JP3865364B2 - Chondroitinase fraction - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超高純度のコンドロイチナーゼＡＢＣ画分、その製造方法、この製造方法において用いることができるモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼＡＢＣ（以下、C-ABCという）は椎間板ヘルニア治療剤として利用できる可能性がある（米国特許４,６９６,８１６号）。C-ABC はプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)の菌体等の培養物から抽出・精製することができ、これにより得られた精製コンドロイチナーゼは安全性も高く十分医薬品として利用できるものである。
【０００３】
しかし近年、プロテウス・ブルガリスにはC-ABC に物理化学的性質が類似した、いわゆる「コンドロイチン硫酸リアーゼII」(特開平１０−２６２６６０；以下、リアーゼIIという)が存在することが明らかとなった。この酵素はC-ABC の精製画分にも極々微量に含まれおり、安全性には問題ないものの、分析・品質管理上、極力排除することが好ましい。一般に、精製ステップを繰り返せば不純物の含量を減少させることができるが、その反面、精製物質の回収率減少は免れない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、医薬品等に用いられるC-ABCと物理化学的に類似しているコンドロイチナーゼ(リアーゼII)を、分析的に検出できない程度にまで排除した超高純度C-ABC画分、およびこの画分を簡便、迅速、かつ高収率で製造する方法等を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、C-ABCの超高純度精製用の抗体を調製し、これを用いたユニークな方法によって類似の酵素を全く検出できない程度にまで超高純度に精製されたC-ABC画分を提供するに至り、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の性質を有するC-ABC 画分（以下、本発明画分ともいう）を提供する。
(1)リアーゼII に対する抗体を用いた免疫測定法で測定することにより、リアーゼII が検出されない。
(2)高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により、リアーゼII のピークが検出されない。
【０００７】
この画分は、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)由来であるものが好ましく、以下の工程を少なくとも含む製造工程により製造されるものがより好ましい。
工程１：リアーゼII に対する抗体を結合させた固相と、C-ABC とリアーゼII とを含有する液相とを接触させ、リアーゼIIをリアーゼIIに対する抗体を結合させた固相に結合させる工程。
工程２：固相と液相とを分離し、液相を回収する工程。
【０００８】
また本発明は、本発明画分からなる医薬（以下、本発明医薬ともいう）を提供する。本発明医薬は、椎間板ヘルニア処置剤であることが好ましい。
【０００９】
また本発明は、以下の工程を少なくとも含む、本発明画分の製造方法（以下、本発明製造方法１ともいう）を提供する。
工程１：リアーゼIIに対する抗体を結合させた固相と、C-ABCとリアーゼIIとを含有する液相とを接触させ、リアーゼIIをリアーゼIIに対する抗体を結合させた固相に結合させる工程。
工程２：固相と液相とを分離し、液相を回収する工程。
【００１０】
また本発明は、リアーゼII に対するモノクローナル抗体（以下、本発明抗体１ともいう）、C-ABC に対するモノクローナル抗体（以下、本発明抗体２ともいう）、本発明抗体１を産生するハイブリドーマ株（以下、本発明細胞株１ともいう）および本発明抗体２を産生するハイブリドーマ株（以下、本発明細胞株２ともいう）を提供する。なお、本発明抗体１および２をまとめて「本発明抗体」ともいう。同様に、本発明細胞株１および２をまとめて「本発明細胞株」ともいう。
【００１１】
また本発明は、本発明抗体１を用いることを特徴とする、リアーゼIIの測定方法（以下、本発明測定方法１ともいう）、および本発明抗体２を用いることを特徴とする、C-ABCの測定方法（以下、本発明測定方法２ともいう）を提供する。なお、本発明測定方法１および２をまとめて「本発明測定方法」ともいう。
さらに本発明は、本発明測定方法１によってリアーゼIIを検出する工程を含む本発明画分の製造方法、および本発明測定方法２によってC-ABCを検出する工程を含む本発明画分の製造方法（以下、これらをまとめて本発明製造方法２ともいう）を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明画分
本発明画分は、以下の性質を有する高純度C-ABC画分である。
(1)リアーゼII に対する抗体を用いた免疫測定法で測定することにより、リアーゼIIが検出されない。
(2)ＨＰＬＣにより、リアーゼIIのピークが検出されない。
【００１３】
上記（１）で用いる免疫測定法は、後述する「本発明測定方法１」であることが好ましい。好ましい具体例等を含めて、後述の「＜５＞本発明測定方法」で説明する。
【００１４】
本発明画分は、このような免疫測定法で測定してもリアーゼIIが検出されない点に特徴がある。ここで「検出されない」とは、上記測定において検出限界以下であることを意味する。
【００１５】
また、ここで用いるＨＰＬＣ法の条件等は以下の通りである。
・カラム担体：カルボキシメチル(CM)基を有する担体
・カラムサイズ：7.5mmｘ7.5cm
・溶出液：(Ａ溶液) 20 mM リン酸緩衝液(pH7.0)
(Ｂ溶液) 0.5 M NaClを含有するＡ溶液
直線濃度勾配(100％ Ａ溶液→50％ Ｂ溶液)/15分
流速：1.0 mL/分
・カラム温度：35 ℃
・サンプルの注入量:100 μL
本発明画分は、このようなＨＰＬＣで分析することによっても、リアーゼIIのピークが検出されない点に特徴がある。また本発明画分は、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましく、また300ユニット/mg蛋白以上の酵素活性を有する画分であることが好ましい。より具体的には、300ユニット/mg蛋白以上の比活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である画分が特に好ましい。なお、本明細書においてC-ABCの「１ユニット(1U)」とは、pH8.0、37℃で、１分間にコンドロイチン硫酸Ｃから１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量を意味する。
【００１６】
本発明画分は、上記の特徴を有している限りにおいて如何なる製造方法で製造されるものであってもよいが、後述する本発明製造方法１によって製造されるものが好ましい。
【００１７】
また本発明画分は如何なる生物資源に由来するものであってもよいが、本発明製造方法１ではプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)に由来する液相を用いることが好ましいことから、本発明画分もプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)に由来するものが好ましい。
【００１８】
＜２＞本発明医薬
本発明医薬は、本発明画分からなる医薬である。本発明医薬の用途は特に限定されないが、C-ABCの椎間板ヘルニア治療剤としての利用可能性が強く示唆されてきていることから（米国特許４,６９６,８１６号）、椎間板ヘルニア処置剤としての用途が好ましい。
【００１９】
椎間板ヘルニア処置剤は、椎間板ヘルニアの処置に用いられる限りにおいてその具体的用途は限定されないが、例えば椎間板ヘルニアの治療目的に使用することができ、注射剤としてヘルニア症の哺乳動物、好ましくはヒトの椎間板に注入し、髄核を溶解して治療する椎間板溶解療法に用いることができる。
【００２０】
本発明医薬の投与量は、投与対象動物の種類、性別、年齢、週齢、病態の種類、病態進行程度等によって個別的に設定されるべきものであり、特に限定されないが、C-ABC量として１回0.1〜100ユニット程度を注入することができる。
【００２１】
本発明医薬の形態も用途等によって適宜設定されるものであるが、例えば椎間板ヘルニア処置剤として用いる場合には、溶液状、凍結状、または凍結乾燥状のいずれであっても良い。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、注射剤とすることができる。
【００２２】
本発明医薬の製剤化は、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、C-ABC自体の活性等に悪影響を与えず、かつC-ABCの作用に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
【００２３】
なお、公知のC-ABC画分の安全性・有用性等については既に知られており、本発明ではさらにリアーゼIIをも実質的に含有しないものであるから、極めて安全性が高いと推定される。
【００２４】
＜３＞本発明製造方法１
本発明製造方法１は、以下の工程を少なくとも含む、本発明画分の製造方法である。
工程１：本発明抗体１（後述）を結合させた固相と、C-ABCとリアーゼIIとを含有する液相とを接触させ、リアーゼIIを本発明抗体１に結合させる工程。
工程２：固相と液相とを分離し、液相を回収する工程。
【００２５】
本発明抗体１の固相への結合は公知の方法により行うことができる。例えば、本発明抗体１を直接固相に共有結合させてもよく、生物学的アフィニティーを利用して結合させてもよく、生物学的アフィニティーを利用して結合した本発明抗体と固相とをさらに架橋剤等により共有結合させてもよい。
