JP3795245B2

JP3795245B2 - 短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌

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Publication number: JP3795245B2
Application number: JP00665899A
Authority: JP
Inventors: 浩竹村; 記子安藤; 義則塚本
Original assignee: Mizkan Group Corp
Current assignee: Mizkan Group Corp
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 1999-01-13
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: JP2000224982A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、納豆の不快臭のひとつであるムレ臭の低下ないし消失システムに関するものである。特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に着目し、該酵素活性を遺伝子操作などによって低下ないし失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確認し、これらの新規知見に基きはじめて完成されたものである。
【０００２】
すなわち、本発明は、納豆のムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）の生産能が低下または消失した納豆菌とその開発方法ならびにその菌を用いたムレ臭低下納豆の生産に関する。さらに詳しくは、短鎖分岐脂肪酸（short branched chain fatty acids）生産酵素遺伝子であるロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase, EC 1.4.1.9）遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ（branched chain α−keto acid dehydrogenase, EC 1.2.1.25）遺伝子の機能を低下または欠損させ、それらの酵素活性を低下または失活させることによる短鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させたムレ臭低下納豆菌の開発方法とその菌ならびにその菌を用いて生産されたムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆の生産に関する。
【０００３】
【従来の技術】
納豆は、大豆を原料に納豆菌による発酵を行って生産され、納豆菌がつくる粘質物と共に、その臭いに特徴のある食品である。納豆中には、ピラジン類、アセトイン、ジアセチル、酢酸、プロピオン酸、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）、アンモニアなどを中心とした種々の揮発性成分が含有されていることが知られているが（日本食品工業学会誌、３１巻、ｐ．５８７−５９５（１９８４））、これらの内のピラジン類、ジアセチルなどは、納豆好きの消費者に好まれるいわゆる納豆臭の主成分であるといわれている。
【０００４】
その一方で、いわゆるアンモニア臭やムレ臭は代表的な不快臭であるといわれており、なるべくこれらの不快臭の原因となる物質の含量の低い納豆を開発することができれば、納豆の品質を向上させることができると期待できる。
【０００５】
このような観点から、不快臭の一つであるアンモニア臭を抑制する方法としては、特開昭６４−８６８５４、特開平１−１９１６５５、特開平４−１７３０６９、特開平６−２６９２８１、特開平８−１５４６１６、特開平８−２７５７７２などに開示の如く、発酵中や保存中にアンモニアをあまり生産しないように改良した納豆菌を開発し、その納豆菌を使用して納豆を生産しようとする試みが多くなされてきている。これらの殆どは、納豆菌が本来保有するプロテアーゼ活性を低下させた納豆菌を開発し、このようなプロテアーゼ活性低下納豆菌を用いて納豆を生産する方法であった。このような方法により、アンモンニアの生産がある程度抑えられ、アンモニア臭が低下した納豆を製造できることが期待されている。
【０００６】
しかし、納豆のもう一方の代表的不快臭であるムレ臭を抑えることについては、これまでに全く検討されていなかった。むしろムレ臭の原因物質を特定することも出来ておらず、従ってムレ臭を抑制する方法の開発も大幅に遅れているのが現状であって、ムレ臭低下納豆の製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、納豆の有用性、特に嗜好食品としてのみでなく健康保健食品としての面からの有用性にも鑑み、更なる摂取量の増加を図る目的でなされたものであり、その際において、従来未解決のまま残されていたムレ臭の消失という技術課題を解決する目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため、先ずはじめに、納豆におけるムレ臭の原因物質を特定すべく各方面から鋭意検討を重ねた結果、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）であることをはじめてつきとめた。そして、分岐アミノ酸を出発物質とする短鎖分岐脂肪酸の生合成経路について、図１のような仮説を設定した。そしてこの仮説にしたがってロイシンデヒドロゲナーゼ／分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させることにより、短鎖分岐脂肪酸の少なくともひとつを生産できないように育種した短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を開発するのにはじめて成功し、その納豆菌を用いて納豆を製造したところ、上記仮説どおり、ムレ臭が著しく低下した納豆であることがはじめて確認できた。
【０００９】
その結果、ムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイシンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌という従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆という新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で育種改良に用いるもとの納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、市販の納豆から分離した納豆菌、およびさらに改良を重ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１１】
納豆菌は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏに分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと分類する文献もある。納豆菌としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏＩＦＯ３００９、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＦＯ３３３５、同ＩＦＯ３３３６、同ＩＦＯ３９３６、同ＩＦＯ１３１６９などがあるほか、上記した各種納豆菌が広く使用される。
【００１２】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株、市販の納豆菌高橋３号菌（Ｔ₃株、東京農業大学菌株保存室）、宮城野納豆菌（宮城野納豆製造所）等、各種の納豆菌が適宜使用できる。
【００１３】
本発明では、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を欠損させ、これらの酵素活性を失活させた納豆菌を育種することにより短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸を生産しない納豆菌を取得するのである。育種の方法のひとつとしては、スタールらがＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて開発した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（J. Bacteriol., Vol.158, p.411-418(1984)）を納豆菌用に改変した方法が用いられる。
【００１４】
本方法が納豆菌においても有効であることは本発明者らにより初めて立証されたことである。本方法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができることである。また本方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、異種蛋白質が発現されることは全くなく、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの、特に食品として利用する場合に重要な長所を有している。
