JP3847053B2 - 血液分析装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液を採取し、血液中の赤血球、白血球、リンパ球、血小板、血液凝固因子などを分離し、その結果得られた血清などのｐＨ値、酸素あるいは二酸化炭素などの濃度を測定する血液分析方法ならびに装置に関する。特に前述の操作に必要な機能、構造のすべてが一つのデバイス内に集積されており、さらにそのデバイスが小さく、その取り扱いに専門の医学の知識、資格を必要とせず、簡易に上述の血液分析を行うことを特徴とするヘルスケアデバイスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
人の健康状態や疾病を診断する電子的な装置として、体温計、血圧計、超音波診断、X線ＣＴ、ＭＲＩなどの他に、血液自動分析装置がある。これは、数ミリリットルの血液を採取し、遠心分離器を用いて、赤血球、白血球、リンパ球、血小板、血液凝固因子を分離して得られた血清を、多数の試験管に分け、各試験管を一列に並べて動かし、ケミカルセンサにより、ｐＨ、酸素、二酸化炭素などの各濃度を測定する他、各試験管の血清に酵素などの試薬を入れ、血清中の基質との発光反応の分光や吸収分光を行い、データをコンピュータで処理して人体を診断することに用いられている。
【０００３】
また、血液あるいは人体組織の分析、測定方法に関する技術として、以下に述べる開発がそれぞれ行われている。まず、血清のような溶液中の混入物質の測定法としては、キャピラリ電気泳動法が一般に用いられている。本方法を図1により説明する。１０１は石英管であり、１０２は正電極であり、１０３は負電極である。例えば、直径０．１ｍｍ程度のキャピラリと呼ばれる細長い石英管１０１の中に電解液を入れる。一般に、石英管の場合、その内壁表面には負の電荷を生じるため、電解液中のカチオン(正電荷のイオン)は負電荷とのク−ロン力により、石英の内壁に集まり、いわゆるヘルムホルツの二重障壁１０４を形成する。そこで、このキャピラリの両端に設けた電極１０２，１０３に高電圧を印加すると、まず、負電圧１０３側に、内壁のカチオン１０５が引っ張られ、移動すると、粘性により電解液全体も負電圧１０３側に移動する。この流れを電気浸透流１０６と呼ぶ。一方、電解液中のカチオンは最も早く負電極１０３側に到達し、中性種１０７は電気浸透流１０６により次に到達し、そしてアニオン１０８(負イオン)は、本来正の電圧側１０２に引っ張られるが、電気浸透流１０６により負電圧１０３側に移動し、従って最も遅れて到達する。このアニオンやカチオンが電界により移動する流れを電気泳動流１０９と呼ぶ。
【０００４】
また、最近、ＤＮＡの分析に関して、以下に述べる方法が研究されている。すなわち、前述のキャピラリを石英板や高分子板に形成し、蓋をして、数ｃｍ角のチップ上に製作したマイクロキャピラリと呼ばれるものがある。例えば、ＤＮＡなどを中性ゲル中にいれ、ＤＮＡは電荷を有するので電気泳動により移動させ、分子量の相違による総電荷相違により分離する。また、本方法は、マイクロキャピラリ中を移動する物質に途中から他の試薬を入れ、その反応を検出するような従来の試験管方式と異なる反応検出法が盛んに研究されている[例えば、馬場嘉信; 蛋白質 核酸 酵素、45巻、1号(2000)76-85頁]。これは、マイクロ全分析システム(μ−ＴＡＳ; total analysis system)やチップ上研究室(Lab-on-Chip)と呼ばれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述の血液自動分析装置は、一般には血液センターや病院で用いられ、高価、且つ大規模であり、しかも全診断に数時間を要する。通常これらの血液分析は、疾病の原因究明あるいは健康体においても一年に一回程度受ける健康診断などの際に実施されるため、一回の分析によって種々の情報をそれぞれ精緻に得ることを目的としている。しかし、昨今大気温暖化や内分泌かく乱物質などの環境悪化により日々人間の健康が蝕まれており、より高い頻度で血液検査を行い健康状態の管理を行うことが、重大な疾病への進展を予防するために必要とされる。このような日々の健康管理を目的とした血液検査には、高々血液中のｐＨ，酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などのいわゆる健康マーカーを呼ばれるものの濃度などを測定するだけで足りるものである。先述のような高価、大規模な血液分析装置を用いた精緻な検査までは必要なく、分析項目を絞った簡素な装置が必要とされていた。
【０００６】
また、最近、寝たきり老人の増加にともない、その健康管理が課題となっているが、このような人にとって、頻繁に病院等に通い検査を受けることは困難であり、在宅のまま健康管理を行う手段が必要とされている。現在の血液検査方法では、採血は医師など有資格者にかぎられており、要介護老人の介護の担い手であるヘルパーではできない行為である。そこで、一般の人でも、採血を含めて手軽に取り扱える血液分析装置が必要とされていた。また、血液検査を頻繁に行うためには、採血の際に苦痛を伴なわないことが望ましく、また、注射針による皮膚の変色など人体への影響も極力抑えることが望ましい。
【０００７】
以上に述べたような家庭で手軽に取り扱える血液分析装置を実現するためには、装置本体が小型でなければならない。そのためには、血液分析に必要となる採血、濾過、分離、分析などの機能がコンパクトに一体化されている必要がある。血液等の分析技術に関しては、前述したような、個々の技術開発は行われているものの、それら技術を取り入れ血液分析装置として一体化するための集積技術はこれまで得られていなかった。
【０００８】
本発明は以上のような事情に鑑みなされたものであり、血液分析に必要となる採血、血漿分離、分析などの機能をコンパクトに一体化することを実現し、家庭で手軽に取り扱えるようにして日々の血液検査を実施可能として、健康管理、疾病の早期発見に大きく貢献する血液分析装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
このような本発明の目的は、血液中の物質を分析するセンサを有する基板を備える血液分析装置において：
(a) 基板上に形成された溝状構造物を蓋をしてなるマイクロキャピラリ流路と；
(b) 前記マイクロキャピラリ流路に血液を取り入れる採取手段と；
(c) 前記マイクロキャピラリ流路の前記採取手段の下流にマイクロキャピラリ流路の一部をＵ字状に形成して設けられた分離手段であって、基板ごと遠心することにより、分離手段内で血液から血漿を分離する分離手段と；
(d) 前記マイクロキャピラリ流路の前記分離手段の下流に設けられ、前記センサを有する分析手段と；
(e) 前記マイクロキャピラリ流路に設けられ、前記分離手段のＵ字状流路の下流側に位置する血漿を前記分析手段に移動させる移動手段と；
(f) 前記センサからの情報を基板外部に取り出すための出力手段：
を備えることを特徴とする血液分析装置、により達成される。
【００１０】
採取手段に中空の針を設けた場合には、これを体内に刺して基板内に血液を取り入れることができる。
【００１１】
移動手段は、分析手段より下流側に設置することができる。また、この移動手段はマイクロキャピラリ流路に設け２個の電極とし、両電極間に印加した電圧によって生じる電気泳動流により、マイクロキャピラリ流路内の血液、血漿又は血清を移動させることができる。この場合、マイクロキャピラリ流路上流側の電極を接地するのが好ましい。
【００１２】
センサとしては、血清中のｐＨ値、酸素濃度、二酸化炭素濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、カルシウム濃度、グルコース濃度、乳酸濃度の何れかを分析するケミカルセンサが使用できる。
【００１３】
採取手段の下流側でかつ分離手段の上流側に位置するマイクロキャピラリ流路に、採取手段により採取した血液をろ過して血漿を得るろ過手段を設けてもよい。
【００１４】
ろ過手段は複数のスリットを備えたものとして、この複数のスリットを形成する微細溝の幅が、マイクロキャピラリ流路の上流から下流に向かって次第に小さくなるようにしてろ過作用を発揮させることが出来る。
【００１５】
マイクロキャピラリ流路の溝状構造物は幅１０〜１５０μｍ、深さ１０μｍ〜１５０μｍとするのが好ましく、またマイクロキャピラリ流路の内壁が、濃度０．２５〜１．０ｗｔ％のＭＰＣポリマー（ 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine ）が塗布されているのが好ましい態様である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