固相としてはゲル、ビーズ、メンブレン等が例示される。
【００２６】
固相への共有結合は、例えば市販のカップリングゲル(例えば、CNBr-活性化ゲル、N-ヒドロキシスクシイミド活性化ゲル、エポキシ活性化ゲル、マレイミド活性化ゲル等)等を用いて行うことができる。また生物学的アフィニティーを利用した結合は、抗体のFc部分を特異的に認識するリガンドが結合した固相、例えばプロテインＡやプロテインＧ等のリガンドが結合した固相を用いて行うことができる。このような固相に本発明抗体１をアフィニティー結合させ、さらにジメチルピメリミデート(DMP)、ジイソチオシアノスチルベンジスルホン酸ナトリウム(DIDS)、マレイミドブチリルオキシスクシンイミド(GMBS)、マレイミドカプロイルオキシスクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド等の二価架橋剤を作用させ、本発明抗体１とリガンドとを共有結合させてもよい。また、抗体のFc部分に存在する糖鎖を酸化しアルデヒド化した後、ヒドラジンのリガンドを有するゲルと共有結合させることによって固相化することもできる。
【００２７】
このように調製された固相(本発明抗体１が結合した固相)に、C-ABCとリアーゼIIとを含有する液相を接触させることにより、当該液相中に存在するリアーゼIIが固相の本発明抗体１に結合し、固相と液相を分離することにより液相中のリアーゼIIを除去することができる。固相に接触させる液相(C-ABCとリアーゼIIを含有する)の由来等は特に限定されないが、例えばプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)の菌体等の培養物等に由来する液相であることが好ましい。プロテウス・ブルガリスは、C-ABCの大量製造に極めて有用であるが、同時にリアーゼIIも産生する。よってプロテウス・ブルガリスからリアーゼIIを実質的に含まないC-ABC画分を大量に製造する際には、本発明製造方法が極めて有用である。なお本発明において「プロテウス・ブルガリス由来」とは、必ずしもプロテウス・ブルガリスの培養物等のみを意味するものではなく、プロテウス・ブルガリスのC-ABC遺伝子を用いて創製した同菌以外の組換え生物体由来のものであっても、リアーゼIIが混在する限り包含される。
【００２８】
前記固相に接触させる液相としてプロテウス・ブルガリス由来の液相を用いる場合には、極力高純度に精製されたものであることが好ましい。具体的には、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一のバンドを示し、ＨＰＬＣ(ゲル濾過およびカチオン交換)においても単一のピークを示し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸およびプロテアーゼ含量が検出限界以下であり、結晶化しうるものであり、比活性が300U/mg以上に精製されたC-ABCを含有する液相が好ましい。このような液相は、例えば特開平６―１５３９４７号公報に記載されている方法で製造することができる。この液相自体も安全性が高く、十分医薬品として利用できるものであるが、さらに本発明製造方法に付すことによりリアーゼIIを実質的に完全に除去することができ、医薬品の分析や品質管理をより容易かつ完全なものとすることができる。
【００２９】
固相と液相との接触方法は、固相に結合した本発明抗体１の分子と、液相中のリアーゼII分子とが接触して、該分子が固相に捕捉される限りにおいて特に限定されず、バッチ法、カラム法のいずれをも用いることができる。このような方法で固相と液相とを接触させると、液相中のリアーゼIIのみが固相に結合した本発明抗体１に結合する。その後、固相と液相とを分離して液相を回収することにより、本発明画分を得ることができる。
【００３０】
固相と液相との分離は通常の固液分離手段により行うことができる。例えば、固相と液相との接触をバッチ法により行った場合には、固相を沈殿、遠心、濾過等することにより分離、除去することができる。固相と液相の接触をカラム法により行った場合には、カラムから溶出してくる液相を回収するだけでよいことから、簡便・迅速に操作することができる。この点で、固相と液相との接触は、カラム法により行うことが好ましい。
このようにして得られた液相をさらに本発明製造方法に付してもよく、これによって、リアーゼII除去の確実性・完全性を期することができる。
【００３１】
＜４＞本発明細胞株、本発明抗体
本発明抗体は、リアーゼIIに対するモノクローナル抗体（本発明抗体１）およびC-ABCに対するモノクローナル抗体（本発明抗体２）である。
また本発明細胞株は、本発明抗体１を産生するハイブリドーマ株（本発明細胞株１）、および本発明抗体２を産生するハイブリドーマ株（本発明細胞株２）である。
【００３２】
本発明抗体は、モノクローナル抗体の公知の調製方法(Kohler and Milstein,Nature 256, p495-497(1975)）により調製することができる。具体的には以下の方法で行うことができる。
抗原を、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠(footpad)に投与する。ここで、本発明細胞株１を取得するためには「抗原」としてリアーゼIIを用い、本発明細胞株２を取得するためには「抗原」としてC-ABCを用いる。
【００３３】
その後、脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した抗体産生細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立する。
【００３４】
細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることもできる。ミエローマ細胞株は、抗体産生細胞と異種のものに比べ、同種のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００３５】
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、このハイブリドーマの中から、リアーゼIIに特異的に反応しC-ABCには反応しない抗体を継続的に産生する細胞株、あるいはC-ABCに特異的に反応しリアーゼIIには反応しない抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。前者の選別を繰り返すことによって本発明細胞株１が、後者の選別を繰り返すことによって本発明細胞株２がそれぞれ得られる。
【００３６】
本発明細胞株１としてはＫ１５Ｇ１１(Ｇ２)が好ましい。また本発明細胞株２としては７Ｂ１１Ａが好ましい。これらの細胞株は、本発明抗体１および本発明抗体２を産生するハイブリドーマ株として本発明者により確立されたものであり、平成１２年９月２６日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８０５４およびＦＥＲＭ Ｐ−１８０５５の受託番号で寄託されている。
【００３７】
本発明抗体１は、本発明細胞株１を適当な培地中で培養し、その培養上清から採取することによって製造することができる。また同様に、本発明抗体２は本発明細胞株２の培養上清から採取することによって製造することができる。またマウスの腹腔などの生体内にて本発明細胞株を培養し、腹水などを採取することによっても本発明抗体を製造することもできる。
【００３８】
本発明抗体は、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡやプロテインＧ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固相化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法、超遠心法等によって精製することもできる。
【００３９】
本発明抗体１は、リアーゼIIに対するモノクローナル抗体であり、本発明抗体２はC-ABCに対するモノクローナル抗体である。本発明抗体１はリアーゼIIに特異的に反応し、C-ABCには反応しないものであることが好ましく、本発明抗体２は、C-ABCに特異的に反応し、リアーゼIIには反応しないものであることが好ましい。
【００４０】
本発明抗体はそのまま使用することもできるが、抗原との特異的結合能を有する限りにおいてフラグメント化したものを使用することもできる。例えば、本発明抗体の抗原結合部位(Fab)分解しないプロテアーゼ(例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等)で処理して得られるFabを含むフラグメントとしてもよい。また本発明抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に本発明抗体のFabを含むフラグメントやキメラ抗体(例えば本発明抗体のFab部分を含むキメラ抗体等)を作製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も、本発明抗体に包含される。
【００４１】
本発明抗体のクラスは特に限定されないが、IgGであるものが好ましく、IgG1であるものがより好ましい。またＬ鎖のタイプも限定されないが、κ型であるものが好ましい。
【００４２】
本発明抗体１としては結合定数(Kd)が 7.4 x 10−８ M 以下であるものが好ましく、本発明抗体２としては結合定数(Kd)が 1.6 x 10−７ M 以下であるものが好ましい。結合定数(Kd)は、L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering B.D. Hames (Ed) pp.77-96 Oxford University Press, New Yorkに記載された方法で測定することができる。
【００４３】
このような本発明抗体１としては、前記Ｋ１５Ｇ１１(Ｇ２)から選ばれるハイブリドーマ株が産生するものが好ましい。また本発明抗体２としては、前記７Ｂ１１Ａのハイブリドーマ株が産生するものが好ましい。
