JP3817739B2 - キメラｄｎａ結合性タンパク質 - Google Patents

Description

政府援助
本明細書に記載した内容の一部は、米国の公衆衛生局／国立衛生研究所、国立科学財団および国立癌研究所からそれぞれ交付番号PO1-CA42063、CDR-8803014およびP30-CA14051により援助を受けた。米国政府は本発明にある種の権利を有する。本明細書に記載した内容の一部はハワード・ヒューズ医学研究所による援助も受けた。
発明の背景
転写因子のようなDNA結合性タンパク質は、遺伝子発現の決定的な調節因子である。例えば、転写調節タンパク質は、細胞外シグナルを改変(altered)遺伝子発現に変換させる細胞シグナル形質導入経路に重要な役割を果たすことが知られている[Curran and Franza, Cell, 55:395-397 (1988)]。DNA結合性タンパク質はまた、細胞増殖の制御やウイルスおよび細菌遺伝子の発現にも決定的な役割を果たす。とりわけ遺伝子治療、生物学的材料の生産、および生物学的研究を含む非常に多くの生物学的および臨床学的プロトコルが、治療上、商業上または実験的価値を持つRNAまたはタンパク質をコードする遺伝子の特異的かつ高水準の発現を引き出す能力に依存している。かかる遺伝子発現はタンパク質−DNA間の相互作用に依存性である。
DNA結合性タンパク質の特異性を変化させる試みが幾つかなされてきた。それらの試みは主に、この種のタンパク質のDNA認識に重要な部位での突然変異誘発を含む手法に頼るものである［Rebar and Pabo, Science 263:671-673 (1994), Jamieson et al, Biochemistry 33:5689-5695 (1994), Suckow et al., Nucleic Acids Research 22(12):2198-2208 (1994)］。この手法は、ある種のDNA結合性ドメインでは、その三次元構造およびDNAへのドッキング様式により加わる制限のために効率的または可能でないことがある。この手法はまた、後述する重要な目的を達成するのに十分ではないこともある。従って、多くの異なるDNA結合性ドメインを利用することができ、これらをDNA認識および遺伝子調節に必要なように結合させることができる手法を持つことが望ましい。
発明の要約
本発明は、少なくとも１つの複合(composite)DNA結合性領域(region)を含み、新規な核酸結合特異性を有するキメラタンパク質に関する。このキメラタンパク質は少なくとも10塩基にわたるヌクレオチド配列（DNAまたはRNA）を認識し、かかる配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに高い親和性を持って結合する。（記載の簡略化のために、本発明のタンパク質を一般にDNA結合性と称しているが、このキメラタンパク質により認識されるヌクレオチド配列はRNAとDNAのいずれでもよく、必ずしも言及していなくてもRNAもまた認識可能であることは理解されよう。）
「キメラ」タンパク質および「複合」ドメインなる用語は、自然界では同じ配置で一緒に存在することがないという意味で互いに異質である少なくとも２つの構成部分を含むタンパク質またはドメインを意味するものとして使用している。より具体的には、これらの構成部分は、自然界では同じ連続ポリペプチド配列または分子で、少なくともそのキメラタンパク質または複合ドメインに存在するのと同じ順序もしくは向きまたは同じ間隔では見出されない。
後で詳述するように、この技術分野で既知の多様なDNA結合性ポリペプチド成分が本発明の実施に採用するのに適している。本発明のキメラタンパク質は、これを構成する２またはそれ以上の成分DNA結合性ドメインが、直接または１個のアミノ酸もしくは短いポリペプチド（２以上のアミノ酸）を介して結合することにより連続ポリペプチドを形成してなる複合領域を含んでいる。このキメラタンパク質は、望ましい特性を持つ追加のドメインも任意に含むことができる。例えば、本発明のキメラタンパク質は、Oct-1ホメオドメインのような少なくとも１つのホメオドメイン(homeodomain)を、自然界ではそのホメオドメインに同じに結合しては存在しない第二のポリペプチドドメインと一緒に有している複合DNA結合性領域を含みうる。或いは、この複合DNA結合性ドメインは、Zif268の亜鉛フィンガー１および／またはフィンガー２のような１または２以上の亜鉛フィンガードメインを、自然界ではその亜鉛フィンガードメインに結合しては存在しない第二のポリペプチドドメインと一緒に含むことができる。
以下により詳しく検討する多くの具体例には、１つのホメオドメインと１または２以上の亜鉛フィンガードメインとを含んだ複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質がある。１態様において、キメラタンパク質は、少なくとも１つのホメオドメイン、１つのポリペプチドリンカー(linker)および少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインを含むDNA結合性タンパク質である。かかるキメラタンパク質の例は、Zif268の亜鉛フィンガー１または亜鉛フィンガー２と、１個のアミノ酸または短い（アミノ酸残基２〜５個の）ポリペプチドと、Oct-1ホメオドメインとを含む複合DNA結合性領域である。別の例は、Zif268の亜鉛フィンガー１および２と、グリシン−グリシン−アルギニン−アルギニンポリペプチドのような短いリンカーと、Oct-1ホメオドメインとを含んだ複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質である。ZFHD1と命名した後者のキメラタンパク質については後で詳しく説明する。別の複合DNA結合性領域の例としては、Oct1 POU特異的ドメイン(aa 268-343)およびそれ自身の可変性(flexible)リンカー(aa 344-366)がZFHD1のアミノ末端に融合したもの、およびZFHD1がそのカルボキシ末端でZif268フィンガー１および２(aa 333-390)にOctl可変性リンカーを介して融合したものを含むものが挙げられる。
別の態様において、キメラタンパク質は、キメラ亜鉛フィンガー−基本ヘリックス−ループヘリックス・タンパク質を含有する複合DNA結合性領域を含んでいる。かかるキメラタンパク質の１例は、Zif268のフィンガー１および２とMyoD bHLH領域とを、フィンガー２のカルボキシル末端領域とbHLHドメインの基本領域のアミノ末端領域との間の約9.5Åにまたがるポリペプチドリンカーにより結合したものを含んでいる。
別の態様において、キメラタンパク質は亜鉛フィンガー−ステロイド受容体融合を含有する複合DNA結合性領域を含んでいる。かかるキメラタンパク質の１例は、Zif268のフィンガー１および２とグルココルチコイド受容体のDNA結合性ドメインとを、フィンガー２のカルボキシル末端領域およびグルココルチコイド受容体のDNA結合性ドメインのアミノ末端領域で、約7.4Åにわたるポリペプチドリンカーにより結合したものを含んでいる。
後からわかるように、本発明のキメラタンパク質の認識したDNA配列に対する結合の選択性を実験的に検証することができる。この特異性の１つの特徴は、キメラタンパク質が、その認識したヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の個々の構成部分に対する結合または別の異なるヌクレオチド配列に対する結合より優先的に結合することができるということである。その意味で、本発明のキメラタンパク質は、それを構成する成分DNA結合性ドメインのそれぞれ単独とははっきり異なるDNA結合特異性を示す。即ち、このキメラタンパク質は、認識したヌクレオチド配列全体への結合性が、この配列の一部のみを含むDNA配列への結合より優先する。この特異性および選択性は、専門家が、既知のヌクレオチド結合特異性を有するDNA結合性ドメインをとり込んだ複合DNA結合性領域を、その複合タンパク質が対応する複合ヌクレオチド配列に選択的に結合し、この選択的結合が該配列を構成する成分ヌクレオチド配列に優先するという知識を持って設計することができるということを意味する。
これらのキメラタンパク質は少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも11塩基、より好ましくは12塩基以上、にわたるヌクレオチド配列（DNAとRNAのいずれでもよい）を選択的に結合する。１例として、代表的なZFHD1複合DNA結合性ドメインを用いて12塩基対ヌクレオチド配列に対する選択的結合を実験的に検証することができる。典型的には、選択されたDNA配列への結合を、約10^-8より良好、好ましくは約10^-0より良好、さらに一層好ましくは10^-10より良好なＫｄ値で得ることができよう。Ｋｄ値は任意の好都合な方法で測定できる。かかる方法の１例は、DNA濃度を変化させて半最大(half-maximal)タンパク質結合に相関するDNA濃度を決定する一連の慣用のDNA結合分析（例、ゲルシフト分析）を行う方法である。
ZFHD1のペプチド配列を含むタンパク質により示される本発明のキメラタンパク質による結合のヌクレオチド配列特異性は、そのDNA結合性が既知のタンパク質のDNA結合性とは明らかに異なるため、多くの重要な場面において有用性がある。かかる用途としては、標的ヌクレオチド配列の選択的転写、転写の抑制もしくは阻害、マーク(marking)、および切断（開裂）が挙げられる。本発明のキメラタンパク質は特定の核酸配列への結合を優先するので、認識した核酸配列を含むヌクレオチド配列に連結した遺伝子またはこの配列により制御される遺伝子の発現をマーク、切断または改変する。好ましくは、このキメラタンパク質は、その複合DNA結合性領域を構成する成分ドメインにより結合されるDNAには著しい程度には結合せず、従って設計（意図）した以外の正常な細胞遺伝子発現についてはマーク、切断または改変しない。
１つの応用において、キメラタンパク質はDNAまたはRNA内のある特定の核酸配列に結合し、その結果、その特定のDNAまたはRNA配列をマークまたはフラッグし、この配列を既知の方法を用いて同定および／またはDNAから単離することができる。これに関して、キメラタンパク質は、キメラタンパク質が接触したDNAまたはRNA内に存在する場合には、ある特定の核酸配列においてDNAまたはRNAを認識し、その配列をマークする点で、制限酵素に類似した作用を示す。制限酵素とは異なり、キメラDNA結合性またはRNA結合性タンパク質は、これが認識した核酸位置でそのDNAまたはRNAを切断または断片化しない。この目的に使用するキメラタンパク質は、例えば放射性により又はアフィニティーリガンドもしくはエピトープ・タグ（例、GST）により標識することができ、従ってキメラタンパク質が結合するDNAまたはRNAの位置は容易に確認することができる。キメラタンパク質の結合特異性のため、その結合が起こるDNAまたはRNAは、キメラタンパク質が認識するように設計されたヌクレオチド配列またはその成分DNA結合性ドメインにより認識されるヌクレオチド配列のいずれかを含んでいるはずである。最適には、キメラタンパク質は成分DNA結合性ドメインにより認識される核酸配列を効率的には認識しない。DNAクローニングおよび配列決定のような標準的な方法を使用して、キメラタンパク質が結合するヌクレオチド配列を決定することができる。
複合DNA結合性領域が自律的に折り畳まれて機能しうるため、本発明の各種態様のキメラタンパク質は、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、DNA切断ドメイン、リガンド結合性ドメイン、またはタンパク質結合性ドメインを包含する１または２以上の追加のドメインをさらに含んでいてもよい。
転写活性化ドメインを含むかかるキメラタンパク質は、そのキメラタンパク質により認識された（即ち、選択的に結合された）DNA配列に連結した遺伝子の転写を活性化することができるキメラ転写因子を構成する。天然の転写因子から得られた、単純ヘルペス（単純性疱疹）ウイルスVP16活性化ドメインおよびNF-κＢ p65活性化ドメインをはじめとする各種の転写活性化ドメインが従来より公知であり、本発明のキメラタンパク質に使用することができる。かかる転写因子の１種は、少なくとも１つの複合DNA結合性領域（例えば、ZFHD1のペプチド配列のように、少なくとも１つのホメオドメインを少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインとを含むもの）と、その転写因子が結合することができるDNA配列に連結した遺伝子の転写を活性化することができる少なくとも１つの追加のドメインとを含んでいる。これらは、後述するZFHD1-VP16およびZFHD1-p65キメラにより例示される。
本発明のキメラタンパク質にはまた、このキメラタンパク質が結合するヌクレオチド配列に連結した標的遺伝子の転写を抑制することができるものも含まれる。かかるキメラタンパク質は、ヌクレオチド配列に結合し、そのヌクレオチド配列のその他の点では正常な機能を遺伝子発現において全面的または部分的に阻止する（例、内生転写因子への結合）ことにより、やや古典的なリプレッサーとして機能する。キメラタンパク質が結合するヌクレオチド配列に連結した標的遺伝子の転写を抑制または阻害することができる、本発明の他のキメラタンパク質としては、本発明の全てのキメラタンパク質に特有の複合DNA結合性領域と、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害または抑制することができる。KRABドメインまたはssn-6/TUP-1もしくはクリュッペル群(Kruppel family)サプレッサードメインのような追加のドメインとを含むキメラタンパク質が挙げられる。いずれの場合も、標的遺伝子に連結したヌクレオチド配列へのキメラタンパク質の結合は、標的遺伝子の転写の減少と関連する。
本発明のキメラタンパク質にはまた、キメラタンパク質が結合するヌクレオチド配列に連結した標的DNAまたはRNAを切断することができるものも含まれる。かかるキメラタンパク質は、本発明の全てのキメラタンパク質に特有の複合DNA結合性領域と、核酸分子を切断することができる、FokIドメインのような追加のドメインとを含む。標的DNAまたはRNAに連結した認識配列へのキメラタンパク質の結合は、標的DNAまたはRNAの切断と関連する。
本発明のキメラタンパク質にはさらに、例えば、その他の点では従来公知の２ハイブリッド(two hybrid)実験に用いるための、別のタンパク質分子に結合することができるものも含まれる。例えば、Fields及びSong，米国特許第5,283,173号（1994年２月１日）を参照。本発明の特徴的な複合DNA結合性領域に加えて、この態様のタンパク質は、既知または未知の別のタンパク質に結合することができるか、またはその可能性がある追加のドメインを含んでいる。かかる実験では、複合DNA結合性領域を含有するキメラタンパク質が、２ハイブリッド系におけるGAL4含有融合タンパク質に代わり、本発明のキメラタンパク質により認識されたヌクレオチド配列が、リポーター遺伝子に連結したGAL4結合性部位に代わる。
本発明のキメラタンパク質にはさらに、生物学的活性のリガンド調節発現が可能なリガンド結合性ドメインをさらに含むものが包含される。本発明のこの態様のキメラDNA結合性タンパク質は、適当な二量体化リガンドの存在により他のリガンド結合性融合タンパク質と複合化または「二量体化」することができる。かかるキメラタンパク質の例としては、特徴的な複合DNA結合性領域とFKBP12などのイムノフィリン(immunophilin)のようなリガンド結合性ドメインとを含むタンパク質が挙げられる。例えば２価リガンドFK1012は、１または２以上のFKBPドメインも含んでいる本発明のキメラタンパク質と、転写活性化ドメインに連結した１または２以上のコピー数のFKBPを含有する融合タンパク質をはじめとする、別のFKBP含有タンパク質とに結合することができる。Spencer,D.M. et al. 1993, Science 162:1019-1024およびPCT/US94/01617を参照。かかる融合タンパク質を発現する細胞は、本発明のDNA結合性キメラが結合することができるヌクレオチド配列に連結した標的遺伝子の二量体依存性転写が可能である。
本発明はさらに複合DNA結合性領域を含む本発明のキメラタンパク質をコードするDNA配列も包含する。かかるDNA配列としては、とりわけ、ZFHD1のペプチド配列を含有するキメラタンパク質で代表されるような、複合DNA結合性領域が少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインに共有結合したホメオドメインを含有するキメラタンパク質をコードするものが挙げられる。上の説明から明らかなように、このDNA配列は、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを切断することができるドメイン、別のタンパク質に結合することができるドメイン、リガンド結合性ドメイン、または検出可能な標識として有用なドメインを含む１または２以上の追加のドメインをさらに含有するキメラタンパク質をコードすることもできる。
本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質をコードするDNA配列を含有する真核性発現作成物(eukaryotic expression construct)であって、このDNA配列がDNA配列の発現および真核細胞内での該キメラタンパク質の産生を可能にするプロモーターおよびエンハンサー要素のような発現制御要素に操縦可能に連結しているものも包含する。１または２以上のこのような発現制御要素が誘導性であってもよく、キメラタンパク質をコードするDNAの調節された発現を可能にする。この発現制御要素は、特に対象となるセルタイプ（細胞型）または組織におけるキメラタンパク質の優先的または選択的発現を可能にする組織特異性または細胞型特異性のものでよい。本発明の真核性発現ベクターの１例は、後で詳述するように、３個のFKBP12ドメインに連結したZFHD1複合DNA結合性領域を含む融合タンパク質の哺乳動物細胞における発現を指令することができるプラスミドpCGNN ZFHD1-FKBPX3 (ATCC No.97399)である。
