ｂ１）およびHedner et al.（Haemostasis 19, 335-343（1989））。
因子ＶＩＩａ調製物の利点は因子ＶＩＩＩを含まないことである。プロトロンビン複合体調製物または活性化プロトロンビン複合体調製物、例えばＦＥＩＢＡ中に含まれる因子ＶＩＩＩは、機能的な因子ＶＩＩＩ阻害剤を有する患者内において、因子ＶＩＩＩを新たに投与することにより、これらの阻害抗体がブースト（boost）され、結果的に阻害剤血友病の症状が一時的に悪化しさえする効果を有する。
しかし、因子ＶＩＩＩ阻害剤血友病における有効な止血に関し、因子ＶＩＩａ調製物の作用はプロトロンビン複合因子調製物の作用より劣ることが認められた（Turecek P. et al., Thrombosis & Haemostasis, 1997, p.222）。
したがって、プロトロンビン複合因子調製物の効力または効率を有するが、このような調製物の望ましくない免疫学的副作用を生じない調製物を提供することが本発明の目的である。
本発明では、因子ＶＩＩＩ抗原含量の低い、因子ＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含む免疫寛容のプロトロンビン複合体医薬調製物を提供することにより上述の目的を達成する。
本発明に記載の調製物の因子ＶＩＩＩ抗原含量は、１０％以下、特に５％以下であるのが好ましい。因子ＶＩＩＩ：Ｃ抗原／ＦＥＩＢＡＵ（ファイバ単位）が０．１（Ｕ／Ｕ）以下であることが好ましい。特に好ましい態様では、因子ＶＩＩＩ抗原含量は０．０３／ＦＥＩＢＡＵ以下、より好ましくは０．０２／ＦＥＩＢＡＵ以下、最も好ましくは検出下限以下でさえある。
特に、血漿または血漿フラクションからプロトロンビン複合因子をさらに精製する場合、プロトロンビン複合因子の活性を大部分維持したまま、因子ＶＩＩＩ含量、および場合によりリン脂質含量を大きく減少させることができるという発見は驚くべきことであると考えられるに違いない。
特に、本発明に記載の医薬調製物は少なくとも因子ＩＸａ、ＸａおよびＶＩＩａを含み、ＦＥＩＢ活性を有し、すなわちこれは、機能的阻害剤を含み、因子ＶＩＩＩが欠如した血漿の凝固時間を短縮する（本明細書中、例えばAT-B 350 726参照）。
本発明に記載の調製物は血漿または血漿フラクションから調製することができる。血漿フラクションは、血漿、特にヒト起源の血漿から、クロマトグラフィー処理、沈降または遠心によって調製することができ、あるいはクリオ沈降物の上清を用いる。
血漿フラクションは、ビタミンＫ依存因子、例えばプロトロンビン複合体の因子を含み、さらにまたタンパク質Ｓ、Ｃおよび／またはＺが含まれるのが好ましい。
特に好ましい態様では、調製物はリン脂質を含まない。好ましくは、含まれるリン脂質の上限は０．１nmol／ＦＥＩＢＡＵである（測定に関しては、実施例参照）。
リン脂質を含まないため、因子ＶＩＩＩに対する望ましくない抗体の形成を減少させ、阻害することができる。
また、本発明により、この調製物を生産する方法をも提供する。この方法は以下の工程を含む：
ａ）因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含む血漿または血漿フラクションを得る工程；
ｂ）場合により界面活性剤の存在下で、血漿または血漿フラクションを担体物質と接触させ、因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩから因子ＶＩＩＩ、および場合によりリン脂質を分離する工程；
ｃ）血漿または血漿フラクションを精製する工程；ならびに、
ｄ）因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含むフラクションを回収する工程。
特に好ましいバリエーションでは、工程ｂおよびｃまたはｂ、ｃおよびｄを一方法工程として行う。
用いる血漿フラクションは少なくとも中間の純度を有するものが好ましい。
「中間の純度を有する調製物」とは、血漿フラクションが、中間の純度の因子ＶＩＩＩ調製物の定義と類似であることを意味する（本明細書中、例えばWood Clive（ed.）Factor VIII:Purity and prophylaxis, Royal Society of Medicine参照）。
したがって、クロマトグラフィー精製によって除去されない付随タンパク質は中間の純度の調製物中に依然として存在していてもよい。
出発物質として、慣用の市販プロトロンビン複合因子調製物、例えばＩＭＭＵＮＯのＦＥＩＢＡ▲Ｒ▼ Ｓ−ＴＩＭ４または活性化プロトロンビン複合体を用いることができる。