【００４４】
＜５＞本発明測定方法
本発明測定方法は、本発明抗体１を用いることを特徴とするリアーゼIIの測定方法（本発明測定方法１）、および本発明抗体２を用いることを特徴とする、C-ABCの測定方法（本発明測定方法２）である。ここでいう「測定」という概念には、単に目的物質の量を測定することのみならず、目的物質の存否（有無）を判定ないし検定することも包含される。
【００４５】
本発明抗体１はリアーゼIIに反応するモノクローナル抗体であり、本発明抗体２はC-ABCに反応するモノクローナル抗体である。本発明測定方法は、このような本発明抗体の性質を、リアーゼIIの測定およびC-ABCの測定に応用したものである。
【００４６】
本発明測定方法は、本発明抗体を用いた免疫測定法により行うことができ、酵素やビオチン等で標識した抗体を用いる酵素免疫測定法、ラジオアイソトープで標識した抗体を用いる放射線免疫測定法、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法等、通常の免疫測定の手法を用いることができる。これらの物質による本発明抗体の標識は、直接的であっても間接的であってもよい。
【００４７】
ここで用いる免疫測定法は、直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドイッチ法等が利用できるが、目的物質の検出特異性を高めるためには二抗体サンドイッチ法を用いることが好ましい。
【００４８】
また、免疫測定法に用いる固相としては、マイクロタイターウェル、アガロース粒子、ラテックス粒子、ビーズ、チューブ、メンブレンなどを用いることができる。目的等に応じて適宜選択できるが、多くのサンプルを同時に検定する場合には、マイクロタイターウェルを用いることが好ましい。
【００４９】
以下に、本発明測定方法の具体例を「本発明測定方法１」を例に挙げて説明する。以下に示す方法は、本発明測定方法１の特に好ましい具体例であるとともに、前記した「本発明画分」の性質を調べるための好ましい免疫測定法の具体例でもある。
(1)抗リアーゼIIポリクローナル抗体を、マイクロタイターウェルに固相化する。なお抗リアーゼIIポリクローナル抗体の製造方法は、後述の実施例で説明する。
(2)このマイクロタイターウェルに検定する画分を入れてインキュベートする（リアーゼIIを、固相化した抗リアーゼIIポリクローナル抗体に結合させる）。
(3)洗浄後、ビオチン標識した本発明抗体１を入れてインキュベートする（固相化した抗リアーゼIIポリクローナル抗体に結合したリアーゼIIに、ビオチン標識した本発明抗体１を結合させる）。
(4)洗浄後、アビジン標識されたペルオキシダーゼを入れてインキュベートする（本発明抗体１が結合したビオチンとアビジンが結合する）。
(5)洗浄後、酵素基質を入れてインキュベートして発色させ、発色の程度を測定する。
【００５０】
本発明画分は、このような免疫測定法で測定してもリアーゼIIが検出されない点に特徴がある。ここで「検出されない」とは、上記測定において検出限界以下であることを意味する。
【００５１】
このように本発明測定方法１は、本発明画分中のリアーゼIIの存否や含量をアッセイする際にも使用することができる。また同様に、本発明測定方法２も、本発明画分中のC-ABCの存否や含量をアッセイする際に使用することができる。
【００５２】
＜６＞本発明製造方法２
本発明製造方法２は、本発明測定方法１によってリアーゼIIを検出する工程を含む本発明画分の製造方法、および本発明測定方法２によってC-ABCを検出する工程を含む本発明画分の製造方法の両方を包含する。
【００５３】
本発明製造方法２は、「本発明測定方法」を本発明画分の製造工程に取り入れたものである。本発明製造方法２は、本発明製造方法１に「本発明測定方法」を取り入れた態様であることが好ましく、より具体的には、本発明製造方法１中の「工程２」の後に、本発明測定方法を組み入れた態様であることが好ましい。特に、本発明製造方法１中の「工程２」の後に、本発明測定方法１を組み入れた態様であることが好ましい。
【００５４】
このように、「本発明測定方法」を本発明画分の製造工程に取り入れ、「本発明測定方法によってリアーゼIIおよび／またはC-ABCを検出する工程」を設けることによって、万一所定の品質を満たさない画分が製造された場合にはこれを発見でき、その画分を排除することができる。従って、本発明製造方法２によって、所定の品質を満たす本発明画分が安定的に製造できることとなる。
【００５５】
【実施例】
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲は限定されない。
＜１＞本発明細胞株および本発明抗体の製造
(1)本発明細胞株１の作製
公知のリアーゼII画分（特開平10-262660号公報に記載の方法で製造したもの） 1mg/mlを、同量のフロイント完全アジュバント(Freund's Complete Adjuvant；Sigma社)と混合し、エマルジョン化した。この溶液約400μlを、Balb/cマウスに２〜３回に分けて皮下注射した。１週間後、同様に製造した公知のリアーゼII画分 1mg/mlを、同量のフロイント不完全アジュバント(Freund's Incomplete Adjuvant；Sigma社)と混合してエマルジョン化した溶液約400μlを皮下注射した。さらに１週間後、同様に、公知のリアーゼII画分とフロイント不完全アジュバントとのエマルジョン化溶液を皮下注射した。
【００５６】
免疫後、マウスの脾臓細胞を採取し、この細胞を KohlerとMilsteinの方法（Nature 256, p495-497(1975)）によってマウスミエローマ細胞株（P3X63Ag8.635）と融合させてハイブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清を、リアーゼIIおよびC-ABCを抗原とした免疫測定法により検定して、リアーゼIIに特異的に結合しC-ABCには結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を得た（K15G11(G2)株）。このハイブリドーマ株により産生されるモノクローナル抗体のクラスはIgG1であり、Ｌ鎖はκ型であった。K15G11(G2)株により産生されるモノクローナル抗体をK15G11(G2)と命名した。
【００５７】
(2)本発明細胞株２の作製
リアーゼIIに代えて公知のC-ABC画分（特開平6-153947号公報に記載の方法で製造したもの）を用い、上記(1)と同様の方法でハイブリドーマ株を得た。ハイブリドーマの培養上清を、上記(1)と同様に検定して、C-ABCに特異的に結合しリアーゼIIには結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株得た（7B11A株）。このハイブリドーマ株により産生されるモノクローナル抗体のタイプはIgG1であり、Ｌ鎖はκ型であった。7B11A株により産生されるモノクローナル抗体を7B11Aと命名した。
【００５８】
モノクローナル抗体 K15G11(G2)および7B11Aの結合定数(Kd)を L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering B.D. Hames (Ed) pp.77-96 Oxford University Press, New York に記載された方法で測定した結果、以下の通りであった。
【００５９】
K15G11(G2) Kd＝7.4 x 10−８ M
7B11A Kd＝1.6 x 10−７ M
【００６０】
(3)ポリクローナル抗体の製造
公知のリアーゼII画分 1mg/mlを、同量のフロイント完全アジュバント(Sigma社)と混合し、エマルジョン化した。この溶液約２mlを、JWウサギに５〜６回に分けて皮下注射した。１週間後、同様に公知のリアーゼII画分をフロイント不完全アジュバント(Sigma社)と混合してエマルジョン化した溶液約２mlを皮下注射した。さらに１週間後、同様に、公知のリアーゼII画分とフロイント不完全アジュバントとのエマルジョン化溶液を皮下注射した。
【００６１】
免疫したウサギから血清を採取し、抗体価をオクタロニーにより検定し、十分に抗体価が上昇したウサギについて頸動脈と心臓から全採血し、遠心操作により抗血清を得た。抗体価の低いウサギについてはさらに免疫を繰り返し、同様に抗血清を得た。
このようにして得られた抗リアーゼII抗血清から、以下の通りリアーゼIIに特異的な抗リアーゼIIポリクローナル抗体を精製した。
【００６２】
Protein G Sepharose 4FF(Amersham Pharmacia Biotech社製) を結合緩衝液(20 mMリン酸緩衝液, pH 7.8)に懸濁し、10mlのスラリーをカラムに充填した。さらにカラムに５倍量の結合緩衝液を流して平衡化した。平衡化したカラムに結合緩衝液で５倍希釈した抗リアーゼII抗血清を添加した。さらに５倍量の結合緩衝液を流してProtein Gに結合しない血清タンパク質を除去した。次に溶出緩衝液(0.1M Glycine-HCl, pH2.8)をカラムに流して、溶出液を10mlのフラクションとして回収した。溶出液は直ちに適当量の中和緩衝液(1M Tris-HCl, pH 9.0)と混合し、溶出されたIgGの変性を防いだ。各フラクションの吸光度(A280nm)を測定し、0.1以上のフラクションをプールした。このプールに最終飽和濃度が50％となるように硫酸アンモニウムを添加した。氷上で30分放置した後、遠心操作で沈殿を回収し、IgGを濃縮・精製した。得られた沈殿を0.1M 重炭酸緩衝液(pH 8.3)に溶解し、0.1M 重炭酸緩衝液(pH 8.3)に対して３日間透析した。透析して得られたIgG溶液を、あらかじめC-ABCを固相化したAffigel-10(Bio-Rad)ゲルと混合してインキュベートすることにより、溶液中に微量に含まれる可能性がある抗C-ABCポリクローナル抗体を吸着除去した。
【００６３】