本発明のキメラタンパク質をコードするDNA配列と、その真核細胞内での発現を指令することができるベクターとを使用して、多くの重要な用途に対する細胞を遺伝子工学処理してもよい。それには、まず所望のキメラタンパク質の真核細胞内での発現を指令するための発現ベクターを用意するか、作成し、次いでこのベクターDNAを、細胞の少なくとも一部において導入されたDNAの発現を可能にするように真核細胞に導入する。異種の遺伝子の発現のためにDNAを細胞に導入する各種の方法および材料のいずれも使用することができ、それらは多くのものが知られている。多様なかかる材料が市販されている。
場合によっては、標的遺伝子およびその連結ヌクレオチド配列（キメラタンパク質により特異的に認識される）は、遺伝子工学処理した細胞にとって内在性であるか、或いはこの細胞に既に存在していたものである。別の場合には、標的遺伝子および／または認識されるDNA配列を含むDNAは、遺伝子工学処理した細胞にとって内在性ではなく、これもその細胞に導入される。
各種のDNA作成物を、培養状態に維持された細胞内に導入するか、あるいはin vivoで細胞内に導入するためにヒトおよび他の動物を含む生体全体に投与しうる。細胞内への導入のために動物へのDNAの供給を行う多様な方法および材料が当技術分野で知られている。
これらの方法により、細胞内の標的遺伝子に結合したDNA配列に結合することができ、DNA配列のマーク、標的遺伝子の転写の活性化、標的遺伝子の転写の抑制、標的遺伝子の切断等を行うことができるキメラタンパク質を発現するように、培養物またはin vivoのいずれであっても、細胞を遺伝子工学処理することができる。キメラタンパク質の発現は、誘導性、細胞型特異性等であってもよく、キメラタンパク質の生物学的効果はリガンド依存性にすることもできる。これらは全て既に説明した。
本発明はさらに、本明細書に説明した任意の作成物を含有および／または発現する遺伝子工学処理された細胞も包含する。この作成物は特に、原核および真核細胞、とりわけ各種の種類および系統の酵母、蠕虫、昆虫、マウスその他の齧歯動物、ならびにヒトの細胞を含む他の哺乳動物の細胞（凍結したものでも生きた成長中のいずれでも、また培養物でもそれを含む生体全体のいずれでも）を含む、複合DNA結合性領域を含んでいるタンパク質をコードするものである。かかる遺伝子工学処理された細胞の数例を後述する実施例に示してある。これらの細胞はさらに、コードされたキメラタンパク質が結合することができるDNA配列を含有していてもよい。同様に、本発明はかかる遺伝子工学処理された細胞を含んでいるヒト以外の任意の生物を包含する。本発明のこの態様を例示するために、複合DNA結合性領域を含有するキメラタンパク質により認識されるヌクレオチド配列に連結した導入標的遺伝子を、リガンド依存性を示すように発現する遺伝子工学処理された細胞を含んでいるマウスの例が示される。
前述した材料および方法により、キメラタンパク質により認識されるDNA配列のマーク、ならびに標的遺伝子の発現の始動（活性化）もしくは阻害または標的遺伝子の切断が可能となる。それには、まずキメラタンパク質をコードする第１のDNA配列を含み、これを発現することができる細胞を用意する。このキメラタンパク質はやはりその細胞内に存在する対象となる標的遺伝子に連結した第２のDNA配列に結合することができるものである。キメラタンパク質はその標的遺伝子への結合能力と標的遺伝子のマーク、切断、転写の始動もしくは阻害等の能力とを考慮して選択する。この細胞を次いで、遺伝子発現およびタンパク質産生が可能な条件下に維持する。この場合も、遺伝子発現は誘導性または細胞型特異性であってもよく、細胞は培養物として又は宿主の生体内に維持しうる。
本発明は、特異的核酸配列の認識が非常に重要な実質的にあらゆる用途に適用しうる。例えば、本発明は遺伝子調節に有用である。即ち、本発明の新規なDNA結合性キメラタンパク質は、細胞培養物中または生体全体内のいずれであろうと、導入された又は内在の遺伝子の転写を特異的に活性化または抑制して、その遺伝子産物の産生を制御するのに使用することができる。遺伝子治療の用途では、異常な遺伝子発現の補正もしくは補償、病気を引き起こす遺伝子産物の発現の制御、治療的もしくは予防的価値がある天然もしくは遺伝子工学処理したタンパク質もしくはRNAの産物の発現の指令、または哺乳動物、特にヒトの患者を含む生体内に導入された、もしくは生体内に存在している細胞の表現型のその他の修飾のために本発明を利用しうる。例えば、本発明は、不足している遺伝子産物の発現を増大させるため、或いは過剰産生もしくは過剰活性な産物の発現を減少させるために遺伝子治療に使用しうる。本発明はまたタンパク質産生のために形質転換した生体における遺伝子発現の制御にも使用できる。
本発明のキメラタンパク質はまた、例えば遺伝子マッピングにおけるマーカーとして使用するなどの、特定の希有な(rare)DNA配列を同定するのにも使用できる。混合物中の或るDNA配列を同定するには、１または２以上のDNA配列を含む混合物を用意し、この混合物に本発明のキメラタンパク質を、DNA結合性タンパク質の認識したDNA配列への特異的結合を可能にする条件下で接触させ、そしてキメラタンパク質による任意のDNA結合の発生、量および／または位置を決定する。例えば、キメラタンパク質は検出可能なラベルで、またはキメラタンパク質と任意の結合DNAとの混合物からの回収が可能な部分で標識してもよい。かかる材料を使用して、所望により、この混合物からキメラタンパク質と結合DNAとを別々に回収し、キメラタンパク質から結合DNAを単離することも可能である。
また、DNAを切断することができるドメインを含むキメラタンパク質に関連する態様は、新系統の配列特異的エンドヌクレアーゼタンパク質を提供する。本発明のキメラDNA結合性タンパク質は、DNAのループ形成を誘発もしくは安定化するため、または２もしくはそれ以上の異なる分子上のDNA部位をまとめるか、もしくは一体にするのにも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｃは、ランダムオリゴヌクレオチドのプールから或るハイブリッド結合性部位のZFHD1による選択を示す。図１Ａは、結合性部位を選択するのに用いたZFHD1キメラタンパク質の構造のグラフ表示である。下線を引いた残基はZif268-DNAおよびOct-1-DNA結晶構造に由来し、コンピュータモデル化研究に用いた末端に対応する。リンカーは２個のグリシンを含み、これは可変性のため及び該ドメインの末端間に必要な距離を広げるのを助けるために導入されたものである。リンカーの残りの２個のアルギニンは、Oct-1ホメオドメインの−１位および１位に存在する。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・ドメイン(GST)は亜鉛フィンガー１のアミノ末端に結合している。図１Ｂは、４ラウンドの結合性部位選択の後に単離された16部位の核酸配列（配列番号１〜16）を示す。これらの配列を用いてZFHD1の共通結合性配列（5'-TAATTANGGGNG-3'、配列番号17）を決定した。図１Ｃは、この共通配列により示唆されるホメオドメイン結合性配置の別の可能性を示す。様式１がZFHD1の正しい最適配置であることが決定された。「Ｎ」と表示した位置は、任意のヌクレオチドがその位置を占めることができることを意味している。
図２Ａ〜Ｃは、ZFHD1、Oct-1 POUドメイン、およびZif268からの３個の亜鉛フィンガーのDNA結合特異性を示すオートラジオグラフである。使用したプローブは各組の列の最上部に列挙し、タンパク質−DNA複合体(complex)の位置は矢印で示してある。
図３はZFHD1によるin vivoプロモーター活性の調節のグラフ表示である。発現ベクターはVP16のカルボキシル末端81アミノ酸に融合したZFHD1タンパク質をコードし（＋の棒）、空の表面ベクターRc/CMVを対照（−の棒）として使用した。棒グラフは３回の独立した試験の平均値を示す。実際の値と標準偏差は、左から右に読んで、1.00±0.05、3.30±0.63、0.96±0.08、42.2±5.1、0.76±0.07、2.36±0.34、1.22±0.10、4.22±1.41である。比誘導(fold induction)とは、ZFHD1-VP16発現作成物で得られた標準化された活性レベルを、対照のRc/CMVで得られた活性レベルで割った値を意味する。
図４のパネルＡは、VP16またはp65のいずれかの転写活性化ドメインに結合したZFHD1を含む融合タンパク質が、HT1080細胞内のZFHD1結合性部位に結合した分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードする遺伝子の転写を活性化することを実証するデータを示す。パネルＢは、VP16またはp65活性化ドメインに結合した３コピーのFKBPドメインを含む融合タンパク質が、ZFHD1-FKBP(x3)融合タンパク質中に存在するZFHD1複合DNA結合性ドメインに対する結合性部位に結合したリポーター遺伝子（分泌アルカリホスファターゼ）のFK1012依存性転写を支持することを実証するデータを示す。パネルＣは、FK1012の代わりに完全に合成の二量体を使用した類似の実験から得られたデータを示す。
図５は、複合DNA結合性ドメインと、その認識されたDNA配列に結合した転写活性化ドメインとを含む本発明のキメラ転写因子を図式的に示す。この図には、１または２以上のFKBPドメインを含む本発明のキメラタンパク質、転写活性化ドメインに結合したFRAP FRBドメインを含む同族(cognate)キメラタンパク質、ならびに二量体化剤のラパマイシン(rapamycin)の存在下で形成されたこれら２つのキメラの複合体（認識されたDNA配列上でこの転写複合体のクラスター化を生ずる）も示されている。
図６は、ZFHD1-FKBP(x3)融合タンパク質のFRAP FRB-p65融合タンパク質への複合体化とこの複合体の動物の全生体内の遺伝子工学処理された細胞のZFHD1結合性部位への結合により生じた、hGH標的遺伝子の官能性二量体化剤依存性発現を実証するデータを示す。これらのデータは、二量体化剤のin vivo投与が、上記の融合タンパク質および応答性標的遺伝子カセットを含む細胞からの分泌遺伝子産物の動物全生体内における遺伝子発現を制御しうることを実証している。転写因子ZFHD1-FKBPx3およびFRB-p65をコードするプラスミドと、ヒト成長ホルモン（hGH）の発現を指令する標的遺伝子とをトランスフェクション（移入）したヒト細胞(2×10⁶)を、nu／nmマウスの骨格筋に注射した。マウスを、指示された濃度のラパマイシンの尾静脈注射により処置した。17時間後、血清hGH濃度をELISAにより測定した。各プロット点はＸ±標準偏差（各点当たりｎ＝５以上）を示す。対照動物には、薬剤を省略して遺伝子工学処理細胞だけ、または遺伝子工学処理細胞を省略して薬剤(10³または10⁴μg/kg)だけを投与した。
発明の詳細な説明
本発明は、複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質を、例えば、そのキメラDNA結合性タンパク質により認識される（即ち、特異的に結合される）ヌクレオチド配列に連結した標的遺伝子の構成性もしくは調節的発現、抑制（リプレッション）、切断またはマークを得るように、設計、製造および使用することに関する。本発明の複合DNA結合性領域は、これを構成する成分DNA結合性ドメインを表す少なくとも２つの異種のポリペプチド部分にわたる１つの連続ポリペプチド鎖からなる。この２以上の成分ポリペプチドドメインは、少なくとも２種の異なるタンパク質に由来する２以上のポリペプチド配列、同じタンパク質の少なくとも２カ所の非隣接部分に由来する２以上のポリペプチド配列、または自然界ではそのように結合することが見られない２以上のポリペプチド配列を含む。
成分ポリペプチドドメインは、天然または非天然のペプチド配列からなるものでよい。キメラタンパク質は２より多いDNA結合性ドメインを含んでいてもよい。これはまた、選択されたドメインを結合するように、適当に１または２以上のアミノ酸残基からなる１または２以上のリンカー領域を含んでいてもよく、或いはリンカーを含んでいなくてもよい。キメラDNA結合性タンパク質により認識される核酸配列は、成分ポリペプチドドメインにより結合される配列の全部または一部を含んでいてもよい。ただし、キメラタンパク質は、その個々のポリペプチド成分の結合特異性とは明らかに異なる結合特異性を示す。
本発明はさらに、かかるキメラタンパク質をコードするDNA配列、このキメラタンパク質が結合する（即ち、複合DNA結合性領域により認識される）組換えDNA配列、標的遺伝子およびキメラDNA結合性タンパク質により認識されるDNA配列を含む作成物、およびヌクレオチド配列の特異的認識に依存する用途におけるこれら材料の使用も包含する。かかる複合タンパク質およびそれらをコードするDNA配列は、少なくともこの組換え体材料に存在する順序、向きまたは配置では、自然界ではこれ以外に直接結合（共有結合）した状態で見出されない少なくとも２つの成分部分を含むという意味で組換え体である。これらのタンパク質の望ましい性質としては、特異的ヌクレオチド配列に対する親和性が高いこと、複合ゲノム（哺乳動物のゲノムのような）中の他の大部分の配列に対する親和性が低いこと、特異的DNA部位からの解離速度が低いこと、および既知の天然のDNA結合性タンパク質とは明らかに異なる新規なDNA認識特異性を有することである。設計の基本原理は、複数のDNA結合性ドメインを、おそらくは個々のドメインの相互作用の結びつきによる高い親和性を持った、長く（少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも11以上の塩基にわたる）複合した１つのDNA配列を認識する単一のタンパク質分子に組み立てることである。この設計の別の利点は、複数の独立したタンパク質−DNA相互作用に由来する潜在的な結合活性(avidity)である。
本発明の実施は一般に、後述するように、複合DNA結合性領域ならびに１もしくは２以上の任意の追加ドメインを含有するキメラタンパクをコードし、かつ細胞内での発現を指令することができる、DNA作成物の発現を包含する。一部の態様はまた、標的遺伝子とキメラDNA結合性タンパク質が好ましくは高い親和性および／または特異性で結合することができるDNA配列の１または２以上のコピーとを含有するDNA作成物を使用する。ある種の態様はさらに、例えば、二量体化用リガンドの存在下に相互に複合化する複数のリガンド結合性ドメインを含むキメラの場合には、DNA結合性タンパク質の活性を調節することができる追加のタンパク質をコードし、かつ発現指令する１または２以上のDNA作成物も包含する。
本発明の１側面において、キメラタンパク質は、複合DNA結合性領域に加えて、１または２以上の調節性ドメインを含んでいてもよい転写因子である。「転写因子」という用語は、遺伝子転写を調節するすべてのタンパク質を包含する意味であり、転写の開始または進行に正または負の影響を及ぼす調節体（レギュレータ）を含む。転写因子は１または２以上の調節ドメインを任意に含有しうる。「調節ドメイン」とは、転写を調節するあらゆるドメインであると定義され、活性化ドメインと抑制ドメインの両者を含む。「活性化ドメイン」とは、遺伝子転写の速度を正方向に調節する（開始または増大させる）転写因子内のドメインを意味する。「抑制ドメイン」とは、遺伝子転写の速度を負方向に調節する（停止、阻害または減少させる）転写因子内のドメインを意味する。転写因子に結合される核酸配列は、典型的には、プロモーターまたは調節要素領域内のように、コード領域の外側のDNAである。しかし、他の位置の例えばコード領域内の、ヌクレオチドに十分に強い結合を使用して遺伝子発現を調節することもできる。
好ましくは、キメラDNA結合性タンパク質は、対応するDNA配列に選択的に結合する、即ち、別のDNA配列の候補が非常に多く存在するにもかかわらず、そのDNA配列に目立って結合する。好ましくは、その特定のDNA配列へのキメラDNA結合性タンパク質の結合の大きさは、他のいずれのDNA配列への結合より、少なくとも２桁、より好ましくは少なくとも３桁、さらに一層好ましくは４桁以上も大きい。この結合の大きさは、選択された特定のDNA配列と任意の他のDNA配列とに関連する遺伝子の転写の相対的Ｋd値または相対的な転写速度もしくはレベルにより測定できる。また、その特定のDNA配列の認識の程度は、複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質による認識の方が、その個々のポリペプチド成分の一部のみを含むタンパク質による認識に比べて実質的に大きいことが好ましい。例えば、複合DNA結合性領域を含むキメラ転写因子の存在下では、その複合DNA結合性領域の成分の一部のみを含むタンパク質の存在下に比べて、標的遺伝子の発現の大きさが、好ましくは少なくとも２桁、より好ましくは少なくとも３桁、さらに一層好ましくは４桁以上も大きい。
本発明の各種側面を実施するための上記以外の指針は、追加の例示と共に以下に説明する。
１．複合DNA結合性領域の設計