各精製処理として、先行技術から既知の方法を用い、好ましくはクロマトグラフィー処理、沈降または遠心を行う。また血漿フラクションとして、クリオ沈降物の上清を用いることもできる。
担体物質はクロマトグラフィー、ろ過および／またはナノフィルトレーションに適当な物質である。ろ過とは特にアフィニティーろ過または膜ろ過である。
前精製された物質、例えばアニオン交換体によって前精製された物質を用いる場合、変化させた条件下で、さらなる担体物質、好ましくは前精製用に用いたのと同じ担体物質への再吸着を用いる。
好ましい態様では、担体物質は因子ＶＩＩＩ特異的担体物質、特にアフィニティークロマトグラフィーに適当な基質（マトリックス）である。特に好ましくは、ｖＷＦ含有基質を用いる。
このような担体物質に対し、因子ＶＩＩＩ、および場合によりリン脂質は吸着し、一方、因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合によりＶＩＩは結合しないのが好ましい。
しかし、担体物質はまた、因子ＶＩＩＩに対して非特異的な担体物質、例えば弱いアニオン交換体、例えばＤＥＡＥ、ＴＭＡＥアニオン交換体または先行技術から十分に既知のさらなるアニオン交換体であり得る。
選択された条件に依存して、因子ＶＩＩＩ、および場合によりリン脂質は担体物質に吸着し、因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩは結合しないか、あるいはその逆である。
さらに好ましい態様では、担体物質は因子ＶＩＩＩに対してよりプロトロンビン複合体に対して高いアフィニティーを有する。したがって、例えば、因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩは吸着し、因子ＶＩＩＩ、および場合によりリン脂質は溶出する。
因子ＶＩＩＩを意図的に不活化し、次いで例えばもはや担体物質と結合しないような不活化形態にすることもできる。このような因子ＶＩＩＩの不活化は、例えばキレート試薬を用いて解離させることによって、分解、特に、例えばセリンプロテアーゼ、例えばトロンビンまたは活性化プロテインＣによってタンパク質分解することによって、アフィニティーパートナー、例えば抗体またはペプチドを結合させることによって行うことができる。
開示するすべてのバリエーションの方法を界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤の存在下で行うこともできる。好ましくは、界面活性剤としてポリエーテルまたはポリソルベートを用い、特にトゥイーンまたはトリトンを用いる。
界面活性剤が存在する場合、好ましい態様では、これを再び除去し、あるいは分離する。
さらに好ましい態様では、特に熱処理、蒸気処理、溶媒での処理および／または界面活性剤での処理の群から選択される、存在する可能性のある病原体の不活化工程を提供する。
したがって、概して前記方法にしたがい、本発明に記載の調製物を得ることができる。これは、因子ＶＩＩＩ阻害剤（＝血友病Ａ）患者、特に１ベテスダ（Bethesda）Ｕ／血漿ｍＬ以上、好ましくは５ベテスダＵ／血漿ｍＬ以上の阻害剤力価を有する患者に対する処置に適当な薬剤の製造に特に適当である。また、高度に精製された個々の因子ＩＩ、ＩＸおよびＸ、ならびに場合により因子ＶＩＩの組み合わせによってこれを製造することもできる。
生物学的物質、すなわち生物または体液または微生物から誘導された物質は、病原体、例えば感染分子または微生物およびウイルスまたは発熱原で汚染されているかもしれないので、病原体または発熱原を不活化あるいは涸渇させる種々の方法が開発された。
このような方法には、物理的および／または化学的処理、例えば種々のろ過方法（例えばナノ−、ディア（dia）−、ウルトラフィルトレーション）、熱処理、酸またはアルカリでの処理、界面活性剤および／または有機溶媒での処理、ならびにＵＶ光またはレーザー光での処理が含まれる。このような病原体を不活化あるいは涸渇させる方法の種々の組み合わせもまた、先行技術においてしばしば示されている。
例えば、ＥＰ０１９７５５４から、生成物が吸着した固相上、ウイルス不活化試薬およびウイルス脱発熱原化試薬、例えば両親媒性物質および／または溶媒で処理することを特徴とする、生物学的生成物または医薬生成物中のウイルスを脱発熱原化および不活化する方法が既知である。この処理に続いて、ウイルス不活化試薬およびウイルス脱発熱原化試薬を固相から分離し、吸着した生成物を洗浄し、最後に固相から溶出させる。
ＥＰ０１３１７４０から、場合により界面活性剤の存在下、溶液中のタンパク質含有組成物を有機溶媒、例えばジ−またはトリ−アルキルホスフェイトで処理すること（溶媒／界面活性剤処理）が既知であり、これにより脂質含有ウイルスを含まないタンパク質組成物を得ることができる。