【００１５】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、本発明者らは、形質転換能の向上した納豆菌を取得することにより、納豆菌の実用的なレベルの形質転換系を開発することも可能としており、この形質転換系を利用してプラスミドベクターを納豆菌に効率良く導入し、目的の遺伝子欠損株を育種することが出来たのである。
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、Appl. Environ. Microbiol., Vol.63., p.4087-4089(1997)に記載のファージベクターを利用した形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が既に開発されており、本発明ではこの方法も利用される。
【００１６】
なお、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、すなわち、既に目的遺伝子の機能が低下または欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等による薬剤変異法や、γ線や紫外線等を用いる方法などによってこれらの遺伝子を変異させて機能を低下または欠損させるなどの、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
このような通常の変異手段によれば、ロイシンデヒドロゲナーゼ及び／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が完全に失活した納豆菌以外にも、これらの酵素活性が中間程度に低下した納豆菌も取得することができる。このような納豆菌を用いて納豆を生産する場合は、ムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が中間程度に低下した納豆が製造可能となる。
本発明においては、このようにして得た短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の生産能が低下ないし消失した納豆菌を使用する。
【００１７】
このようにして開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。このようにして短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて生産した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌で製造した納豆は、短鎖分岐脂肪酸をほとんど含有しておらず、いわゆるムレ臭がほとんどないことが確認される。
また、短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した上記の納豆菌を通常の納豆菌と適当な比率で混合して使用して納豆の発酵をさせることによっても、納豆のムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が通常の納豆よりも低下しており、かつ任意の含有量の納豆を製造することができる。
【００１８】
ここに開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており、これらの酵素活性がほとんど消失した納豆菌である。このような納豆菌を用いて生産された納豆は、短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸をほとんど含有しておらず、そしてムレ臭が低下した納豆であることが確認されたことから、納豆のムレ臭の原因物質がイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸などの短鎖分岐脂肪酸であることが明白となり、ここに、これらの短鎖分岐脂肪酸は納豆菌においては、図１に示すような代謝経路により生産されることが初めて確認されたのである。
【００１９】
したがって、ムレ臭が低下ないし消失した納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそれ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示されたことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するには、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行われている変異手段によればよく、あるいは、自然界から分離してもよい。
これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理するなどの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆を製造することが可能である。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示す。
【００２１】
【実施例１】
▲１▼使用菌株等
納豆菌Ｏ−２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌である。納豆菌ｒ２２株はＯ−２株の形質転換能を高めた変異株であり、後述の如く、Ｏ−２株をニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫおよび大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９９は宝酒造株式会社より購入した。
培地は、納豆試験法（光琳）ｐ．８５−９７（１９９０）記載の肉汁培地、胞子形成培地、ＮＰ再生培地等を用いた。ただし、必要な場合は、テトラサイクリン（２μｇ／ｍｌ）や短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、各０．１ｍＭ）を添加した。
【００２２】
納豆菌ｒ２２株は、以下の方法で取得した。すなわち、市販納豆分離菌Ｏ−２株を、常法に準じ、ＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３０℃・１ｈｒ、生存率７．３％）した。その結果得られた変異処理菌（５×１０⁶個）を、Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111(1979）に記載のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの方法に準じたプロトプラスト法により枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。この場合、形質転換後のプロトプラストの再生培地はＮＰ再生培地を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十株の形質転換株を得た。これらの株は親株Ｏ−２株に比較して形質転換能が向上していることが期待されたが、これらの株にはベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが導入されており、このことが形質転換に利用する際に障害となるのでベクターｐＨＹ３００ＰＬＫを除去する必要があった。
【００２３】
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去は、納豆菌Ｏ−２株が胞子を形成する際にベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが欠落しやすい性質を本発明実施の中で見出し、利用することにした。そこで、これらの形質転換株の内３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた胞子各１６個を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの保持の有無を調べた結果、３０株中の２１株についてベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去に成功したことが確認できた。
【００２４】
さらに得られた２１株のベクター除去株について、プロトプラストを作成し、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換能が向上しているかを比較し、１５株で形質転換能が向上していることを確認した。さらに、これら１５株について常法による納豆製造試験を行い、発酵能や品質評価を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造できる株は４株だけであった。さらにこれら４株中２株は納豆の香りで硫黄臭などの不快臭の強い品質の悪いものしか製造できず、また１株は糸引きが極端に悪くなったものであった。残る１株（ｒ２２株と命名）のみが９名のパネラーによる評価の結果、親株Ｏ−２株を用いて製造した納豆よりは少し品質が劣るものの、納豆として許容される範囲の品質のものを製造できた。
【００２５】
ｒ２２株で製造した納豆を親株Ｏ−２株で製造した納豆と比較した品質評価結果を表１に、またｒ２２株の形質転換能を親株Ｏ−２株と比較した結果を表２に示した。なお、表１において、評価点は、対照（Ｏ−２株で製造）を３とした５段階評価の結果で示した。但し、総合評価は、対照（Ｏ−２株で製造）を０とした±５段階評価の結果で示した。
【００２６】
【表１】

