JP3803745B2

JP3803745B2 - 病害抵抗性反応を制御する新規遺伝子とその利用

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Publication number: JP3803745B2
Application number: JP2002151627A
Authority: JP
Inventors: 洋彦廣近; 安藝雄宮尾; 桂小野里
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2002-05-24
Publication date: 2006-08-02
Anticipated expiration: 2022-05-24
Also published as: US20040003428A1; US7067717B2; CA2408447C; JP2003339381A; CA2408447A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝子に関する。より詳細には、植物において病害抵抗性反応反応を制御する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され転移をする性質を利用して、イネの多数の遺伝子破壊系統が作出されている。トランスポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとして、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、１９８９、Ｃｅｌｌ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ３５、２３５−２４２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、４７８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８４、ＥＭＢＯＪ、３、１０１５−１０１９）が知られている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トランスポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現型が変化することを利用する。この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆｔら、１９９３、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、５、６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１９９８、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、１０、８７７−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８、１１０１−１１１５）。
【０００３】
クラスＩに属するトランスポゾンは、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を介して複製し、転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、ショウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付けられたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そのかなりの部分を占めていることが明らかにされている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組み込みユニットであるようである。最近の研究は、これらのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１ＡおよびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９８８、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６、３６５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）について、ストレス条件下における活性化が報告されている。
【０００４】
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素である。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチオニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。Ｔｏｓ１７の転写は、組織培養により強く活性化され、そして培養時間とともにＴｏｓ１７のコピー数が増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種である日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であるが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピーに増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたクラスＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解析の強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１９９７、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１−２４０；１９９９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子、より詳細には、植物における病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子、これを含むベクター、当該遺伝子で形質転換された植物、および当該遺伝子を植物に形質転換する工程を包含する、植物の改良方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され転移をする性質を利用して作製された多数のイネ遺伝子破壊系統の中から、擬似病斑変異体を発見した。この変異体では、病原体に感染したかのように葉に茶色の壊死斑が現れ、やがて葉全体に広がって枯れていく。この形質の変化と病害抵抗性との関連を鋭意検討した結果、この形質の変化の原因となる遺伝子が、病害抵抗性反応に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
１つの局面では、本発明は、植物における病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２の１位のメチオニンから３６１位のセリンまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、かつ病害抵抗性反応を制御する機能を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
１つの局面では、本発明は、植物における病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１の１４６位のＡから１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、上記病害抵抗性反応は、防御関連遺伝子の発現を誘導することにより制御される。
【００１０】
１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、イネ由来である。
【００１１】
１つの局面では、本発明は、制御配列に作動可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
【００１２】
なお別の局面では、本発明は、植物において病害抵抗性反応を制御する方法であって、上記のポリヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する、方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて単離され、機能が解明された植物新規遺伝子を提供する。
【００１４】
本明細書中で使用する用語「遺伝子」は、遺伝情報を担う構造単位で、形質を規定する因子をいう。遺伝子は、高分子ＤＮＡまたはＲＮＡでの一定の領域の塩基配列により規定される遺伝の作用単位として定義され得る。従って、遺伝子は、最終的にタンパク質に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、物質としては、ポリヌクレオチドとして理解され得る。