図２に本発明に基づく装置の概略図を示す。２０１は基板であり、本装置の各手段は本基板をエッチングにより製作されたマイクロキャピラリ流路に沿って配置される。このマイクロキャピラリ流路の内壁表面にはＭＰＣポリマー（2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine）の被覆が設けられており、血漿や血清中のタンパク質のマイクロキャピラリ流路表面上での凝固、付着を防止する。２０２は血液の採取手段である。２０３は中空の針であり、採取手段に付属する。この針を体内に刺して基板内への血液の取り入れ口とする。２０４、２０５は電極であり、この電極間に印加した電圧のため生じる電気泳動流による吸引力によって、体内より基板内に血液を取り入れる。
【００１７】
２０６は血液の濾過手段であり、血液の流れの上流から下流に向かって、次第に間隔の狭くなる複数のスリットを有する。このスリットにより、血液中の赤血球、白血球、リンパ球、血小板を濾過して取り除き、濾過手段の下流側に血漿を得る。２０７は分離手段であり、例えばＵ字型のマイクロキャピラリからなる。採取した血液を濾過して得られる血漿をこのＵ字型のマイクロキャピラリ流路に導いた後、本基板を遠心分離器により一定方向に加速度を加えることによって、Ｕ字部に血漿より凝固因子を分離除去した血清が得られる。２０８は分析手段であり、血液中のｐＨ値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度を測定するためのセンサを有する。
【００１８】
２０９は採取手段、濾過手段、分離手段、分析手段のそれぞれを接続する流路手段であり、基板をエッチングして製作したマイクロキャピラリ溝（溝状構造物）に蓋をしてなるマイクロキャピラリ流路からなる。２１０はマイクロキャピラリ流路中で血液を電気泳動法により移動させるための移動手段である。２１１は分析手段から情報を取出すための出力手段であり、電極などから構成される。２１２は、以上の採取手段、濾過手段、分離手段、分析手段、移動手段、出力手段を必要に応じて制御するための制御手段である。図２には示していないが、基板上のマイクロキャピラリ溝内に血液を保持しておくための板（蓋）（図５の５０４）は、基板２０１（５０１）に接着あるいは圧着されている（図５参照）。
【００１９】
採取手段２０２により採取された血液は、濾過手段２０６にて濾過され血漿となり、さらに分離手段２０７にて凝固因子を分離除去して血清が得られ、これを分析手段２０８においてｐＨ値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度を測定する。各手段間の血液の移動は、電気泳動法を用いた移動手段２１０により行う。
【００２０】
【第１実施例】
本実施例の装置は図２に示したものと同様であり、符号は前述のものを使用する。以下、各手段ごとに説明する。まず、図３、図４を用いて血液の採取手段２０２に付属する針の製造法について説明する。図３の上段に針を製作する際に芯材として使用する石英の製造方法を示す。３０１は芯材の石英棒であり、これをバーナー３０２により加熱して軟化させたのち引き延ばして、先端の径を１０μｍ以下になるようにして切断した。次に、図３の下段に示すような抵抗加熱ヒータ３０４を有する電気炉３０５を予め８００℃に加熱してから、前述の要領で製作した石英の芯材３０３を炉の中に置き、その後処理ガス３０６として三塩化燐（ＰＯＣｌ3）と酸素を電気炉３０３中に流す。その結果、芯材３０３の表面には燐ガラス（Ｐ2Ｏ5）３０８が形成される。なお３０７は排気である。次に、表面に燐ガラスを掲載したさらにその上にステンレスを堆積する方法についてのべる。図４にこの処理を行う装置を示す。４０１はステンレス製の円筒真空容器であり、円筒真空容器４０１の外周には、一対のリング状磁石４０２が約１ｃｍ離して設置されており、Ｎ極とＳ極が形成されている。このとき、円筒真空容器４０１の内壁には数１０から数百ガウスの磁場が生じている。この円筒真空容器４０１内に表面に燐ガラスを形成した石英の芯材４０３を置き、Ａｒガスを２０ｓｃｃｍを流して、圧力を１０ｍＴｏｒｒとした。この状態において電源４０４を用いて円筒真空容器４０１に負の高電圧を印加し、容器内でマグネトロン放電４０５を生じさせる。放電を２０分間行うことにより、芯材４０３の表面には厚さ約１０μｍのステンレス堆積膜４０６が形成された。なお、マグネトロン放電の際に円筒真空容器４０１の温度が上昇することを抑えるために水冷パイプ４０７と冷却板４０８によって円筒真空容器４０１を冷却した。この後、この芯材４０３を３０〜６０度の角度に固定し、研磨し、鋭利な針先を形成する。次に、この芯材４０３を緩衝フッ酸液に入れ、燐ガラスのみを高速でエッチングすることにより、ステンレス堆積物は芯材４０３から除去され、長さが約１ｃｍのステンレスの中空な針が得られる。このような極細のステンレスの針は、先端の約１ｍｍの部分を残し、他の部分の周囲をシリコンラバーなどで覆い、補強、保護とする。さらに、この針を基板の採取手段の端部に当る注入口に接着剤を用いて貼り付けて使用する。以上に述べたようにして製作した針は、先端の径が微細であることから、皮膚に刺したところ、神経に当らずに皮膚を突き通し血管まで達するため、痛みを感じなかった。なお、芯材４０３の材料は石英に限らず、ガラスあるいは高分子などでもよい。また、円筒真空容器４０１はステンレス以外の金属を用いても良い。
【００２１】
次に、基板内の各手段を形成するマイクロキャピラリ流路の製作方法を、図５を用いて説明する。例えば、厚さ０．５ｍｍで２ｃｍ角の石英板５０１を用意し、まず、（１）石英板５０１上にクロム（Ｃｒ）膜５０２を約１μｍの厚さでスパッタ法で堆積する。次に、（２）Ｃｒ膜５０２上にホトレジスト５０３を塗布し、光露光で約３０μｍ幅の抜けパターンを形成する。（３）このＣｒ膜５０２を湿式又はドライ法によりエッチングする。ドライ法では、Ｃｌ2ガスを一巻アンテナを用いたＩＣＰ（誘導結合プラズマ）で放電し、アンテナより１８〜２０ｃｍの下流域（ダウンストリーム）でＣｒ膜５０２をエッチングする。本エッチング法は、特願平１１−１２４７０９による方法を用いている。そして、（４）このＣｒ膜５０２をマスクに、Ｃ4Ｆ8とＳＦ6を８５対１５の比で混合したガスをＩＣＰにより放電し、１３．５６ＭＨｚの高周波バイアスを印加した電極上に石英板５０１を載置し、下地の石英板５０１を垂直の壁を有するようにエッチングし、キャピラリ溝（溝状構造物）を形成する。その際の条件は、アンテナに導入した１３．５６ＭＨｚの電力は５００Ｗであり、高周波バイアス用の１３．５６ＭＨｚの電力は５Ｗ、圧力は１０ｍＴｏｒｒとした。
【００２２】
その後、（５）Ｃｒ膜５０２を湿式法で除去し、（６）血液や緩衝液の注入口や出口用の孔を超音波加工により開口したもう一枚の石英板５０４を用意して、キャピラリ溝を設けた石英板５０１と共に、１％ＨＦ（フッ酸）に侵した後、両板を重ね合わせ、１．３ＭＰａの圧力で２４時間押し付けた。この石英板５０４は溝状構造物を覆う蓋となり、これによりマイクロキャピラリ流路を形成する。
【００２３】
最後に、（７）白金等の電極５０５を、上記の注入口や出口などに蒸着などの方法で形成し、マイクロキャピラリチップが出来上がる。（４）の工程で形成されたマイクロキャピラリ溝を有する石英板を成形型として用い、ポリエチレン等の高分子膜に適当な温度でモールド形成してマイクロキャピラリ溝を製作してもよい。更に、石英板を用いずに、高分子板に直接マイクロキャピラリ溝（溝状構造物）を形成し、蓋も高分子で形成しても良い。
【００２４】
次に、血液の採取手段において血液をマイクロキャピラリ流路中に引き込む方法、ならびに、移動手段においてマイクロキャピラリ流路中で血液を移動させる方法を図６を用いて説明する。用いたマイクロキャピラリ流路を図６に示すグラフ中に示す。これは、前述の製造方法により製作した石英板内のマイクロキャピラリ流路の一部を示したものである。このマイクロキャピラリ流路のキャピラリ溝は幅が約３０μｍ、深さが約３０μｍである。このマイクロキャピラリの全域をｐＨ７．４の燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした後、Ａ−Ｃ間に高電圧を印加し、そのときの電圧−電流特性をイオン強度を変えて測定した結果を図６のグラフに示す。グラフ中で「低速」とは１５秒毎に５０Ｖを印加した結果であり、「高速」とは一秒間に７０Ｖの電圧を印加した結果である。「低速」の場合は、電圧印加と共に電流が急激に流れ始め、特に高イオン強度の場合は激しい。これは、電流が流れることによりジュール加熱が起こり、緩衝液の移動度が増加するためと説明されている。一方、「高速」で電圧を上昇させると線形関係を示す。従って、急激に電圧を上げると、緩衝液の温度が上昇せずに正イオンが高速で移動することを意味する。すなわち、「高速」モードを用いると電気浸透流により、液を動かすポンプ作用が得られることを示している。