ＡＴ特許第４０２，１５１号から、加熱前に、少なくとも１重量％の濃度のテンシド（tenside）を水溶液中に存在する調製物と混合する熱処理が既知である。
生物学的生成物あるいは医薬生成物中の望ましくない活性を減少させ、あるいは抑制するさらなる方法は、ＥＰ００８３９９９から既知である。この方法は、非変性両親媒性試薬の溶液または懸濁液と長時間接触させることに基づく。脱発熱原化生成物をイオン交換体で処理し、両親媒性試薬を除去する。
先行技術から既知のこれらの多くの方法の不都合な点は、処理される組成物に含まれている不安定なタンパク質、例えば血液タンパク質の活性がしばしば失われることである。特にクロマトグラフィー精製工程を行う場合、タンパク質の不活化が比較的高い程度に生じる。また、タンパク質の分解は活性化を導くこともある。したがって、例えばクロマトグラフィー精製の間に、自触媒作用的工程のせいで、因子ＶＩＩが非常に容易に活性化し、非常に不安定なので望ましくない因子ＶＩＩａになることが知られている。
さらなる不都合な点は、多くの方法に必要とされる多大な時間および装置に存し、これは該方法の実用性を大きく減少させ、それゆえしばしば産業規模での適用に不適当なものにする。
したがって、本発明の範囲内では、タンパク質、特に不安定なタンパク質に対して容易であり、生物学的物質中の病原体を効果的に不活化する方法を用いるべきであり、これは容易に産業規模で適用でき、経済的に実施できるものである。特に、この病原体不活化方法では、起こり得るタンパク質の分解および可能な活性化が大部分回避されるべきである。
生物学的物質中の病原体、特にウイルスを不活化する本方法では、この物質を化学物質と、少なくとも２００mmol／Ｌ、好ましくは少なくとも３００mmol／ＬのＮａＣｌ濃度に相当するエルオトロピック（eluotropic）塩の存在下でインキュベートする。
溶液中の病原体の不活化は、吸着剤の処理よりもいくらか有利である。したがって、例えばこのような方法は、均質の単相系でより高い実用性を示し、不活化の確認がより可能である。さらに、比較的均質の相において病原体がより影響を受けやすいことは、本方法工程の効率を増加させると思われる。
このような生物学的物質はヒトタンパク質を含み、特にそれは血漿または血漿フラクションであるか、あるいは細胞培養物から誘導されるものである。好ましくは、生物学的物質は血液因子、例えば因子ＸＩＩ、ＸＩ、ＶＩＩＩ、Ｖ、フォンビルブラント因子またはフィブリノーゲン、特にビタミンＫ依存性タンパク質、例えば因子ＩＩ、因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、プロテインＣ、プロテインＳまたはプロテインＺを含む。
このようなタンパク質は、好ましくは精製された形態あるいは複合体混合物で、単一の因子として存在し得る。特に好ましい態様では、生物学的物質はプロトロンビン複合体の少なくと１つの因子を含み、特にプロトロンビン複合体含有フラクションまたは因子ＶＩＩ含有物質であり、例えば、血漿をクリオ沈降させた後、その各上清（クリオ上清）から出発する。
本発明の調製物は好ましくはＦＥＩＢ活性（因子ＶＩＩＩ阻害剤バイパス活性）を有するものであり、すなわち因子ＶＩＩＩ阻害剤患者の処置に適当な調製物である。
細胞培養物から誘導された物は好ましくは、組換え的に生産された血液因子を含む物質であり、それらの血液因子の中には、内因性もしくは外因性の凝固因子、繊維素溶解因子、血栓崩壊因子、またはそれらの阻害剤、特にビタミンＫ依存性の血液因子がある。細胞として、組換えタンパク質の発現用に一般に用いられる細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばＶｅｒｏ、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞を用いることができる。存在し得る病原体を不活化するため、直接、粗製の細胞抽出物由来か、あるいは前精製細胞フラクション由来であってもよい各タンパク質を本発明の方法に付する。
化学物質は、例えば界面活性剤（両親媒性物質、テンシド）であり、これは少なくとも１％、より好ましくは５％以上、最も好ましくは１０％以上の量含まれるのが好ましいが、本発明にしたがい、殺ウイルス効果、殺菌効果または脱発熱原化（deparogenizing）効果を有することが既知である他の化学物質、またはほとんどの種々の化学物質の混合物を用いてもよい。
