JP3749359B2 - New bifidobacteria and their use - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐酸性を有する新規なビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) に関する。
また、本発明は、少なくとも、この耐酸性を有する新規なビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 菌株及び天然果汁を含有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 等のビフィズス菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであって、その摂取により整腸作用を有することが知られている。近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌を含む食品への需要も高まっており、発酵乳や乳酸菌飲料等に広くビフィズス菌が利用されている。また、血中コレステロール低下作用、抗腫瘍活性、免疫賦活作用、抗変異原性等、ビフィズス菌の有する生理作用についても、種々報告がなされており、各種健康食品への利用が試みられている。
このように、腸内菌叢の維持や改善等、ビフィズス菌の効果が期待されているが、このような効果をビフィズス菌に発揮させるためには、ビフィズス菌を継続的に摂取することが必要とされている。しかし、ビフィズス菌は、酸性条件下や酸素存在下での保存が難しく、現状では、発酵乳や錠剤等の限られたビフィズス菌含有製品が知られるのみであり、また、これらの市場で流通しているビフィズス菌含有飲食品も、光や空気を遮断してビフィズス菌の生菌数を維持したり、低pH耐性の高いビフィズス菌を選択して使用する必要に迫られている。
【０００３】
したがって、ビフィズス菌を含有する飲食品を開発するに際しては、製造後の流通及び消費の過程で、如何に一定以上の生菌数を維持できるかが技術課題となっている。
一方、天然果汁は、健康的な自然食品として、近年、需要が急速に伸長してきた素材であり、日常の食生活の中で、天然果汁飲料として摂取されるようになってきている。また、天然果汁を含むゼリーや生菓子等の製品も販売されており、その消費も増加している現状にある。
このような現状から、ビフィズス菌を含有する飲食品のバラエティー化の一つとして、天然果汁とビフィズス菌を組み合わせた飲食品の開発が望まれている。しかし、天然果汁は、一般的にpHが４以下と低く、ビフィズス菌が生残するには過酷な条件であり、ビフィズス菌を配合した天然果汁含有飲食品を提供することは非常に困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ビフィズス菌を配合した天然果汁を含有する飲食品を開発する目的で、天然果汁中においても生残することができる耐酸性の高いビフィズス菌を求めて、鋭意研究を進めていたところ、通常のビフィズス菌含有飲食品に使用されているビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を育種改良して耐酸性を賦与することにより、天然果汁中でも生残することができる耐酸性の高いビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を得ることができることを見出し、さらに、この耐酸性の高いビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を飲料、ゼリー、生菓子等の飲食品に配合することができることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、天然果汁中でも生残することができる耐酸性の高いビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を提供することを課題とした。また、本発明は、この耐酸性の高いビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) を含む飲料、ゼリー、生菓子等の天然果汁含有飲食品を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明では、天然果汁中においても生残性を有する耐酸性の高いビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を取得するために、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) の育種改良を行った。
なお、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) は、発酵乳用スターターとして利用されている菌株であり、この菌体自体やこの菌体が産生する物質に種々の生理的機能が存在することが知られている (特開平3-120222号公報、特開平8- 99888号公報、特開平8-259597号公報) 。
【０００６】
以下に育種改良の方法を示す。
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) をBriggs liver broth (光岡知足著, 腸内菌の世界, p319, 叢分社発行, 1980) に接種し、培養した後、遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水で洗浄する。
（２） 100％バレンシアオレンジ果汁(pH 3.9)に菌体を懸濁し、低温で１週間保存する。
（３）菌体を懸濁した果汁を遠心分離して上清を除去し、生理食塩水で２回洗浄する。
（４）回収した菌体及び果汁固形を Briggs liver broth に懸濁し、培養する。（５）培養物を新しい Briggs liver broth に接種し、培養する。
（６）（１）〜（５）の操作を30回繰り返す。
（７）培養菌液から釣菌し、ＢＬ寒天培地（日水製薬製）上で純化を行って菌株を選択した後、培養し、保存する。
（８）取得した菌株のそれぞれについて、（１）及び（２）の操作を行い、 100％バレンシアオレンジ果汁中の生残率を求める。
生残率（％）＝｛（保存後の生菌数）／（保存前の生菌数）｝×100
なお、生菌数は、ＢＬ寒天培地（日水製薬製）で培養して形成されたコロニー数を測定することにより求めた。
（９）生残率の最も高い菌株をビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)として取得する。
【０００７】
本発明の耐酸性を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) SBT 10519 (FERM P-16107)の菌学的性質を以下に示す。（１）菌形（ＢＬ寒天培地で37℃、72時間嫌気培養したときの光学顕微鏡観察時）
大きさ： 0.3〜0.8 μm × 4〜10μm