【００２５】
この電気浸透流のポンプ作用による吸引力の測定について述べる。図７にポンプ作用の吸引力測定を行ったマイクロキャピラリ流路を示す。これは、先に述べた方法で製作した石英板の一部を取出して図示したものである。このマイクロキャピラリ流路の溝は幅が約３０μｍ、深さが約３０μｍである。まず、マイクロキャピラリ流路全域７０１をｐＨが７．４の燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした。そして電極Ａ７０２と電極Ｂ７０３に高電圧を印加すると、ＰＢＳが電極Ａ側に電気浸透流により移動し、入り口Ｃ７０４から空気７０５が注入される。マイクロキャピラリ流路中に侵入した空気７０５の先端をピストン７０６を用いて、入り口Ｃ７０４まで引き戻したときの圧力を圧力計７０７で測定した。その結果、このときの電気浸透流のポンプ作用による吸引力６×103Ｐａであることがわかった。
【００２６】
次に血液の濾過手段について説明する。図８は、先に述べた方法で製作した石英板の中から採取手段と濾過手段を取出して図示したものである。８０１は血液の採取手段とろ過手段であり、下段にその拡大を示す。８０２は注入口であり、端部に針８０３が接着により取り付けられている。８０４はろ過手段であり、内部には図に示すような石英板のエッチング加工により形成した多段階の微細溝を有する。ここで用いた石英板では、注入口８０２側より、１０μｍ幅溝８０５、８μｍ幅溝８０６、６μｍ幅溝８０７、４μｍ幅溝８０８、２μｍ幅溝８０９、１μｍ幅溝８１０を設けてある。電極Ａ８１１、電極Ｂ８１２に電圧を印加し、前述したように電気浸透流のポンプ作用により、血液を針８０３から採取し、次にろ過手段を通過させた。その結果、ろ過手段の下流には、ほとんど赤血球の混入が無い血漿８１３が得られた。
【００２７】
次に、血液からろ過手段を通して得られた血漿より、更に遠心分離によりマイクロキャピラリ流路内で凝固因子を分離し血清を得る分離手段と分離方法を、図９を用いて説明する。Ｕ字型のマイクロキャピラリ流路９０１の一方は針を付属した注入口９０２と結合している。また、電気浸透流ポンプ９０３を有し、高電圧を印加するための電極Ａ９０４と電極Ｂ９０５が設けてある。電極Ａ９０４と電極Ｂ９０５の間に電界約１ｋＶ／ｃｍを印加し、針９０２よりＵ字型のマイクロキャピラリ流路９０１に血液を導入した。このとき、感電を避けるため、電極Ａ９０４側を接地した。そして、図１０に示す簡易型遠心分離器１００１に、図９のマイクロキャピラリ流路を含む石英板１００２を、図９に示した矢印の方向により大きな加速度がかかるように取り付け回転させた。５０００ｒｐｍの回転速度で３０分回転した後に、Ｕ字型キャピラリ流路９０１の図９に示した矢印の向きと反対側のＵ字管部分に血清を得た。
【００２８】
以上述べた採取手段、ろ過手段、分離手段、流路手段、分析手段の構造を構成する要素であるマイクロキャピラリ流路は石英で製作されている。そのため、血液や血漿や血清のような生体物質をマイクロキャピラリ流路内に導入すると、内壁にタンパク質が凝固したり吸着するため、キャピラリ流路が細くなったり、極端な場合は詰まったりする現象が見られる。この凝固や付着を防止するために、マイクロキャピラリ流路の内壁に、ＭＰＣポリマー(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine)をコートした。ＭＰＣポリマーは、石原らにより発明された（特許第２９４７２９８号）が、これは我々生物の生体膜を構成している材料と類似の材料から人工的に合成した高分子である。従って、タンパク質吸着を抑制し、生体との好ましくない反応を阻止する極めて優れた効果を示す。
【００２９】
図１１のグラフ中に示すマイクロキャピラリ流路を用いて、ＭＰＣポリマーのマイクロキャピラリ内壁へのコートの有無、及び内壁にコートするＭＰＣポリマーの濃度に対するタンパク質等の凝固、付着防止効果を示す。マイクロキャピラリ溝の幅は約３０μｍ、深さは約３０μｍである。まず、マイクロキャピラリ流路内をｐＨ＝７．４、イオン強度 ０．１６の燐酸緩衝液で満たし、キャピラリ端Ａに牛血清を注入後、速やかにＡ−Ｃ間に種種の高電界を印加し、血清をキャピラリ流路中に導入した。血清のマイクロキャピラリ流路内の流れに及ぼす凝固や付着の影響は、導入された血清濃度をキャピラリ端Ａより４ｍｍ離れた点Ｅにおいて、血清に対して吸収が強い２２０ｎｍの紫外光を絞って照射し、その吸収により血清が点Ｅに到達したかどうかを判定した。測定はＭＰＣポリマー被覆なし、０．０５ｗｔ％濃度コート、０．３ｗｔ％濃度コートのそれぞれについて行った。ＭＰＣポリマーコートの場合は、石英表面と比べ、ＭＰＣポリマー表面には負荷電を多く生じ無いので、電気浸透流が抑えられ、被覆なしが最も速く測定点に達すると予想されるが、測定の結果、コートなしが最も遅かった。０．０５ｗｔ％と０．３ｗｔ％の到着時間は大差ない。しかし、０．３ｗｔ％では到達後、濃度が飽和するのに対し、０．０５ｗｔ％と被覆なしでは明らかに減少する。これらより、被覆なし及び０．０５ｗｔ％では、ＭＰＣコーティングが不十分で、血清中のタンパク質が測定点に達する前に内壁に付着して失われてしまったと考えられる。すなわち、０．３ｗｔ％濃度のＭＣＰポリマーを石英のマイクロキャピラリ流路内壁表面にコートすることによる、マイクロキャピラリ中での血清たんぱく質測定における凝固ならびに付着の抑制効果が示された。
【００３０】
次に、分析手段として血清濃度をケミカルセンサで測定する際、特にその測定にＩＳＦＥＴ(ion sensitive field effect transistor)を用いる場合の問題点と実施した対策例について述べる。ＩＳＦＥＴはＭＯＳ(metal-oxide-semiconductor)構造を有する。そこで、図１１のグラフ内に図示したようにマイクロキャピラリ流路端Ａより血清を導入し、Ａ−Ｃ間に高電圧を印加し、Ａ−Ｃ間を移動する血清中のイオン濃度を例えば点Ｅにおいて測定するために、ＩＳＦＥＴの測定領域面をＡ−Ｃ間に置くと、高電圧が直接ＭＯＳ構造に印加され、たとえＦＥＴを浮遊状態にしても窒化シリコンと酸化シリコン膜の積層からなるＩＳＦＥＴの絶縁膜が絶縁破壊する。この対策として、マイクロキャピラリ流路の下流側に高電圧を印加する電気浸透流ポンプを設け、このポンプの吸引作用により、ポンプより上流に位置するマイクロキャピラリ流路に血清などを導き、このマイクロキャピラリ流路のところにＩＳＦＥＴのようなケミカルセンサを設けた。図１２は、（ａ）のようにマイクロキャピラリ流路の下流に１１ｃｍの長さのポンプ領域を設けた場合と、（ｂ）のように０．８ｃｍの極短いポンプ領域を設けた場合について、電気浸透流の作用による血清の移動状況を比較したものである。マイクロキャピラリ流路の幅は約３０μｍ、深さは約３０μｍである。まず、ＰＢＳで全マイクロキャピラリ流路を満たした後、いずれのマイクロキャピラリにおいても、Ｂ−Ｃ間に２ｋＶの電圧を印加した。その後、入り口Ａから牛血清を注入し、点Ｅで２２０ｎｍの紫外光を絞って照射したときの吸光度の時間変化を示す。その結果、電圧を同じとしたとき、（ａ）のマイクロキャピラリ形状の方が（ｂ）のものよりも速く血清が入り口Ａより４ｍｍの位置に到達し、Ｂ−Ｃ間のマイクロキャピラリ流路長を長くとることにより高いポンプ能力が得られることから、ＩＳＦＥＴなどのケミカルセンサの下流側に血清などの移動手段を設けた場合にも、ケミカルセンサに血清を導けることがわかり、ＩＳＦＥＴの絶縁破壊を防止できることが示された。
【００３１】
一方、ケミカルセンサの下流側に設けた移動手段により、血清をケミカルセンサ近傍のマイクロキャピラリ流路内に引き込み、移動手段の電圧を切ったとする。この際、ケミカルセンサで測定をしている間にＰＢＳが拡散現象で逆流してくると測定が出来なくなる。そこで、この逆流が生じるまでの時間を調べた。図１３のグラフ中に図示したマイクロキャピラリ流路は、本測定に用いたものであるが、寸法は図１２（ａ）と同様である。測定では、まず全マイクロキャピラリ流路をＰＢＳで満たした後、Ｂ−Ｃ間に高電圧を印加し、入り口Ａから牛血清を注入し、その後高電圧を切り、入り口Ａから２ｍｍと４ｍｍの地点における２００ｎｍの紫外光の吸収を調べた。縦軸の吸収度が低下し始める時点においてＰＢＳがケミカルセンサの下流側から戻り始めたことを示す。ケミカルセンサを用いた測定に要する時間に応じて、Ｂ−Ｃ間の引き込み距離をより長くすることにより、逆流開始に至る時間を延長できることは容易に推測される。