精製された抗リアーゼII IgGポリクローナル抗体を還元し、あるいはそのままSDS-14％ ポリアクリルアミドゲル（旭テクノグラス）を用いた電気泳動に付した結果、Ｈ鎖およびＬ鎖で構成される単一バンドの抗体蛋白質であることが確認された。
なお抗C-ABC抗血清からのC-ABCに特異的な抗C-ABCポリクローナル抗体の製造、精製およびその確認も、上記と同様に行った。
【００６４】
(4)抗体固相化カラムの作製
抗体を固相化したアフィニティーカラム担体は、Protein G 結合ゲル(Pierce Chemical社)を用いて作製した。50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.2)(以下、B/W 緩衝液という) ５mlをカラムに２回添加して平衡化した。精製した抗リアーゼII抗体 １ml(12mg蛋白/ml)を、1mlのB/W 緩衝液で希釈してカラムに添加した。カラムを室温で30分間、穏やかに転倒攪拌して、カラム担体のProtein Gと抗体のFc部分を結合させた。B/W 緩衝液 ５mlでカラムを２回洗浄し、次に6.6mg/mlのジメチルピメリミデート(Dimethylpimelimidiate)溶液を加えて、カラムを室温にて60分間穏やかに転倒攪拌し、カラム担体と抗体とを共有結合により架橋させた。カラム洗浄後、アミノ基のブロッキング緩衝液(0.1M エタノールアミン, pH 8.2) ５mlを添加して、室温で10分間穏やかに転倒攪拌した。その後、架橋していない抗体を、5mlの0.1M Glycine-HCl, pH2.8により溶出させた。カラムはB/W 緩衝液 ５mlで２回洗浄し、この状態で次回の使用まで4℃で保存した。
【００６５】
試薬等は ImmunoPure Protein G Orientation Kit(Pierce Chemical社)を使用した。
抗C-ABC抗体の固相化カラムの作製も、これと同様に行った。
【００６６】
＜２＞本発明画分の製造
本発明画分の製造は、全てエンドトキシンフリーの条件下で実施した。
公知のC-ABC画分(特開平６―１５３９４７号公報に記載の方法で製造したもの；エンドトキシンフリー) 約20mlを0.22μmのフィルターで濾過した後、上記で作製した抗リアーゼII抗体固相化カラム（カラムの５倍量の１％POELE溶液で洗浄した後、エンドトキシンフリーの蒸留水で平衡化したもの）に添加した。カラムから滴下してきた液(フロースルー)を、3mlずつのフラクションとして回収して吸光度(A280nm)を測定した。吸光度0.1以上のフラクションをプールして、同じ操作をもう一度繰り返し、フロースルーを回収して、C-ABC画分を得た。
【００６７】
また、公知のリアーゼII画分(特開平１０-２６２６６０号公報に記載の方法で製造したもの)を、同様に上記で作製した抗C-ABC抗体を固相化したカラムに通し、同様にリアーゼII画分を得た。
【００６８】
＜３＞本発明画分の性質
上記で得られた各画分中に含まれるC-ABC およびリアーゼIIの含量を、免疫測定法およびＨＰＬＣ法により測定した。測定方法は以下の通りである。
(1)免疫測定法
(1-1)ビオチン標識抗体の作製
前記で得られた抗C-ABCモノクローナル抗体および抗リアーゼIIモノクローナル抗体を、それぞれ50 mM 重炭酸緩衝液 (pH 8.3)で2 mg/mlに調製した。これらの溶液とSulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce Chemical社製)と混合し、室温で１時間、ゆるやかに攪拌した。得られたラベル化抗体から未反応のビオチンを除去するために、50 mM 重炭酸緩衝液に対して２日間透析した。
【００６９】
(1-2)サンドイッチ-免疫測定法による、C-ABCおよびリアーゼIIの測定
抗C-ABCポリクローナル抗体または抗リアーゼIIポリクローナル抗体を、炭酸-重炭酸緩衝液(pH 9.4)で20μg/mlに調製し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（Nunc immunoplate）に100μl/wellで添加して、37℃で1.5時間インキュベートした。次いでイムノスタビライザー(ABI社)をプレートに200μl/ウエル添加して、37℃で1.0時間インキュベートして抗体結合プレートを作製した。
【００７０】
別途、測定用サンプル(＜２＞で得られたC-ABCまたはリアーゼII)をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）で適当な濃度に希釈して、C-ABCおよびリアーゼIIのスタンダードを作製した。測定用サンプルとスタンダードを、上記で作製した抗体結合プレートに100μl/ウエルで添加して、37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをPBS-0.05％ Tween20で４回洗浄した。
【００７１】
上記(1-1)で作製したビオチン標識抗C-ABC抗体またはビオチン標識抗リアーゼII抗体をPBSで2500倍希釈して、プレートに100μl/ウエルで添加し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをPBS-0.05％ Tween20で４回洗浄した。
【００７２】
アビジン-ペルオキシダーゼ(Sigma社)をPBSで10000倍希釈して、プレートに100μl/ウエルで添加し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをPBS-0.05％ Tween20で４回洗浄した。
【００７３】
基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Moss,INC)をプレートに100μl/wellで添加し、室温で10分間反応させた。1M HClをプレートに100μl/wellで添加して反応を停止させた後、ウェルリーダー SK601(生化学工業株式会社販売)により、450〜630nmの吸光度を測定した。
【００７４】
(2)ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣカラム、溶出溶媒、流速等の条件は以下の通りで行った。
【００７５】
・カラム：TSKgel CM-5PW(7.5 mmx7.5 cm；東ソー製)
・溶出液：(Ａ溶液) 20 mM リン酸緩衝液( pH7.0 )
(Ｂ溶液) 0.5 M NaClを含有するＡ溶液
・直線濃度勾配( 100％ Ａ溶液→50％ Ｂ溶液 )/15分
・流速：1.0 mL/分
・カラム温度：35 ℃
・サンプルの注入量:100 μL
【００７６】
(3)上記＜２＞で得られたC-ABC画分(本発明画分)の分析結果を以下に示す。なお「N.D.」は検出されなかったこと(検出限界以下)を示す。
(3-1)免疫測定法
【００７７】
【表１】
(3-2)ＨＰＬＣ法（A280nmの検出チャートのピーク面積の相対値）
【００７９】
【表２】
（リアーゼIIのピークは、溶出時間15.73分付近に検出された）
この結果から、本発明方法は、精製目的物の収量をほとんど減ずることなく、リアーゼIIを効率よく検出限界以下まで除去できることが明らかとなった。
上記＜２＞で得られたリアーゼII画分の分析結果を以下に示す。
【００８１】
なお、リアーゼII含量はＨＰＬＣ法で、C-ABC含量は免疫測定法で測定した。またカッコ内の数値は、リアーゼII含量に対するC-ABC含量の重量比を示す。
【００８２】
【表３】
この結果から、本発明方法をリアーゼII画分の精製に応用しても、精製目的物の収量をほとんど減ずることなく、C-ABC含量を効率よく検出限界近くまで除去できることが明らかとなった。
【００８４】
【発明の効果】
本発明画分は、医薬品等に用いられるC-ABCと物理化学的に類似するリアーゼIIを、分析的に検出できない程度にまで排除した超高純度コンドロイチナーゼ画分であり、これによりC-ABC製剤の分析・品質管理が容易となることから極めて有用である。このような本発明画分からなる本発明医薬も、例えば椎間板ヘルニア処置用途として有用のみならず、分析・品質管理を容易に行うことができる医薬品としても極めて有用である。
【００８５】
本発明製造方法１は、本発明画分を簡便、迅速、かつ高収率で製造できることから極めて有用である。また本発明抗体は、本発明製造方法１、本発明測定方法および本発明製造方法２に用いることができる。従って、本発明画分の製造・工程管理や、製造された本発明画分の分析・品質管理等に用いることができ、極めて有用である。本発明細胞株は、このような本発明抗体の製造に用いることができ、極めて有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an ultrapure chondroitinase ABC fraction, a production method thereof, a monoclonal antibody that can be used in this production method, a hybridoma strain that produces this monoclonal antibody, and the like.
[0002]
[Prior art]
Chondroitinase ABC (hereinafter referred to as C-ABC) may be used as a therapeutic agent for intervertebral hernia (US Pat. No. 4,696,816). C-ABC can be extracted and purified from cultures such as Proteus vulgaris cells, and the resulting chondroitinase obtained is highly safe and can be used as a pharmaceutical product. .