各複合DNA結合性領域は、個々に特定のヌクレオチド配列を認識（即ち、これに結合）できる２以上の異種の成分ポリペプチド部分を含む１つの連続したポリペプチド領域からなる。この個々の成分部分は、各成分ポリペプチド部分がDNA標的と同時接触することができるようにするために、１または２以上のアミノ酸残基を含むリンカーにより離間させておいてもよい。２以上の成分DNA結合性モジュールにより形成された複合DNA結合性領域の組合わされた作用は、各セットの相互作用の自由エネルギーの減少をさらに増強するものと考えられる。この効果は、解離定数が10^-9M以下、より好ましくは10^-10M以下、さらに一層好ましくは10^-11M以下の非常に高い親和性のDNA−タンパク質相互作用を達成するためである。この目標は、それ単独では、哺乳動物の細胞内の典型的な条件下でのDNAの機能的認識には不十分な、弱い、即ち、低い親和性でDNAを結合する成分ポリペプチド領域を組合わせることにより達成するのが最良であることが多い。このハイブリッドタンパク質が示す複合部位に対する親和性は、個々のサブドメインが示すそのサブ部位に対する親和性より数桁も大きいので、このタンパク質は、典型的には複合DNA結合性領域の個々の成分ポリペプチド部分により認識される個々のDNA配列にまたがるヌクレオチド配列を含んでいる「複合」部位を優先的に（好ましくは独占的に）占める。
１つの複合領域に取り込むのに適した複数の成分DNA結合性ポリペプチドは、下記特性の１または２以上、好ましくは２以上を有する。これは、単量体としてDNAを結合するが、二量体も適応させることができる。これは、解離定数が好ましくは10^-6〜10^-9Mの範囲内の比較的小さなDNAに対する親和性を有しているべきである。これは、構造およびDNAとの相互作用がよくわかっており、従って操縦し易い種類のDNA結合性ドメインに属していることが最適である。遺伝子治療用途に対しては、これは好ましくはヒトタンパク質に由来するものである。
既知のDNA結合性モジュールの融合に対する構造に基づく戦略を用いて、新規なDNA結合特異性を持つ転写因子を設計した。あるDNA結合性ドメインが他のDNA結合性ドメインにいかに融合しうるかを視覚化するため、コンピュータモデル化の研究手法を用いて各種のタンパク質−DNA複合体を重ね合わせ及び整列させた。
次の２つの基準が、２以上のDNA結合性ドメインのどの整列が１つの複合DNA結合性領域への組合わせへの可能性を持つかを示唆する。即ち、(1)ドメイン間の衝突がないことと、(2)ドメインのカルボキシルおよびアミノ末端領域の一定した配置（向き）である。つまり、ドメインは１つのポリペプチドのカルボキシル末端領域が次のポリペプチドのアミノ末端領域に、直接的またはリンカーにより（間接的に）結合できるように向いていなければならない。２つのアミノ末端領域だけが互いに隣接するか、または２つのカルボキシル末端領域だけが互いに隣接するように位置するドメインは、本発明のキメラタンパク質に取り込むのに適していない。タンパク質−DNA複合体に関する詳しい構造上の情報が利用できない場合には、各種の終点での実験が必要になることがあり、キメラタンパク質のDNA結合性を決定するのにより多くの生化学的作業が必要となるかも知れない。この最適化は公知の方法を用いて実施できる。上記の基準を満たす実質的に全てのドメインが本発明のキメラタンパク質に取り込むための候補である。また、コンピュータによらないモデル化を使用してもよい。
２．適当な成分DNA結合性ドメインの例
適当なDNA結合特性を持ったDNA結合性ドメインを、いくつかの異なる種類の天然のDNA結合性タンパク質から選択しうる。一つの種類は、補助DNA結合性タンパク質と一緒でのみ（通常は協力して）DNAに正常に結合するタンパク質を含み、ここでは両方のタンパク質がDNAと接触し、各タンパク質は互いに接触する。この種の例としてはホメオドメインが挙げられ、その多くはDNAの結合に対して低い親和性と乏しい特異性を持つが、パートナーのDNA結合性タンパク質との相互作用のためin vivoでは高度の特異性を持って作用する。よく特性が判明しているこの種の１例は、酵母α２タンパク質であり、これは別の酵母タンパク質であるMcm1と協力してしかDNAに結合しない。別の例はヒト・ホメオドメインタンパク質であるPhox1であり、これはヒト転写因子である血清応答因子(SRF)と協力して相互作用する。
ホメオドメインは数百もの転写因子中に見出された高度に維持されたDNA結合性ドメインである[Scott et al., Biochem. Biophys. Acta 989:25-48 (1989)およびRosenfeld, Genes Dev. 5:897-907 (1991)]。ホメオドメインタンパク質の調節機能はそのDNAとの、ならびに恐らくはRNAポリメラーゼもしくは副転写因子のような基本的転写機構の成分との相互作用の特異性に由来する[Laughon, Biochemistry 30(48):11357 (1991)]。典型的なホメオドメインは、DNAに結合する３個のαラセンに折り畳まれた約61アミノ酸残基のポリペプチド鎖を含む。
第２の種類は、DNA結合性ドメインがDNAの高親和性結合を達成するように協力する複数の反復単位からなるタンパク質を含む。１例はC2H2クラスの亜鉛フィンガータンパク質であり、これは典型的には２〜３個から12個の亜鉛フィンガーモジュールのタンデム列（縦列）を含む。各単位はDNAの３塩基対のストレッチ(stretch)と接触することができるαラセンを含む。典型的には、少なくとも３個の亜鉛フィンガーが高親和性DNA結合に必要である。従って、１または２個の亜鉛フィンガーは、本発明で１成分として使用するのに適した特性を持つ低親和性DNA結合性ドメインとなる。C2H2クラスのタンパク質の例としては、TFIIIＡ、Zif268、Gli、およびSRE-ZBPが挙げられる。（ここに言及した上記およびその他のタンパク質およびDNAは当該技術分野では周知である。その供給原および配列も知られている。）
転写因子IIIＡ内に最初に発見された種類の亜鉛フィンガー単位（モチーフ）[Miller et al.,EMBO J. 4:1609 (1985)]は、新規なDNA結合特異性を持つ転写因子の研究に対する魅力的な枠組みを与える。亜鉛フィンガーは最も普通の真核DNA結合性モチーフの１つであり[Jacobs, EMBO J. 11:4507 (1992)]、この群のタンパク質は多様な組のDNA配列を認識することができる[Pavletich and Pabo, Science 261:1701 (1993)]。Zif268−DNA複合体のおよび他の亜鉛フィンガー−DNA複合体の結晶学的研究は、各フィンガー内の４つの位置の残基が大部分の塩基接触をなすことを示し、亜鉛フィンガー−DNA認識を説明しうる法則についてもいくらか検討されてきた[Desjarlais and Berg, PNAS 89:7345 (1992)およびKlevit, Science 253:1367 (1991)]。しかし、研究は亜鉛フィンガーが多様な方法でDNAに対してドッキングすることができることも示している[Pavletich and Pabo (1993)およびFairall et al., Nature 366:483 (1993)]。
第３の一般的な種類は、それ自体が複数の独立したDNA結合性ドメインを含むタンパク質を含んでいる。これらのドメインのいずれか１つでは高親和性DNA認識を媒介するには不十分であり、共有結合した相手のドメインとの協力が必要になることが多い。実例としては、ホメオドメインとPOU特異的ドメインの両者を含む、Oct-1、Oct-2およびPit-1のようなPOUクラスのもの；POUタンパク質に類似の構造を持つHNF1；ホメオドメインと対をなすボックス／ドメインの両者を含むある種のPaxタンパク質（例、Pax-3，Pax-6）；およびホメオドメインと複数のC2H2クラスの亜鉛フィンガーとを含むXXXが挙げられる。
構造的視点からは、複合DNA結合性領域のポリペプチド成分として使用するのに適したドメインを含んでいるDNA結合性タンパク質は、MATα1, MATα2, MATa1, Antennapedia, Ultrabithorax, Engrailed, Paired, Fushi tarazu, HOX, Unc86ならびに前述したOct-1, Oct-2およびPitを含む（これらに制限されないが）らせん−ターン−らせん構造設計のDNA結合性タンパク質；Zif268, SW15, KruppelおよびHunchback等の亜鉛フィンガータンパク質；ステロイド受容体；Daughterless, Achaete-scute (T3), MyoD, E12およびE47等のらせん−ループ−らせん構造設計のDNA結合性タンパク質；ならびにGCN4, C/EBP, c-Fos/c-JunおよびJunBを含むロイシン−ジッパーに似た他のらせんモチーフに分類することができる。成分DNA結合性ドメインのアミノ酸配列は天然または非天然（もくは修飾）でよい。
成分DNA結合性ドメインの選択は、標的とする種、系統および細胞型（セルタイプ）；モデル化により示されることがあるように、キメラタンパク質への取り込みの可能性；ならにび所望の用途もしくは有用性を含む多くの観点により影響されうる。DNA結合性ドメインの選択は、そのドメインの独自のDNA配列特異性、ならにびそのドメインが他のタンパク質と相互作用する能力および特定の細胞調節経路により影響される能力によっても影響されうる。好ましくは、ドメイン末端間の距離は、可能な最短リンカーの使用またはリンカーの不使用を助長するように比較的短い。DNA結合性ドメインは天然のタンパク質から分離することができ、または全体もしくは一部が天然ドメインに基づいた合成分子であってもよい。
本発明に適した性質を持つ成分DNA結合性ドメインを得るための別の戦略は、実在するDNA結合性ドメインをそのDNAに対する親和性を適当な範囲内に減少させるように修飾することである。例えば、ヒト転写因子Phox1に由来するようなホメオドメインを、このホメオドメインの50位のグルタミン残基の置換により修飾してもよい。この位置での置換は、このタンパク質と、このタンパク質により認識される6-bp DNA配列の１または２個の塩基対との間の重要な接触点を除去するか、または変化させる。そのため、この置換は結合の自由エネルギーおよびこの配列との相互作用の親和性を低下させ、同時に他の配列に対する親和性を増大させることも、させないこともある。かかる親和性の低下は、哺乳動物細胞内に見られる典型的な濃度で産生された時にこのタンパク質による自然な標的部位の占有を効果的に排除するのに十分である。しかし、それでも、このドメインは別の結合したDNA結合性ドメインへの結合エネルギーに寄与し、従ってそれと協力することは可能であろう。この種の操縦がやり易い別のドメインとしては、対box、ステロイドホルモン受容体で代表される亜鉛フィンガー種、mybドメイン、およびetsドメインが挙げられる。
３．共有結合した複合DBDに対するリンカー配列の設計
複合DNA結合性ドメインの連続ポリペプチドのスパンは、末端同士が直接結合した、または介在するアミノ酸もしくはペプチドリンカーにより間接的に結合した複数の成分ポリペプチド単位を含有しうる。リンカー部分は、立体障害なしに各成分DNA結合性ドメインとDNAとの独立した相互作用が可能となるように設計または実験的に選択しうる。リンカーは、そのDNA結合性ドメインに特定の間隔および向きを付与するように選択または設計しうる。リンカーのアミノ酸は、成分ドメインの内在性フランキング(flanking)ペプチド配列に由来するものでも、或いは１または２以上の異種アミノ酸を含むものでもよい。リンカーはモデル化により設計しても、実験的な試行により決定してもよい。
リンカーは、各成分ドメインがそのそれぞれのヌクレオチド配列に結合する能力を保持するように成分ドメインの結合を生ずる任意のアミノ酸配列でよい。一部の態様では、比較的短い距離、好ましくは約10Å以下、にまたがるリンカーを必要とするドメインの配置を含む設計が好ましい。しかし、選択したDNA結合性ドメインおよび配置に応じて、態様によっては、リンカーは約５０Åまでの距離にまたがってもよい。例えば、ZFHD1タンパク質は、亜鉛フィンガー２のカルボキシル末端をOct-1ホメオドメインのアミノ末端領域に結合するグリシン−グリシン−アルギニン−アルギニンリンカーを含有する。
実験的に決定されるか、モデル化により明らかになるように、リンカー内で、アミノ酸配列はリンカーの好ましい特性に基づいて変更しうる。例えば、モデル化の研究は、所望の長さに加えて、ある種のヌクレオチドまたはアミノ酸の側鎖基が、そのタンパク質の結合を妨害するかも知れないことを示すことがある。主な基準は、各ドメインがそれぞれのDNA配列に結合する能力を保持するようにリンカーがDNA結合性をドメインを結合することであり、従って、この能力を妨害するリンカーは望ましくない。望ましいリンカーは、ある複合部位のみがキメラタンパク質で認識されるようにドメインの相対的三次元位置を拘束することもできるべきである。リンカーの選択における他の考慮点としては、リンカーの可変性、リンカーおよび選択した結合性ドメインの電荷、ならびに天然ドメインにおけるリンカーのある種のアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーはまた、リンカー内の残基がDNAと接触して、結合親和性または特異性に影響を及ぼすか、または他のタンパク質と相互作用するように、設計することもできる。例えば、リンカーは、キメラタンパク質の活性が切断により調節されうるようにプロテアーゼが認識することができるアミノ酸配列を含んでいてもよい。場合により、特に２つのDNA結合性ドメイン間により長い距離をおく必要がある場合またはドメインを特定の配置（形態）に保持しなければならない場合には、リンカーは任意に追加の折り畳まれたドメインを含んでいてもよい。
４．追加のドメイン
本発明の各種のキメラタンパク質には、例えば、Ａ核局在化配列、転写調節ドメイン、リガンド結合性ドメイン、タンパク質結合性ドメイン、核酸を切断することができるドメイン等といった追加のドメインを含有させることができる。
例えば、場合によっては、キメラタンパク質は、このタンパク質を核に転移させるようにする細胞標的性配列を含む。典型的には、核局在化配列は二分式塩基性反復(bipartite basic repeat)と呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有する[Garcia-Bustos et al., Biochimica et Biophysica Acta (1991) 1071, 83-101に解説]。この配列はＮまたはＣ末端の内部またはこれに近い分子の任意の部分に現れることができ、キメラタンパク質の核内局在化を生ずる。
キメラタンパク質はその精製を容易にするドメイン、例えば、「ヒスチジン標識」またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメイン、を含んでいてもよい。キメラタンパク質はまた、細胞内でのタンパク質の検出またはin vitroでの抗体によるタンパク質の捕捉のために既知のモノクローナル抗体により認識されるペプチドをコードする「エピトープ・タグ」を含んでいてもよい。
エンドヌクレアーゼ活性を持つドメイン（切断ドメイン）を含むキメラDNA結合性タンパク質も、キメラタンパク質により結合される認識配列に隣接するDNAを切断するための新規な配列特異的制限エンドヌクレアーゼとして使用することができる。例えば、かかるキメラタンパク質は複合DNA結合性領域および非特異的DNA切断活性を持つFok IエンドヌクレアーゼのＣ末端切断ドメインを含んでいてもよい[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279 (1992)]。
部位特異的制限酵素も、非常に厳密な配列要件を持つエンドヌクレアーゼを生成させるために他のDNA結合性ドメインに結合させうる。キメラDNA結合性タンパク質も、本発明の新規なタンパク質の安定性、会合および細胞下局在化を制御することができる他のドメインに融合させうる。
キメラタンパク質はまた、ウイルス性タンパク質VP16に由来する特性のよくわかったドメインまたは異なる設計の新規な活性化ドメインといった、１または２以上の転写活性化ドメインを含んでいてもよい。１例として、Oct-2の18アミノ酸（NFLQLPQQTQGALLTSQP）グルタミン・リッチ領域、p53のＮ末端72アミノ酸、ユーイング肉腫遺伝子のSYGQQS反復、またはRel Aタンパク質の11アミノ酸(535-545)酸性リッチ領域をはじめとする、ヒトタンパク質に由来する転写活性化単位の１つまたは複数のコピーを使用することができる。複合DNA結合性ドメインと転写活性化ドメインの両方を含むキメラタンパク質は、従って、そのキメラタンパク質により認識されたDNA配列に連結した標的遺伝子の転写を始動させることができる複合転写因子を含む。キメラタンパク質は、外部リガンドの制御下でDNA結合性ドメインの機能を持たせる調節ドメインを含んでいてもよい。１例はステロイド受容体のリガンド結合性ドメインであろう。
本発明の実施に有用な多量体化用リガンドは、多価、即ち、２またはそれ以上のキメラタンパク質分子に結合することができ、従って多量体化することができるものである。多量体化用リガンドは、このリガンドとの結合性ドメインを含んでいる２以上のキメラ分子に、順次または同時に、好ましくは約10^-6以下、より好ましくは約10^-7以下、さらに一層好ましくは約10^-8以下、態様によっては約10^-9M以下のＫd値で結合しうる。このリガンドは好ましくはタンパク質またはポリペプチドではなく、分子量は約５kDa、好ましくは２kDa以下である。こうして多量体化されたキメラタンパク質のリガンド結合性ドメインは、同一でも異なっていてもよい。リガンド結合性ドメインとしては、とりわけ、各種のイムノフィリンドメインが挙げられる。１例は、FK506部位または他のFKBP結合性部位を取り込んだ二量体化用リガンドに結合することができるFKBPドメインである。例えば、PCT/US93/01617（その内容をここに援用する）を参照されたい。