【００１５】
本発明によれば、植物において病害抵抗性反応を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドが提供される。本願明細書で使用する用語「病害抵抗性」とは、植物に病気を引き起こす病原体の攻撃に対して防御可能であることを意味する。病原体には、ウイロイド、ウイルス、マイコプラズマ様微生物（ファイトプラズマ）、細菌、菌類、原生動物、線虫、および寄生性植物が含まれる。本願明細書で用いる用語「病害抵抗性反応を制御し得る」は、植物において上記の病害抵抗性を惹起または促進し得ることをいう。
【００１６】
植物における病害抵抗性の機構は、研究されている。植物細胞および組織が外敵の攻撃に対して積極的に発動する一連の防御反応としては、以下が知られる：ｉ）活性酸素の生成とそれに伴う過敏感反応の開始；およびｉｉ）防御関連遺伝子の発現。この防御関連遺伝子の発現により、フェニールアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、カフェイン酸デヒドロゲナーゼなどのフェニールプロパノイド合成系酵素、あるいはカルコン合成酵素（ＣＨＳ)などのイソフラボノイド・ファイトアレキシン合成に関与する遺伝子群の発現誘導と遺伝子産物の蓄積、また、ＨＭＧ−ＣｏＡ−還元酵素などのテルペン系ファイトアレキシン合成に関与する遺伝子群の発現誘導と遺伝子産物の蓄積；および侵入菌の細胞壁を分解し、侵入菌あるいは自己細胞壁からもエリシター分子を遊離させるPRタンパク質の合成が生じ得る。本発明のポリヌクレオチドは、上記のｉ）とｉｉ）の反応に関与し得る。防御関連遺伝子としては、病原関連タンパク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をコードする遺伝子が挙げられる。ファイトアレキシンとは、外敵（寄生菌を含む）が植物体内に侵入したとき宿主である植物細胞により合成あるいは活性化される抗菌性物質であり、このようなファイトアレキシンには、モミラクトンＡおよびサクラネチンが含まれる。
【００１７】
上述したような本発明のポリヌクレオチドは、代表的には、配列表の配列番号２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン（Ｓｅｒ）までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはこのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１の１４６位〜１２３１位に示されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、上述した領域（配列番号２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン（Ｓｅｒ）までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列領域または配列番号１の１４６位〜１２３１位に示されたヌクレオチド配列領域）の外側、すなわち、５’末端側または３’末端側に、さらなるヌクレオチド配列（例えば、非翻訳領域）を含み得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の１位〜１３９５位に示された全長配列からなる。ここで、本願発明のポリヌクレオチドは、配列番号１における縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできるＤＮＡを意味する。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを、縮重異性体と呼ぶこととする。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され転移をする性質を利用して作出されたイネの遺伝子破壊系統の擬似病斑変異体の発見から出発して、このＴｏｓ１７を目印としてイネゲノムＤＮＡから単離されたものである。従って、１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、イネに由来する。
【００１９】
開示されたヌクレオチド配列およびそれによりコードされたタンパク質のフラグメントおよび改変体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」によって、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、従って、それによってコードされるタンパク質もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメントは、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１つ以上を保持するタンパク質フラグメントをコードし得る。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型または人為操作から生じ得る。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿入を包含する）で変化され得る。このような操作のための方法は、一般に、当該分野で公知である。例えば、本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌｉａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ）およびその中で引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００２２】
従って、「１もしくは数個が欠失、置換および／もしくは付加された」とは、遺伝的多型または人為操作（上述したような周知の方法を含む）によって置換、欠失および／もしくは付加され得る程度の数のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加され得ることを意味する。「１もしくは数個が欠失、置換および／もしくは付加された」とは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限り、上記アミノ酸配列においていかなる数のアミノ酸が欠失、付加、および／もしくは置換されていてもよい。アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限り、例えば、上記アミノ酸配列の全長において、以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、置換および／もしくは付加され得る。
【００２３】
本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００２４】
本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４６位のＡから１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらになおより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００２７】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。配列アラインメントは、上記のプログラムのデフォルトのパラメーターを使用して行われ得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって、同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００３０】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して、記載されるアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、アミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００３１】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことである。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列を共有する。
【００３２】