しかし、この選択は、生物学的物質の性質が実質的に有害な影響を受けないものに限定される。経済的な方法または手法のため、インキュベーション前の活性を基準にして５０％以上、好ましくは少なくとも７０％、特に８５％以上のこの物質の生物学的活性を維持する化学物質が選択される。生物学的活性の維持は、この生物学的物質に含まれるタンパク質がその天然に与えられている機能または異なる機能を満たすことができることを意味する。次いで、例えば染色体試験または抗原決定により、この生物学的活性を決定し、タンパク質のタイプに応じて記載することができる。場合により、インキュベーション後に化学物質を分離する。
界面活性剤とは、非常に一般的な合成の有機の界面活性物質を意味する。
好ましくは、本発明の方法では非イオン性の界面活性剤を用いる。非イオン性テンシド、例えばポリエーテル、特にアルキルフェノールポリグリコールエーテルは、脂肪酸、脂肪酸アミド、脂肪アミン、脂肪アルコール、アミノキシド（aminoxides）、ポリアルコールの脂肪酸エステルおよび糖エステルのエトキシル化生成物である。
このようなテンシドはタンパク質に対して変性作用を有さず、好ましくはポリソルベートおよびトリトンの群から選択される。ポリソルベートとしては、例えばトゥイーン^Rを用いる。
化学物質として界面活性剤を用いる場合、好ましい態様では、他の物質を加えずに、特に有毒な有機物質または溶媒、例えばＴＮＢＰを加えずに、界面活性剤を用いる。この方法では、汚染される危険性が最小にまで減少する。
本発明の方法では、生物学的物質を化学物質とインキュベートする。インキュベーションとは、存在する可能性がある病原体および発熱原を不活化するのに十分な時間、一定温度で、生物学的物質を化学物質の溶液、懸濁液または乳液と接触させることを意味する。例えば、混合物を単に決められた時間静置することによって接触を行ってもよい。
本発明では、エルオトロピック塩の存在下にインキュベーションを行う。以下、「エルオトロピック塩」は、固形または液状浸透タイプまたはゲルタイプの吸着剤から吸着された物質を溶解させ、ならびに／あるいはそれらを置換する性質を有する、化学物質との混合物中の塩または複合体組成物中の塩を意味する。好ましくは、エルオトロピック塩はクロマトグラフィー法で用いられる脱着物質である。吸着された物質は、エルオトロピック塩の存在下で十分に可溶であり、すなわち生物学的物質が沈降しない条件が選択されるのが好ましい。
塩または組成物のタイプおよび濃度は、一般に、用いられる吸着剤に依存して選択される。塩の溶出作用は例えば、溶媒の極性に依存し、すなわち例えば、エタノール−アセトン−メタノール−水の順で増加する。吸着剤は固相、特にイオン交換クロマトグラフィー用に適当な基質であり得る。またエルオトロピック塩を含む組成物中にさらに、添加剤、例えばさらなる塩を含ませることができる。好ましくは、組成物は、６．０から８．０の範囲のｐＨ、好ましくは約７．０のｐＨを有する水性組成物である。
好ましい態様では、塩化ナトリウムをエルオトロピック塩として用い、さらに他のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、その中でもＣａＣｌ₂を用いる。エルオトロピック塩として、いわゆるカオトロピック塩、例えば、尿素、ロダニド（rhodanides）またはグアニジウムを用いることもできる。塩の濃度は少なくとも

２００mmol／Ｌ、好ましくは

３００mmol／Ｌである。用いられる濃度の上限は、特にそれぞれの塩の溶解度に依存し、例えばＮａＣｌに関しては、約２mol／Ｌである。カオトロピック物質、例えば尿素は８mol／Ｌまでの濃度でさえ用いられることがある。
存在する可能性があるすべての病原体を不活化するのに十分な時間、好ましくは１０分から１０時間、最も好ましくは１時間から５時間、この生物学的物質を化学物質とインキュベートする。本発明の方法に必要な時間は、前アッセイにおけるモデルウイルス、例えばＨＩＶ、シンドビス、ＴＢＥまたは肝炎卯ウイルスを用いて決定することができる。
また、温度の選択は、用いられる時間に影響する。本発明の方法では、室温、例えば１５から４５℃、特に２０から３０℃の範囲の温度でインキュベーションを行うのが好ましい。
本発明の方法では、好ましくは生物学的物質を固形担体に吸着させ、精製し、精製された物質を溶出させた後すぐにインキュベーションを行う。溶出およびインキュベーションは連続して行ってもよいが、同時に行うこともできる。
さらなる好ましい態様では、生物学的物質をクロマトグラフィー精製し、遠心、ろ過または他の物理的方法によって溶出物をさらに処理した後、インキュベーションを行う。
固形担体はクロマトグラフィー用に適当な物質、特にイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー用に適当な物質であるのが好ましい。例えばSepharose^R、Superdex、Sephadex^R、Spherodex^R、Toyopearl^Rのような物質、またはヒドロキシルアパタイトのような無機物質を用いる。