少なくとも１つのホメオドメインと少なくとも１つの亜鉛フィンガードメインとを含んでいる複合DNA結合性ドメインを含む種類の本発明のキメラタンパク質の例は、複合DNA結合性領域が、本書で"ZFHD1"と呼ばれるOct-1ホメオドメインとZif268の亜鉛フィンガー１および２とを含んでいる、一組のキメラタンパク質である。ZFHD1複合DNA結合性領域を含むタンパク質を製造したところ、これはその２つの成分DNA結合性タンパク質の関連部分により結合される核酸配列を含む複合DNA配列（配列番号17）に結合することが示された。
少なくとも１つの転写活性化ドメインをさらに含んでいる種類の本発明のキメラDNA結合性タンパク質の例は、ZFHD1複合DNA結合性領域と単純性疱疹ウイルスVP16活性化ドメインとを含有するキメラタンパク質であり、これを製造したところ、反復したZFHD1結合性部位に結合した遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）のin vivo転写を選択的に活性化することが示された。ZFHD1及びNF-κB p65活性化ドメインを含有する別のキメラタンパク質も製造し、これは反復ZFHD1結合性部位に結合した遺伝子（分泌アルカリホスファターゼ）のin vivo転写を活性化することが示された。
転写因子を簡単な分析[F.M. Ausubel et al.編，分子生物学の最新プロトコル(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley & Sons, New York, 1994); de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987)]を用いてin vivo活性について試験することができる。このin vivo分析は、転写因子をコードする組換えDNA配列を含み、その発現を指令することができるプラスミドを必要とする。この分析はまた、転写因子に対する結合性部位に結合したリポーター遺伝子（例、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、分泌アルカリホスファターゼまたはヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子)を含むプラスミドも必要とする。この２つのプラスミドを、普通は妨害するレベルのリポーター遺伝子産物を産生しない宿主細胞に導入する。やはり転写因子をコードする遺伝子とリポーター遺伝子の両者が欠損している第２の群の細胞を対照群として使用し、これになしで、転写因子をコードする遺伝子を含むプラスミドと、転写因子に対する結合性部位をもたない試験遺伝子を含むプラスミドとを入れる。
リポーター遺伝子によりコードされるmRNAまたはタンパク質の産生を測定する。対照には見られないリポーター遺伝子発現の増大は、その転写因子が正の転写調節体であることを意味する。リポーター遺伝子発現が対照に比べて小さい場合には、転写因子は負の転写調節体である。
場合により、この分析はトランスフェクション効率制御プラスミドを含んでいてもよい。このプラスミドは試験遺伝子とは無関係に遺伝子産物を発現し、この遺伝子産物の量は、プラスミドを取り込んでいる細胞の多さと、そのDNAが細胞内に導入される際の効率をおおまかに示す。本発明のキメラタンパク質を評価する別の指針は以下に示す。
５．作成物の設計および組立て
個々のDNA結合性サブドメインおよびリンカー（存在すれば）をコードするDNA配列を、複合DNA結合性領域を含み、かつ全部の成分ドメインを取り込んだ単一のポリペプチドに細胞または細胞溶解物（リゼイト）内で翻訳されることができる１つのキメラタンパク質をコードする単一のオープンリーディングクレームを構成するように結合させる。このタンパク質コーディングDNA配列を次いで、適当な細胞タイプ中でタンパク質の発現を指令する慣用のプラスミドベクター中に入れる。タンパク質の試験ならびに結合特異性および親和性の測定には、細菌内または網状赤血球−溶解物系内でタンパク質の発現を指令するプラスミドを作成することが望ましいことがある。哺乳動物細胞内でのタンパク質の産生に使用するには、このタンパク質をコードする配列をこれらの細胞内での発現を指令する発現ベクター中に導入する。この用途に適した発現ベクターは当技術分野では周知である。各種種類のかかるベクターが市販されている。
複数のドメインを含む複合DNA結合性タンパク質または副キメラタンパク質、例えば、リガンド結合性ドメインおよび／または転写調節ドメインを含むタンパク質が関係する態様では、任意の導入された配列改変を持つ、成分ドメインをコードするDNA配列を、全部の成分ドメインを取り込んだ単一のポリペプチドに細胞内で翻訳されることができる単一のオープンリーディングクレームを構成するように、一緒に連結または他の方法で結合させる。ポリペプチド内でのドメインの順序および配置は所望に応じて変化させることができる。
６．標的DNA配列
複合DNA結合性ドメインを含むキメラタンパク質により認識されるDNA配列は、後述するように実験により決定することができ、またこのタンパク質を所望の配列の方向にその特異性を向けるように操縦することもできる。望ましい核酸認識配列は、少なくとも10、好ましくは少なくとも11、より好ましくは12以上の塩基にわたるヌクレオチド配列からなる。このヌクレオチド配列内の成分結合性部分（推定または実証された）は完全に連続している必要はなく、その間に「スペーサー」対が散在していてもよい。このスペーサー対はキメラタンパク質が直接接触している必要はないが、各モジュールにより認識された核酸サブ部位間に適切な間隔を設けるものである。これらの配列は、遺伝子工学処理されたDNA結合性タンパク質の不存在下で細胞内に導入された場合には、連結した遺伝子に発現を付与すべきではない。
複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質により認識される、好ましくは高い親和性（10^-11M以下の解離定数が特に好ましい）で認識されるヌクレオチド配列を確認するには、いくつかの方法を使用することができる。複合DNA結合性領域の個々のサブドメインの高親和性結合性部位が既知であるなら、これらの配列を各種の間隔および向きで結合させて、最適の配置を実験的に決定することができる（後述する親和性の決定方法の欄を参照）。或いは、タンパク質またはタンパク質複合体に対する高親和性結合性部位を、発表された方法(Pollock, R.とTreisman, R., 1990，タンパク質−DNA結合特異性の鋭敏な決定方法，Nucl. Acids Res. 18, 6197-6204)の採用によりランダムDNA配列の多数のプールから選択することができる。結合した配列をプラスミド中にクローニングし、その正確な配列および該タンパク質に対する親和性を決定する。この配列のコレクションから、望ましい特性（即ち、複合タンパク質に対する親和性が大きく、個々のサブドメインに対する親和性が小さい）を持った個々の配列を使用のために選択する。或いは、配列のコレクションを用いて、各位置で好ましい塩基対を保有する共通配列を導き出す。かかる共通配列を合成し、これが適当なレベルの親和性および特異性を持っていることを確認するために試験する（以下参照）。
７．標的遺伝子作成物の設計
本発明のDNA結合性タンパク質による標的遺伝子の調節、切断等を可能にするDNA作成物は、典型的には、(1)複合DNA結合性タンパク質により高親和性で認識される１コピーまたは複数コピーのDNA配列、(2)最低限TATAボックスおよびイニシエーター配列からなるが、場合により他の転写因子結合性部位を含んでいてもよいプロモーター配列、(3)適切であれば、翻訳の開始および停止を促進する配列を含んでいる、所望の産物(タンパク質またはRNA)をコードする配列、(4)スプライス・ドナー、スプライス・アクセプター、及び介在イントロンDNAからなる任意の配列、および(5)得られたRNA転写物の切断およびポリアデニル化を指令する配列、からなる合成転写ユニットを保有する断片（フラグメント）、プラスミド、または他の核酸ベクターである。
８．結合親和性の測定
DNA結合性タンパク質とこれらが結合する同族(cognate)DNA配列の結合親和性（通常は解離定数で表される）の測定には多くのよく特徴がわかっている分析法を利用できる。これらの分析は通常、濃度および特異的活性が既知の精製タンパク質および結合性部位（通常は合成オリゴヌクレオチド）の調製を必要とする。分析法の例としては、電気泳動移動度シフト分析、DNアーゼＩ保護もしくは「フットプリント」法、ならびにフィルター結合法が挙げられる。上記の値は、BIAコア装置を用いるとより高い精度で求めることができる。この分析法では、合成オリゴヌクレオチドを分析「チップ」に結合させ、精製DNA結合性タンパク質を流れセルに通す。チップ上に固定されたDNAへのタンパク質の結合、を屈折率の増大として測定する。タンパク質が平衡状態で結合されたら、タンパク質を含まない緩衝液をチップ上に流すと、タンパク質の解離により屈折率が基底値に戻る。これらの屈折率の曲線から会合および解離の速度を計算し、これらの速度から親和性または解離定数を算出する。高親和性複合体に対する結合速度および親和性を、そのタンパク質の各サブドメインにより認識されたサブ部位について得られた値と比較してもよい。上述したように、これらの解離定数の差は少なくとも２桁、好ましくは３桁以上の大きさとすべきである。
９．in vivo機能試験
本発明に従って設計されたDNA結合性タンパク質の満足すべき性能を確認するために、いくつかの説得性を高める試験を使用することができる。全てが以下の本質的に同じ成分を有する：(1)(a)複合DNA結合性領域および強力な転写活性化ドメインとを含むキメラタンパク質の産生を指令する発現プラスミドもしくは(b)対応する二量体化剤の存在下に二量体化することができる本発明の一対のキメラタンパク質の産生を指令し、従って一方のタンパク質上に複合DNA結合性領域と他方のタンパク質上に転写活性化ドメインとを含むタンパク質複合体を形成する、１または２以上の発現プラスミド、ならびに(2)リポーター遺伝子、好ましくは上述した標的遺伝子と設計が同一のもの（即ち、DNA結合性ドメインに対する複数の結合性部位、最小限のプロモーター要素、および遺伝子本体）の発現を指令するが、任意の測定に好都合なタンパク質をコードするリポータープラスミド。
過渡的トランスフェクション（移入）分析法では、上記プラスミドを、例えばリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、およびリポフェクションを含む任意の慣用のトランスフェクション手法により組織培養細胞内に一緒に導入する。適当な時間（通常は24〜48時間）の経過後、細胞を捕集し、リポータータンパク質の産生に対して分析する。転写の活性化のためにキメラタンパク質の二量体化を必要とする態様では、分析は二量体化剤の存在下で行う。適切に設計された系では、リポーター遺伝子は、複合転写因子に対して共移入（コトランスフェクション）されたプラスミドの不存在下（または二量体化剤で制御する態様では二量体化剤の不存在下）では、バックグラウンドより高い活性をほとんど示さないのがよい。これに対して、複合転写因子をコードするプラスミド（または多量体化剤の添加後に、多量体化可能なキメラをコードするプラスミド）を含有させると、リポーター遺伝子の発現は用量依存性の関係で増大するのがよい。この結果は、受容細胞内には、試験した結合性部位を認識し、転写を活性化させる可能性を持つ天然の転写因子がほとんどないこと、および遺伝子工学処理したDNA結合性ドメインが生きた細胞内でこの部位に結合しうることを示している。
過渡的トランスフェクション分析法は、移入された細胞内のプラスミドDNAが高濃度であって、異常に高いDNA結合性タンパク質およびその認識部位の濃度を生じ、相対的に親和性が低い相互作用でも機能性認識を可能にするため、多くの場合に極めて厳密な試験ではない。この系のより厳密な試験は、ほとんど単一コピーで導入されたDNAの組み込みを生ずるトランスフェクションである。即ち、タンパク質濃度と特異的／非特異的DNA部位比のいずれも非常に低く、非常に高い親和性相互作用だけを生ずることが予測される。このシナリオは、プラスミドを関連しない選択可能なマーカー（例、G418耐性）をコードする別のDNAと一緒に移入する安定なトランスフェクションにより達成するのが最も容易である。薬剤耐性で選択された形質転換細胞クローンは、典型的には、０から数ダースに及びコピー数の選択されなかったプラスミドを含む。その範囲内のコピー数をカバーする１組のクローンを使用して、その系の効率のかなり明確な推測値を得ることができる。
恐らく最も厳密な試験は、リポーター遺伝子と複合転写因子またはその多量体化可能な成分をコードする遺伝子の両方を取り込んだウイルス性ベクター、代表的にはレトロウイルスを使用するものである。かかる作成物から得られたウイルスのストックは、一般にそれらの遺伝子の１コピーの形質導入を生じよう。
最終的な用途が遺伝子治療である場合には、そのタンパク質ば動物内で機能しうるか否かを決定するため、類似のDNAを保有する形質転換された動物を作成することが好ましいことがある。
11．細胞内への作成物の導入
複合DNA結合性領域を含むキメラをコードする作成物、関連するキメラタンパク質をコードする作成物（例、リガンド依存性用途の場合）、および標的遺伝子の発現を指令する作成物（全て本明細書に記載した通り）を、１または２以上のDNA分子または作成物として、多くの場合にはその作成物を含む宿主細胞の選択を可能にする１または２以上のマーカーと組合わせて、細胞内に導入することができる。作成物の調製は、コード配列および調節領域を分離し、適宜に連結、適当なクローニング宿主内でのクローン化、制限酵素処理もしくは配列決定分析、または他の好都合な手段による分析を行うことができる慣用手段により実施できる。特に、PCRを用いて、機能ユニットの全部または一部を含む個々の断片を分離してもよく、そこで適宜に「プライマー対」、連結、in vitro変異誘発等を用いて１または２以上の突然変異を導入してもよい。作成物が完成し、適切な配列を持つことが実証されたら、これを次いで任意の好都合な手段で宿主細胞中に導入する。作成物は、細胞内への感染または形質導入のために、レトロウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)または単純性疱疹ウイルス(HSV)のような非複製型欠陥ウイルスゲノム中への組込みおよび詰込みをしてもよい。作成物は所望によりトランスフェクションのためのウイルス配列を含んでいてもよい。或いは、作成物を融合、エレクトロポレーション、バイオリスティックス(biolistics)、トランスフェクション、リポフェクション等により導入してもよい。宿主細胞は、場合により、作成物の導入の前に培養により増殖および拡大させておき、その後で作成物の導入および作成物の組込みのための適当な処理を行う。細胞を次いで拡大させ、作成物中に存在するマーカーによってスクリーニングする。首尾よく使用できる各種のマーカーとしては、hpt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシン耐性等が挙げられる。
場合により、作成物を特定の遺伝子座に組込むことが望ましい場合、相同的組換えに対する標的部位を有していてもよい。例えば、内在性遺伝子を削除および／または本発明の組換え標的作成物で（同じ遺伝子座またはどこでも）置換することができる。相同的組換えに対しては、一般にΩまたはＯ−ベクターのいずれかを使用しうる。例えば、Thomas and Capecchi, Cell (1987) 51, 503-512; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352;およびJoyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156を参照。
複数の作成物は、遺伝子の全部をコードする単一のDNA分子として、または１または２以上の遺伝子を有する異なるDNA分子として導入することができる。複数の作成物の導入は、それぞれ同じまたは異なるマーカーを用いて同時にまたは順次行うことができる。
DNA作成物のストックの調製およびトランスフェクションの実施に使用できる、細菌もしくは酵母の複製起点、選択および／または増幅可能なマーカー、原核生物もしくは真核生物中の発現に対するプロモーター／エンハンサー要素等といった有用な要素を含むベクターは、当該技術分野で周知であり、多くのものが市販されている。
12．作成物の動物への導入
本発明のDNA作成物でex vivo修飾された細胞を選択的条件下で培養により増殖させ、所望の作成物を持つとして選ばれた細胞を次いで拡大させ、さらに宿主細胞内の作成物の存在を決定するために、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いてさらに分析する。修飾した宿主細胞を確認したら、これを次いで計画通りに、例えば培養により増殖させるか、または宿主生体中に導入する。
細胞の性質に応じて、細胞の宿主生体（例、哺乳動物）への導入は多様な方法により実施しうる。造血細胞を注射により血管系内に投与してもよく、細胞数は通常は少なくとも約10⁴個で、一般に約10¹⁰個以下、より普通には約10⁸個以下である。細胞の使用数は、多くの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用すべきプロトコル、例えば、投与回数、細胞の増幅能力、治療剤の安定性、治療剤の生理学的必要性等に依存しよう。または、移植片として使用しうる皮膚細胞では、細胞数は火傷またはその他の損傷に貼付すべき層の寸法の依存しよう。一般に、筋芽細胞または繊維芽細胞については、細胞数は約10⁴個以上、約10⁸個以下であり、分散液として、一般に対象位置またはその付近に注射されて投与しうる。細胞は通常は生理学的に許容される媒体中で用いる。