本発明の病害抵抗性反応を制御し得るタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、植物において病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明の全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の３６１アミノ酸）をコードする。ＰＣＲプライマーについてハイブリダイゼーションプローブとして用いるための、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレオチド配列のフラグメントは、一般に、植物において病害抵抗性反応を制御し得るタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００３３】
イネ以外の他の植物に由来する病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドもまた、本願発明の範囲内に含まれ得る。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、開示された全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、本明細書中に記載の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。本明細書中に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって包含される。
【００３４】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、³²Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の植物において病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築のためのプローブの調製のための方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００３５】
例えば、本明細書中に開示された病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡＥｒｌｉｃｈ編、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：１７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために、または生物中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと）。
【００３６】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００３７】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５ＭＮａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０ＭＮａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。ストリンジェントな条件として、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いる３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×から２×のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を用いる５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。よりストリンジェントな条件としては、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１．０ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５×から１×のＳＳＣを用いる５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。さらによりストリンジェントな条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×のＳＳＣを用いる６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
【００３８】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔ_mは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_m＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔ_mは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔ_mは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔ_m、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔ_mは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融解温度（Ｔ_m）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔ_m）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔ_m）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔ_m）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴ_mを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ_mを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２章（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００３９】
得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、代表的には、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ）により市販されるポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００４１】
上述のようにして遺伝子工学的手法または化学合成手法のような手順に従って生成されたポリヌクレオチドが、所望の活性、すなわち病害抵抗性反応を制御する作用、を有することは、例えば、当該ポリヌクレオチドを用いてアンチセンスＲＮＡを発現させたイネにおいて、以下の実施例４の記載と本質的に同様に、ノーザンブロット分析によって、防御関連遺伝子の発現を調べることによって確認され得る。また、このようなポリヌクレオチドは、以下の実施例５の記載と本質的に同様の手順に従って、Ｔｏｓ１７の転移により得られるような擬似病斑変異体を用いる相補性検定において、変異型の壊死斑の形成がなくなることを立証することによっても、所望の活性を有することを確認され得る。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、特定の病原体に対してだけではなく、多種多様な病原体に対する抵抗性を付与した植物を作出するために使用され得る。この植物が農業的に有用であれば、なお好ましい。このような病害抵抗性植物の開発は、病原体の攻撃による農業上の被害の軽減をもたらすことが期待される。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、内在する当該遺伝子の機能を抑制するように導入され、病害抵抗性を有する植物を開発することが期待される。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
【００４４】
「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００４５】
「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ１９９３，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用いることができる。
【００４６】