【００２７】
【表２】

【００２８】
▲２▼ ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の分離
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｙｑｉＴ）内部の約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
【００２９】
ｉ）ベクター構築（図２、図３）
Jpn. J. Genet. Vol.61, p.515-528に記載された、ｐＨＹ３００ＰＬＫの塩基配列を基に、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧ−３′、および、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを調製し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型に用い、常法どおりＰＣＲを行い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ上のテトラサイクリン耐性遺伝子全長を増幅すると共に両末端に、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識サイトを導入した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、プラスミドｐＨＳＧ３９９のＥｃｏＲＩサイトに導入し、プラスミドｐＨＳＧ３９９Ｔを得た。（図３）
【００３０】
アミノ酸配列のデータベースＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴに登録されている（登録番号Ｐ５４５３１）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴ−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′の２種のオリゴＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条件でＰＣＲを行い、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム全長（１０９５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを得た。（図２）
【００３１】
ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバンドのうち、長いほうのバンド（約３．１ｋｂ）をアガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴ上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を脱落させたプラスミドｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを得た。（図２）
【００３２】
ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶをＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．８６ｋｂの断片を回収し（この断片は、中央部の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片が脱落したロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子）、ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られたプラスミドはｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶと命名し、以下の実験に供した。（図３）
【００３３】
ii）形質転換（図４、図５）
プラスミドｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳを宿主にして調製した。本大腸菌はｒｅｃＡ+株であるので、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶの２量体が得られる。得られた２量体を用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体では、染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子とｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の間で１回又はそれ以上の回数の相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶが染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子に組み込まれている。
【００３４】
複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により解析し、各形質転換株で何回組換えが起こっているか確認した。そして、２回組換えが起こっている株を選択し、ｙｑｉＴ７株と命名した。（図５）
【００３５】
iii）形質導入（図５）
上記の形質転換に用いたｒ２２株よりも、親株であるＯ−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるため、ｙｑｉＴ７上に挿入されたｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の、納豆菌ファージφＢＮ１００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｙｑｉＴｔ１株と命名した。
【００３６】
iv）脱落株の選択（図５）
ｙｑｉＴｔ１株上のｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ挿入は、染色体上で相同組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、結果として、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子上の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片が脱落し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損株が取得できる。この相同組換えによる脱落株は、テトラサイクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られた株をＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ２（以下、Ｂ２株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−６６０５として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。
【００３７】
ｖ）ロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性
納豆菌Ｏ−２株およびＢ２株を１００ｍｌの肉汁培地（各０．１ｍＭのイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸を含む）入りの坂口フラスコ中で３７℃、振とう培養した。定常期初期（ＯＤ６６０が約１）まで菌が生育した時点で、集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．００２％β−メルカプトエタノールを含む）に懸濁後、フレンチプレスにて、菌体を破砕した。菌体破砕液を３．５ｋｒｐｍ、１５分遠心分離し、上清を粗酵素液として用いた。
【００３８】
酵素活性は、J. Ferment. Bioeng., Vol.69, p.199-203(1990)に記載の方法に従って測定した。表３に結果を示す。
【００３９】
【表３】

【００４０】
Ｏ−２株では、活性が検出されたのに対し、Ｂ２株では、活性が検出されず、Ｂ２株がロイシンデヒドロゲナーゼ失活株となっている事が確認された。
【００４１】
vi）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認
ロイシンデヒドロゲナーゼが失活すると、分岐アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vol.246, 5264-5272(1971))。
【００４２】
Ｏ−２株およびＢ２株について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加した。Ｏ−２株は短鎖分岐脂肪酸の有無に関係なく生育したのに対し、Ｂ２株は、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、いずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果により、Ｂ２株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００４３】
vii）納豆製造（官能検査、短鎖分岐脂肪酸分析）
Ｂ２株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照としては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００４４】
試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテストチューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍのセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣによる短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）の分析に供した。なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸として計算した。結果を表４に記す。
【００４５】
【表４】