本発明に従って遺伝子工学処理した細胞はまた、例えば、慣用の材料および方法を用いてカプセル化してもよい。例えば、Uludag and Sefton, 1993, J. Biomed. Mater. Res. 27(10):1213-24; Chang et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4(4):433-40; Reddy et al., 1993, J. Infect. Dis. 168(4):1082-3; Tai and Sun, 1993, FASEB J. 7(11):1061-9; Emerich et al., 1993, Exp. Neurol. 122(1):37-47; Segen et al., 1993, J. Neurosci. 13(6):2415-23; Aebischer et al.,1994, Exp. Neurol. 126(2):151-8; Savelkoul et al., 1994, J. Immunol. Methods, 170(2):185-96; Winn et al., 1994, PNAS USA 91(6):2324-8; Emerich et al., 1994, Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 18(5):935-46; およびKordower et al., PNAS USA 91(23):10898-902を参照。細胞を次いでカプセル化形態でそれを必要とする動物宿主、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの患者に導入しうる。好ましくは、カプセル化材料は、カプセル化された細胞により産生された分泌タンパク質の宿主中への放出が可能になるように半透過性である。多くの態様では、半透過性カプセル化により、カプセル化された細胞は、これを導入する宿主生体から免疫学的に分離されるようになる。それらの態様では、カプセル化される細胞は、他の種からのウイルス性タンパク質に由来する成分ドメインを含む１または２以上のキメラタンパク質を発現しうる。
細胞のex vivo修飾の代わりに、多くの場合、細胞をin vivo修飾したいことがある。この目的には、標的組織および細胞のin vivo修飾用に各種手法が開発されている。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスといった多くのウイルスベクターが開発されており、これらは宿主へのウイルスのトランスフェクションおよびランダム組込みを可能にする。例えば、Debunks et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Caned et al., (1989) Scienece 243, 375-378; Hiebert et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al., (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-1729 3; およびFerry et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381を参照。ベクターは注射（例、静脈内または筋肉内）、吸入または他の非経口経路で投与しうる。
in vivo遺伝子修飾によれば、修飾方法は組織の性質、要求される細胞修飾の効率、その細胞を修飾する機会の数、導入すべきDNA組成物への組織の接近のし易さ等に依存しよう。所望により、標的転写開始領域を保有する弱毒化または修飾されたレトロウイルスを採用することにより、ウイルスが産生され、隣接細胞を移入するように、本発明の転写因子作成物の一つを用いてウイルスを活性化することができる。
DNA導入はすべての場合に組込みを生じなくてもよい。状況によっては、導入されたDNAの一時的な維持で十分である。このようにして短期間作用を得ることができ、その場合、細胞を宿主に導入してから、所定時間後、例えば細胞を特定の部位に戻ることができるようになった後、ターンオン(turn on)することができよう。
13．ZFHD1
一つの設計手法の例として、実施例１は潜在的に有用なDNA結合性ドメインの向きおよび結合を決定するために用いたコンピュータモデル化の研究を説明する（実施例１を参照）。コンピュータモデル化の研究により、Zif268およびOct-1タンパク質−DNA複合体の結晶構造の操縦および重ね合わせが可能になった。この研究は、キメラタンパク質に使用するのに適しているように思われた二つの配置のドメインを生じた。一方の整列では、亜鉛フィンガー２のカルボキシル末端領域はホメオドメインのアミノ末端領域から8.8Å離れており、短いポリペプチドがこれらのドメインを連結しうることを示唆している。このモデルでは、キメラタンパク質は5'-AAATNNTGGGCG-3'（配列番号18）なる配列でハイブリッドDNA部位を結合しよう。Oct-1ホメオドメインはAAATサブ部位を認識し、亜鉛フィンガー２はTGGサブ部位を認識し、そして亜鉛フィンガー１はGCGサブ部位を認識しよう。ドメイン間の立体妨害の危険性はこのモデルでは見られなかった。この配置は後述する実験および実施例で使用された。
第２のもっともらしい配置も、亜鉛フィンガー２からホメオドメインまでの距離にまたがる短いポリペプチドリンカー（10Å未満）を有していようが、予測された結合配列が5'-CGCCCANNAAAT-3'（配列番号19）であるようにサブ部位が配置される。この配置は後述する実験では明らかには使用しなかったが、このリンカー領域の可変性によりZFHD1がこの部位も認識できるかもしれない。
適当な配置を選択した後、対応する分子の構築を実施した。一般に、標準的な方法により、生成物の発現、検出、精製または分析を容易にするようにキメラタンパク質に配列を付加してもよい。この目的でZFHD1にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメイン(GST)を結合させた（実施例２を参照）。
キメラタンパク質ZFHD1の共通結合配列を、オリゴヌクレオチドのランダム・プールからの選択的結合の研究により決定した。キメラタンパク質により結合したオリゴヌクレオチド配列を配列決定し、キメラタンパク質に対する共通結合配列を決定するために比較した（実施例３および図１を参照）。
４ラウンドの選択の後、16部位をクローニングし、配列決定した（配列番号１〜16、図１Ｂ）。これらの配列の比較は、共通結合部位5'-TAATTANGGGNG-3'（配列番号17）を明らかにした。この共通配列の5'ハーフであるTAATTAは、規範的なホメオドメイン結合性部位TAATNN [Laughon, (1991)]に似ており、POU特異的ドメインの不存在下でOct-1ホメオドメインにより好まれる部位(TAATNA）とも合っていた[Verrijzer et al., EMBO J. 11:4993(1992)]。この共通配列の3'ハーフであるNGGGNGは、Zif268のフィンガー２および１の隣接結合性部位（それぞれTGGおよびGCG)と符合していた。
キメラタンパク質ZFHD1がこの複合DNA結合性領域の成分ポリペプチドにより認識される配列から共通配列を識別する能力を決定するために結合の研究を行った。ZFHD1、Oct-1 POUドメイン（ホメオドメインおよびPOU特異性ドメインを含有）、ならびにZif268の３つの亜鉛フィンガーを、Oct-1部位の中で5'-ATGCAAATGA-3'（配列番号20）、Zif268部位5'-GCGTGGGCG-3'およびハイブリッド結合性部位5'-TAATGATGGGCG-3'（配列番号21）を識別するそれらの能力について比較した。キメラタンパク質ZFHD1は、オクタマー部位より最適ハイブリッド部位を240倍も優先し、Zif部位には結合しなかった。Oct-1のPOUドメインは、使用した分析条件下でオクタマー部位に1.8×10^-10Mの解離定数で結合し、ハイブリッド部位よりこの部位10〜30倍も優先し、Zif部位には結合しなかった。Zif268の３つの亜鉛フィンガーは、Zif部位に3.3×10^-10Mの解離定数で結合し、残りの３つの部位には結合しなかった。これらの実験は、ZFHD1がハイブリッド部位を緊密かつ特異的に結合し、元のタンパク質のいずれとも明らかに異なるDNA結合特異性を発揮したことを示している。
この新規なDNA結合性タンパク質がin vivoで機能しうるかどうかを決定するため、ZFHD1を転写活性化ドメインに融合して転写因子を生成させ、トランスフェクションの実験を行った（実施例５を参照）。単純性疱疹ウイルスVP16タンパク質のカルボキシル末端81アミノ酸に融合させたZFHD1をコードする発現プラスミドを、SV40プロモーターおよび螢ルシフェラーゼ遺伝子を含むリポーター作成物と共に293細胞内に共移入（コトランスフェクション）した（図３）。このキメラタンパク質が遺伝子発現を特異的に調節することができるかどうかを決定するため、SV40プロモーターの上流に挿入されたZFHD1部位5'-TAATGATGGGCG-3'（配列番号21）、オクタマー部位5'-ATGCAAATGA-3'（配列番号20）、またはZif部位5'-GCGTGGGCG-3'のいずれかの２つのタンデムコピーを含むリポーター作成物を試験した。リポーターが２コピーのZFHD1部位を含んでいた場合には、ZFHD1-VP16タンパク質は用量依存性の関係でこのプロモーターの活性を刺激した。さらに、この刺激活性はZFHD1結合性部位を含むプラスミドに対して特異的であった。このプロモーターを44倍刺激するタンパク質濃度で、オクタマーまたはZif部位を含むプロモーターについてはバックグラウンド以上の刺激は認められなかった。即ち、ZFHD1はin vivoでその標的部位を効率的かつ特異的に認識した。
上記の手法および既知のDNA結合性ドメインを利用して、他の新規なキメラ転写因子タンパク質を構築することができる。これらのキメラタンパク質を本明細書に開示したようにして検討し、キメラタンパク質の共通結合配列を決定することができる。このキメラタンパク質の結合特異性ならびにin vivo活性も、本明細書に例示した手法を用いて決定できる。従って、本発明の方法はDNA結合性タンパク質のドメインから各種のキメラタンパク質を作りだすのに利用することができる。
14．複合DNA結合性領域の最適化および遺伝子工学処理
複合DNA結合性領域の有用な範囲は、２つの天然DNA結合性サブドメインを結合することにより得ることができる特異性に制限されない。多様な変異誘発法を使用して結合特異性を変化させることができる。このような例には、DNA結合性ドメイン(DBD)のDNAとの複合体の結晶またはNMR構造(3D)をコンピュータモデル化手法と併用して、DNA結合のヌクレオチド配列の特異性を変化させるであろうアミノ酸置換を合理的に予測することがある。次いで、候補の変異体を遺伝子工学処理および発現させ、そのDNA結合特異性を、先に説明したようにして、オリゴヌクレオチド部位選択とDNA配列決定を用いて確認することができる。
新規な配列特異性を発生させる別の手法は、結合性を変化させるであろうアミノ酸置換を予測するのにDBDの既知の同族体のデータベースを使用することである。例えば、亜鉛フィンガー配列のデータベースの解析を亜鉛フィンガーの結合特異性を変化させるのに使用した例がある[Desjarlais and Berg (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2256-2260]。
別の強力な手法は、DNAと接触しうるアミノ酸残基のランダム変異誘発の後に、所望の新規な特異性に対してスクリーニングもしくは選択を行うことである。好ましくは、変異体を直接選択することができるようにファージ表示を用いてライブラリーを調査する。例えば、Zif268の３つのフィンガー（ZFHD1に取り込まれた２つを含む）のファージ表示が既に記載されており、ランダム変異誘発および選択を用いてこれらのフィンガーの特異性および親和性を変化させることが行われた[Rebar and Pabo (1994) Science 263, 671-673; Jamieson et al. (1994) Biochemistry 33, 5689-5695; Choo and Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11163-11167; Choo and Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11168-11172; Choo et al. (1994) Nature 372, 642-645; Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 344-348]。これらの変異体をZFHD1中に取り込んで、新規なヌクレオチド配列特異性を持つ新規な複合DNA結合性領域を与えることができる。他のDBDも同様に改変させてもよい。構造に関する情報が利用できない場合には、一般的な変異誘発手法を用いてドメイン全体を望ましい突然変異についてスキャンすることができる。例えば、アラニン・スキャン変異誘発[Cunningham and Wells (1989) Science 244, 1081-1085]、PCR誤取り込み(misincorporation)変異誘発[Cadwell and Joyce (1992) PCR Meth. Applic. 2, 28-33を参照]、および「DNAシャッフリング」[Stemmer (1994) Nature 370, 389-391]である。これらの方法はランダム変異体のライブラリーまたは複数の組の単一変異体を生成し、これはその後ファージ表示のようなスクリーニングまたは選択手法により容易に調査することができる。
これらの全ての手法において、変異誘発は複合DNA結合性領域に対して直接実施してもよく、或いは対象となる個々のサブドメインに対してその自然または他のタンパク質状況下で実施することもできる。後者の場合、新規なヌクレオチド配列特異性を持つ遺伝子工学処理した成分ドメインを、その後、出発成分の代わりに複合DNA結合性領域中に取り込んでもよい。得られた新規なDNA結合特異性は、最初のタンパク質のそれとは全体的または部分的に異なりうる。例えば、所望の結合特異性が既知のDNA結合性サブドメインに対するサブ部位を含む場合、別のサブドメインを隣接配列を認識するように変異させ、次いで天然ドメインと結合させて所望の特異性を持つ複合DNA結合性領域を得ることができる。
ランダム化と選択という手法は、適当なin vitro選択圧力を加えることにより、変化させたヌクレオチド認識特異性に加えて、複合DNA結合性領域に他の望ましい性質を取込むのにも使用できる［概説についてはClackson and Wells (1984) Trends Biotech. 12, 173-184を参照］。これらには、親和性の向上、安定性の向上、およびタンパク質分解に対する耐性の向上が含まれる。
結合性領域を新規なDNA結合特異性で遺伝子工学処理できることから、複合DNA結合性領域を他の所望のヌクレオチド配列と特異的に相互作用するように設計および作製することが可能となる。即ち、臨床上興味がある配列を選択し、これを認識するように複合DNA結合性領域を遺伝子工学処理することができる。例えば、複合DNA結合性領域の設計は、染色体切断点を結合し、他の方法で活性化された腫瘍遺伝子（オンコジーン）の転写を抑制するように[Choo et al. (1994) Nature 372, 642-645を参照]；ウイルスDNAまたはRNAを結合し、主要なウイルス遺伝子の発現を素子または活性化させるように；または腫瘍遺伝子中の変異ホットスポット配列の共通の変異したバージョンを特異的に結合して転写を抑制し（ヒトrasのコドン21の変異のように）、そして変異した腫瘍サプレッサー遺伝子を結合してその転写を活性化するように、行うことができる。
また、本発明のキメラタンパク質を最適化する際には、ポリペプチド配列の免疫原性は、MHCタンパク質によるペプチドの結合と、与えられたペプチドの内在性Ｔ細胞受容体による異物としての認識とを必要とすると考えられることを理解すべきである。少なくとも遺伝子治療用途において、ある異物ペプチド配列をそれが人体内で与えられる可能性を最小限にするように改変することが好ましいかも知れない。例えば、ヒトMHCクラスＩ分子へのペプチド結合は、結合したペプチド内の主要な「アンカー」位置である種の残基に対する厳しい要件を持っている。例えば、HLA-A2は２位にロイシン、メチオニンまたはイソロイシンを、Ｃ末端にロイシンまたはバリンを要求する［概説についてはStern and Wiley (1994) Structure 2, 145-251を参照］。従って、遺伝子工学処理したタンパク質においては、これらの残基の周期性を避けるのがよいかも知れない。
15．組織特異性またはセルタイプ（細胞型）特異性の発現
ある種の態様では、本発明のキメラタンパク質を細胞特異性または組織特異性となるように発現することが好ましいことがある。かかる発現の特異性は、このキメラタンパク質をコードする１または２以上のDNA配列を細胞型特異性の転写調節配列（例、プロモーター／エンハンサー）に操作可能に結合することにより達成しうる。この目的に使用しうる数多くの細胞型特異性転写調節配列が既知である。他のものも細胞特異性となるように発現される遺伝子から得ることができる。
例えば、本発明のキメラタンパク質を発現する作成物は、選択された組織中での特異性発現のために既知の遺伝子に由来する調節配列を含んでいてもよい。代表例を次に表にまとめて示す。