[0003]
Recently, however, it has been clarified that Proteus bulgaris has so-called “chondroitin sulfate lyase II” (JP-A-10-262660; hereinafter referred to as lyase II), which has similar physicochemical properties to C-ABC. . This enzyme is contained in a very small amount in the purified fraction of C-ABC, and although there is no problem in safety, it is preferable to eliminate it as much as possible for analysis and quality control. In general, the content of impurities can be reduced by repeating the purification step, but on the other hand, the recovery rate of the purified material is inevitably reduced.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is an ultrapure C-ABC fraction that excludes chondroitinase (lyase II), which is physically and chemically similar to C-ABC used in pharmaceuticals and the like, to the extent that it cannot be detected analytically, and It is an object of the present invention to provide a method for producing this fraction in a simple, rapid and high yield.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve such problems, the present inventors have prepared an antibody for ultra-high purity purification of C-ABC, and to the extent that a similar enzyme cannot be detected at all by a unique method using this antibody. The present invention was completed by providing a C-ABC fraction purified to ultra-high purity.
[0006]
That is, the present invention provides a C-ABC fraction having the following properties (hereinafter also referred to as the present fraction).
(1) Lyase II is not detected by measuring with an immunoassay using an antibody against lyase II.
(2) The lyase II peak is not detected by high performance liquid chromatography (HPLC).
[0007]
This fraction is preferably derived from Proteus vulgaris, and more preferably produced by a production process including at least the following steps.
Step 1: A step in which a solid phase to which an antibody against lyase II is bound is contacted with a liquid phase containing C-ABC and lyase II, and lyase II is bound to a solid phase to which an antibody against lyase II is bound.
Step 2: A step of separating the solid phase and the liquid phase and recovering the liquid phase.
[0008]
The present invention also provides a medicament comprising the fraction of the present invention (hereinafter also referred to as the present medicament). The medicament of the present invention is preferably a treatment for disc herniation.
[0009]
Moreover, this invention provides the manufacturing method (henceforth this invention manufacturing method 1) of this invention fraction including the following processes at least.
Step 1: A step in which a solid phase to which an antibody against lyase II is bound is contacted with a liquid phase containing C-ABC and lyase II, and lyase II is bound to a solid phase to which an antibody against lyase II is bound.
Step 2: A step of separating the solid phase and the liquid phase and recovering the liquid phase.
[0010]
The present invention also includes a monoclonal antibody against lyase II (hereinafter also referred to as the present antibody 1), a monoclonal antibody against C-ABC (hereinafter also referred to as the present antibody 2), and a hybridoma strain that produces the present antibody 1 (hereinafter referred to as the present antibody 1). The present invention also provides a cell line 1) and a hybridoma strain that produces the present antibody 2 (hereinafter also referred to as the present cell line 2). Inventive antibodies 1 and 2 are also collectively referred to as “inventive antibodies”. Similarly, the cell lines 1 and 2 of the present invention are collectively referred to as “cell lines of the present invention”.
[0011]
In addition, the present invention is characterized by using the inventive antibody 1, a lyase II measuring method (hereinafter also referred to as the present measuring method 1), and using the present invention antibody 2, C-ABC The measurement method (hereinafter also referred to as the measurement method 2 of the present invention) is provided. In addition, this invention measuring method 1 and 2 are collectively called "this invention measuring method".
Furthermore, the present invention provides a method for producing the fraction of the present invention comprising the step of detecting lyase II by the measurement method 1 of the present invention, and a method for producing the fraction of the present invention comprising the step of detecting C-ABC by the measurement method 2 of the present invention. (Hereinafter, these are collectively referred to as the production method 2 of the present invention).
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<1> Inventive fraction The invented fraction is a high-purity C-ABC fraction having the following properties.
(1) Lyase II is not detected by measuring with an immunoassay using an antibody against lyase II.
(2) The lyase II peak is not detected by HPLC.
[0013]
The immunoassay method used in the above (1) is preferably “the present invention measurement method 1” described later. This will be described in the following “<5> Measurement method of the present invention” including preferred specific examples.
[0014]
The fraction of the present invention is characterized in that lyase II is not detected even when measured by such an immunoassay. Here, “not detected” means below the detection limit in the above measurement.
[0015]
The conditions of the HPLC method used here are as follows.
-Column carrier: carrier having carboxymethyl (CM) group-Column size: 7.5mm x 7.5cm
-Eluent: (A solution) 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)
(B solution) A solution linear concentration gradient containing 0.5 M NaCl (100% A solution → 50% B solution) / 15 min flow rate: 1.0 mL / min, column temperature: 35 ° C
・ Sample injection volume: 100 μL
The fraction of the present invention is characterized in that the peak of lyase II is not detected even by analysis by such HPLC. Further, the fraction of the present invention is preferably substantially free of substances that are not allowed to be mixed as a pharmaceutical, and is preferably a fraction having an enzyme activity of 300 units / mg protein or more. More specifically, a fraction having a specific activity of 300 units / mg protein or more, substantially free of endotoxin, and having a nucleic acid and protease content below the detection limit is particularly preferred. In this specification, “1 unit (1U)” of C-ABC means the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin sulfate C per minute at pH 8.0 and 37 ° C. To do.
[0016]
The fraction of the present invention may be produced by any production method as long as it has the above characteristics, but is preferably produced by the production method 1 of the present invention described later.
[0017]
Further, the fraction of the present invention may be derived from any biological resource. However, in the production method 1 of the present invention, it is preferable to use a liquid phase derived from Proteus vulgaris. A portion derived from Proteus vulgaris is also preferable.
[0018]
<2> Invention Drug The drug of the present invention is a drug comprising the fraction of the present invention. Although the use of the medicament of the present invention is not particularly limited, the possibility of using C-ABC as a therapeutic agent for intervertebral disc herniation has been strongly suggested (US Pat. No. 4,696,816). Use is preferred.
[0019]
The specific use of the treatment for intervertebral hernia is not limited as long as it is used for the treatment of intervertebral disc herniation.For example, it can be used for the treatment of intervertebral disc herniation. It can be injected into the intervertebral disc and used for intervertebral disc therapy where the nucleus pulposus is dissolved and treated.
[0020]
The dosage of the pharmaceutical of the present invention should be individually set according to the type of animal to be administered, sex, age, age, type of pathological condition, degree of progression of pathological condition, etc., and is not particularly limited, but the amount of C-ABC About 0.1 to 100 units can be injected at one time.
[0021]
The form of the pharmaceutical agent of the present invention is also appropriately set depending on the use and the like. For example, when used as a treatment for intervertebral hernia, it may be in the form of a solution, frozen or lyophilized. This can be filled and sealed in an appropriate container such as an ampoule, vial, or syringe for injection to obtain an injection.
[0022]
The pharmaceutical preparation of the present invention can be formulated by a known method. In addition, other pharmaceutical active ingredients, conventional excipients, stabilizers, bindings, etc. should be used as long as they do not adversely affect the activity of C-ABC itself and do not adversely affect the action of C-ABC. Ingredients usually used in medicine, such as agents, emulsifiers, osmotic pressure regulators, buffers, isotonic agents, preservatives, soothing agents, coloring agents, and the like can be used.
[0023]
Note that the safety and usefulness of known C-ABC fractions are already known, and in the present invention, they are also substantially free of lyase II, so it is estimated that they are extremely safe. The
[0024]
<3> Production method 1 of the present invention
This invention manufacturing method 1 is a manufacturing method of this invention fraction including the following processes at least.
Step 1: A step of bringing a solid phase to which the antibody 1 of the present invention (described later) is bound into contact with a liquid phase containing C-ABC and lyase II to bind the lyase II to the antibody 1 of the present invention.
Step 2: A step of separating the solid phase and the liquid phase and recovering the liquid phase.
[0025]
The antibody 1 of the present invention can be bound to the solid phase by a known method. For example, the antibody 1 of the present invention may be directly covalently bound to a solid phase, may be bound using biological affinity, or the antibody of the present invention bound using biological affinity may be bound to a solid phase. Further, it may be covalently bonded with a crosslinking agent or the like.
Examples of the solid phase include gels, beads, and membranes.
[0026]
Covalent bonding to the solid phase should be performed using, for example, a commercially available coupling gel (for example, CNBr-activated gel, N-hydroxysuccinimide activated gel, epoxy activated gel, maleimide activated gel, etc.), etc. Can do. Binding using biological affinity can be performed using a solid phase to which a ligand specifically recognizing the Fc portion of the antibody is bound, for example, a solid phase to which a ligand such as protein A or protein G is bound. The antibody 1 of the present invention is affinity-bound to such a solid phase, and further, dimethylpimelimidate (DMP), sodium diisothiocyanostilbene disulfonate (DIDS), maleimidobutyryloxysuccinimide (GMBS), maleimidocaproyloxy A divalent crosslinking agent such as succinimide (EMCS) or glutaraldehyde may be allowed to act to covalently bond the antibody 1 of the present invention and the ligand. Alternatively, the sugar chain present in the Fc portion of the antibody can be oxidized and aldehyded, and then solid-phased by covalently bonding to a gel having a hydrazine ligand.