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，２３５８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（ＶａｎＢｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ１９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，１４０６）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯＪ．８，６５１）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００４７】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【００４９】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【００５０】
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。実施例で使用したベクターに加えて、植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【００５１】
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
【００５２】
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００５３】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ９９，１２）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【００５５】
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物の伝播体（花粉など）、および植物細胞、ならびにそれらの子孫への言及を含む。植物細胞は、本明細書中で使用される場合、限定されることなく、種子懸濁培養物、胚、メリステム領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物の両方を包含する。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含まれる。好ましくは、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、アスパラガス、ジャガイモ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ナタネ、ホウレンソウ、トマト、ペチュニアなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明が適用される最も好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネである。
【００５７】
本発明が使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００５８】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００５９】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００６０】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００６１】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００６２】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
【００６３】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００６４】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
【００６５】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
【００６６】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００６７】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００６８】
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに細胞培養について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【００６９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００７０】
【実施例】
（実施例１：培養によるＴｏｓ１７の活性化および得られた変異体の特徴付け）
ジヤポニカ種の品種「日本晴」の完熟種子を出発材料に用い、先に記載のように（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）（前述）、カルス開始培養および細胞懸濁培養を行った。遺伝子破壊を行うために使用したＴｏｓ１７を活性化するための培養条件は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報協会）に従った。
【００７１】
要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ケ月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前述）で５ヶ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植物）を得た。
【００７２】
得られたＲ１イネの各々を１株とし、それぞれの株から種子を回収した。この種子を播種後圃場に植え、第２世代（Ｒ２）植物を得て形態分析を行った。Ｒ２集団の各植物の表現型を発芽後約５ヶ月にわたり注意深く観察した結果、変異系統ＮＤ５００１（品種日本晴）株は擬似病斑を示した（図１）。図１は、圃場で育成した擬似病斑変異体および対照の野生型の草姿形態を示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を示す写真（Ｂ）である。（Ａ）は、左側が野生型であり、右側が変異体である。（Ｂ）は、上側が野生型であり、下側が変異体である。病徴様変異体は、本葉５、６枚展開した頃から葉に茶色の斑点が現れ始めた。それ以降の葉においても順次展開した跡に壊死斑が形成され、葉身全体に斑点が広がり枯れた。
【００７３】
（実施例２：Ｔｏｓ１７の隣接配列の単離）
実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏｓ１７の隣接配列を単離した。
【００７４】
実施例１で得られたＲ２イネ（ＮＤ５００１株）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製した。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、総ＤＮＡを用いるＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ＬｉｕＹ−Ｇ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２５、６７４−６８１、ＬｉｕＹ−Ｇ．ら、１９９５、ＰｌａｎｔＪ．、８、４５７−４６３）により実施した。
【００７５】
要約すれば、新たなＴｏｓ１７標的部位を持つ再生植物からの総ＤＮＡを鋳型として用い、以下に示す３セットのプライマーを用いる３回のＴＡＩＬ−ＰＣＲにより増幅反応を行った。１回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡには、上記で抽出した総ＤＮＡを使用した。Ｔｏｓ１７特異的プライマーにはＴａｉｌ３（ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ）をもちいた。以下、２回目のＰＣＲではＴａｉｌ４（ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ）、３回目のＰＣＲではＴａｉｌ５（ＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧ）を用いた。１回目のＰＣＲの反応液は全量２０μｌで行った。ＡＤプライマーの配列はＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ（ＡＤ１プライマー）である。このＡＤプライマーは１〜３回目のＰＣＲプライマー対の一方として使用した。
【００７６】
以下に１回目のＰＣＲで用いた最終濃度、および、サイクル数を記載する。
【００７７】
（最終濃度）