組織特異性プロモーターの確認
遺伝子の組織または細胞型特異性発現を制御する配列を確認するため、そのタンパク質をコードするエキソンから「上流」の配列を含む選択された遺伝子のゲノムコピーを分離する。

これらの上流配列を次いで、β−ガラクトシダーゼのような容易に検出可能なリポーター遺伝子に普通に融合させる。これは、上流調節配列の制御下にその遺伝子の発現を追跡することができるようにするためである。

細胞型特異性となるように遺伝子発現を制御するのにどの上流配列が必要かつ十分であるかを確定するため、対象となる細胞に完全な上流配列を導入して、初期クローンが対照配列を含んでいるかどうかを決定する。リポーター遺伝子発現を発現の証拠として監視する。

これらの配列が細胞型特異性発現に必要な配列を含んでいるなら、5'フランキング配列に欠失（上に図式的に説明するように）が起こることがあり、どの配列が細胞型特異性発現に最低限必要であるかを決定することができる。これは、各構築物を持った形質転換マウスを作りだしてβgal発現を監視することにより、或いはまず特異性培養細胞における発現を、非特異性培養細胞における発現と比較して検査することにより実施できる。
通常は、数回の連続した欠失分析により、組織特異性発現に必要な最低限の配列が正確に確定される。最終的には、これらの配列をその後で形質転換マウスに導入して、その発現が対象細胞内でのみ検出可能であることを確認する。
16．応用
Ａ．構成性遺伝子治療
遺伝子治療は、治療遺伝子の制御された高レベルの発現を、時には細胞型特異性パターンで必要とすることが多い。本発明の活性化転写因子を飽和する量で治療用遺伝子に供給することにより、自然のプロモーターまたはエンハンサーに対してかなり高いレベルの遺伝子発現を得ることができ、これは内在性転写因子に依存性である。従って、遺伝子治療への本発明の応用の１つは、(1)本発明の複合DNA結合性領域と強力な転写活性化ドメイン（例、VP16タンパク質、p65タンパク質等に由来）とからなるキメラタンパク質をコードする転写ユニット、および(2)その複合DNA結合性ドメインに対する結合性サイトを１個、好ましくは数個保有する最小プロモーター(minimal promoter)の制御下で発現された治療用遺伝子からなる転写ユニット、からなる２つの転写ユニットのカセット（これは放出ベクターに応じて１個または２個のプラスミド分子上に存在しうる）を放出することである。これら２つの転写ユニットを細胞に同時導入すると、ハイブリッド転写因子が生成し、これが今度は治療用遺伝子を高度に活性化する。この手法は、従来の遺伝子治療において治療量遺伝子生成物を生成させるのに使用されるようなプロモーターを代わりに用いて転写因子の活性化を生じさせるため、増幅工程を本質的に取り込んでいる。各転写因子は、治療用タンパク質の複数のコピーの作製を指令する可能性を持っている。
この方法を採用して、治療用遺伝子の発現を治療有効レベルに達することができるように実質的に高めることにより、多くの遺伝子治療法の効率を増大させることができる。この手法が有益な治療用遺伝子の例は、サイトカイン、成長因子およびその他のタンパク質ホルモン、抗体、ならびに可溶性受容体といった分泌治療用タンパク質をコードする遺伝子である。他の治療用遺伝子の候補がPCT/US93/01617に開示されている。
Ｂ．調節された遺伝子治療
多くの場合、治療用遺伝子のオン、オフの切替えが随意に可能であること、または発現の強さを正確に定量できること、が治療効力に不可欠である。本発明は特に標的遺伝子の制御された発現を得るのによく適している。調節された発現を得る方法についての２つの例を次に説明する。最初の例は、複合DNA結合性ドメイン、強力な転写活性化ドメインおよび小さい経口利用可能なリガンドにより制御可能な調節用ドメインを含む組換え転写因子を利用する。１例は、ステロイド受容体のリガンド結合性ドメイン、特にWang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8180-8184に記載の修飾プロゲステロン受容体に由来するドメインである。この例では、この組換え転写因子内のGAL4ドメインの代わりに本発明の複合DNA結合性ドメインを使用し、この複合DNA結合性ドメインにより認識されたDNA配列に標的遺伝子を結合する。かかる設計により、RU486のような既知の抗プロゲスチンによる標的遺伝子の調節が可能となる。ここに説明した転写因子は、DNA結合性ドメインの親和性が増大し、発表された構築物におけるGAL4ドメインにより指令されるリガンド依存性二量体化から生ずるバックグラウンド活性が存在しないため、この調節用ドメインの効力を著しく高める。
別の例は、一対のキメラタンパク質、このキメラを二量体化することができる二量体化剤、および発現される標的遺伝子構築物を利用する。第１のキメラタンパク質は、ここに説明した複合DNA結合性領域と、リガンド、好ましくは高親和性リガンドが利用可能な１または２以上の受容体ドメイン（例、FKBP、シクロフィリン、FRAPのFRB領域など）の１または２以上のコピーとを含む。第２のキメラタンパク質は、活性化ドメインと、１または２以上の受容体ドメイン（これは最初のキメラタンパク質に含まれるものと同じでも異なっていてもよい）の１または２以上のコピーとを含む。二量体化剤は各キメラ上に存在する受容体（または「リガンド結合性」）ドメインに結合することにより、キメラを二量体化またはオリゴマー化することができる。これらのキメラタンパク質の発現をコードおよび発現するDNA分子を、遺伝子工学処理する細胞内に導入する。やはり細胞内に導入されるのは、複合DNA結合性ドメインが結合することができるDNA配列に結合した標的遺伝子である（細胞内にまだ存在していない場合）。遺伝子工学処理した細胞またはそのプロゲニー（子孫）をオリゴマー化試薬と接触させると、転写因子の調節された活性、従って標的遺伝子の発現を生ずる。標的遺伝子および認識配列が細胞内に既に存在している場合には、活性化ドメインを、標的遺伝子の発現の調節された阻害のために転写抑制ドメインに置換してもよい。同様な成分の設計および使用は、PCT/US93/01617に開示されている。これらを、この参照用特許文献に開示された交互DNA結合性ドメインの代わりに複合DNA結合性ドメインとこれをコードするDNA配列とを用いることにより本発明に応用してもよい。
二量体化リガンドは、標的遺伝子の転写を活性化するため所望に応じて患者に投与しうる。リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与方法、半減期、細胞の存在数、各種プロトコルを採用しうる。リガンドは非経口または経口投与しうる。投与細胞数は上述した因子に応じて変動する。リガンドの接種は、錠剤、粉剤、もしくは分散液として経口；バッカル；舌下；静脈内、腹腔内、皮下注射；吸入等の経路でよい。リガンド（および拮抗物質である単量体化合物）は、各種の投与経路に対して当該技術分野で周知の慣用方法および材料を用いて調剤することができる。正確な投与量および投与方法は上記の因子に依存し、主治医や人間もしくは動物の健康管理提供者により決定されよう。ほとんどの場合、投与方法は経験的に決定されよう。
リガンドによる転写活性化を逆転または停止させたい場合には、二量体化リガンドと競合することができる単量体化合物を投与してもよい。即ち、副作用が現れたか、または治療効果を終了させたい場合、二量体化剤に対する拮抗物質を任意の好都合な方法で、特に素早く逆転させたい場合には静脈内経路で投与することができる。或いは、DNA結合性ドメインとの不活性化ドメイン（または転写サイレンサー）を存在させるようにしてもよい。別の手法として、各所に記載されているようにFasまたはTNF受容体を介したシグナリングを経てアポトーシスにより細胞を排除してもよい。国際特許出願PCT/US93/01617およびPCT/US94/08008を参照。
特定レベルの発現の維持が長期間（例、約２週間以上）にわたって望まれる場合、または短期間にわたるリガンドの個々のもしくは反復投与を長期の間隔（例、２週間以上）で繰り返す反復治療を行う場合、各用途に対するリガンドの具体的な投与量は治療投与量の監視に対して使用される手法に従って決定しうる。所定範囲内のリガンドの用量を与え、応答を監視して、時間−発現レベルの関係を得ると同時に、治療応答を観察するようにする。その時間内に観察されたレベルおよび治療応答に応じて、その応答に続く次回には用量を増減することができる。こん方法を治療範囲内である投与量を得るまで反復して繰り返す。リガンドを長期投与する場合には、リガンドの維持用量を決定したら、細胞系が発現生成物の適当な応答およびレベルを与え続けることが確保されるように長期の間隔で分析を行うことができる。
この系は、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、ならびに適宜、分泌のレベル、発現生成物の活性、患者の具体的な必要性（これは時間と状況により変動しうる）、細胞もしくは個々の細胞の発現活性の消失に起因する細胞活性の低下速度、といった多くの変動因子による影響を受けることは理解されよう。従って、その集団全般に投与可能な万能の細胞があったとしても、個々の患者に対しては、各患者を個別に適正な投与量について監視することになると予測される。
Ｃ．遺伝子治療：内在性遺伝子
本発明は、遺伝子工学処理した細胞に対して内在性である遺伝子の転写の調節を利用した遺伝子治療に対する多くの手法に適応可能である。これらの手法は、その遺伝子生成物が有益である内在性遺伝子の転写を始動または増大させるための、またはその遺伝子生成物が過剰、病気を誘発、或いはその他の点で有害である内在性遺伝子の転写を阻害するための転写因子としてのキメラタンパク質を利用するものである。
１つの手法において、対象の内在性遺伝子に結合した内在性ヌクレオチド配列（例、内在性遺伝子のコード領域の横に位置するDNA配列のプロモーター領域または他の領域の内部もしくは隣接位置にあるヌクレオチド配列）に結合することができるDNA結合性ドメインを設計または選択する。代わりに、複合DNA結合性領域に対する既知の認識配列を、相同的組換えによって選択した内在性遺伝子に近接して導入し、その内在性遺伝子を対応する本発明のキメラ転写因子に応答性にしてもよい。例えば、Gu et al., Science 265, 103-106(1994)を参照。この複合DNA結合性領域と転写活性化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする作成物を、文献記載のように作る。このキメラ転写因子の発現を可能にするDNA作成物を細胞に導入すると、そのキメラタンパク質に対する認識配列に結合した内在性遺伝子の転写の特異的活性化を生ずる。標的遺伝子の発現の抑制または阻害も、複合DNA結合性領域を含み、文献記載の任意の転写阻害ドメインをさらに含んでいてもよいキメラタンパク質を用いて行うことができる。やはり文献記載のように、例えば、誘導可能なプロモーターを用いるか、または従来公知の調節可能な遺伝子治療手法のいずれかを用いて、キメラタンパク質の調節された発現を可能にするようにDNA作成物を設計してもよい。また、作成物は組織特異性プロモーターまたはエンハンサーの制御下においてもよく、それによりキメラの組織特異性もしくは細胞型特異性発現および内在性遺伝子の調節が可能になる。最後に、単一の転写因子作成物の代わりに、リガンド依存性機能を可能にするリガンド−結合性ドメインを含む一対の転写因子をコードする作成物を使用しうることにも留意されたい。
Ｄ．組換えタンパク質およびウイルスの生産
商業的および研究の目的で組換え治療用タンパク質の生産が、高レベルにタンパク質を発現するように遺伝子工学処理された哺乳動物の細胞系を用いてしばしば行われている。細菌または酵母ではなく、哺乳動物細胞を使用することは、タンパク質の適正な機能が、異種細胞では一般に実施されない翻訳後修飾を必要とする場合に指示される。この方法で商業生産されているタンパク質の例には、エリトロポイエチン、組織プラスミノーゲン活性化剤、第VIII因子のような血液凝固因子、抗体等が挙げられる。このような手段でのタンパク質の生産コストは遺伝子工学処理した細胞において達成された発現のレベルに直接関連する。従って、上述した本発明の構成性２転写ユニット方式は、従来の発現方式よりかなり高い発現レベルを達成することができるので、タンパク質の生産コストを著しく低減させる可能性がある。かかるタンパク質の生産の別の制限は、宿主細胞に対する毒性である。タンパク質の発現により細胞の高密度の増殖が妨げられることがあり、生産レベルが急激に低下する。従って、調節された遺伝子治療について説明したように、タンパク質発現を緊密に制御できるので、タンパク質を生産させずにまず細胞を高密度に増殖させることが可能となる。最適の細胞密度に達した後で始めて、遺伝子の発現を活性化させ、その後で生産されたタンパク質を採集する。
同様の問題が、商業用（例、遺伝子治療）および実験用の組換えウイルスの生産についても「パッケージング（ゲノム詰め込み）系」の作成および使用において経験されている。これらの細胞系は、欠陥組換えゲノムを収容する感染性ウイルス粒子のアセンブリに必要なウイルス性タンパク質を生産するために遺伝子工学処理される。かかるパッケージング系に依存性があるウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。後者の場合、或るパッケージング系から得られたウイルスストックの力価は、そのウイルスの反復(rep)およびコアタンパク質の生産レベルに直接関係する。しかし、これらのタンパク質は宿主細胞に対する毒性が高い。従って、高力価の組換えウイルスの生成は困難であることが証明されてきた。本発明は、反復およびコア遺伝子をここに説明した設計の調節可能な転写因子の制御下に置いたパッケージング系の作成を可能にすることで、この問題に対する解答を与える。このパッケージング細胞系は高密度に増殖させ、ヘルパーウイルスで感染させ、組換えウイルスゲノムでトランスフェクションすることができる。その後、二量体化材料を添加して、パッケージング細胞でコードされたウイルスタンパク質の発現を誘発させると、高力価のウイルスの生産が可能になる。
Ｅ．ゲノム標識試薬としてのキメラDBDの使用
複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質を使用して、特異的認識サイトを含んでいるDNA分子（染色体のスプレッド<spread>および固定化DNAマトリックスなどの全ゲノム調製物を包含する）内の認識されたヌクレオチド配列をラベル（標識）することができる。この手法は、これらの配列を、例えば遺伝子治療用のレトロウイルスベクター内のゲノムDNA中に導入した後で、これを特異的染色体領域に局在化させるために使用できる。より一般的には、複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質を、遺伝子マッピングのような用途に対して、そのヌクレオチド認識サイトの位置を明らかにするための試薬として使用してもよく、この場合、キメラタンパク質は細胞遺伝学的マーカーとして使用できる。複合DNA結合性領域によるDNA結合は、in situハイブリッド形成における蛍光(FISH)のような方法に比べて、より短いヌクレオチド配列を特異的に認識できるという利点を持つことがある。このような手法は、例えば、容易に視覚化できる、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)のようなエピトープまたは赤血球凝集素(HA)タグにより標識するといった方法で、キメラタンパク質をラベルする必要がある。上記の視覚化法には、例えば、免疫学的および比色的検出、ビオチニル化後にストレプタビジンで検出、または緑色蛍光タンパク質(GFP)等の直接検出可能な部位に融合といった手段がある。
Ｆ．生物学的研究
本発明は、標的遺伝子の正確な認識が求められる広範囲の生物学実験に適用可能である。このような実験としては、(1)生化学的精製のために対象タンパク質もしくはRNAを発現させる実験、(2)組織培養細胞中の対象タンパク質もしくはRNAの生物学的機能を評価するためにその調節された発現を行う実験、(3)形質転換動物中の対象タンパク質もしくはRNAの生物学的機能を評価するためにその調節された発現を行う実験、(4)内在性遺伝子に作用する別の調節タンパク質の発現を、その遺伝子の生物学的機能を評価するために調節する実験がある。本発明の複合DNA結合性ドメインを使用できる形質導入動物モデルおよび他の応用としては、米国特許出願第08/292,595号および第08/292,596号（1994年８月18日出願）に開示されているものがある。
Ｇ．キット
本発明はらに、以上の用途に有用なキットも提供する。かかるキットの１例は、本発明の複合DNA結合性領域（上述したように、さらに追加のドメインを含有していてもよい）を含むキメラタンパク質をコードする第１のDNA配列と、このキメラタンパク質が結合できるDNA配列に結合した標的遺伝子を含む第２のDNA配列とを備えている。或いは、第２のDNA配列は、実施者による所望の標的遺伝子の挿入のためのクローニングサイトを含んでいてもよい。調節可能な用途に対しては（即ち、組換えタンパク質が複合DNA結合性ドメインと受容体ドメインとを含んでいる場合には）、上述したように、キットはさらに転写活性化ドメインをコードする第３のDNA配列と、第２の受容体ドメインとを含んでいる。かかるキットは、２種類の組換えタンパク質を二量体化して、標的遺伝子の転写を活性化することができる二量体化剤のサンプルをさらに含んでいてもよい。
以下の実施例は、本発明のその各種の態様およびその均等物の実施に応用できる重要な追加の情報、例示、および指針を含んでいる。実施例は、制限を意図したものではなく、例示のために示すものである。
実施例
以下の実施例は、複合DNA結合性領域を含むキメラタンパク質の設計、作成および使用、この複合DNA結合性領域が結合する共通(consensus)核酸配列の同定、その結合特異性の評価、およびその生体内活性の証明を記述している。ここで引用した文献の内容はこれにより参照として援用する。
実施例１：コンピューターによる設計
コンピューターによる設計研究(PROTEUSおよびMOGLI)を用いて、亜鉛フィンガーがどのようにOct-1ホメオドメインに融合しうるかを視覚化した。Zif268-DNA(Pavletich and Pabo, Science 252:809(1991))およびOct-1-DNA(Klemm, et al., Cell 77:21(1994))複合体を、いくつかの異なる方向に二重らせんのリン酸エステルを重ねることにより整列させた。この研究により、キメラタンパク質に用いるのに適しているように思われる２つの配列が得られた。
結晶学的に決定された２つの異なるタンパク質-DNA複合体の一部を並べることにより各モデルを作成した。まず、各種の位置合わせで二重らせんのリン酸エステルを重ねてモデルを作り、ポリペプチド鎖がどのように連結できるかをみるために分析した。リン酸エステルを重ねたセットは、典型的には対応している原子間の二乗平均距離が0.5〜1.5Åとなった。これらの距離により、設計に含まれる誤差の限度にある見通しが与えられ、正確な配列についての不確実さが、数個のグリシンを含む可変性リンカーを用いる理由の一つであった。
１つの配列では、亜鉛フィンガー２のカルボキシ末端領域がホメオドメインのアミノ末端領域から8.8Å離れており、これは短いポリペプチドリンカーがこれらのドメインに結合しうることを示唆している。このモデルでは、キメラタンパク質は配列5'-AAATNNTGGGCG-3'（配列番号18）を有するハイブリッドDNA部位に結合するであろう。Oct-1ホメオドメインがAAATのサブサイト(subsite)を認識し、亜鉛フィンガー２がTGGサブサイトを認識し、そして亜鉛フィンガー１がGCGサブサイトを認識するであろう。このモデルにおいては、ドメイン間の立体的干渉の危険性がないことは明らかである。
第２の可能な配列もまた、亜鉛フィンガー２をホメオドメインに結合する短いポリペプチドリンカー（10Å未満の距離）を有するであろう；しかし、このサブサイトは推定結合配列が5'-CGCCCANNAAAT-3'（配列番号19）であるように配置される。可変性リンカーがZFHD1にもこの部位を認識させるようにすることは可能であるが、明らかなようにこのモデルは以下の研究に用いなかった。
実施例２：キメラタンパク質の作成
Zif268のフィンガー１および２、グリシン−グリシン−アルギニン−アルギニンリンカー、およびOct-1ホメオドメインを含むキメラタンパク質、ZFHD1(図1A)の作成により設計戦略を試した。Zif268残基333-390をコードする断片（Christy et al., Natl. Acad. Sci. USA85:7857(1988)）、２個のグリシンおよびOct-1残基378-439（Sturm et al., Genes & Development 2:1582(1988)）をポリメラーゼ連鎖反応により製造し、ジデオキシ配列決定により確認し、pGEX2T（ファルマシア）のBamHIサイトにクローン化して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)への枠内（in-frame）融合物を得た。GST-ZFHD1タンパク質を標準の方法（Ausubel et al.,Eds., Current Protocols In Molecular Biology(John Wiley & Sons, New York, 1994)）により発現させ、製造者のプロトコルに従いグルタチオン・セファロース4B（ファルマシア）で精製し、50mMトリスpH8.0, 100mM KClおよび10％グリセロール中に-80℃で貯蔵した。タンパク質の濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミン（Boehringer-Mannheim Biochemicals）を用いてクーマシー(coomasie)染色SDS PAGEに溶解したタンパク質のデンシトメータースキャニングにより測定した。このキメラタンパク質のDNA結合活性はオリゴヌクレオチドのランタムプールから結合部位を選択することにより決定した。
実施例３：共通結合配列
ランダム結合部位選択に用いたプローブは、配列5'-GGCTGAGTCTGAACGGATCCN₂₅CCTCGAGACTGAGCGTCG-3'（配列番号22）を含有していた。100ng poly[d(I-C)]/poly[d(I-C)]および0.025％ノニゲットP-40を結合反応液に含有させた以外はPomerantz and Sharp, Biochemistry 33:10851（1994）に記載の方法により選択を４回行った。第１回目の選択では５ngのランダム化DNAを用い、以下の回では約１ng用いた。結合反応液は、１回目では6.4ngの、２回目では1.6ngの、３回目では0.4ngの、４回目では0.1ngのGST-ZFHD1を含んでいた。
４回の選択を行った後、16の部位をクローン化し配列決定した（配列番号１−16、図1B）。これらの配列を比較すると、共通結合部位5'-TAATTANGGGNG-3'（配列番号17）が明らかになった。この共通配列の5'側半分、TAATTAは、典型的なホメオドメイン結合部位TAATNN（Laughon(1991)）に似ており、POU-特異的ドメインの不在化でOct-1ホメオドメイン（Verrijzer et al., EMBO J. 11:4993(1992)）により好まれる部位（TAATNA）に合った。この共通配列の3'側半分、NGGGNGは、Zif268のフィンガー２（TGG）およびフィンガー１（GCG)の隣接結合部位に似ていた。これらの亜鉛フィンガーサブサイトではグアニンが他の部分よりもよく保存されており、その結晶構造により、これらが重要な側鎖−塩基間の相互作用の位置（Pavletich and Pabo(1991)）であることが分かる。
ZFHD1の共通配列が決定された(5'-TAATTANGGGNG-3'(配列番号17))が、TAATTAサブサイトの内部対称性により、この配列は２つの方向のいずれかで結合するホメオドメインと一致する（図1C、様式１と様式２を比較）。第２の配置（図1C、様式２）は、重要なTAATが他方の鎖上にあり、亜鉛フィンガー（TGGGCG）サブサイトと直接並んだ配置であり、可能性は少ない。というのはモデル化では、この配置はフィンガー２のカルボキシル末端領域とホメオドメインのアミノ末端領域の間の長い距離にまたがるリンカーを必要とすることを示唆しているためである。
共通配列の5'側半分のTAATTA配列にホメオドメインがどのように結合するかを決定するために、これらの方向を区別するために設計されたプローブ(5'-TAATGATGGGCG-3',配列番号21および5'-TCATTATGGGCG-3'，配列番号23)へのZFHD1の結合を試験した。ZFHD1は解離定数8.4×10^-10Mで5'-TAATGATGGGCG-3'プローブに結合し、このプローブを5'-TCATTATGGGCG-3'プローブよりも33倍も優先した。これは、共通配列の最初の４個の塩基が、ホメオドメインにより認識される重要なＴＡＡＴサブサイトを形成すること、およびZFHD1は図1Cの様式１に示すモデルで推定されるように結合することを示唆している。
実施例４：新規な特異性
ZFHD1、Oct-1 POUドメイン(ホメオドメインおよびPOU-特異的ドメインを含有する、Pomerantz et al., Genes & Development 6:2047(1992))およびZif268の３つの亜鉛フィンガー（M.Elrod-Ericksonから入手）について、Oct-1部位5'-ATGCAAATGA-3'（配列番号20）、Zif268部位5'-GCGTGGGCG-3'およびハイブリッド結合部位5'-TAATGATGGGCG-3'（配列番号21）を区別する能力を比較した。DNA結合反応液は全量10μｌ中に10mMヘペス(pH 7.9)、0.5mM EDTA、50mM KCl、0.75mM DTT、４％Ficoll-400、300μｇ/mlウシ血清アルブミン、および適宜タンパク質と結合部位を含んでいた。結合部位の濃度は常に、少なくとも10倍は見掛け解離定数よりも低くした。反応液を30℃で30分間インキュベートし、４％非変性性のポリアクリルアミドゲル中で分析した。見掛け解離定数はPomerantz and Sharp, Biochemistry 33:10851(1994)記載の方法で決定した。プローブは、以下の断片をpBSKII＋(Stratagene)のKpn IおよびXho I部位にクローン化し、Asp718およびHind IIIで断片を切り出すことにより得た：