イオン交換体として、アニオン交換物質、例えばDEAE-Sephacel^R、DEAE-Sephadex^R、DEAE-Sepharose^R、ＣＬ６Ｂ、DEAE-Sepharose^R Fast Flow、QAE-Sephadex^R、Q-Sepharose^R Fast Flow、Q-Sepharose^R High Performance，DEAE-Tris-acryl、DEAE-Spherodex^R、Q-Hyper-D（Sepractorから得られる）、DEAE-Toyopearl^R、QAE-Toyopearl^R、Fractogel^R EMD-TMAEまたは他のFractogel物質を用いることができる。
疎水性クロマトグラフィー物質の例としては、例えばブチル−Sepharose^R、オクチル−Sepharose^R、フェニル−Sepharose^R、Fractogel^R TSK−ブチル、t−ブチル−HIC支持体またはTSKゲルブチルToyopearl^Rを記載すべきである。
複合体混合物由来の生物学的物質は担体に直接吸着され、精製されるが、不活化工程の前後に、この物質を精製するためのさらなる工程を行うこともでき、好ましくはさらなるクロマトグラフィー精製工程は本発明の範囲内である。
本発明の方法によって、病原体を不活化する。病原体とはまた、例えばウイルスの断片、特にまた、単離されたゲノムまたはその断片を意味する。
病原体は、例えばＢ型肝炎ウイルスのような脂質包膜病原体、または例えばＡ型肝炎ウイルスのような非脂質包膜病原体であり得る。
現在、高用量の試験ウイルス、例えば肝炎ウイルスのモデルウイルスとしてのＨＩウイルスまたはシンドビスウイルスと混合された生物学的物質のサンプルに対して本方法を用いた後に、ウイルス力価が検出下限より減少していてサンプル中にウイルスがもはや検出できなければ、ウイルスの不活化方法は有効であると言える。
核酸の検出および定量は、例えばＡＴ特許第４０１，０６２号に記載のＰＣＲ法または直接滴定法によって行うことができる。
不活化の尺度として、試験ウイルスを一回加えた後、出発ウイルス力価と最終ウイルス力価の比率の常用対数（decadic logarithm）から計算されるいわゆる減少因子が知られている。さらに、欧州共同体の委員会の欧州ガイドラインＥＣＩＩＩ／８１１５／８９−ＥＮから、いわゆる総合減少因子が既知である。これは個々の連続する不活化方法の減少因子の合計から計算される。
またさらに、病原体を不活化あるいは涸渇させる独立した工程をそれぞれ行うのが好ましい。このために先行技術から既知のすべての方法を用い、感染の危険性を最小にすることができる。
特に、さらなる不活化あるいは涸渇工程としてろ過および／または熱処理を行う。
ろ過として、好ましくはナノフィルトレーションを行う。熱処理は、ＥＰ−０１５９３１１に記載のように、５０℃から８０℃の温度で、固形生物学的物質、例えば制御された、例えば５から８％の範囲の水含量を有する凍結乾燥物に対して行うのが好ましい。
好ましい態様では、化学物質として界面活性剤を用いる二工程処理を提供する。ここでは、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１０％量の界面活性剤を第一工程で用いる。第二工程では、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１２％、最も好ましくは少なくとも１４％量のさらなる界面活性剤を用いる。用いられる界面活性剤は両工程で同じものにしてもよいが、異なる界面活性剤を用いることもできる。非常に一般的に、ウイルスの不活化工程の組み合わせによって、対応する調製物を投与した後のウイルス感染の危険性を大きく減少させ、排除することができる。
本発明ではまた、活性化された血液因子および活性化されていない血液因子の含量を基準にして、５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、最も好ましくは１％以下の割合の活性化された血液因子を有し、ならびに界面活性剤を含有する、自己動力学的に活性化し得る血液因子を含むクロマトグラフィー精製された調製物を提供する。
特に調製物は、活性化された因子ＶＩＩおよび活性化されていない因子ＶＩＩの含量を基準にして５０％以下、好ましくは１０％以下、最も好ましくは１％以下の因子ＶＩＩａ活性を含むプロトロンビン複合体含有調製物である。本発明の調製物の界面活性剤含量は製薬的に許容される量、好ましくは１％から界面活性剤の検出限界量までの範囲である。