[0027]
By bringing the liquid phase containing C-ABC and lyase II into contact with the solid phase thus prepared (the solid phase to which the antibody 1 of the present invention is bound), the lyase II present in the liquid phase is fixed. Liase II in the liquid phase can be removed by binding to the antibody 1 of the present phase and separating the solid phase and the liquid phase. The origin of the liquid phase (containing C-ABC and lyase II) to be brought into contact with the solid phase is not particularly limited, but for example, it is a liquid phase derived from a culture of Proteus vulgaris ( Proteus vulgaris ). Preferably there is. Proteus vulgaris is extremely useful for mass production of C-ABC, but also produces lyase II. Therefore, the production method of the present invention is extremely useful when producing a large amount of C-ABC fraction substantially free of lyase II from Proteus vulgaris. In the present invention, the term “derived from Proteus vulgaris” does not necessarily mean only a culture of Proteus vulgaris, etc., but a combination other than the same strain created using the C-ABC gene of Proteus vulgaris Even those derived from a replacement organism are included as long as lyase II is mixed.
[0028]
When a liquid phase derived from Proteus vulgaris is used as the liquid phase to be brought into contact with the solid phase, it is preferable that the liquid phase is purified as highly as possible. Specifically, it shows a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a single peak in HPLC (gel filtration and cation exchange), substantially free of endotoxin, and has a nucleic acid and protease content. A liquid phase containing C-ABC that is below the detection limit, can be crystallized, and purified to have a specific activity of 300 U / mg or more is preferable. Such a liquid phase can be produced, for example, by the method described in JP-A-6-153947. Although this liquid phase itself is highly safe and can be used as a pharmaceutical product, lyase II can be substantially completely removed by subjecting it to the production method of the present invention. It can be easier and more complete.
[0029]
The contact method between the solid phase and the liquid phase is particularly limited as long as the molecule of the antibody 1 of the present invention bound to the solid phase is brought into contact with the lyase II molecule in the liquid phase and the molecule is captured on the solid phase. However, either a batch method or a column method can be used. When the solid phase and the liquid phase are brought into contact with each other by such a method, only lyase II in the liquid phase binds to the antibody 1 of the present invention bound to the solid phase. Thereafter, the fraction of the present invention can be obtained by separating the solid phase and the liquid phase and collecting the liquid phase.
[0030]
Separation of the solid phase and the liquid phase can be performed by ordinary solid-liquid separation means. For example, when the contact between the solid phase and the liquid phase is performed by a batch method, the solid phase can be separated and removed by precipitation, centrifugation, filtration, or the like. When the contact between the solid phase and the liquid phase is carried out by the column method, it is only necessary to collect the liquid phase eluted from the column, so that it can be operated simply and rapidly. In this regard, the contact between the solid phase and the liquid phase is preferably performed by a column method.
The liquid phase thus obtained may be further subjected to the production method of the present invention, thereby ensuring the certainty and completeness of lyase II removal.
[0031]
<4> Cell Line of the Invention, Antibody of the Invention The antibody of the invention is a monoclonal antibody against lyase II (invention antibody 1) and a monoclonal antibody against C-ABC (invention antibody 2).
The cell lines of the present invention are a hybridoma strain that produces the antibody 1 of the present invention (the cell line 1 of the present invention), and a hybridoma strain that produces the antibody 2 of the present invention (the cell line 2 of the present invention).
[0032]
The antibody of the present invention can be prepared by a known method for preparing monoclonal antibodies (Kohler and Milstein, Nature 256, p495-497 (1975)). Specifically, it can be performed by the following method.
The antigen is administered intraperitoneally, subcutaneously, or footpad of an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, hamster or the like. Here, lyase II is used as the “antigen” in order to obtain the cell line 1 of the present invention, and C-ABC is used as the “antigen” in order to obtain the cell line 2 of the present invention.
[0033]
Thereafter, the spleen or popliteal lymph nodes are removed, and antibody producing cells collected from these are fused with myeloma cells, which are tumor cell lines, to establish hybridomas.
[0034]
In addition to spleen cells, lymph node cells and lymphocytes in peripheral blood can also be used as cells used for cell fusion. The myeloma cell line is preferably of the same type as that of a different type from that of the antibody-producing cell, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
[0035]
The resulting hybridoma is continuously propagated, and from this hybridoma, a cell line that continuously produces an antibody that specifically reacts with lyase II but does not react with C-ABC, or reacts specifically with C-ABC. A cell line that continuously produces antibodies that do not react with lyase II is selected. The cell line 1 of the present invention is obtained by repeating the former selection, and the cell line 2 of the present invention is obtained by repeating the latter selection.
[0036]
As the cell line 1 of the present invention, K15G11 (G2) is preferable. Further, as the cell line 2 of the present invention, 7B11A is preferable. These cell lines were established by the present inventor as hybridoma strains producing the antibodies 1 and 2 of the present invention. On September 26, 2000, the biotechnology industry of the Ministry of International Trade and Industry Deposited at the Technical Research Laboratories under the accession numbers of FERM P-18054 and FERM P-18055, respectively.
[0037]
The antibody 1 of the present invention can be produced by culturing the cell line 1 of the present invention in an appropriate medium and collecting it from the culture supernatant. Similarly, the antibody 2 of the present invention can be produced by collecting from the culture supernatant of the cell line 2 of the present invention. The antibody of the present invention can also be produced by culturing the cell line of the present invention in a living body such as the abdominal cavity of a mouse and collecting ascites.
[0038]
The antibody of the present invention has an affinity using salting out with sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., low temperature alcohol precipitation and selective precipitation fractionation with polyethylene glycol or isoelectric point, electrophoresis, ion exchange chromatography, protein A, protein G, etc. It can also be purified by chromatography, hydroxyapatite chromatography, immunoadsorption chromatography in which an antigen is immobilized, gel filtration, ultracentrifugation, or the like.
[0039]
The antibody 1 of the present invention is a monoclonal antibody against lyase II, and the antibody 2 of the present invention is a monoclonal antibody against C-ABC. The antibody 1 of the present invention preferably reacts specifically with lyase II and does not react with C-ABC. The antibody 2 of the present invention reacts specifically with C-ABC but does not react with lyase II. It is preferable.
[0040]
The antibody of the present invention can be used as it is, or a fragmented antibody can be used as long as it has a specific binding ability with an antigen. For example, it may be a fragment containing Fab obtained by treatment with a protease that does not degrade the antigen-binding site (Fab) of the antibody of the present invention (for example, plasmin, pepsin, papain, etc.). Further, once the nucleotide sequence of the gene encoding the antibody of the present invention or the amino acid sequence of the antibody is determined, a fragment containing the Fab of the antibody of the present invention or a chimeric antibody (for example, a chimeric antibody containing the Fab portion of the antibody of the present invention, etc.) Such fragments and chimeric antibodies are also encompassed by the antibody of the present invention.
[0041]
The class of the antibody of the present invention is not particularly limited, but is preferably IgG and more preferably IgG1. Further, the type of the L chain is not limited, but is preferably κ type.
[0042]
The antibody 1 of the present invention preferably has a binding constant (Kd) of 7.4 × 10 −8 M or less, and the antibody 2 of the present invention preferably has a binding constant (Kd) of 1.6 × 10 −7 M or less. The binding constant (Kd) can be measured by the method described in L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering BD Hames (Ed) pp. 77-96 Oxford University Press, New York.
[0043]
Such an antibody 1 of the present invention is preferably one produced by a hybridoma strain selected from K15G11 (G2). The antibody 2 of the present invention is preferably one produced by the 7B11A hybridoma strain.
[0044]
<5> Measurement Method of the Present Invention The measurement method of the present invention is characterized by using the measurement method of lyase II (the measurement method 1 of the present invention) characterized by using the antibody 1 of the present invention and the antibody 2 of the present invention. This is a C-ABC measurement method (measurement method 2 of the present invention). The concept of “measurement” here includes not only measuring the amount of the target substance but also determining or testing the presence (presence) of the target substance.