図２のレーンの各セットの上部に挙げたプローブを含むDNA結合反応液にGST-ZFHD1タンパク質を滴下した。レーン１、６、11および16は9.8×10^-11Mのタンパク質を含有し、各セットの続くレーンにおいてはタンパク質濃度を３倍増加させた。キメラタンパク質ZFHD1は240倍もオクタマー部位よりも最適ハイブリッド部位を優先し、Zif268部位には結合しなかった。
Oct-1-POUタンパク質を、ZFHD1の場合と同様のDNA結合反応液に滴下したが、レーン１、６、11および16はタンパク質を2.1×10^-12M含有していた。Oct-1のPOUドメインは解離定数1.8×10^-10Mでオクタマー部位に結合し、この部位を10および30倍ハイブリッド配列よりも優先し、Zif268部位には結合しなかった。Zifフィンガー１、２、および３を含むペプチドを、ZFHD1およびOct-1-POUタンパク質と同様のDNA結合反応液に滴下し、レーン１、６、11および16はペプチドを3.3×10^-11M含有していた。Zif268の３つのフィンガーは解離定数3.3×10^-10MでZif部位に結合し、他の３つの部位には結合しなかった。これらの実験から分かるように、ZFHD1はハイブリッド部位に強くかつ特異的に結合し、もとのタンパク質のいずれとも明確に区別されるDNA結合特異性を示した。
実施例５：生体内活性
ZFHD1を転写活性化ドメインに融合し、トランスフェクション実験を用いて、新規なDNA結合性タンパク質が生体内で機能しうるかどうかを決定した。単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質のカルボキシル末端の81個のアミノ酸に融合したZFHD1(ZFHD1-VP16)をコードする発現プラスミドを、SV40プロモーターおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するリポーター作成物と共に293細胞にコトランスフェクションした。293細胞を５μｇのリポーターベクター、10μｇの発現ベクターおよび５μｇのpCMV-hGH（内部対照として用いる）と共にコトランスフェクションした。リポーターベクターは、ZFHD1部位(TAATGATGGGCG)、Oct-1部位(ATGCAAATGA)、Zif部位(GCGTGGGCG)または挿入物なしのいずれかの２つの縦列コピーを含んでいた。
10個のアミノ酸ポリペプチドエピトープMYPYDVPDYAをコードする断片、ZFHD1およびVP16残基399-479(Pellet et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5870(1985))をRc/CMV（Invitrogen）のNot IおよびApa I部位にクローン化することによりZFHD1-VP16発現ベクターを作成した。リポーターベクターを、以下の断片をpGL2-プロモーター(Promega)のXho IおよびKpn I部位にクローン化することにより作成した：

293細胞を、Ausubel et al.,Eds., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, New York（1994）に記載のようにして、グリセロールショックによるリン酸カルシウム沈殿を用いトランスフェクションした。hGH産生の定量を、製造者の指示に従いTandem-RHGH Immunoradiometric Assay（Hybritech Inc., San Diego, CA）を用いて行った。トランスフェクションの48時間後に細胞抽出を行い、ML2250 Luminometer （Dynatech Laboratories, Chantilly, VA）において全抽出液100μｌの中10μｌを用い/10cmプレートおよび100μｌルシフェラーゼ分析用試薬(Promega)を用い、増強フラッシュプログラムを用い遅延なく20秒間組み込んでルシフェラーゼ活性を測定した。得られたルシフェラーゼ活性のレベルをhGH産生に標準化し、挿入物なしリポーターpGL2-プロモーターによるRc/CMVのコトランスフェクションについて1.0にセントした。
キメラタンパク質が特異的に遺伝子発現を調節しうるかどうかを決定するために、SV40プロモーターの上流に挿入した、ZFHD1部位5'-TAATGATGGGCG-3'、オクタマー部位5'-ATGCAAATGA-3'、Zif部位5'-GCGTGGGCG-3'のいずれかの縦列コピー２つを含むリポーター作成物を試験した。リポーターがZFHD1部位のコピー２つを含む場合、ZFHD1-VP16タンパク質は用量依存的にプロモーターの活性を刺激した。さらに、この刺激活性はZFHD1結合部位を含むプロモーターに特異的であった。このプロモーターを44倍刺激するタンパク質濃度では、オクタマーまたはZif部位を含むプロモーターではバックグラウンドを超える刺激はみられなかった。このように、生体内においてZFHD1は効果的かつ特異的にその標的部位を認識した。
実施例６：追加実験
以下の追加実験は、複合DNA結合性ドメインZFHD1をその他の種々のドメインと共に含むキメラタンパク質、およびこれらのキメラの構成的、リガンド依存的転写活性化への使用を説明するものである。
A.プラスミド
pCGNN ZFHD1
哺乳動物細胞中でZFHD1コード配列の発現を指示するための発現ベクターを以下のようにして調製した。プライマー5'Xba/Zifおよび3'Zif＋Gを用いたPCRによりcDNAクローンからZif268配列を増幅した。プライマー5'Not Oct HDおよびSpe/Bam 3'Octを用いたPCRによりcDNAクローンからOct-1ホメオドメイン配列を増幅した。Oct-1 PCR断片をNotIおよびBamHIで切断した。両断片をpCGNN(Attar and Gilman, 1992)のXbaIおよびBamHI部位間に3-ウェイ・ライゲーションで連結してpCGNN ZFHD1を作成した。このpCGNN ZFHD1では、cDNA挿入物がヒトCMVプロモーターおよびエンハンサー配列の転写制御下にあり、SV40 T抗原からの核局在配列に連結している。プラスミドpCGNNはまた、選択可能なマーカーとして働くアンピシリン耐性の遺伝子も含有している。
pCGNN ZFHD1-p65
複合DNA結合ドメイン、ZFHD1、およびp65(ヒト)からの転写活性化ドメインを含有するキメラ転写因子の哺乳動物細胞中での発現を指示する発現ベクターを次のようにして作成した。活性化ドメインを含有するp65のC-末端領域（アミノ酸残基450-550）をコードする配列を、プライマーp65 5'Xbaおよびp65 3' Spe/Bamを用いてpCGN-p65から増幅した。PCR断片をXbalおよびBamHIで切断し、pCGNN ZFHD1のSpelおよびBamHI部位間に連結してpCGNN ZFHD1-p65ADを作成した。
p65転写活性化配列は以下の直鎖配列を有する：

pCGNN ZFHD1-FKBPx3
ヒトFKBPの３つの縦列反復に連結したZFHD1の発現を指示する発現ベクターを次のようにして調製した。ヒトFKBPの３つの縦列反復をpCGNNF3からのXbaI-BamHI断片として分離し、pCGNN ZFHD1のSpelおよびBamHI部位間に連結してpCGNN ZFHD1-FKBPx3（ATCC受託番号97399）を作成した。
pZHWTx8SVSEAP
ZFHD1結合部位（Pomerantz et al., 1995）の縦列の８コピーおよび分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）を含むリポーター遺伝子作成物を、縦列ZFHD1結合部位をpSEAP-プロモーターベクター(Contech)のNhelおよびBblII部位間に連結してpZHWTx8SVSEAPを作成することにより調製した。ZHWTx8SVSEAPリポーターは縦列で以下の配列の２コピーを含有する：

ZFHD1結合部位は下線部分である。
pCGNN F1およびF2
FKBP12の１または２のコピーをプライマーFKBP5'XbaおよびFKBP3'Spe/Bamを用いてpNF3VEから増幅した。PCR断片をXbalおよびBamHIで切断し、pCGNNベクターのXbalおよびBamHI部位間に連結してpCGNN F1およびpCGNN F2を作成した。
pCGNN ZFHD1-FKBPx3はFKBPcDNAの別の供給源となりうる。
pCGNN F3
FKBPの縦列の２コピーを含む断片をXbalおよびBamHIで切断することによりpCGNN F2から切り出した。この断片をpCGNN F1のSpelおよびBamHI部位間に連結した。
pCGNN F3VP16
活性化ドメインを含有する、単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16のC-末端領域を、プライマーVP16 5'XbaおよびVP16 3' Spe/Bamを用いてpCGN-Gal4-VP16から増幅した。PCR断片をXbalおよびBamHIで切断し、pCGNN F3プラスミドのSpelおよびBamHI部位間に連結した。
pCGNN F3p65
活性化ドメインを含むp65のXbalおよびBamHI断片を上記のようにして調製した。この断片をpCGNN F3のSpelおよびBamHI部位間に連結した。

C.二量体化剤
FK1012は、天然物FK506の２分子が合成リンカーにより互いに共有結合で連結したものからなり、文献記載の方法を用いてFK506から調製しうる。例えば、PCT/US94/01617およびSpencer et al, 1993を参照。FK1012は２つのFKBPドメインに結合でき、FKBP含有キメラタンパク質の二量体化剤として作用する。

(i)ZFHD1-p65およびZFHD1-VP16キメラタンパク質は、ZFHD1結合性部位を含むヌクレオチド配列に連結した標識遺伝子の転写を活性化する
HT1080細胞を、10％ウシ胎児血清を添加したMEM(GIBCO BRL)中で増殖させた。35mm皿中の細胞を以下のようにしてリポフェクション(lipofection)により一時的にトランスフェクトした：10、50、250ngのZFHD1活性化ドメイン融合プラスミドを１μｇのpZHWTx8SVSEAPプラスミドDNAと共に、チューブ当たり合計2.5μｇのDNAに対してpUC118プラスミドを含むマイクロフュージ(microfuge)チューブに添加した。次いで、各チューブのDNAをOPTIMEN(GIBCO BRL)200μｌ中の20μｇリポフェクタミンと混合した。DNA-リポフェクタミン混合物を室温で20分間インキュベートした。別の800μｌのOPTIMENを各チューブに加え、混合し、予め１mlのDMEM(GIBCO BRL)で洗浄したHT1080細胞に添加した。この細胞を37℃で５時間インキュベートした。次いで、DNA-リポフェクタミン培地を除去し、細胞に10％ウシ胎児血清を含むMEM ２mlを再び供給した。37℃で24時間インキュベートした後、培地20μｌを除去し、文献記載(Spencer et al., 1993)のようにしてSEAP活性を測定した。
結果
ZFHD1-VP16およびZFHD1-p65の両者ともZFHD1結合性部位に連結したSEAPをコードする遺伝子の転写活性化を助けた。結果は図4Aに示す。
(ii)ZFHD1-FKBPx3およびFKBPx3-VP16またはFKBPx3-p65によるFK1012-依存性転写活性化
293細胞を10％ウシ・子ウシ血清を添加したD-MEM(GIBCO BRL)中で増殖させた。35mm皿中の細胞（2.5×10⁵細胞／皿）をリン酸カルシウム沈殿を用いて一時的にトランスフェクトした（Ausubel et al., 1994）。各皿に375ngのpZHWTx8SVSEAP、12ngのpCGNN ZFHD1-FKBPx3および25ngのpCGNN FKBPx3-VP16またはpCGNN FKBPx3-p65を入れた。トランスフェクションの後、２mlの新しい培地を添加し、所望の濃度までFK1012を補充した。24時間のインキュベーション後、培地の100ml部分を除去し、文献記載(Spencer et al., 1993)のようにしてSEAP活性を測定した。
結果
ZFHD1-FKBPx3は、FKBPx3-VP16またはFKBPx3-p65と共にFK1012依存性転写活性化を助けた。FK1012濃度が100nMの時に最大活性化がみられた。図4B参照。
(iii)ZFHD1-FKBPx3およびFKBPx3-VP16またはFKBPx3-p65による合成二量体依存性転写活性化
FK1012の代わりに完全合成二量体を用いて類似の実験を行った。FK1012と同様、この合成二量体は２価のFKBP-バインダーであり、FKBPドメインを含有するキメラタンパク質を二量体化しうる。この実験では、293細胞を10％ウシ子ウシ血清を添加したDMEM中で増殖させた。10cm皿中の細胞をリン酸カルシウム沈殿を用いて一時的にトランスフェクトした(Natesan and Gilman, 1995, Mol.Cell Biol., 15,5975-5982)。各皿に１μｇのpZHWTx8SVSEAPリポーター、50ngのpCGNN ZFHD1-FKBP3x3および50ngのpCGNNF3p65またはpCGNNF3VP16を入れた。トランスフェクションの後、２mlの新しい培地を添加し、所望の濃度までFK1012を補充した。24時間のインキュベーション後、培地100mlを除去し、文献記載(Spencer et al., 1993)のようにしてSEAP活性を測定した。
結果
ZFHD1-FKBPx3は、FKBPx3-VP16またはFKBPx3-p65と共に合成二量体依存性転写活性化を助けた。図4C参照。
参照文献
1. Attar,R.M., and M.Z.Gilman 1992, Mol.Cell.Biol. 12:2432-2443
2. Ausubel,F.M. et al.,Eds., 1994, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（Wiley, NY）
3. Pomerantz,J.L., et al., 1995, Science, 267:93-96
4. Spencer,D.M., wt al., 1993, Science, 262:1019-1924
実施例７：動物生体におけるZFHD1-FKBPx3およびFRAP-p65によるラパマイシン依存性転写活性化
実施例６に記載の方法を用いて、ZFHD1-FKBPx3融合タンパク質、FKBPを含む第２の融合タンパク質、p65活性化ドメインに連結したFRAPのラパマイシン結合性("FRB")領域、および多重ZFHD1結合性部位に連結したヒト成長ホルモンをコードする遺伝子含有リポーターカセットをコードする作成物を調製した。天然物であるラパマイシンはFKBP12とFRAPとの三重複合体を形成する。同様に、ラパマイシンは融合タンパク質のFKBPドメインおよびFRAP FRBドメインの１または２以上に結合しうる。３つの作成物をHT1080細胞に導入すると、これは、実施例６に記載の実験と同じように、細胞培養物におけるhGH遺伝子のラパマイシン依存性発現を助けた。
形成転換されたHT1080培養物からの２×10⁶個の細胞を筋肉注射によりnu/nuマウスに投与した。細胞を植付けた後、ラパマイシンを10〜10,000μｇ/kgの用量範囲で静脈注射により投与した。ラパマイシン投与17時間後に血清サンプルを集めた。対照群は細胞を投与しないが1.0mg/kgラパマイシン（静脈注射）を投与したマウス、および細胞を投与するがラパマイシンを投与しないマウスからなる。
ラパマイシンの投与量の範囲にわたり、hGHの用量反応性の発現がみられた（サーキュレイティングhGHとして）。対照群はいずれも測定可能なhGHを産生しなかった。hGH分析の検出限界は0.0125ng/mlである。図５参照。
これらのデータは動物生体における他の融合タンパク質との二量体化に関して、ZFHD1-FKBP(x3)のZFHD1結合性部位への機能的DNA結合を示している。これらのデータは二量体化剤の生体内投与が、融合タンパク質および反応性標的遺伝子カセットを含有する細胞からの分泌遺伝子産物の動物体内での遺伝子発現を制御できることを実証している。本発明者らは以前、丸薬hGHを投与（腹腔内または静脈注射のいずれか）すると２分より短い半減期で急速にhGHが消失し、30分で検出されなくなることを実証した。従って、この実施例でみられたhGH分泌は持続された現象のようである。
実施例８：FRAP FRB作成物
この実施例は本発明の実施に用いるための、FRAP由来のFRBドメインを含有するキメラタンパク質をコードする作成物に関する背景および情報を提供するものである。以下に記載するVP16-FRB作成物は実施例７で用いたp65-FRB作成物に類似している。
ラパマイシンはFK506結合性タンパク質、FKBPに結合してラパマイシン：FKBP複合体を生じる天然物である。この複合体はタンパク質FRAPに結合して三重の[FKBP：ラパマイシン]:[FRAP]複合体を形成する。FKBP12および289kDaの哺乳動物タンパク質（FRAP、RAFT1またはRAPT1と命名）およびその酵母の類似体DRRおよびTOR(以後、”FRAP”と称する）のラパマイシン依存性会合はいくつかの研究グループにより発表された。例えば、Brown et al, 1994, Nature 369:756-758, Sabatini et al, 1994, Cell 78:35-43, Chiu et al, 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:12574-12578, chen et al, 1994, Biochem.Biolphys.Res.Comm. 203:1-7, Kunz et al, 1993 Cell 73:585-596, Cafferkey et al, 1993 Mol.Cell Biol, 13:6012-6023。Chiu. et al,上記およびStan et al, 1994, J.Biol.Chem. 269:32027-32030は、FKBP12がFRAPのより小さいサブユニットにラパマイシン依存的に結合することを記載している。