形 状：多形性を示す桿菌（こん棒状、Ｙ字状等）
（２）グラム染色性：陽性
（３）コロニー形態
形 状：円形
隆 起：半球状に隆起
周 縁：円滑
大きさ：１〜４mm
色 調：黄褐色
表 面：円滑
（４）芽胞形成：陰性
（５）ガス生成：なし
【０００８】
（６）運動性：なし
（７）カタラーゼ活性：陰性
（８）脱脂乳凝固性：凝固
（９）ゼラチン液化性：なし
（１０）硝酸塩還元性：なし
（１１）インドール産生：なし
（１２）硫化水素産生：なし
（１３）酢酸／Ｌ（＋）乳酸モル比： 1.5以上
（１４）酢酸生成：あり
（１５）糖の発酵性
【０００９】
光岡の方法（光岡知足, 臨床検査, vol.18, pp.1163-1172, 1974) に従って実施した。（＋：発酵性あり、−：発酵性なし）
１．アラビノース ＋
２．キシロース ＋
３．リボース ＋
４．グルコース ＋
５．マンノース ＋
６．フラクトース ＋
７．ガラクトース ＋
８．シュークロース ＋
９．マルトース ＋
１０．セロビオース −
１１．ラクトース ＋
１２．トレハロース −
１３．メリビオース ＋
１４．ラフィノース ＋
１５．メレチトース ＋
１６．スターチ −
１７．グリコーゲン −
１８．イヌリン −
１９．マンニット −
２０．ソルビット −
２１．イノシット −
２２．エスクリン −
２３．サリシン −
２４．アミグダリン −
【００１０】
（１６）ＤＮＡを用いた分類
１．染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーションによる分類
ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) ATCC 15697、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis) ATCC 15703、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve) ATCC 15700 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707及びビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum) ATCC 29521 の染色体ＤＮＡをそれぞれ抽出し、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)から抽出した染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行った。また、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) の精製ＤＮＡ (ファルマシアバイオテク社製) とのハイブリダイゼーションを行った。
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)から抽出した染色体ＤＮＡは、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707から抽出した染色体ＤＮＡと最も強くハイブリダイズした。また、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) の染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの強度を０とし、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707の染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの強度を 100とした場合、その他のビフィズス菌から抽出した染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの強度は50以下であった。
【００１１】
２．ＰＣＲ(polymerase chain reaction) による分類
16ｓリボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの配列の違いに基づいてＰＣＲ用プローブを作成し、ＰＣＲによりビフィズス菌を菌種レベルで分類する方法が知られている(Denis Roy et al., International Journal of Food Microbiology, vol.29, pp.11-29, 1996)。そこで、この方法に従ってビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 用のプローブを作成し、ビフィズス菌の染色体ＤＮＡをテンペレートとしたＰＣＲを行ったところ、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 の染色体ＤＮＡをテンペレートとした場合に、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707の染色体ＤＮＡをテンペレートとした場合と同じ大きさのＤＮＡ断片（約0.57bp）の増幅が観察された。しかし、その他のビフィズス菌の染色体ＤＮＡをテンペレートとした場合には、そのようなＤＮＡ断片の増幅は観察されなかった。
以上、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) vol.2, 1986 の分類基準に示されるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) の性質に合致しており、また、ＤＮＡを用いた分類によってビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) であると同定された。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の耐酸性を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) は、標準的な性質のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 菌株を 100％バレンシアオレンジ果汁(pH 3.9)中で保持し、選択することにより得られるものであり、例えば、バレンシアオレンジ果汁、グレープフルーツ果汁、パイナップル果汁等の天然果汁中において高い生残性を示すので、これらの天然果汁と共に、飲料やゼリー、生菓子等に配合することができる。
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１３】