[0045]
The antibody 1 of the present invention is a monoclonal antibody that reacts with lyase II, and the antibody 2 of the present invention is a monoclonal antibody that reacts with C-ABC. The measurement method of the present invention applies such properties of the antibody of the present invention to the measurement of lyase II and the measurement of C-ABC.
[0046]
The measurement method of the present invention can be performed by an immunoassay method using the antibody of the present invention. An enzyme immunoassay method using an antibody labeled with an enzyme or biotin, a radioimmunoassay method using an antibody labeled with a radioisotope, a fluorescence method A usual immunoassay technique such as a fluorescent antibody method using a labeled antibody can be used. The labeling of the antibody of the present invention with these substances may be direct or indirect.
[0047]
As the immunoassay used here, a direct antibody method, an indirect antibody method, a competitive method, a two-antibody sandwich method, and the like can be used. In order to increase the detection specificity of the target substance, the two-antibody sandwich method is preferably used.
[0048]
As the solid phase used in the immunoassay, microtiter wells, agarose particles, latex particles, beads, tubes, membranes, and the like can be used. Although it can be selected appropriately according to the purpose, etc., when many samples are assayed simultaneously, it is preferable to use a microtiter well.
[0049]
Hereinafter, a specific example of the measurement method of the present invention will be described by taking “measurement method 1 of the present invention” as an example. The following method is a particularly preferred specific example of the measurement method 1 of the present invention, and is also a specific example of a preferable immunoassay for examining the properties of the above-mentioned “fraction of the present invention”.
(1) An anti-lyase II polyclonal antibody is immobilized on a microtiter well. In addition, the manufacturing method of an anti- lyase II polyclonal antibody is demonstrated in the below-mentioned Example.
(2) Place the fraction to be assayed in this microtiter well and incubate (Lyase II is bound to the immobilized anti-lyase II polyclonal antibody).
(3) After washing, biotin-labeled present antibody 1 is added and incubated (biotin-labeled present antibody 1 is bound to lyase II bound to the immobilized anti-lyase II polyclonal antibody).
(4) After washing, avidin-labeled peroxidase is added and incubated (biotin bound to the antibody 1 of the present invention and avidin bind).
(5) After washing, add enzyme substrate and incubate to develop color, and measure the degree of color development.
[0050]
The fraction of the present invention is characterized in that lyase II is not detected even when measured by such an immunoassay. Here, “not detected” means below the detection limit in the above measurement.
[0051]
As described above, the measurement method 1 of the present invention can also be used for assaying the presence and content of lyase II in the fraction of the present invention. Similarly, the measurement method 2 of the present invention can also be used when assaying the presence or content of C-ABC in the fraction of the present invention.
[0052]
<6> Production method 2 of the present invention
The production method 2 of the present invention comprises a method for producing a fraction of the present invention comprising a step of detecting lyase II by the measurement method 1 of the present invention, and a step of the present invention comprising a step of detecting C-ABC by the measurement method 2 of the present invention. Includes both manufacturing methods.
[0053]
The production method 2 of the present invention incorporates the “measurement method of the present invention” in the production process of the fraction of the present invention. The production method 2 of the present invention is preferably an embodiment in which the “measurement method of the present invention” is incorporated into the production method 1 of the present invention. More specifically, after the “step 2” in the production method 1 of the present invention, It is preferable that the invention measurement method is incorporated. In particular, it is preferable that the measurement method 1 of the present invention is incorporated after “Step 2” in the production method 1 of the present invention.
[0054]
In this way, the “measurement method of the present invention” is incorporated into the production process of the fraction of the present invention, and the “step of detecting lyase II and / or C-ABC by the measurement method of the present invention” is provided. If a fraction that does not satisfy is produced, it can be discovered and the fraction can be eliminated. Therefore, the production method 2 of the present invention can stably produce the fraction of the present invention that satisfies the predetermined quality.
[0055]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these.
<1> Production of the cell line of the present invention and the antibody of the present invention
(1) Production of cell line 1 of the present invention Known lyase II fraction (produced by the method described in JP-A-10-262660) 1 mg / ml was added to the same amount of Freund's Complete Adjuvant; Sigma And was emulsified. About 400 μl of this solution was injected subcutaneously into Balb / c mice in 2 to 3 divided doses. One week later, 1 mg / ml of a known lyase II fraction prepared in the same manner was mixed with the same amount of Freund's Incomplete Adjuvant (Sigma), and about 400 μl of an emulsified solution was injected subcutaneously. After another week, similarly, an emulsified solution of a known lyase II fraction and Freund's incomplete adjuvant was subcutaneously injected.
[0056]
After immunization, mouse spleen cells were collected and fused with mouse myeloma cell line (P3X63Ag8.635) by Kohler and Milstein method (Nature 256, p495-497 (1975)) to obtain a hybridoma. The hybridoma culture supernatant was assayed by immunoassay using lyase II and C-ABC as antigens to obtain a hybridoma strain that produced a monoclonal antibody that specifically bound to lyase II but did not bind to C-ABC. (K15G11 (G2) strain). The class of monoclonal antibodies produced by this hybridoma strain was IgG1, and the L chain was κ type. The monoclonal antibody produced by the K15G11 (G2) strain was named K15G11 (G2).
[0057]
(2) Production of the present cell line 2 A method similar to the above (1) using a known C-ABC fraction (produced by the method described in JP-A-6-153947) instead of lyase II A hybridoma strain was obtained. The hybridoma culture supernatant was assayed in the same manner as in (1) above to obtain a hybridoma strain that produces a monoclonal antibody that specifically binds to C-ABC but does not bind to lyase II (7B11A strain). The type of monoclonal antibody produced by this hybridoma strain was IgG1, and the L chain was kappa. The monoclonal antibody produced by the 7B11A strain was named 7B11A.
[0058]
The binding constant (Kd) of monoclonal antibodies K15G11 (G2) and 7B11A was determined by the method described in L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering BD Hames (Ed) pp. 77-96 Oxford University Press, New York. As a result of measurement, the results were as follows.
[0059]
K15G11 (G2) Kd = 7.4 x 10 -8 M
7B11A Kd = 1.6 x 10 -7 M
[0060]
(3) Production of polyclonal antibody A known lyase II fraction (1 mg / ml) was mixed with the same amount of Freund's complete adjuvant (Sigma) and emulsified. About 2 ml of this solution was injected subcutaneously into JW rabbits in 5-6 divided doses. One week later, about 2 ml of an emulsified solution obtained by mixing the known lyase II fraction with Freund's incomplete adjuvant (Sigma) was injected subcutaneously. After another week, similarly, an emulsified solution of a known lyase II fraction and Freund's incomplete adjuvant was subcutaneously injected.
[0061]
Serum was collected from the immunized rabbit, antibody titer was assayed by octalony, and rabbits with sufficiently elevated antibody titer were collected from the carotid artery and heart, and antiserum was obtained by centrifugation. Rabbits with low antibody titers were further immunized to obtain antisera in the same manner.
From the thus obtained anti-lyase II antiserum, an anti-lyase II polyclonal antibody specific for lyase II was purified as follows.
[0062]
Protein G Sepharose 4FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was suspended in a binding buffer (20 mM phosphate buffer, pH 7.8), and 10 ml of slurry was packed in the column. Further, the column was equilibrated with a 5-fold amount of binding buffer. Anti-lyase II antiserum diluted 5-fold with binding buffer was added to the equilibrated column. Furthermore, serum protein that did not bind to Protein G was removed by flowing a 5-fold amount of binding buffer. Next, elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.8) was passed through the column, and the eluate was collected as a 10 ml fraction. The eluate was immediately mixed with an appropriate amount of neutralization buffer (1M Tris-HCl, pH 9.0) to prevent denaturation of the eluted IgG. Absorbance (A280nm) of each fraction was measured, and fractions of 0.1 or more were pooled. Ammonium sulfate was added to this pool to a final saturation concentration of 50%. After leaving on ice for 30 minutes, the precipitate was recovered by centrifugation, and IgG was concentrated and purified. The resulting precipitate was dissolved in 0.1M bicarbonate buffer (pH 8.3) and dialyzed against 0.1M bicarbonate buffer (pH 8.3) for 3 days. The IgG solution obtained by dialysis is mixed with Affigel-10 (Bio-Rad) gel in which C-ABC is solid-phased and incubated, so that anti-C that may be contained in a trace amount in the solution. -ABC polyclonal antibody was removed by adsorption.
[0063]
As a result of reducing the purified anti-lyase II IgG polyclonal antibody or subjecting it to electrophoresis using SDS-14% polyacrylamide gel (Asahi Techno Glass) as it is, a single band composed of H chain and L chain is obtained. It was confirmed to be an antibody protein.