FRAPドメイン-VP16転写活性化ドメイン-エピトープ・タグをコードする作成物
この作成物を作る出発点は、PCT/US94/01617に記載の原核生物の発現ベクターpBJ5/NF1Eであった。pBJ5は、5'SacIIおよび3'EcolI部位を含むポリリンカーが165スプライス部位およびポリA部位の間に挿入されたpCDL-SR(MCB 8,466-72)の誘導体である。pBJ5/NF1Eを作成するために、カセットを、Kozak配列および出発部位、SV40 T抗原核局在配列のコード配列(NLS)、単一のFKBPドメイン、およびH.influenzaヘマグルチニンタンパク質(HA)由来のエピトープ・タグ−以下に示すように制限酵素部位が両側に隣接する−を含有するこのポリリンカーにクローン化した：

上記において(X/S)はXhoIおよびSalIによる切断で得られた融和性(compatible)産物間で連結し、いずれの酵素によっても開裂しない配列を生じた結果を示す。このようにFKBPコード配列の両側に隣接するXhoIおよびSalI部位は独特である。
FRAP-VP16融合物をコードする一連の作成物を次の２段階でpBJ5/NF1Eから作成する：(i)FKBPをコードするXhoIおよびSalI制限断片を切り出し、PCR増幅で得られたヒトFRAPのコード配列の全部または一部を含む断片で置換し、作成物NRIEおよびその関連物（その場合RはFRAPまたはその一部を示す）を作り；VP16活性化ドメインのコード配列を、これらのベクターに独特のSalI部位にクローン化し、作成物NRIVIEおよびその関連物を得る。FRAP誘導および／またはVP16ドメインの多量体をコードする作成物を作るには、各段階において追加の操作を行う。
(i)FRAP結合に必要な領域を含むヒトFRAPの一部を、XhoI部位を含む5'プライマーおよびSalI部位を含む3'プライマーを用いてPCRにより増幅する。増幅領域はFRAPの全長（プライマー１および４：断片ａ）；残基2012から2144（FKBP-ラパマイシンに結合しうる能力を保持する133個のアミノ酸領域；Chiu et al, 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:12574-12578参照)(プライマー２および５：断片ｂ)；または残基2025から2114(やはりこの能力を保持する90個のアミノ酸領域；Chen et al, 1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4947-4951参照)(プライマー３および６：断片ｃ)をコードしうる。このDNAは標準的方法によりFRAP遺伝子を含有するヒトcDNAまたはプライマーから増幅し、PCR産物を分離してSalIおよびXhoIで切断する。プラスミドpBJ5/NF1EをSalIおよびXhoIで切断し、切断されたベクターを精製する。切断されたPCR産物を切断されたベクターに連結し、作成物NRa1E、NRb1EおよびNRc1Eを生産する。ここでRa、RbおよびRcは上記のFRAP断片の全長または一部を示す。この作成物はDNA配列決定により確認される。
FRAPドメインの多量体を、NRa1E、NRb1EおよびNRc1EベクターからXhoI/SalI断片としてRa、RbおよびRc配列を分離し、これらの断片をXhoIで直線化したもとの作成物に戻して連結することにより得る。FRAPドメインの２、３またはそれ以上のコピーを含有する作成物（NRa2E、NRa3E、NRb2EおよびNRb3E等と命名する）を制限酵素切断またはPCR分析により同定し、DNA配列決定により確認する。
増幅産物の5'末端：
FRAP断片ａ（全長：プライマー１）

FRAP断片ｂ（残基2012−2144：プライマー２）

プライマー断片ｃ（残基2025−2144：プライマー３）

増幅産物の3'末端：
FRAP断片ａ（全長：プライマー４）

FRAP断片ｂ（残基2012−2144：プライマー５）

FRAP断片ｃ（残基2012−2144：プライマー６）

(ii)VP16転写活性化ドメイン(アミノ酸413-490)を、XhoI部位を含む5'プライマー（プライマー７）およびSalI部位を含む3'プライマー（プライマー８）を用いてPCRにより増幅する。PCR産物を分離してSalIおよびXhoIで切断し、SalIおよびXhoIで切断したプラスミドpBJ5/NF1Eに連結し、中間体NV1Eを産生する。この作成物は制限酵素切断またはPCR分析およびDNA配列決定により確認される。多量体化したVP16ドメインを、NV1EからXhoI/SalI断片として単一のVP16配列を分離し、この断片をXhoIで直線化したNV1Eに戻して連結することにより作成する。この方法により作成物NV2E、NV3EおよびNV4Eを産生し、制限酵素切断またはPCR分析により同定し、DNA配列決定により確認する。
PCR産物の5'末端：

PCR産物の3'末端：

FRAPの一部とVP16の融合物をコードする最終作成物を、VP16配列を(i)に記載の一連のFRAPコードベクターに移行させることにより作る。VP16活性化ドメインの１、２、３および４のコピーをコードするXhoI/SalI断片を、NV1E、NV2E、NV3EおよびNV4Eの切断により作成する。これらの断片をSalIにより直線化したベクターNRa1E、NRb1EおよびNRc1Eに連結し、NRa1V1E、NRb1V1EおよびNRc1V1E、NRa1V2E、NRb1V2E等を作成する。同様にして、FRAPドメインの多量コピーをコードするベクターを、同じ断片をベクターNRa2E、NRb3E、NRb2E、NRb3E等に連結することにより得る。これらのベクターはすべて制限酵素切断またはPCR分析により同定し、DNA配列決定により確認する。このように、最終の一連のベクターは、（Ｎ末端からＣ末端までの）核局在配列、１またはそれ以上のVP16転写活性化ドメインにＮ末端で融合した１またはそれ以上のFRAP由来ドメイン（単一のXhoI/SalI断片上に含有される）、およびエピトープ・タグ標識ををコードする。
オリゴヌクレオチド：

代表的最終作成物(NRc1V1E)の配列：

実施例９：別の複合DNA結合性領域を含有するキメラタンパク質のための作成物
成分DNA結合性サブドメインおよびそれを含有する複合DNA結合性領域をコードする組み換えDNA配列を含有する以下のDNAベクターを調製した。
作成物
すべての発現タンパク質が精製のためのアミノ末端ヒスチジン”タグ”および免疫沈殿のためのエピトープ・タグを有するように改変したpET-19BHA、pET-19Bに基づくベクターにおいてすべてのプラスミドを作成した。pET-19BはE.coliまたは網状赤血球ライゼートにおける異種タンパク質の発現のための周知のベクターである。
亜鉛フィンガー作成物
すべての亜鉛フィンガー配列はSRE-ZBPをコードするヒトcDNAに由来する（Attar,R.M. and Gilman,M.Z., 1992, MBC 12:2432-2443)。
p19B2F：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内(in frame)融合したSREZBP亜鉛フィンガー６および７（アミノ酸328-410）を含む。ZBP亜鉛フィンガー６および７をコードするDNAを、プライマー2F-Xba5'およびZNF-Spe/Bam(以下を参照)を用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19B4F：p19BHAにおけるエピトープ標識に枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー４、５、６および7
（アミノ酸300-410）を含む。ZBP亜鉛フィンガー４、５、６および７をコードするDNAを、プライマー4F-Xba5'およびZNF-Spe/Bamを用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19B7F：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１〜７（アミノ酸216-410）を含む。ZBP亜鉛フィンガー１〜７をコードするDNAを、プライマー7F-Xba5'およびZNF-Spe/Bamを用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BF1：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１（アミノ酸204-214）を含む。ZBP亜鉛フィンガー１をコードするDNAを、プライマーZBPZF15'およびZBPZF13'を用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BF123：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１、２および３（アミノ酸204-297）を含む。ZBP亜鉛フィンガー１、２および３をコードするDNAを、プライマーZBPZF15'およびZBPZF33'を用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
ホメオドメイン作成物
p19BHH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメインおよびフランキングアミノ酸（アミノ酸43-150(Grueneberg et al, 1992, Science, 257:1089-1095)）を含む。Phox1をコードするDNAを、プライマーPhox HH5'およびPhox HH Spe/Bamを用いてPCRにより作成した。得られた断片をXbaIおよびBamHIで切断し、pET-19BHAのXbaIおよびBamHI部位の間に連結した。
亜鉛フィンガー／ホメオドメイン作成物
p19B2FHH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー６および７（アミノ酸328-410）およびPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）を含む。Phox1ホメオドメインをコードする配列を含むp19BHHからのXbaI-BamHI断片をp19B2FのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
P19B4FHH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー４、５、６および７(アミノ酸300-410)およびPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）を含む。Phox1ホメオドメインをコードする配列を含むp19BHHからのXbaI-BamHI断片をp19B4FのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19B7FHH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１〜７(アミノ酸216-410)およびPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）を含む。Phox1ホメオドメインをコードする配列を含むp19BHHからのXbaI-BamHI断片をp19B7FのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BZF1HH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１(アミノ酸204-241)およびPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）を含む。Phox1ホメオドメインをコードする配列を含むp19BHHからのXbaI-BamHI断片をp19BZF1のSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BZF123HH：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したSREZBP亜鉛フィンガー１、２および３(アミノ酸204-297)およびPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）を含む。Phox1ホメオドメインをコードする配列を含むp19BHHからのXbaI-BamHI断片をp19BZF123のSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
ホメオドメイン／亜鉛フィンガー作成物
p19BHH2F：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）およびZBP亜鉛フィンガー６および７(アミノ酸328-410)を含む。ZBP亜鉛フィンガー６および７をコードする配列を含むp19B2FからのXbaI-BamHI断片をp19BHHのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BHH4F：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）およびZBP亜鉛フィンガー４、５、６および７(アミノ酸300-410)を含む。ZBP亜鉛フィンガー４、５、６および７をコードする配列を含むp19B4FからのXbaI-BamHI断片をp19BHHのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BHH7F：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）およびZBP亜鉛フィンガー１〜７（アミノ酸216-410)を含む。ZBP亜鉛フィンガー１〜７をコードする配列を含むp19B7FからのXbaI-BamHI断片をp19BHHのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BHHZF1：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）およびZBP亜鉛フィンガー１(アミノ酸204-241)を含む。ZBP亜鉛フィンガー１をコードする配列を含むp19BZF1からのXbaI-BamHI断片をp19BHHのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
p19BHHZF123：p19BHAにおけるエピトープ・タグに枠内で融合したPhox1ホメオドメイン（アミノ酸43-150）およびZBP亜鉛フィンガー１、２および３(アミノ酸204-297)を含む。ZBP亜鉛フィンガー１、２および３をコードする配列を含むp19BZF123からのXbaI-BamHI断片をp19BHHのSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。
PCRプライマー：

均等物
本明細書に開示された発明は広い用途を有し、ここで記載し説明した内容の範囲内の多くの有用な変形が可能である。当業者は通常の実験により、上記開示から、ここに記載した本発明の特定の具体例と均等な多くの価値ある例を確認できることを認めるであろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に含まれものである。

Claims (36)

1. 転写調節ドメインおよび複合DNA結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現可能な核酸を含み、細胞に導入して標的遺伝子の発現を制御するように該細胞を遺伝子工学処理するための薬剤。ただし、前記複合DNA結合性ドメインは、
   (a)標的遺伝子に結合し、
   (b)(i)自然界では同じタンパク質中に存在しないか、
   (ii)複合DNA結合性ドメイン中に存在する順序では同じタンパク質中に存在しないか、または
   (iii)複合DNA結合性ドメイン中に存在するのと同じ間隔では自然界に存在しない、
   少なくとも２つの核酸結合性ドメインを含有し、
   (c)成分核酸結合性ドメインのそれぞれのDNA結合性とは異なるDNA結合性を示す。
2. 複合DNA結合性ドメインが１または２以上の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項１記載の薬剤。
3. 標的遺伝子が、遺伝子工学処理される細胞に対し異種遺伝子である、請求項１または２記載の薬剤。
4. 標的遺伝子が、遺伝子工学処理される細胞の内在性遺伝子である、請求項１または２記載の薬剤。
5. 標的遺伝子が、複合タンパク質の複合DNA結合性ドメインが結合する内在性ヌクレオチドに連結している、請求項４記載の薬剤。
6. 転写調節ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１〜５のいずれかの項記載の薬剤。
7. 転写活性化ドメインがVP16またはp65転写活性化ドメインである、請求項６記載の薬剤。
8. 転写調節ドメインが転写抑制ドメインである、請求項１〜５のいずれかの項記載の薬剤。
9. 生体外細胞に導入するための、請求項１〜８のいずれかの項記載の薬剤。
10. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸により分かれている、請求項１〜９のいずれかの項記載の薬剤。
11. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、１、２、３、４または５つのアミノ酸により分かれている、請求項１〜９のいずれかの項記載の薬剤。
12. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、50Å未満の距離で分かれている、請求項１〜９のいずれかの項記載の薬剤。
13. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、１０Å未満の距離で分かれている、請求項１〜９のいずれかの項記載の薬剤。
14. 転写調節ドメインおよび複合DNA結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現可能な核酸を含み、細胞中で発現させて該細胞中で標的遺伝子の発現を制御するための薬剤。ただし、前記複合DNA結合性ドメインは、
    (a)標的遺伝子に結合し、
    (b)(i)自然界では同じタンパク質中に存在しないか、
    (ii)複合DNA結合性ドメイン中に存在する順序では同じタンパク質中に存在しないか、または
    (iii)複合DNA結合性ドメイン中に存在するのと同じ間隔では自然界に存在しない、
    少なくとも２つの核酸結合性ドメインを含有し、
    (c)成分核酸結合性ドメインのそれぞれのDNA結合性とは異なるDNA結合性を示す。
15. 複合DNA結合性ドメインが１または２以上の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項14記載の薬剤。
16. 標的遺伝子が、遺伝子工学処理される細胞に対し異種遺伝子である、請求項14または15記載の薬剤。
17. 標的遺伝子が、遺伝子工学処理される細胞の内在性遺伝子である、請求項14または15記載の薬剤。
18. 標的遺伝子が、融合タンパク質の複合DNA結合性ドメインが結合する内在性ヌクレオチドに連結している、請求項17記載の薬剤。
19. 転写調節ドメインが転写活性化ドメインである、請求項14〜18のいずれかの項記載の薬剤。
20. 転写活性化ドメインがVP16またはp65転写活性化ドメインである、請求項19記載の薬剤。
21. 転写調節ドメインが転写抑制ドメインである、請求項14〜18のいずれかの項記載の薬剤。
22. 生体外細胞に導入するための、請求項14〜21のいずれかの項記載の薬剤。
23. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸により分かれている、請求項14〜22のいずれかの項記載の薬剤。
24. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、１、２、３、４または５つのアミノ酸により分かれている、請求項14〜22のいずれかの項記載の薬剤。
25. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、50Å未満の距離で分かれている、請求項14〜22のいずれかの項記載の薬剤。
26. 少なくとも２つの核酸結合性ドメインが、10Å未満の距離で分かれている、請求項14〜22のいずれかの項記載の薬剤。
27. 請求項１〜13のいずれかの項記載の薬剤により作成された、転写調節ドメインおよび複合DNA結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現可能な核酸を含み、ここで該融合タンパク質は標的遺伝子に連結した核酸に結合する、遺伝子工学処理された細胞。
28. 複合DNA結合性ドメインが１または２以上の亜鉛フィンガードメインを含む、請求項27記載の細胞。
29. 標的遺伝子が、融合タンパク質が結合する核酸配列に連結した異種遺伝子である、請求項27または28記載の細胞。
30. 標的遺伝子が、内在性ヌクレオチド配列である、請求項27または28記載の細胞。
31. 標的遺伝子が、融合タンパク質の複合DNA結合性ドメインが結合する内在性ヌクレオチド配列に連結している、請求項30記載の細胞。
32. 転写調節ドメインが転写活性化ドメインである、請求項27〜31のいずれかの項記載の細胞。
33. 転写活性化ドメインがVP16またはp65転写活性化ドメインである、請求項32記載の細胞。
34. 転写調節ドメインが転写抑制ドメインである、請求項27〜31のいずれかの項記載の細胞。
35. 転写調節ドメインおよび複合DNA結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現可能な核酸を、生体外細胞に導入することを含む、標的遺伝子の発現を制御するように該細胞を遺伝子工学処理する方法。ただし、前記複合DNA結合性ドメインは、
    (a)標的遺伝子に結合し、そして
    (b)(i)自然界では同じタンパク質中に存在しないか、
    (ii)複合DNA結合性ドメイン中に存在する順序では同じタンパク質中に存在しないか、または
    (iii)複合DNA結合性ドメイン中に存在するのと同じ間隔では自然界に存在しない、
    少なくとも２つの核酸結合性ドメインを含有し、
    (c)成分核酸結合性ドメインのそれぞれのDNA結合性とは異なるDNA結合性を示す。
36. 転写調節ドメインおよび複合DNA結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現可能な核酸を、生体外細胞中で発現させることを含む、該細胞中で標的遺伝子の発現を制御する方法。ただし、前記複合DNA結合性ドメインは、
    (a)標的遺伝子に結合し、そして
    (b)(i)自然界では同じタンパク質中に存在しないか、
    (ii)複合DNA結合性ドメイン中に存在する順序では同じタンパク質中に存在しないか、または
    (iii)複合DNA結合性ドメイン中に存在するのと同じ間隔では自然界に存在しない、
    少なくとも２つの核酸結合性ドメインを含有し、
    (c)成分核酸結合性ドメインのそれぞれのDNA結合性とは異なるDNA結合性を示す。

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