【００３２】
以下、本装置を用いた血液分析とその結果を説明する。図１４は、本装置の分析手段近傍の構成を示す。１４０１、１４０２はＩＳＦＥＴセンサであり、１４０３と１４０４はグルコースセンサとＡｇ／ＡｇＣｌ電極であり、１４０５は移動手段である電気浸透流ポンプを示す。ＩＳＦＥＴセンサの測定面積は１５μｍ×１５０μｍであり、３０μｍ幅のマイクロキャピラリの流路に沿って、その下に配置し、白金直径２０μｍの白金線グルコースセンサはマイクロキャピラリ流路の側壁に垂直に挿入した。
【００３３】
図１５に、牛血清中に濃度の異なるグルコースを混入させ、その濃度変化に対するセンサ電流を示す。ここで、グルコースセンサとしては、直径２０μｍのＰｔ線上に、酢酸セルロース、グルコース酸化酵素、フェロセンカルボキシアルデヒドを順にコーティングしたものを用い、これらの表面はＭＰＣポリマーでコーティングした。図１５より、グルコース濃度が０の時に流れている電流は暗電流であるが、グルコース濃度の変化に対してほぼ線形に応答していることが示される。
【００３４】
図１６は、ＩＳＦＥＴセンサを用いた牛血清中のｐＨ，Ｎａ+，Ｋ+各濃度の測定結果を示す。ｐＨの測定にはＳｉ3Ｎ4、Ｎａ+にはＰＶＣ、ＴＨＦ、BIS(12-crown-4)、ＮＰＯＥ、Ｋ−ＴＣＰＧの混合膜、Ｋ＋の測定にはＰＶＣ、ＴＨＦ、BIS(Benzo-15-crown-5)、ＮＰＯＥ、Ｋ−ＴＣＰＧの混合膜を感応膜とした。いずれの場合でも、広範囲に線形的に応答していることが分かる。
【００３５】
【第２実施例】
図１７には図２で説明した本発明のヘルスケアデバイスの変型例を示す。本装置は図２の例と同様に１７０１の石英基板上に、まず１７０２の血液採取のための針を介して血液を１７０３のマイクロキャピラリ流路へ導入する。この際キャピラリ中で血液が凝固しないように液貯め１７０４に貯めておいた抗凝固剤（クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリン）を１７０５のゴム栓を押すことで適宜キャピラリ流路内に供給できるようになっている。そして１７０６の分離手段において図１０に示した遠心分離器を用い、血漿と血球を分離する。そしてこの血清を１７０７の分析手段へと１７０８と１７０９の電極間に電場を印加することで生じる電気浸透流により導き、血漿中のｐＨ、ナトリウムイオン濃度、カリウムイオン濃度、グルコース濃度等を検出する。本実施例においてはこの分析手段を複数設置しており、これらの濃度を一度に分析することが可能である。実際に血漿中のこれらの濃度を調べたところ、第１実施例の場合と同様の精度で濃度を測定することができた。
【００３６】
【第３実施例】
図１８には図２で説明した本発明のヘルスケアデバイスの変型例を示す。本装置は図２の例と同様に１８０１の石英基板上に、まず１８０２の血液採取のための針を介して血液を１８０３のマイクロキャピラリ流路へ導入する。この際キャピラリ中で血液が凝固しないように１８０４に貯めておいた抗凝固剤（クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリン）を１８０５のゴム栓を押すことで適宜キャピラリ流路内に供給してもよい。そして１８０ ６の濾過手段において血漿と血球を分離する。そしてこの血漿を１８０７の分析手段へと１８０８と１８０９の電極間に電場を印加することで生じる電気浸透流により導き、血漿中のｐＨ、ナトリウムイオン濃度、カリウムイオン濃度、グルコース濃度等を検出する。本実施例においてはこの分析手段を複数設置しており、これらの濃度を一度に分析することが可能である。実際に１８０６で濾過した血漿中のこれらの濃度を調べたところ、第一の実施例の場合と同様の精度で濃度を測定することができた。
【００３７】
【発明の効果】
以上に述べたとおり、本発明による血液分析装置では、血液分析に必要となる採血、血漿分離、分析などの機能をコンパクトに一体化することを実現した。家庭で手軽に取り扱える本装置により、日々血液検査を実施し、健康管理、疾病の早期発見に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 キャピラリ電気泳動法を説明する図
【図２】 本発明による血液分析装置の概略図
【図３】 針の製造法を説明する図（その１）
【図４】 針の製造法を説明する図（その２）
【図５】 マイクロキャピラリ流路の製造法を説明する図
【図６】 電気柄浸透流によりマイクロキャピラリ流路中のイオンの移動を示す図
【図７】 ポンプ作用の吸引力の測定方法を示す図
【図８】 ろ過手段の構成を示す図
【図９】 分離手段の構成を示す図
【図１０】 遠心分離器を示す図
【図１１】 マイクロキャピラリ流路内壁へのＭＰＣポリマーコート効果を示す図
【図１２】 ポンプ作用に及ぼすマイクロキャピラリ流路長の影響を示す図
【図１３】 マイクロキャピラリ流路中での緩衝液の逆流を示す図
【図１４】 ケミカルセンサの構成を示す図
【図１５】 グルコース密度の測定結果を示す図
【図１６】 ｐＨ，Ｎａ+，Ｋ+各濃度の測定結果を示す図
【図１７】 第２実施例を示す図
【図１８】 第３実施例を示す図
【符号の説明】
101 石英
102 電極
103 電極
104 電気二重層
105 カチオン
106 電気浸透流
107 中性イオン
108 アニオン
109 電気泳動流
201 基板
202 採取手段
203 針
204 電極
205 電極
206 濾過手段
207 分離機構
208 分析手段
209 流路手段（マイクロキャピラリ流路）
210 移動手段
211 出力手段
212 制御手段
301 石英棒
302 バーナー
303 石英棒
304 ヒーター
305 石英管
306 気体（ＰＯＣｌ3＋Ｏ2）
307 排気
308 リンガラス
309 支持台
401 ステンレスターゲット
402 永久磁石
403 リンガラス
404 電源
405 プラズマ
406 ステンレス堆積膜
407 水冷パイプ
408 銅板
501 石英板Ａ
502 クロム膜
503 ホトレジスト
504 石英板Ｂ
505 電極
701 マイクロキャピラリ流路
702 電極Ａ
703 電極Ｂ
704 入口Ｃ
705 空気
706 ピストン
707 圧力計
708 平衡圧力
709 吐出圧力
710 高電圧吐出領域
711 無電界領域
801 採取手段ならびに濾過手段
802 注入口
803 針
804 濾過手段
805 10μm幅溝
806 8μm幅溝
807 6μm幅溝
808 4μm幅溝
809 2μm幅溝
810 1μm幅溝
811 電極Ａ
812 電極Ｂ
813 血漿の流れ
901 マイクロキャピラリ流路
902 注入口
903 電気浸透ポンプ
904 電極Ａ
905 電極Ｂ
906 石英基板
1001 遠心分離器
1002 キャピラリ流路を含む石英板
1401 ISFETa
1402 ISFETb
1403 参照、白金電極a
1404 参照、白金電極b
1405 電極a（+）
1406 電極b（+）
1407 液貯め
1408 液貯め
1701 石英基板
1702 針
1703 マイクロキャピラリ流路
1704 液貯め
1705 ゴム栓
1706 分離手段
1707 分析手段
1708 電極
1709 電極
1801 石英基板
1802 針
1803 マイクロキャピラリ流路
1804 液貯め
1805 ゴム栓
1806 濾過手段
1807 分析手段
1808 電極
1809 電極
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液を採取し、血液中の赤血球、白血球、リンパ球、血小板、血液凝固因子などを分離し、その結果得られた血清などのｐＨ値、酸素あるいは二酸化炭素などの濃度を測定する血液分析方法ならびに装置に関する。特に前述の操作に必要な機能、構造のすべてが一つのデバイス内に集積されており、さらにそのデバイスが小さく、その取り扱いに専門の医学の知識、資格を必要とせず、簡易に上述の血液分析を行うことを特徴とするヘルスケアデバイスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
人の健康状態や疾病を診断する電子的な装置として、体温計、血圧計、超音波診断、X線ＣＴ、ＭＲＩなどの他に、血液自動分析装置がある。これは、数ミリリットルの血液を採取し、遠心分離器を用いて、赤血球、白血球、リンパ球、血小板、血液凝固因子を分離して得られた血清を、多数の試験管に分け、各試験管を一列に並べて動かし、ケミカルセンサにより、ｐＨ、酸素、二酸化炭素などの各濃度を測定する他、各試験管の血清に酵素などの試薬を入れ、血清中の基質との発光反応の分光や吸収分光を行い、データをコンピュータで処理して人体を診断することに用いられている。