In addition, production, purification and confirmation of an anti-C-ABC polyclonal antibody specific for C-ABC from anti-C-ABC antiserum were performed in the same manner as described above.
[0064]
(4) Preparation of antibody-immobilized column An affinity column carrier on which an antibody was immobilized was prepared using Protein G binding gel (Pierce Chemical). 5 ml of 50 mM sodium borate buffer (pH 8.2) (hereinafter referred to as B / W buffer) was added to the column twice and equilibrated. 1 ml of purified anti-lyase II antibody (12 mg protein / ml) was diluted with 1 ml of B / W buffer and added to the column. The column was gently agitated at room temperature for 30 minutes to bind the protein carrier Protein G and the antibody Fc portion. Wash the column twice with 5 ml of B / W buffer, then add 6.6 mg / ml Dimethylpimelimidiate solution, gently invert the column for 60 minutes at room temperature, The antibody was cross-linked by covalent bond. After column washing, 5 ml of an amino group blocking buffer (0.1 M ethanolamine, pH 8.2) was added, and the mixture was gently agitated for 10 minutes at room temperature. The uncrosslinked antibody was then eluted with 5 ml of 0.1 M Glycine-HCl, pH 2.8. The column was washed twice with 5 ml of B / W buffer and stored in this state at 4 ° C. until next use.
[0065]
As a reagent, ImmunoPure Protein G Orientation Kit (Pierce Chemical) was used.
An anti-C-ABC antibody-immobilized column was prepared in the same manner.
[0066]
<2> Production of the fraction of the present invention All the production of the fraction of the present invention was carried out under endotoxin-free conditions.
Known C-ABC fraction (manufactured by the method described in JP-A-6-153947; endotoxin-free) About 20 ml was filtered through a 0.22 μm filter, and the anti-lyase II antibody prepared above was immobilized. It was added to the column (washed with 1% POELE solution in 5 times the volume of the column and equilibrated with endotoxin-free distilled water). The liquid dropped from the column (flow-through) was collected as 3 ml fractions, and the absorbance (A280 nm) was measured. Fractions with an absorbance of 0.1 or more were pooled, the same operation was repeated once more, and the flow-through was collected to obtain a C-ABC fraction.
[0067]
Further, a known lyase II fraction (produced by the method described in JP-A-10-262660) is passed through a column on which an anti-C-ABC antibody prepared in the same manner is immobilized, and lyase is similarly produced. II fraction was obtained.
[0068]
<3> Properties of the fraction of the present invention The contents of C-ABC and lyase II contained in each of the fractions obtained above were measured by immunoassay and HPLC. The measuring method is as follows.
(1) Immunoassay
(1-1) Preparation of biotin-labeled antibody The anti-C-ABC monoclonal antibody and the anti-lyase II monoclonal antibody obtained above were each prepared to 2 mg / ml with 50 mM bicarbonate buffer (pH 8.3). These solutions were mixed with Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce Chemical) and stirred gently at room temperature for 1 hour. In order to remove unreacted biotin from the labeled antibody obtained, it was dialyzed against 50 mM bicarbonate buffer for 2 days.
[0069]
(1-2) Measurement of C-ABC and lyase II by sandwich-immunoassay Prepare anti-C-ABC polyclonal antibody or anti-lyase II polyclonal antibody at 20 μg / ml with carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.4) Then, it was added to a 96-well microtiter plate (Nunc immunoplate) at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. Next, 200 μl / well of immunostabilizer (ABI) was added to the plate and incubated at 37 ° C. for 1.0 hour to prepare an antibody-binding plate.
[0070]
Separately, samples for measurement (C-ABC or lyase II obtained in <2>) were diluted to an appropriate concentration with phosphate buffered saline (PBS) to prepare C-ABC and lyase II standards. . Samples for measurement and standards were added to the antibody-binding plate prepared above at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. After incubation, the plate was washed 4 times with PBS-0.05% Tween20.
[0071]
The biotin-labeled anti-C-ABC antibody or biotin-labeled anti-lyase II antibody prepared in (1-1) above was diluted 2500-fold with PBS, added to the plate at 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the plate was washed 4 times with PBS-0.05% Tween20.
[0072]
Avidin-peroxidase (Sigma) was diluted 10,000 times with PBS, added to the plate at 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the plate was washed 4 times with PBS-0.05% Tween20.
[0073]
Substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (Moss, INC) was added to the plate at 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 10 minutes. 1M HCl was added to the plate at 100 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 450 to 630 nm was measured with a well reader SK601 (sold by Seikagaku Corporation).
[0074]
(2) HPLC method The conditions such as HPLC column, elution solvent, and flow rate were as follows.
[0075]
・ Column: TSKgel CM-5PW (7.5 mmx7.5 cm; manufactured by Tosoh Corporation)
-Eluent: (A solution) 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)
(Solution B) Solution A containing 0.5 M NaCl, linear gradient (100% solution A → 50% solution B) / 15 minutes, flow rate: 1.0 mL / minute, column temperature: 35 ° C
・ Sample injection volume: 100 μL
[0076]
(3) The analysis results of the C-ABC fraction (the fraction of the present invention) obtained in <2> above are shown below. “ND” indicates that it was not detected (below the detection limit).
(3-1) Immunoassay [0077]
[Table 1]
(3-2) HPLC method (relative value of peak area of A280nm detection chart)
[0079]
[Table 2]
(The lyase II peak was detected at an elution time of around 15.73 minutes)
From this result, it became clear that the method of the present invention can efficiently remove lyase II to below the detection limit without substantially reducing the yield of the purified product.
The analysis results of the lyase II fraction obtained in <2> above are shown below.
[0081]
The lyase II content was measured by HPLC, and the C-ABC content was measured by immunoassay. The numerical value in parenthesis indicates the weight ratio of C-ABC content to lyase II content.
[0082]
[Table 3]
From these results, it has been clarified that even when the method of the present invention is applied to the purification of the lyase II fraction, the C-ABC content can be efficiently removed to near the detection limit without substantially reducing the yield of the purification target product.
[0084]
【The invention's effect】
The fraction of the present invention is an ultrapure chondroitinase fraction that excludes lyase II that is physicochemically similar to C-ABC used in pharmaceuticals and the like to an extent that it cannot be detected analytically. It is extremely useful because it facilitates the analysis and quality control of ABC preparations. The medicament of the present invention comprising such a fraction of the present invention is not only useful as a treatment for, for example, disc herniation, but also extremely useful as a medicament capable of easily performing analysis and quality control.
[0085]
The production method 1 of the present invention is extremely useful because the fraction of the present invention can be produced simply, rapidly and in a high yield. The antibody of the present invention can be used in the production method 1, the measurement method and the production method 2 of the present invention. Therefore, it can be used for the production / process control of the fraction of the present invention, the analysis / quality control of the produced fraction of the present invention, and the like, and is extremely useful. The cell line of the present invention can be used for the production of the antibody of the present invention and is extremely useful.
Claims (4)
工程１：コンドロイチン硫酸リアーゼStep 1: Chondroitin sulfate lyase IIII に特異的に結合する抗体を結合させた固相と、コンドロイチナーゼＡＢＣとコンドロイチン硫酸リアーゼA solid phase bound with an antibody that specifically binds to chondroitinase ABC and chondroitin sulfate lyase IIII とを含有する液相とを接触させ、コンドロイチン硫酸リアーゼIn contact with a liquid phase containing a chondroitin sulfate lyase IIII をコンドロイチン硫酸リアーゼChondroitin sulfate lyase IIII に特異的に結合する抗体を結合させた固相に結合させる工程。A step of binding to a solid phase to which an antibody that specifically binds to is bound.
工程２：固相と液相とを分離し、液相を回収する工程。Step 2: A step of separating the solid phase and the liquid phase and recovering the liquid phase.
（製造されるコンドロイチナーゼＡＢＣ画分の性質）(Properties of the chondroitinase ABC fraction produced)
（１）コンドロイチン硫酸リアーゼ(1) Chondroitin sulfate lyase IIII に特異的に結合する抗体を用いた免疫測定法で測定することにより、コンドロイチン硫酸リアーゼChondroitin sulfate lyase by measuring with an immunoassay using an antibody that specifically binds to IIII が検出されない。Is not detected.
（２）高速液体クロマトグラフィーにより、コンドロイチン硫酸リアーゼ(2) Chondroitin sulfate lyase by high performance liquid chromatography IIII のピークが検出されない。No peak is detected.
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