【実施例１】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) を Briggs liver broth 20mlに接種し、37℃で16時間培養した後、遠心分離により菌体を回収し、生理食塩水で洗浄した。この菌体を 100％バレンシアオレンジ果汁飲料 (pH 3.9；ドールオレンジジュース 100％；雪印乳業製) 20mlに懸濁し、10℃で１週間保存した。保存後、菌体を懸濁した果汁を遠心分離して上清を除去し、沈澱物を生理食塩水で２回洗浄した。この沈澱物として回収した菌体及び果汁固形を Briggs liver broth 20mlに懸濁して37℃で培養し、さらに、新しい Briggs liver broth 20mlに培養物を３％接種し、37℃で培養した。そして、これらの操作を30回繰り返した後、培養菌液から釣菌し、ＢＬ寒天培地（日水製薬製）上で純化を行って60株を選択し、培養して保存した。さらに、取得した60株について、それぞれ、 Briggs liver broth 20mlに接種し、37℃で16時間培養した後、遠心分離により菌体を回収し、生理食塩水で洗浄して 100％バレンシアオレンジ果汁飲料 (pH 3.9；ドールオレンジジュース 100％；雪印乳業製) 20mlに懸濁し、10℃で１週間保存した。この60株から生残率の最も高かった株をビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum）SBT 10519 (FERM P-16107)として取得した。
【００１４】
【試験例１】
実施例１で得たビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum）SBT 10519 (FERM P-16107)の各有機酸に対する耐性を調べた。また、比較対照として、親株であるビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株であるビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様に、各有機酸に対する耐性を調べた。
上記したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の各菌株を Briggs liver broth で培養した後、菌体を回収し、洗浄した。そして、これらの菌体を0.3Mクエン酸緩衝液(pH 4.0)、0.3Mリンゴ酸緩衝液(pH 4.0)、0.3M乳酸緩衝液(pH 4.0)又は0.3M酢酸緩衝液(pH 4.0)に懸濁し、容器に充填して、10℃で４日間保存した後、各緩衝液中のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の生菌数を測定し、生残率を算出した。その結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【実施例２】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を Briggs liver broth 100ml で培養した後、菌体を回収して洗浄した。そして、この菌体を 100％バレンシアオレンジ果汁飲料 (pH 3.9；ドールオレンジジュース 100％；雪印乳業製) に懸濁し、容器に充填して、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁飲料を製造した。
また、対照として、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁飲料を製造した。
そして、これらの製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁飲料を10℃で保存し、保存期間中の生菌数の変化を測定した。その結果を図１に示す。
これによると、基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) ATCC 15707は急速に死滅し、保存２週間後には生菌数が１ml当たり数個まで減少した。また、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) の保存２週間後の生菌数は１ml当たり 3.5×104 個程度であった。一方、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は保存２週間後でも１ml当たり 2.8×107 個（生残率 2.0％）という高い生菌数を維持していた。
なお、本実施例で製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を含有するバレンシアオレンジ果汁飲料は、外観、香り、風味共に、通常の 100％バレンシアオレンジ果汁飲料とほぼ変わらないものであった。
【００１７】
【実施例３】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を Briggs liver broth 100ml で培養した後、菌体を回収して洗浄した。そして、この菌体を 100％グレープフルーツ果汁飲料（pH 3.8；ドールグレープフルーツジュース 100％；雪印乳業製）に懸濁し、容器に充填して、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するグレープフルーツ果汁飲料を製造した。
また、対照として、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するグレープフルーツ果汁飲料を製造した。
そして、これらの製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するグレープフルーツ果汁飲料を10℃で保存し、保存期間中の生菌数の変化を測定した。その結果を図２に示す。
これによると、基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) ATCC 15707及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) は急速に死滅したが、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は保存２週間後でも高い生菌数を維持していた。
なお、本実施例で製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を含有するグレープフルーツ果汁飲料は、外観、香り、風味共に、通常の 100％グレープフルーツ果汁飲料とほぼ変わらないものであった。
【００１８】
【実施例４】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を Briggs liver broth 100ml で培養した後、菌体を回収して洗浄した。そして、この菌体を 100％パイナップル果汁飲料（pH 3.9；ドールパイナップルジュース 100％；雪印乳業製）に懸濁し、容器に充填して、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するパイナップル果汁飲料を製造した。