鋳型ＤＮＡ；０．５ｎｇ／μＬ／ｔａｉｌ３プライマー（Ｔｏｓ１７特異的プライマー）；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×ＰＣＲ緩衝液（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；１×／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
【００７８】
（サイクル数）
９５℃・３分／１サイクル、９４℃・１分−６５℃・１分−７２℃・３分／５サイクル、９４℃・１分−２５℃・３分−７２℃・３分／１サイクル、９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１５サイクル、７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００７９】
２回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡは１回目のＰＣＲ液を１／５０に希釈して使用した。反応液は全量２０μｌで行った。以下、２回目ののＰＣＲで用いた最終濃度、および、サイクル数を記載する。
【００８０】
（最終濃度）
鋳型ＤＮＡ／Ｔａｉｌ４プライマー；１ｐｍｏｌ／ｕＬ／ＡＤプライマー；１０ｐｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×ＰＣＲ緩衝液（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
【００８１】
（サイクル数）
９５℃・３分／１サイクル、９４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００８２】
３回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡは２回目のＰＣＲ液を１／１０に希釈して使用した。反応液は全量５０μｌで行った。以下、３回目ののＰＣＲで用いた最終濃度、および、サイクル数を記載する。
【００８３】
（最終濃度）
鋳型ＤＮＡ／Ｔａｉｌ５プライマー；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×ＰＣＲ緩衝液（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０５単位／μＬ。
【００８４】
（サイクル数）
９５℃・３分／１サイクル、９４℃・３０秒−６６℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−９４℃・３０秒−４５℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００８５】
次に、それぞれのＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後に簡易カラム精製し、直接的にシークエンサー（ＡＢＩ社、Ｍｏｄｅｌ３１００)を用いて配列を決定した。
【００８６】
（実施例３：変異体の原因遺伝子の構造解析）
土壌で１１日間生育させた野生型イネ（日本晴）の幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯＧＥＮ溶液を用いて幼苗から総ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡからポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーをＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に構築した。このｃＤＮＡライブラリーは、５×１０⁵プラークの感染能力を持つ。陽性のｃＤＮＡ挿入片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのインビボ切除は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ２株で行った。
【００８７】
このｃＤＮＡライブラリーを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って、実施例２で得たＴｏｓ１７が転移した隣接配列のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をプローブとして用いてスクリーニングした。
【００８８】
ｃＤＮＡライブラリーから、強いハイブリダイゼーションシグナルを示す５つのｃＤＮＡクローンが得られた。
【００８９】
１つのクローンの中で最長の約１．４ｋｂサイズのｃＤＮＡを３１００シークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ））を用いてその両方向について配列決定し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析、およびＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０プログラム（帝人システムテクノロジー（株））を用いる分析に供した。
【００９０】
配列決定分析により、最長のｃＤＮＡクローンは１３９５ｂｐ（配列番号１）の長さを有した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０パッケージを用いたｍＲＮＡの分析により、３６１アミノ酸（配列番号２）からなるタンパク質をコードする最長の１０８３ｂｐオープンリーディングフレームが同定された。配列番号１に示した、この１３９５ｂｐのｃＤＮＡ配列を図２に示す。オープンリーディングフレームは、上記ｃＤＮＡ配列の１４６〜１２３１位に位置する。上記オープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。上記アミノ酸配列解析の結果、このタンパク質はキナーゼドメインを有すると推定される。このタンパク質はまた、トマトの病害性抵抗性関連遺伝子であるＰｔｏｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ１（Ｐｔｉ１）とアミノ酸配列レベルで高い相同性を示した（８４％）。これら両タンパク質の配列比較を図３に示す。この相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析を用いて決定した。トマトＰｔｉ１は、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促進する機能を有することが知られている。
【００９１】
（実施例４：擬似病斑変異体における病害抵抗性誘導の評価）
擬似病斑変異体の原因遺伝子へのＴｏｓ１７挿入により引き起こされる当該遺伝子の発現阻害を解析するために、変異体および野生型イネからＲＮＡを抽出し、ノーザン解析により発現特性を調べた。
【００９２】
水中で７日間発芽させ、土壌中で２、４および６週間生育させたそれぞれの植物の葉からＩＳＯＧＥＮＲＮＡ抽出溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、そして５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液を含む１．５％アガロースゲルで分離した。電気泳動には、約１０μｇのＲＮＡを用いた。病害抵抗性反応時に発現する防御関連遺伝子である病原関連タンパク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をプローブとして用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前述、に記載の方法に従って、０．５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、２００μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中、６８℃で、それぞれ３および１２時間行った。このプローブ配列は、以下の通りであった：
＜ＰＡＬ＞：
ＣＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡ
＜ＰＲ１ｂ＞：
ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＧＴＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＧＴＡＡＧＴＡＧＧＴＡＣＧＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧ。
【００９３】
ハイブリダイゼーション後、フィルターを、５５℃で、０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中で２回、合計１時間洗浄した。
【００９４】