【０００３】
また、血液あるいは人体組織の分析、測定方法に関する技術として、以下に述べる開発がそれぞれ行われている。まず、血清のような溶液中の混入物質の測定法としては、キャピラリ電気泳動法が一般に用いられている。本方法を図1により説明する。１０１は石英管であり、１０２は正電極であり、１０３は負電極である。例えば、直径０．１ｍｍ程度のキャピラリと呼ばれる細長い石英管１０１の中に電解液を入れる。一般に、石英管の場合、その内壁表面には負の電荷を生じるため、電解液中のカチオン(正電荷のイオン)は負電荷とのク−ロン力により、石英の内壁に集まり、いわゆるヘルムホルツの二重障壁１０４を形成する。そこで、このキャピラリの両端に設けた電極１０２，１０３に高電圧を印加すると、まず、負電圧１０３側に、内壁のカチオン１０５が引っ張られ、移動すると、粘性により電解液全体も負電圧１０３側に移動する。この流れを電気浸透流１０６と呼ぶ。一方、電解液中のカチオンは最も早く負電極１０３側に到達し、中性種１０７は電気浸透流１０６により次に到達し、そしてアニオン１０８(負イオン)は、本来正の電圧側１０２に引っ張られるが、電気浸透流１０６により負電圧１０３側に移動し、従って最も遅れて到達する。このアニオンやカチオンが電界により移動する流れを電気泳動流１０９と呼ぶ。
【０００４】
また、最近、ＤＮＡの分析に関して、以下に述べる方法が研究されている。すなわち、前述のキャピラリを石英板や高分子板に形成し、蓋をして、数ｃｍ角のチップ上に製作したマイクロキャピラリと呼ばれるものがある。例えば、ＤＮＡなどを中性ゲル中にいれ、ＤＮＡは電荷を有するので電気泳動により移動させ、分子量の相違による総電荷相違により分離する。また、本方法は、マイクロキャピラリ中を移動する物質に途中から他の試薬を入れ、その反応を検出するような従来の試験管方式と異なる反応検出法が盛んに研究されている[例えば、馬場嘉信; 蛋白質 核酸 酵素、45巻、1号(2000)76-85頁]。これは、マイクロ全分析システム(μ−ＴＡＳ; total analysis system)やチップ上研究室(Lab-on-Chip)と呼ばれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述の血液自動分析装置は、一般には血液センターや病院で用いられ、高価、且つ大規模であり、しかも全診断に数時間を要する。通常これらの血液分析は、疾病の原因究明あるいは健康体においても一年に一回程度受ける健康診断などの際に実施されるため、一回の分析によって種々の情報をそれぞれ精緻に得ることを目的としている。しかし、昨今大気温暖化や内分泌かく乱物質などの環境悪化により日々人間の健康が蝕まれており、より高い頻度で血液検査を行い健康状態の管理を行うことが、重大な疾病への進展を予防するために必要とされる。このような日々の健康管理を目的とした血液検査には、高々血液中のｐＨ，酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などのいわゆる健康マーカーを呼ばれるものの濃度などを測定するだけで足りるものである。先述のような高価、大規模な血液分析装置を用いた精緻な検査までは必要なく、分析項目を絞った簡素な装置が必要とされていた。
【０００６】
また、最近、寝たきり老人の増加にともない、その健康管理が課題となっているが、このような人にとって、頻繁に病院等に通い検査を受けることは困難であり、在宅のまま健康管理を行う手段が必要とされている。現在の血液検査方法では、採血は医師など有資格者にかぎられており、要介護老人の介護の担い手であるヘルパーではできない行為である。そこで、一般の人でも、採血を含めて手軽に取り扱える血液分析装置が必要とされていた。また、血液検査を頻繁に行うためには、採血の際に苦痛を伴なわないことが望ましく、また、注射針による皮膚の変色など人体への影響も極力抑えることが望ましい。
【０００７】
以上に述べたような家庭で手軽に取り扱える血液分析装置を実現するためには、装置本体が小型でなければならない。そのためには、血液分析に必要となる採血、濾過、分離、分析などの機能がコンパクトに一体化されている必要がある。血液等の分析技術に関しては、前述したような、個々の技術開発は行われているものの、それら技術を取り入れ血液分析装置として一体化するための集積技術はこれまで得られていなかった。
【０００８】
本発明は以上のような事情に鑑みなされたものであり、血液分析に必要となる採血、血漿分離、分析などの機能をコンパクトに一体化することを実現し、家庭で手軽に取り扱えるようにして日々の血液検査を実施可能として、健康管理、疾病の早期発見に大きく貢献する血液分析装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
このような本発明の目的は、血液中の物質を分析するセンサを有する基板を備える血液分析装置において：
(a) 基板上に形成された溝状構造物を蓋をしてなるマイクロキャピラリ流路と；
(b) 前記マイクロキャピラリ流路に血液を取り入れる採取手段と；
(c) 前記マイクロキャピラリ流路の前記採取手段の下流にマイクロキャピラリ流路の一部をＵ字状に形成して設けられた分離手段であって、基板ごと遠心することにより、分離手段内で血液から血漿を分離する分離手段と；
(d) 前記マイクロキャピラリ流路の前記分離手段の下流に設けられ、前記センサを有する分析手段と；
(e) 前記マイクロキャピラリ流路に設けられ、前記分離手段のＵ字状流路の下流側に位置する血漿を前記分析手段に移動させる移動手段と；
(f) 前記センサからの情報を基板外部に取り出すための出力手段：
を備えることを特徴とする血液分析装置、により達成される。
【００１０】
採取手段に中空の針を設けた場合には、これを体内に刺して基板内に血液を取り入れることができる。
【００１１】
移動手段は、分析手段より下流側に設置することができる。また、この移動手段はマイクロキャピラリ流路に設け２個の電極とし、両電極間に印加した電圧によって生じる電気泳動流により、マイクロキャピラリ流路内の血液、血漿又は血清を移動させることができる。この場合、マイクロキャピラリ流路上流側の電極を接地するのが好ましい。
【００１２】
センサとしては、血清中のｐＨ値、酸素濃度、二酸化炭素濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、カルシウム濃度、グルコース濃度、乳酸濃度の何れかを分析するケミカルセンサが使用できる。
【００１３】
採取手段の下流側でかつ分離手段の上流側に位置するマイクロキャピラリ流路に、採取手段により採取した血液をろ過して血漿を得るろ過手段を設けてもよい。
【００１４】
ろ過手段は複数のスリットを備えたものとして、この複数のスリットを形成する微細溝の幅が、マイクロキャピラリ流路の上流から下流に向かって次第に小さくなるようにしてろ過作用を発揮させることが出来る。
【００１５】
マイクロキャピラリ流路の溝状構造物は幅１０〜１５０μｍ、深さ１０μｍ〜１５０μｍとするのが好ましく、またマイクロキャピラリ流路の内壁が、濃度０．２５〜１．０ｗｔ％のＭＰＣポリマー（ 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine ）が塗布されているのが好ましい態様である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
図２に本発明に基づく装置の概略図を示す。２０１は基板であり、本装置の各手段は本基板をエッチングにより製作されたマイクロキャピラリ流路に沿って配置される。このマイクロキャピラリ流路の内壁表面にはＭＰＣポリマー（2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine）の被覆が設けられており、血漿や血清中のタンパク質のマイクロキャピラリ流路表面上での凝固、付着を防止する。２０２は血液の採取手段である。２０３は中空の針であり、採取手段に付属する。この針を体内に刺して基板内への血液の取り入れ口とする。２０４、２０５は電極であり、この電極間に印加した電圧のため生じる電気泳動流による吸引力によって、体内より基板内に血液を取り入れる。
【００１７】