また、対照として、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するパイナップル果汁飲料を製造した。
そして、これらの製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するパイナップル果汁飲料を10℃で保存し、保存期間中の生菌数の変化を測定した。その結果を図３に示す。
これによると、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707は急速に死滅したが、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は保存２週間後でも高い生菌数を維持していた。
なお、本実施例で製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を含有するパイナップル果汁飲料は、外観、香り、風味共に、通常の 100％パイナップル果汁飲料とほぼ変わらないものであった。
【００１９】
【実施例５】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を Briggs liver broth 100ml で培養した後、菌体を回収して洗浄した。一方、 100％バレンシアオレンジ果汁飲料 (pH 3.9；ドールオレンジジュース 100％；雪印乳業製) を40℃まで加温した後、別途、加熱溶解しておいたゼラチンを加え、１％ゼラチンを含む90％バレンシアオレンジ果汁を調製した。そして、このバレンシアオレンジ果汁中に、洗浄したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)の菌体を懸濁し、容器に充填して、冷却し、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁ゼリーを製造した。
また、対照として、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁ゼリーを製造した。
そして、これらの製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するバレンシアオレンジ果汁ゼリーを10℃で保存し、保存期間中の生菌数の変化を測定した。その結果を図４に示す。
これによると、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium lo ngum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707は急速に死滅したが、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は保存２週間後でも高い生菌数を維持していた。
なお、本実施例で製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を含有するバレンシアオレンジ果汁ゼリーは、外観、香り、風味共に、通常のバレンシアオレンジ果汁ゼリーとほぼ変わらないものであった。
【００２０】
【実施例６】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を Briggs liver broth 100ml で培養した後、菌体を回収して洗浄した。この菌体を牛乳 120mlに懸濁した後、レアチーズケーキミックス (雪印食品製) 75g を添加して混合し、さらに、レモン果汁35mlを添加して混合した。そして、このミックスをケーキ型に流し込み、冷却固化させることにより、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するレモン果汁入りレアチーズケーキを製造した。なお、このレモン果汁入りレアチーズケーキのpHは 4.0であった。
また、対照として、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) 及び基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) ATCC 15707についても、同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するレモン果汁入りレアチーズケーキを製造した。
そして、これらの製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を含有するレモン果汁入りレアチーズケーキを10℃に保存し、保存期間中の生菌数の変化を測定した。その結果を図５に示す。
これによると、基準株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriumlongum) ATCC 15707は急速に死滅して、保存１週間後には生菌数が1g当たり３×102 個程度まで減少した。また、親株のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifid obacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) の保存１週間後の生菌数は1g当たり４×105 個程度であった。一方、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)は保存１週間後でも1g当たり９×107 個（生残率 3.6％）という高い生菌数を維持していた。
なお、本実施例で製造したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107)を含有するレモン果汁入りレアチーズケーキは、外観、香り、風味共に、通常のレモン果汁入りレアチーズケーキとほぼ変わらないものであった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) は、天然果汁中においても生残性を示す高い耐酸性を有する。したがって、このビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体を天然果汁を含有する飲料やゼリー、生菓子等に配合することができ、生きたビフィズス菌を含有する飲食品のバラエティー化に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１；10℃のオレンジジュ−ス中でのビフィズス菌の生菌数変化を示す。
図２；10℃のグレ−プフル−ツジュ−ス中でのビフィズス菌の生菌数変化を示す。
図３；10℃のパイナップルジュ−ス中でのビフィズス菌の生菌数変化を示す。
図４；10℃のオレンジゼリ−中でのビフィズス菌の生菌数変化を示す。
図５；10℃保存のレモン果汁入りレアチ−ズケ−キ中でのビフィズス菌の生菌数変化を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel Bifidobacterium longum having acid resistance.