本発明に記載の「自己動力学的に活性化し得る血液因子」とは、表面接触により、あるいは例えばクロマトグラフィー工程のような工程により自触媒的に活性化することができる血液因子を意味する。特にこのような血液因子は因子ＶＩＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩおよびプレカリクレインの群から選択される因子である。
さらに好ましい態様では、本調製物はセリンプロテアーゼ阻害剤、例えばトロンビン阻害剤、およびその補因子、例えばヘパリンを含まない。特定の態様では、クロマトグラフィー工程の間に、すでにこのような物質を含まないようになっている。
したがって、本発明はまた、本発明の方法によって得られる対応する調製物に関する。
また本発明の調製物中には、さらに添加剤、例えばアミノ酸のような安定化物質が含まれていてもよい。
以下の実施例は本発明を、これらに限定することなく、より詳細に説明する。
実施例１：因子ＶＩＩＩの測定
Moritz B. et al.（Thromb. Haemost. 1997, Suppl:31）の方法にしたがい、ＦＥＩＢＡ中の因子ＶＩＩＩ抗原を測定した。この測定では、ＦＥＩＢＡ中、捕獲抗体として、因子ＶＩＩ分子の軽鎖に対するモノクローナル抗体を、ならびに検出抗体として、因子ＶＩＩＩ分子の軽鎖に対するモノクローナル抗体であって、異なるエピトープに対するものを用い、他の血漿タンパク質を除いて、因子ＶＩＩＩを選択的に検出する。
実施例２：リン脂質の測定
Folch J. et al.（J. Biol. Chem. 1957, 226:497-509）の方法にしたがい、ＦＥＩＢＡフラクションの凍結乾燥剤粉末から、クロロホルム、メタノールをメタノール１容量に対してクロロホルム２容量の割合で含む溶媒混合物を用いて、構造上結合したホスフェイト（phosphate）を抽出する。次いで完全なリン脂質部分を含む抽出物をテフロン容器に移し、窒素流下で有機溶媒を蒸発させた。緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）およびOxisolv試薬（Merck）を加えた後、テフロン容器を堅く密封し、１６０℃で５時間消化した。Ames B.N.（Methods in Enzymology 1996, 8:115-118）の方法にしたがい、消化処理によって遊離したホスフェイトをモリブデン酸複合体として定量的光度測定的に検出した。
実施例３：因子ＶＩＩＩ結合アフィニティー担体の調製
組換えフォンビルブラント因子を産生するＣＨＯ細胞クローンをFEBS Lett.1994; 351:345-348に記載のように調製する。ヒトフリンのｃＤＮＡをコードするベクターをトランスフェクションする（van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 1990; 18:664）ことによって、ヒトフリンを同時発現するセルラインを作成した。潅流反応容器中、マイクロ担体上で、このような適当な細胞クローンを大規模に発酵させた

Thromb.Haemost.1995; 73:1160に記載の二工程クロマトグラフィー法として精製を行った。食塩水での溶出により脱着させたフラクションを回収し、
Sephadex G25（Pharmacia）でのゲルろ過により、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液に再懸濁した。次いで、Amicon YM30膜（カットオフ：３０，０００Ｄ）を介してこの調製物を超濃縮
（ultraconcentration）し、タンパク質濃度３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。この調製物中のフォンビルブラント因子の濃度は総計ｖＷＦ抗原６０Ｕ／タンパク質ｍｇに達した。
２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液で、組換えフォンビルブラント因子の調製物を１．５ｍｇ／ｍＬにまで希釈した。アフィニティークロマトグラフィーに適当な前活性化ゲル（Actigel, ALD-Superflow, from Sterogene）を、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７.５の緩衝液で何度も前洗浄した。前洗浄ゲル１容量をタンパク質溶液１．１容量と混合して固定化し、次いで０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０中の０．１Ｍシアノホウ水素化物（ＮａＣＮＢＨ₃）溶液０．１５容量を加えた。振動によりゲルをこの緩衝液に懸濁し、振動を継続しながら、室温で１６時間インキュベートした。