２０６は血液の濾過手段であり、血液の流れの上流から下流に向かって、次第に間隔の狭くなる複数のスリットを有する。このスリットにより、血液中の赤血球、白血球、リンパ球、血小板を濾過して取り除き、濾過手段の下流側に血漿を得る。２０７は分離手段であり、例えばＵ字型のマイクロキャピラリからなる。採取した血液を濾過して得られる血漿をこのＵ字型のマイクロキャピラリ流路に導いた後、本基板を遠心分離器により一定方向に加速度を加えることによって、Ｕ字部に血漿より凝固因子を分離除去した血清が得られる。２０８は分析手段であり、血液中のｐＨ値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度を測定するためのセンサを有する。
【００１８】
２０９は採取手段、濾過手段、分離手段、分析手段のそれぞれを接続する流路手段であり、基板をエッチングして製作したマイクロキャピラリ溝（溝状構造物）に蓋をしてなるマイクロキャピラリ流路からなる。２１０はマイクロキャピラリ流路中で血液を電気泳動法により移動させるための移動手段である。２１１は分析手段から情報を取出すための出力手段であり、電極などから構成される。２１２は、以上の採取手段、濾過手段、分離手段、分析手段、移動手段、出力手段を必要に応じて制御するための制御手段である。図２には示していないが、基板上のマイクロキャピラリ溝内に血液を保持しておくための板（蓋）（図５の５０４）は、基板２０１（５０１）に接着あるいは圧着されている（図５参照）。
【００１９】
採取手段２０２により採取された血液は、濾過手段２０６にて濾過され血漿となり、さらに分離手段２０７にて凝固因子を分離除去して血清が得られ、これを分析手段２０８においてｐＨ値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度を測定する。各手段間の血液の移動は、電気泳動法を用いた移動手段２１０により行う。
【００２０】
【第１実施例】
本実施例の装置は図２に示したものと同様であり、符号は前述のものを使用する。以下、各手段ごとに説明する。まず、図３、図４を用いて血液の採取手段２０２に付属する針の製造法について説明する。図３の上段に針を製作する際に芯材として使用する石英の製造方法を示す。３０１は芯材の石英棒であり、これをバーナー３０２により加熱して軟化させたのち引き延ばして、先端の径を１０μｍ以下になるようにして切断した。次に、図３の下段に示すような抵抗加熱ヒータ３０４を有する電気炉３０５を予め８００℃に加熱してから、前述の要領で製作した石英の芯材３０３を炉の中に置き、その後処理ガス３０６として三塩化燐（ＰＯＣｌ3）と酸素を電気炉３０３中に流す。その結果、芯材３０３の表面には燐ガラス（Ｐ2Ｏ5）３０８が形成される。なお３０７は排気である。次に、表面に燐ガラスを掲載したさらにその上にステンレスを堆積する方法についてのべる。図４にこの処理を行う装置を示す。４０１はステンレス製の円筒真空容器であり、円筒真空容器４０１の外周には、一対のリング状磁石４０２が約１ｃｍ離して設置されており、Ｎ極とＳ極が形成されている。このとき、円筒真空容器４０１の内壁には数１０から数百ガウスの磁場が生じている。この円筒真空容器４０１内に表面に燐ガラスを形成した石英の芯材４０３を置き、Ａｒガスを２０ｓｃｃｍを流して、圧力を１０ｍＴｏｒｒとした。この状態において電源４０４を用いて円筒真空容器４０１に負の高電圧を印加し、容器内でマグネトロン放電４０５を生じさせる。放電を２０分間行うことにより、芯材４０３の表面には厚さ約１０μｍのステンレス堆積膜４０６が形成された。なお、マグネトロン放電の際に円筒真空容器４０１の温度が上昇することを抑えるために水冷パイプ４０７と冷却板４０８によって円筒真空容器４０１を冷却した。この後、この芯材４０３を３０〜６０度の角度に固定し、研磨し、鋭利な針先を形成する。次に、この芯材４０３を緩衝フッ酸液に入れ、燐ガラスのみを高速でエッチングすることにより、ステンレス堆積物は芯材４０３から除去され、長さが約１ｃｍのステンレスの中空な針が得られる。このような極細のステンレスの針は、先端の約１ｍｍの部分を残し、他の部分の周囲をシリコンラバーなどで覆い、補強、保護とする。さらに、この針を基板の採取手段の端部に当る注入口に接着剤を用いて貼り付けて使用する。以上に述べたようにして製作した針は、先端の径が微細であることから、皮膚に刺したところ、神経に当らずに皮膚を突き通し血管まで達するため、痛みを感じなかった。なお、芯材４０３の材料は石英に限らず、ガラスあるいは高分子などでもよい。また、円筒真空容器４０１はステンレス以外の金属を用いても良い。
【００２１】
次に、基板内の各手段を形成するマイクロキャピラリ流路の製作方法を、図５を用いて説明する。例えば、厚さ０．５ｍｍで２ｃｍ角の石英板５０１を用意し、まず、（１）石英板５０１上にクロム（Ｃｒ）膜５０２を約１μｍの厚さでスパッタ法で堆積する。次に、（２）Ｃｒ膜５０２上にホトレジスト５０３を塗布し、光露光で約３０μｍ幅の抜けパターンを形成する。（３）このＣｒ膜５０２を湿式又はドライ法によりエッチングする。ドライ法では、Ｃｌ2ガスを一巻アンテナを用いたＩＣＰ（誘導結合プラズマ）で放電し、アンテナより１８〜２０ｃｍの下流域（ダウンストリーム）でＣｒ膜５０２をエッチングする。本エッチング法は、特願平１１−１２４７０９による方法を用いている。そして、（４）このＣｒ膜５０２をマスクに、Ｃ4Ｆ8とＳＦ6を８５対１５の比で混合したガスをＩＣＰにより放電し、１３．５６ＭＨｚの高周波バイアスを印加した電極上に石英板５０１を載置し、下地の石英板５０１を垂直の壁を有するようにエッチングし、キャピラリ溝（溝状構造物）を形成する。その際の条件は、アンテナに導入した１３．５６ＭＨｚの電力は５００Ｗであり、高周波バイアス用の１３．５６ＭＨｚの電力は５Ｗ、圧力は１０ｍＴｏｒｒとした。
【００２２】
その後、（５）Ｃｒ膜５０２を湿式法で除去し、（６）血液や緩衝液の注入口や出口用の孔を超音波加工により開口したもう一枚の石英板５０４を用意して、キャピラリ溝を設けた石英板５０１と共に、１％ＨＦ（フッ酸）に侵した後、両板を重ね合わせ、１．３ＭＰａの圧力で２４時間押し付けた。この石英板５０４は溝状構造物を覆う蓋となり、これによりマイクロキャピラリ流路を形成する。
【００２３】
最後に、（７）白金等の電極５０５を、上記の注入口や出口などに蒸着などの方法で形成し、マイクロキャピラリチップが出来上がる。（４）の工程で形成されたマイクロキャピラリ溝を有する石英板を成形型として用い、ポリエチレン等の高分子膜に適当な温度でモールド形成してマイクロキャピラリ溝を製作してもよい。更に、石英板を用いずに、高分子板に直接マイクロキャピラリ溝（溝状構造物）を形成し、蓋も高分子で形成しても良い。
【００２４】
次に、血液の採取手段において血液をマイクロキャピラリ流路中に引き込む方法、ならびに、移動手段においてマイクロキャピラリ流路中で血液を移動させる方法を図６を用いて説明する。用いたマイクロキャピラリ流路を図６に示すグラフ中に示す。これは、前述の製造方法により製作した石英板内のマイクロキャピラリ流路の一部を示したものである。このマイクロキャピラリ流路のキャピラリ溝は幅が約３０μｍ、深さが約３０μｍである。このマイクロキャピラリの全域をｐＨ７．４の燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした後、Ａ−Ｃ間に高電圧を印加し、そのときの電圧−電流特性をイオン強度を変えて測定した結果を図６のグラフに示す。グラフ中で「低速」とは１５秒毎に５０Ｖを印加した結果であり、「高速」とは一秒間に７０Ｖの電圧を印加した結果である。「低速」の場合は、電圧印加と共に電流が急激に流れ始め、特に高イオン強度の場合は激しい。これは、電流が流れることによりジュール加熱が起こり、緩衝液の移動度が増加するためと説明されている。一方、「高速」で電圧を上昇させると線形関係を示す。従って、急激に電圧を上げると、緩衝液の温度が上昇せずに正イオンが高速で移動することを意味する。すなわち、「高速」モードを用いると電気浸透流により、液を動かすポンプ作用が得られることを示している。
【００２５】
この電気浸透流のポンプ作用による吸引力の測定について述べる。図７にポンプ作用の吸引力測定を行ったマイクロキャピラリ流路を示す。これは、先に述べた方法で製作した石英板の一部を取出して図示したものである。このマイクロキャピラリ流路の溝は幅が約３０μｍ、深さが約３０μｍである。まず、マイクロキャピラリ流路全域７０１をｐＨが７．４の燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした。そして電極Ａ７０２と電極Ｂ７０３に高電圧を印加すると、ＰＢＳが電極Ａ側に電気浸透流により移動し、入り口Ｃ７０４から空気７０５が注入される。マイクロキャピラリ流路中に侵入した空気７０５の先端をピストン７０６を用いて、入り口Ｃ７０４まで引き戻したときの圧力を圧力計７０７で測定した。その結果、このときの電気浸透流のポンプ作用による吸引力６×103Ｐａであることがわかった。