【００４６】
Ｂ２株を用いて製造した納豆には、短鎖分岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ２株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香りに関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００４７】
【実施例２】
▲１▼使用菌株等
納豆菌Ｏ−２株は、ｒ２２株、大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９９及び培地などは実施例１と同様に実施した。
【００４８】
▲２▼ 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の分離
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝子（ｏｄｂ２）内部の約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
【００４９】
ｉ）ベクター構築（図６）
Eur. J. Biochem., Vol.213, p.1091-1099(1993)に報告されているＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの分岐ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝子（ｏｄｂ２）の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条件でＰＣＲを行い、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ２サブユニットのオープンリーディングフレーム全長（１２７５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２を得た。
【００５０】
ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２を制限酵素Ｃｆｒ１０Ｉで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバンドのうち、長いほうのバンド（約３．０ｋｂ）をアガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２上のＥ２サブユニット遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を脱落させたプラスミドｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを得た。
【００５１】
ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．７４ｋｂの断片を回収し（この断片は、中央部の０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落したＥ２サブユニット遺伝子）、ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られたプラスミドはｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉと命名し、以下の実験に供した。（図７）
【００５２】
ii）形質転換（図８）
プラスミドｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを大腸菌ＪＭ１０９を宿主にして調製した。得られたプラスミドを用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体では、染色体上のＥ２サブユニット遺伝子とｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ上のＥ２サブユニット遺伝子の間で１回相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉが染色体上のＥ２サブユニット遺伝子に組み込まれている。
【００５３】
複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、Ｅ２サブユニット遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡおよび、市販のＭ１３用プライマーＭ４、ＲＶを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により解析することにより、Ｅ２サブユニット遺伝子上のＣｆｒ１０Ｉサイトの上流（５′末端側）で組換えが起こっているのか、下流（３′末端側）で組換えが起こっているのか確認した。Ｅ２サブユニット遺伝子のＣｆｒ１０Ｉサイトの下流で組換えが起こっている株１株を選択し、ｏｄｂ２−１株と命名した。
【００５４】
iii）形質導入（図８）
上記の形質転換に用いたｒ２２株より、親株であるＯ−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるため、ｏｄｂ２−１株の遺伝子上に挿入されたｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の納豆菌ファージφＢＮ１００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｏｄｂ２ｔ１株と命名した。
【００５５】
iv）脱落株の選択（図８）
ｏｄｂ２ｔ１株上のｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ挿入は、染色体上で重複しているＥ２サブユニット遺伝子の５′末端からＣｆｒ１０Ｉサイトの間で相同組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、結果として、Ｅ２サブユニット遺伝子上の０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落し、Ｅ２サブユニット遺伝子の欠損株が取得できる。相同組換えによる脱落株は、テトラサイクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られた株をＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ５（以下、Ｂ５株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−６６０６として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。
【００５６】
ｖ）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼが失損すると、分岐アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vol.246, p.5264-5272(1971))。Ｏ−２株およびＢ５株について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加した。
【００５７】
Ｏ−２株は、短鎖分岐脂肪酸の有無に関係なく生育したのに対し、Ｂ５株は、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、いずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果によりＢ５株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００５８】
vi）納豆製造（官能検査、短鎖分岐脂肪酸分析）
Ｂ５株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照としては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００５９】
試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテストチューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍのセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣによる短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸）の分析に供した。
【００６０】
なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸をスタンダードとして計算した。結果を表５に記す。
【００６１】
【表５】

【００６２】
Ｂ５株を用いて製造した納豆には、短鎖分岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。
Ｂ５株を用いて作製した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香りに関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、納豆の不快臭のひとつであるムレ臭の原因物質である短鎖分岐脂肪酸の生産量の非常に低い納豆菌を育種開発する方法が提供され、その方法により開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて納豆を生産することにより短鎖分岐脂肪酸含量が非常に低くムレ臭の著しく少ない納豆が製造可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】納豆菌における短鎖分岐脂肪酸の合成経路を示す。
【図２】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図３】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図４】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株の構築過程の概略（１）を示す。
【図５】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株の構築過程の概略（２）を示す。
【図６】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図７】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図８】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株構築過程の概略を示す。

Claims

ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下ないし欠損させてロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性を低下ないし失活せしめたことを特徴とするムレ臭が低下したまたはムレ臭のない納豆を生産する納豆菌。
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下ないし欠損させてロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性を低下ないし失活せしめたことを特徴とする短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌。
ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＯ−２株を親株とし、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を欠損させてロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性を失活せしめたことを特徴とするムレ臭が低下したまたはムレ臭のない納豆を生産する短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ２（ＦＥＲＭＢＰ−６６０５）。
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下ないし欠損させてロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性を低下ないし失活せしめることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の納豆菌の育種方法。