次いで、焼結吸引フィルター上、１０倍容量の２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液および５倍容量の２０ｍＭトリス塩酸、２ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液でこのゲルを洗浄した。次いで、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液５容量でこれを再び平衡化し、直径：ゲル床の高さの寸法が１：４であるクロマトグラフィーカラムにこのゲルを移した。フォンビルブラント因子溶液およびアフィニティーゲルのインキュベーション上清ならびに燒結吸引フィルターで分離された洗浄溶液の溶液中のタンパク質濃度を測定することにより、用いたタンパク質の９０％以上のカップリング比が測定できた。
実施例４：アフィニティーゲルと接触させることによる因子ＶＩＩＩを含まないプロトロンビン複合体の調製（現在、発明者が本発明の最良の実施方法であると考えているもの）
医薬調製物FEIBA▲Ｒ▼ S-TIM 4 IMMNO（１０００ユニット）を蒸留水２０ｍＬに再組成した。凍結乾燥粉末を完全に溶解させた時点で、この溶液は５０ユニット／ｍＬの活性物質濃度を含んでいた。この溶液１０ｍＬを前述の固定化フォンビルブラント因子１００ｍｇと接触させ、穏やかに振動させながら室温で１時間インキュベートした。次いで燒結吸引フィルターを介してこの固定化物を除去した。ろ液中に含まれるＦＥＩＢＡ溶液は、ＦＥＩＢＡ４９ユニット／ｍＬの活性を有していた。調製物中に含まれる因子ＶＩＩＩを固定化フォルビンブラント因子と結合させることによって、この調製物中の因子ＶＩＩＩ抗原は検出下限以下になった。
実施例５：非特異的担体への再吸着による因子ＶＩＩＩを含まない活性化プロトロンビン複合体の調製
PharmaciaのDEAE-Sephadex^R A-50 １５ｍｇを３０ｇ／ＬＮａＣｌの水溶液と、室温で１５分間、膨張するまでインキュベートした。次いで、遠心により、膨張上清からこのゲルを分離した。このゲルを緩衝液（９ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄２Ｈ₂Ｏ、７ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．０）各１ｍＬで５回洗浄し、さらに緩衝液（７ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ₃ ２Ｈ₂Ｏ、７ｇ／ＬＮａＣｌ）で２回洗浄した後、また再懸濁し、遠心した。
新しい凍結ヒトクエン酸添加血漿３０ｍＬを０から＋４℃で溶かし、生じたクリオ沈降物を＋２℃で遠心して分離した。ここから得られた「クリオ上清」を、洗浄したDEAE-Sephadex^Rとインキュベートし、ＦＥＩＢＡを生成させ、プロトロンビン複合体の因子、因子ＶＩＩＩおよび不活性タンパク質とともにゲルに吸着させた。その後、緩衝液（９ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄ ２Ｈ₂Ｏ，７ｇ／ＬＮａＣｌ）で洗浄し、同時に吸着された不活性タンパク質をDEAEゲルから除去した。
１５０ｍｇ／ｍＬトゥイーン^R−８０および３０ｍｇ／ｍＬＮａＣｌの溶液１．５ｍＬを用い、緩衝液で湿らせたゲルタンパク質複合体を２６℃で１時間懸濁した。高イオン強度の溶液で処理することにより、タンパク質をプロトロンビン複合体および因子ＶＩＩＩとともに脱着させた。次いで、水６．５ｍＬを加えて懸濁液を希釈し、室温で１時間再吸着させ、プロトロンビン複合体フラクションを再び吸着させた。同時に、タンパク質フラクションに含まれる少量の因子ＶＩＩＩのみがゲルに再吸着した。次いで、界面活性剤を含まない７ｇ／ＬＮａＣｌの水溶液各１ｍＬでゲル／タンパク質複合体を５回洗浄した。
溶出のため、攪拌しながら、３０ｇ／ＬＮａＣｌ水溶液０．７ｍＬでゲルを処理した。この溶出液を蒸留水に対して透析し、凍らせ、凍結乾燥した。凍結乾燥物の再組成後、ＡＴ３５０，７２６にしたがってＦＥＩＢ活性を測定した。
さらに因子ＶＩＩＩ抗原含量を測定した。コントロールとして、ＡＴ３５０，７２６に記載の一般に製造されるＦＥＩＢＡ調製物を用いた。記載の方法にしたがって回収された調製物は、因子ＶＩＩＩ含量がコントロールと比べて１／１０であった。
界面活性剤と接触させることにより、存在する可能性がある病原体、特に脂質包膜ウイルスを不活化した。
実施例６：非特異的担体への再吸着による、因子ＶＩＩＩを含まず、リン脂質を含まない活性化プロトロンビン複合体の調製