【００２６】
次に血液の濾過手段について説明する。図８は、先に述べた方法で製作した石英板の中から採取手段と濾過手段を取出して図示したものである。８０１は血液の採取手段とろ過手段であり、下段にその拡大を示す。８０２は注入口であり、端部に針８０３が接着により取り付けられている。８０４はろ過手段であり、内部には図に示すような石英板のエッチング加工により形成した多段階の微細溝を有する。ここで用いた石英板では、注入口８０２側より、１０μｍ幅溝８０５、８μｍ幅溝８０６、６μｍ幅溝８０７、４μｍ幅溝８０８、２μｍ幅溝８０９、１μｍ幅溝８１０を設けてある。電極Ａ８１１、電極Ｂ８１２に電圧を印加し、前述したように電気浸透流のポンプ作用により、血液を針８０３から採取し、次にろ過手段を通過させた。その結果、ろ過手段の下流には、ほとんど赤血球の混入が無い血漿８１３が得られた。
【００２７】
次に、血液からろ過手段を通して得られた血漿より、更に遠心分離によりマイクロキャピラリ流路内で凝固因子を分離し血清を得る分離手段と分離方法を、図９を用いて説明する。Ｕ字型のマイクロキャピラリ流路９０１の一方は針を付属した注入口９０２と結合している。また、電気浸透流ポンプ９０３を有し、高電圧を印加するための電極Ａ９０４と電極Ｂ９０５が設けてある。電極Ａ９０４と電極Ｂ９０５の間に電界約１ｋＶ／ｃｍを印加し、針９０２よりＵ字型のマイクロキャピラリ流路９０１に血液を導入した。このとき、感電を避けるため、電極Ａ９０４側を接地した。そして、図１０に示す簡易型遠心分離器１００１に、図９のマイクロキャピラリ流路を含む石英板１００２を、図９に示した矢印の方向により大きな加速度がかかるように取り付け回転させた。５０００ｒｐｍの回転速度で３０分回転した後に、Ｕ字型キャピラリ流路９０１の図９に示した矢印の向きと反対側のＵ字管部分に血清を得た。
【００２８】
以上述べた採取手段、ろ過手段、分離手段、流路手段、分析手段の構造を構成する要素であるマイクロキャピラリ流路は石英で製作されている。そのため、血液や血漿や血清のような生体物質をマイクロキャピラリ流路内に導入すると、内壁にタンパク質が凝固したり吸着するため、キャピラリ流路が細くなったり、極端な場合は詰まったりする現象が見られる。この凝固や付着を防止するために、マイクロキャピラリ流路の内壁に、ＭＰＣポリマー(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine)をコートした。ＭＰＣポリマーは、石原らにより発明された（特許第２９４７２９８号）が、これは我々生物の生体膜を構成している材料と類似の材料から人工的に合成した高分子である。従って、タンパク質吸着を抑制し、生体との好ましくない反応を阻止する極めて優れた効果を示す。
【００２９】
図１１のグラフ中に示すマイクロキャピラリ流路を用いて、ＭＰＣポリマーのマイクロキャピラリ内壁へのコートの有無、及び内壁にコートするＭＰＣポリマーの濃度に対するタンパク質等の凝固、付着防止効果を示す。マイクロキャピラリ溝の幅は約３０μｍ、深さは約３０μｍである。まず、マイクロキャピラリ流路内をｐＨ＝７．４、イオン強度 ０．１６の燐酸緩衝液で満たし、キャピラリ端Ａに牛血清を注入後、速やかにＡ−Ｃ間に種種の高電界を印加し、血清をキャピラリ流路中に導入した。血清のマイクロキャピラリ流路内の流れに及ぼす凝固や付着の影響は、導入された血清濃度をキャピラリ端Ａより４ｍｍ離れた点Ｅにおいて、血清に対して吸収が強い２２０ｎｍの紫外光を絞って照射し、その吸収により血清が点Ｅに到達したかどうかを判定した。測定はＭＰＣポリマー被覆なし、０．０５ｗｔ％濃度コート、０．３ｗｔ％濃度コートのそれぞれについて行った。ＭＰＣポリマーコートの場合は、石英表面と比べ、ＭＰＣポリマー表面には負荷電を多く生じ無いので、電気浸透流が抑えられ、被覆なしが最も速く測定点に達すると予想されるが、測定の結果、コートなしが最も遅かった。０．０５ｗｔ％と０．３ｗｔ％の到着時間は大差ない。しかし、０．３ｗｔ％では到達後、濃度が飽和するのに対し、０．０５ｗｔ％と被覆なしでは明らかに減少する。これらより、被覆なし及び０．０５ｗｔ％では、ＭＰＣコーティングが不十分で、血清中のタンパク質が測定点に達する前に内壁に付着して失われてしまったと考えられる。すなわち、０．３ｗｔ％濃度のＭＣＰポリマーを石英のマイクロキャピラリ流路内壁表面にコートすることによる、マイクロキャピラリ中での血清たんぱく質測定における凝固ならびに付着の抑制効果が示された。
【００３０】
次に、分析手段として血清濃度をケミカルセンサで測定する際、特にその測定にＩＳＦＥＴ(ion sensitive field effect transistor)を用いる場合の問題点と実施した対策例について述べる。ＩＳＦＥＴはＭＯＳ(metal-oxide-semiconductor)構造を有する。そこで、図１１のグラフ内に図示したようにマイクロキャピラリ流路端Ａより血清を導入し、Ａ−Ｃ間に高電圧を印加し、Ａ−Ｃ間を移動する血清中のイオン濃度を例えば点Ｅにおいて測定するために、ＩＳＦＥＴの測定領域面をＡ−Ｃ間に置くと、高電圧が直接ＭＯＳ構造に印加され、たとえＦＥＴを浮遊状態にしても窒化シリコンと酸化シリコン膜の積層からなるＩＳＦＥＴの絶縁膜が絶縁破壊する。この対策として、マイクロキャピラリ流路の下流側に高電圧を印加する電気浸透流ポンプを設け、このポンプの吸引作用により、ポンプより上流に位置するマイクロキャピラリ流路に血清などを導き、このマイクロキャピラリ流路のところにＩＳＦＥＴのようなケミカルセンサを設けた。図１２は、（ａ）のようにマイクロキャピラリ流路の下流に１１ｃｍの長さのポンプ領域を設けた場合と、（ｂ）のように０．８ｃｍの極短いポンプ領域を設けた場合について、電気浸透流の作用による血清の移動状況を比較したものである。マイクロキャピラリ流路の幅は約３０μｍ、深さは約３０μｍである。まず、ＰＢＳで全マイクロキャピラリ流路を満たした後、いずれのマイクロキャピラリにおいても、Ｂ−Ｃ間に２ｋＶの電圧を印加した。その後、入り口Ａから牛血清を注入し、点Ｅで２２０ｎｍの紫外光を絞って照射したときの吸光度の時間変化を示す。その結果、電圧を同じとしたとき、（ａ）のマイクロキャピラリ形状の方が（ｂ）のものよりも速く血清が入り口Ａより４ｍｍの位置に到達し、Ｂ−Ｃ間のマイクロキャピラリ流路長を長くとることにより高いポンプ能力が得られることから、ＩＳＦＥＴなどのケミカルセンサの下流側に血清などの移動手段を設けた場合にも、ケミカルセンサに血清を導けることがわかり、ＩＳＦＥＴの絶縁破壊を防止できることが示された。
【００３１】
一方、ケミカルセンサの下流側に設けた移動手段により、血清をケミカルセンサ近傍のマイクロキャピラリ流路内に引き込み、移動手段の電圧を切ったとする。この際、ケミカルセンサで測定をしている間にＰＢＳが拡散現象で逆流してくると測定が出来なくなる。そこで、この逆流が生じるまでの時間を調べた。図１３のグラフ中に図示したマイクロキャピラリ流路は、本測定に用いたものであるが、寸法は図１２（ａ）と同様である。測定では、まず全マイクロキャピラリ流路をＰＢＳで満たした後、Ｂ−Ｃ間に高電圧を印加し、入り口Ａから牛血清を注入し、その後高電圧を切り、入り口Ａから２ｍｍと４ｍｍの地点における２００ｎｍの紫外光の吸収を調べた。縦軸の吸収度が低下し始める時点においてＰＢＳがケミカルセンサの下流側から戻り始めたことを示す。ケミカルセンサを用いた測定に要する時間に応じて、Ｂ−Ｃ間の引き込み距離をより長くすることにより、逆流開始に至る時間を延長できることは容易に推測される。
【００３２】
以下、本装置を用いた血液分析とその結果を説明する。図１４は、本装置の分析手段近傍の構成を示す。１４０１、１４０２はＩＳＦＥＴセンサであり、１４０３と１４０４はグルコースセンサとＡｇ／ＡｇＣｌ電極であり、１４０５は移動手段である電気浸透流ポンプを示す。ＩＳＦＥＴセンサの測定面積は１５μｍ×１５０μｍであり、３０μｍ幅のマイクロキャピラリの流路に沿って、その下に配置し、白金直径２０μｍの白金線グルコースセンサはマイクロキャピラリ流路の側壁に垂直に挿入した。
【００３３】
図１５に、牛血清中に濃度の異なるグルコースを混入させ、その濃度変化に対するセンサ電流を示す。ここで、グルコースセンサとしては、直径２０μｍのＰｔ線上に、酢酸セルロース、グルコース酸化酵素、フェロセンカルボキシアルデヒドを順にコーティングしたものを用い、これらの表面はＭＰＣポリマーでコーティングした。図１５より、グルコース濃度が０の時に流れている電流は暗電流であるが、グルコース濃度の変化に対してほぼ線形に応答していることが示される。
【００３４】