ノーザン解析の結果、変異体の壊死斑（ｂｒｏｗｎｓｐｏｔ）のある葉において、ＰＲ１ｂおよびＰＡＬが発現していることが明らかになった。この結果を図４に示す。上から順にＰＲ１ｂ、ＰＡＬ、リボソームＲＮＡを示す。レーンは、左が野生型（ＷＴ）、中央および右が変異型（ＭＴ）であって、中央は壊死斑があり（ｂｒｏｗｎｓｐｏｔ（＋））、右側は壊死斑がない（ｂｒｏｗｎｓｐｏｔ（−））場合である。壊死斑がある葉で防御関連遺伝子の発現が確認された。
【００９５】
さらに、病徴様変異体の葉において、ファイトアレキシン（モミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅＡ）およびサクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ））の定量を行った。この定量は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＰｌａｎｔＪ．（１９９９）１７，５３５−５４５の方法に準じて行った。要約すると、損傷スポット（直径５ｍｍ）を含む組織を、５ｍｌの８０％メタノールで抽出し、そして沸騰させた。次いで、１０ｍｌのブラインをメタノール溶液に添加し、そしてファイトアレキシンを５ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した（3回）。Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した後、ＥｔＯＡｃ層を真空中で濃縮し、粗抽出物を得た。抽出物を３ｍｌのｎ−ヘキサン中に溶解し、Ｓｅｐ−ＰａｋＬｉｇｈｔＳｉｌｉｃａＣａｒｔｉｌａｇｅにロードした。２ｍｌのＭｅＯＨで希釈した後、サンプル溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて分析した。ＬＣ条件：カラムＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ２；溶媒、０．１％蟻酸を伴うＣＨ₃ＣＮ；流速、０．５ｍｌ／分。この分析において、標準物質としてモミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅＡ）およびサクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ）を用いた。この結果を表１に示す。
【００９６】
【表１】

表１は、葉１ｇ新鮮重あたりのファイトアレキシン（モミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅＡ）およびサクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ））含量（μｇ）を示す；ここで、Ｍｕｔａｎｔは、変異体を、ＷｉｌｄＴｙｐｅは野生型を示す；ｎ／ｄは、検出されないことを示す。
【００９７】
表１より、変異体の茶色の壊死斑の現れた葉で、特にモミラクトンＡが蓄積されたことが明らかになった。
【００９８】
以上の結果より、擬似病斑変異体の原因遺伝子は、病害抵抗性反応の誘導を負に制御していることが明らかになり、トマトＰｔｉ１（これは、上述したように、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促進する機能を有することが知られている）とは相反する機能を持つことが示された。
【００９９】
（実施例５：擬似病斑変異の相補性検定）
相補性ベクターの構築とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる擬似病斑変異体の形質転換
完全長の当該遺伝子のオープンリーディングフレームを含む約１．４ｋｂのｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に連結し、ｐＰＺＰ２Ｈａ３（＋）ベクターに組み込んだ（Ｆｕｓｅら、ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、２１９−２２２）。この組換えベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株を形質転換した。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存した。
【０１００】
当該遺伝子変異体の種子を、１％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄した。この種子を用いて田中らの方法（日本国特許第３１４１０８４号）に従って形質転換を行った。種子を、籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。
【０１０１】
次いで、種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した。
【０１０２】
形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。
【０１０３】
共存培養の完了後、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行った。
【０１０４】
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０１０５】
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０１０６】
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
【０１０７】
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／ｌＮＡＡ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１０８】
第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１０９】
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。形質転換体は、壊死斑を形成せず、野生型と同様の表現形を示した。この結果から、当該遺伝子の変異が擬似病斑変異の原因であることが証明された。
【０１１０】
【発明の効果】
植物育種に利用可能な病害抵抗性反応を制御し得る新規ポリヌクレオチドが提供される。さらに、多種多様な病原体に対する病害抵抗性を強化した植物の作出に有用なポリヌクレオチドが提供される。
【０１１１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】圃場で育成した擬似病斑変異体および対照の野生型の草姿形態を示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を示す写真（Ｂ）である。
【図２】擬似病斑変異体の原因遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図３】擬似病斑変異原因遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列とトマトPti1のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図４】擬似病斑変異体における防御関連遺伝子の発現解析を示す電気泳動写真である。

Claims

イネにおける病害抵抗性反応を負に制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２の１位のメチオニンから３６１位のセリンまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、かつ病害抵抗性反応を負に制御し得る機能を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
イネにおける病害抵抗性反応を負に制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１の１４６位のＡから１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
前記病害抵抗性反応反応が、防御関連遺伝子の発現を誘導することにより制御され得る、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
イネ由来である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
制御配列に作動可能に連結された請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
イネにおける病害抵抗性反応を制御する方法であって、トランスポゾンを用いて請求項１または２に記載のヌクレオチド配列を有するイネ遺伝子を破壊する工程を包含する、方法。