３０ｇ／ＬＮａＣｌの水溶液１ｍＬとともに、室温で１５分間、DEAE-Sephadex^R A-50（Pharmacia）１５ｍｇを膨張するまでインキュベートした。次いで、遠心により膨張上清からゲルを分離した。この後、このゲルを緩衝液（９ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄ ２Ｈ₂Ｏ、７ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．０）各１ｍＬで５回洗浄し、緩衝液（７ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ₃ ２Ｈ₂Ｏ、７ｇ／ＬＮａＣｌ）でさらに２回洗浄し、さらに再懸濁し、遠心した。
新しい凍結ヒトクエン酸添加血漿３０ｍＬを０から＋４℃で溶かし、生じたクリオ沈降物を＋２℃で遠心して分離した。ここから得られた「クリオ沈降物」を洗浄されたDEAE-Sephadex^Rとインキュベートし、ＦＥＩＢＡを生産し、プロトロンビン複合体の因子、因子ＶＩＩＩ、リン脂質および不活性タンパク質とともにゲルに吸着させた。その後、緩衝液（９ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄ ２Ｈ₂Ｏ、７ｇ／ＬＮａＣｌ）で洗浄し、同時に吸着された不活性タンパク質をDEAEゲルから除去した。
１ｍｇ／ｍＬトゥイーン^R−８０および３０ｍｇ／ｍＬＮａＣｌの溶液１．５ｍＬを用い、緩衝液で湿らせたゲルタンパク質複合体を室温で１時間懸濁し、タンパク質フラクションおよび非特異的に吸着された不純物を脱着させた。次いで、ろ過によりゲルを分離した。今度はトゥイーン^R−８０をさらに加えて、この溶液の界面活性剤濃度を１５０ｍｇ／ｍＬにした後、これを４０℃で１時間、攪拌しながらインキュベートした。次いで、水６．５ｍＬを加えてこれを希釈し、新しく洗浄され調製されたDEAE-Sephadex^R A-50ゲルを再吸着させ、プロトロンビン複合体フラクションを再吸着させた。同時に、タンパク質フラクションに含まれる少量の因子ＶＩＩＩのみがゲルに結合した。次いで、界面活性剤を含まない７ｇ／ＬＮａＣｌ水溶液各１ｍＬでこれを５回洗浄した。そのようにして、また両親媒性物質と接触させたことにより可溶化状態で存在する結合リン脂質を除去した。
溶出のため、攪拌しながら、３０ｇ／ＬＮａＣｌ水溶液０．７ｍＬでゲルを処理した。この溶出液を蒸留水に対して透析し、凍らせ、凍結乾燥した。凍結乾燥物の再組成後、ＡＴ−Ｂ３５０，７２６にしたがってＦＥＩＢ活性を測定した。
さらに記載のように因子ＶＩＩＩ抗原含量およびリン脂質を測定した。コントロールとして、ＡＴ３５０，７２６にしたがって回収された、一般的に製造されるＦＥＩＢＡ調製物を用いた。記載の方法にしたがって得られた調製物は、因子ＶＩＩＩ含量がコントロールと比べて減少しており、リン脂質を含んでいなかった。分析の結果を表１にまとめる。

Claims

因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含み、因子ＶＩＩＩ抗原の含量が、因子ＶＩＩＩ：Ｃ抗原／ファイバ単位が０．１（Ｕ／Ｕ）以下であることを特徴とする免疫寛容プロトロンビン複合体医薬調製物。
血漿または血漿フラクションから製造されることを特徴とする請求項１に記載の医薬調製物。
該調製物が因子ＩＸａ、ＸａおよびＶＩＩａの少なくとも１つを含み、因子ＶＩＩＩ阻害剤バイパス活性を有することを特徴とする請求項１または２に記載の医薬調製物。
リン脂質を含まないことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の医薬調製物。
以下の工程を含む請求項１から４のいずれかに記載の調製物の製造方法：
ａ）因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含む血漿または血漿フラクションを得る工程、
ｂ）場合により界面活性剤の存在下に該血漿または血漿フラクションを担体物質と接触させ、因子ＶＩＩＩ、および場合によりリン脂質を因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩから分離する工程、
ｃ）血漿または血漿フラクションを精製する工程、ならびに、
ｄ）因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および場合により因子ＶＩＩを含むフラクションを回収する工程。
工程ｂおよびｃを一方法工程として行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
該担体物質がクロマトグラフィー、ろ過および／またはナノフィルトレーション用に適当な物質であることを特徴とする請求項５または６に記載の方法。