図１６は、ＩＳＦＥＴセンサを用いた牛血清中のｐＨ，Ｎａ+，Ｋ+各濃度の測定結果を示す。ｐＨの測定にはＳｉ3Ｎ4、Ｎａ+にはＰＶＣ、ＴＨＦ、BIS(12-crown-4)、ＮＰＯＥ、Ｋ−ＴＣＰＧの混合膜、Ｋ＋の測定にはＰＶＣ、ＴＨＦ、BIS(Benzo-15-crown-5)、ＮＰＯＥ、Ｋ−ＴＣＰＧの混合膜を感応膜とした。いずれの場合でも、広範囲に線形的に応答していることが分かる。
【００３５】
【第２実施例】
図１７には図２で説明した本発明のヘルスケアデバイスの変型例を示す。本装置は図２の例と同様に１７０１の石英基板上に、まず１７０２の血液採取のための針を介して血液を１７０３のマイクロキャピラリ流路へ導入する。この際キャピラリ中で血液が凝固しないように液貯め１７０４に貯めておいた抗凝固剤（クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリン）を１７０５のゴム栓を押すことで適宜キャピラリ流路内に供給できるようになっている。そして１７０６の分離手段において図１０に示した遠心分離器を用い、血漿と血球を分離する。そしてこの血清を１７０７の分析手段へと１７０８と１７０９の電極間に電場を印加することで生じる電気浸透流により導き、血漿中のｐＨ、ナトリウムイオン濃度、カリウムイオン濃度、グルコース濃度等を検出する。本実施例においてはこの分析手段を複数設置しており、これらの濃度を一度に分析することが可能である。実際に血漿中のこれらの濃度を調べたところ、第１実施例の場合と同様の精度で濃度を測定することができた。
【００３６】
【第３実施例】
図１８には図２で説明した本発明のヘルスケアデバイスの変型例を示す。本装置は図２の例と同様に１８０１の石英基板上に、まず１８０２の血液採取のための針を介して血液を１８０３のマイクロキャピラリ流路へ導入する。この際キャピラリ中で血液が凝固しないように１８０４に貯めておいた抗凝固剤（クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリン）を１８０５のゴム栓を押すことで適宜キャピラリ流路内に供給してもよい。そして１８０ ６の濾過手段において血漿と血球を分離する。そしてこの血漿を１８０７の分析手段へと１８０８と１８０９の電極間に電場を印加することで生じる電気浸透流により導き、血漿中のｐＨ、ナトリウムイオン濃度、カリウムイオン濃度、グルコース濃度等を検出する。本実施例においてはこの分析手段を複数設置しており、これらの濃度を一度に分析することが可能である。実際に１８０６で濾過した血漿中のこれらの濃度を調べたところ、第一の実施例の場合と同様の精度で濃度を測定することができた。
【００３７】
【発明の効果】
以上に述べたとおり、本発明による血液分析装置では、血液分析に必要となる採血、血漿分離、分析などの機能をコンパクトに一体化することを実現した。家庭で手軽に取り扱える本装置により、日々血液検査を実施し、健康管理、疾病の早期発見に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 キャピラリ電気泳動法を説明する図
【図２】 本発明による血液分析装置の概略図
【図３】 針の製造法を説明する図（その１）
【図４】 針の製造法を説明する図（その２）
【図５】 マイクロキャピラリ流路の製造法を説明する図
【図６】 電気柄浸透流によりマイクロキャピラリ流路中のイオンの移動を示す図
【図７】 ポンプ作用の吸引力の測定方法を示す図
【図８】 ろ過手段の構成を示す図
【図９】 分離手段の構成を示す図
【図１０】 遠心分離器を示す図
【図１１】 マイクロキャピラリ流路内壁へのＭＰＣポリマーコート効果を示す図
【図１２】 ポンプ作用に及ぼすマイクロキャピラリ流路長の影響を示す図
【図１３】 マイクロキャピラリ流路中での緩衝液の逆流を示す図
【図１４】 ケミカルセンサの構成を示す図
【図１５】 グルコース密度の測定結果を示す図
【図１６】 ｐＨ，Ｎａ+，Ｋ+各濃度の測定結果を示す図
【図１７】 第２実施例を示す図
【図１８】 第３実施例を示す図
【符号の説明】
101 石英
102 電極
103 電極
104 電気二重層
105 カチオン
106 電気浸透流
107 中性イオン
108 アニオン
109 電気泳動流
201 基板
202 採取手段
203 針
204 電極
205 電極
206 濾過手段
207 分離機構
208 分析手段
209 流路手段（マイクロキャピラリ流路）
210 移動手段
211 出力手段
212 制御手段
301 石英棒
302 バーナー
303 石英棒
304 ヒーター
305 石英管
306 気体（ＰＯＣｌ3＋Ｏ2）
307 排気
308 リンガラス
309 支持台
401 ステンレスターゲット
402 永久磁石
403 リンガラス
404 電源
405 プラズマ
406 ステンレス堆積膜
407 水冷パイプ
408 銅板
501 石英板Ａ
502 クロム膜
503 ホトレジスト
504 石英板Ｂ
505 電極
701 マイクロキャピラリ流路
702 電極Ａ
703 電極Ｂ
704 入口Ｃ
705 空気
706 ピストン
707 圧力計
708 平衡圧力
709 吐出圧力
710 高電圧吐出領域
711 無電界領域
801 採取手段ならびに濾過手段
802 注入口
803 針
804 濾過手段
805 10μm幅溝
806 8μm幅溝
807 6μm幅溝
808 4μm幅溝
809 2μm幅溝
810 1μm幅溝
811 電極Ａ
812 電極Ｂ
813 血漿の流れ
901 マイクロキャピラリ流路
902 注入口
903 電気浸透ポンプ
904 電極Ａ
905 電極Ｂ
906 石英基板
1001 遠心分離器
1002 キャピラリ流路を含む石英板
1401 ISFETa
1402 ISFETb
1403 参照、白金電極a
1404 参照、白金電極b
1405 電極a（+）
1406 電極b（+）
1407 液貯め
1408 液貯め
1701 石英基板
1702 針
1703 マイクロキャピラリ流路
1704 液貯め
1705 ゴム栓
1706 分離手段
1707 分析手段
1708 電極
1709 電極
1801 石英基板
1802 針
1803 マイクロキャピラリ流路
1804 液貯め
1805 ゴム栓
1806 濾過手段
1807 分析手段
1808 電極
1809 電極
Claims (7)
- 血液中の物質を分析するセンサを有する基板を備える血液分析装置において：
(a) 基板上に形成された溝状構造物を蓋をしてなるマイクロキャピラリ流路と；
(b) 前記マイクロキャピラリ流路に血液を取り入れる採取手段と；
(c) 前記マイクロキャピラリ流路の前記採取手段の下流にマイクロキャピラリ流路の一部をＵ字状に形成して設けられた分離手段であって、基板ごと遠心することにより、分離手段内で血液から血漿を分離する分離手段と；
(d) 前記マイクロキャピラリ流路の前記分離手段の下流に設けられ、前記センサを有する分析手段と；
(e) 前記マイクロキャピラリ流路に設けられ、前記分離手段のＵ字状流路の下流側に位置する血漿を前記分析手段に移動させる移動手段と；
(f) 前記センサからの情報を基板外部に取り出すための出力手段：
を備えることを特徴とする血液分析装置。 - 前記採取手段は体内に刺して基板内に血液を取り入れる中空の針を有することを特徴とする請求項１の血液分析装置。
- 前記移動手段が、前記分析手段より下流側に設置されていることを特徴とする請求項１の血液分析装置。
- 前記移動手段は前記マイクロキャピラリ流路に設けられた２個の電極を備え、両電極間に印加した電圧によって生じる電気泳動流により、マイクロキャピラリ流路内の血液、血漿又は血清を移動させることを特徴とする請求項１の血液分析装置。
- 前記２個の電極の内、マイクロキャピラリ流路上流側の電極が接地されていることを特徴とする請求項４の血液分析装置。
- 前記センサは血清中のｐＨ値、酸素濃度、二酸化炭素濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、カルシウム濃度、グルコース濃度、乳酸濃度の何れかを分析するケミカルセンサであることを特徴とする請求項１の血液分析装置。
- 前記マイクロキャピラリ流路の溝状構造物は幅１０μｍ以上１５０μｍ以下、深さ１０μｍ以上１５０μｍ以下であり、マイクロキャピラリ流路の内壁に０．２５ｗｔ％以上１．０ｗｔ％以下の濃度のＭＰＣポリマー（2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine）が塗布されていることを特徴とする請求項１の血液分析装置。
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