The present invention also relates to a food and drink containing at least the novel Bifidobacterium longum strain having acid resistance and natural fruit juice.
[0002]
[Prior art]
Bifidobacterium longum and other bifidobacteria are one of the dominant bacterial species of the intestinal flora formed in the human intestinal tract, and are known to have an intestinal regulating action when ingested. It has been. In recent years, with the increase in the health orientation of consumers, demand for foods containing bifidobacteria has increased, and bifidobacteria have been widely used in fermented milk, lactic acid bacteria beverages, and the like. In addition, various reports have been made on the physiological actions of bifidobacteria such as blood cholesterol lowering action, antitumor activity, immunostimulatory action, antimutagenicity, and the like, and attempts have been made to use them in various health foods.
In this way, the effects of bifidobacteria such as maintenance and improvement of intestinal flora are expected, but in order to exert such effects on bifidobacteria, it is necessary to continuously ingest bifidobacteria It is said that. However, bifidobacteria are difficult to preserve under acidic conditions or in the presence of oxygen, and at present, only limited products containing bifidobacteria such as fermented milk and tablets are known, and are also distributed in these markets. Bifidobacteria-containing foods and beverages that are currently being used are also required to block the light and air to maintain the viable count of bifidobacteria, or to select and use bifidobacteria with high low pH resistance.
[0003]
Therefore, when developing foods and beverages containing bifidobacteria, a technical issue is how to maintain a certain number of viable bacteria in the process of distribution and consumption after production.
On the other hand, natural fruit juice is a material that has been rapidly growing in demand in recent years as a healthy natural food, and has been ingested as a natural fruit juice drink in daily eating habits. In addition, products such as jelly and fresh confectionery containing natural fruit juice are being sold, and their consumption is increasing.
From such a current situation, as one of the variety of foods and drinks containing bifidobacteria, development of foods and drinks combining natural fruit juice and bifidobacteria is desired. However, natural juice generally has a low pH of 4 or less, and is a severe condition for the survival of bifidobacteria, and it is very difficult to provide a natural fruit juice-containing food and drink containing bifidobacteria. It was.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
For the purpose of developing foods and drinks containing natural fruit juice containing bifidobacteria, the present inventors have been conducting earnest research in search of highly acid-resistant bifidobacteria that can survive in natural fruit juice. As a result, the Bifidobacterium longum used in ordinary foods and beverages containing bifidobacteria has been bred and given acid resistance, so that it can survive even in natural fruit juice. Finding that high Bifidobacterium longum can be obtained, and adding this highly acid-resistant Bifidobacterium longum to beverages, jellies, fresh confectionery and other foods and beverages As a result, the present invention has been completed. Accordingly, an object of the present invention is to provide Bifidobacterium longum having high acid resistance that can survive in natural fruit juice. Another object of the present invention is to provide natural fruit juice-containing foods and drinks such as beverages, jellies, and fresh confectionery containing this highly acid-resistant Bifidobacterium longum.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In the present invention, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-P) is used to obtain a highly acid-resistant Bifidobacterium longum having survival even in natural juice. 10657) breeding was improved.
Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) is a strain used as a starter for fermented milk. It is known that a physiological function exists (Japanese Patent Laid-Open Nos. 3-120222, 8-99888, and 8-259597).
[0006]
The method of breeding improvement is shown below.
(1) Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) was inoculated and cultured in Briggs liver broth (Mitooka Tomoashi, The World of Enterobacteria, p319, published by Chosokusha, 1980) Thereafter, the cells are collected by centrifugation and washed with physiological saline.
(2) Suspend cells in 100% Valencia orange juice (pH 3.9) and store at low temperature for 1 week.
(3) Centrifuge the fruit juice in which the cells are suspended, remove the supernatant, and wash twice with physiological saline.
(4) The collected cells and fruit juice solid are suspended in Briggs liver broth and cultured. (5) Inoculate the culture into fresh Briggs liver broth and culture.
(6) Repeat operations (1) to (5) 30 times.
(7) Fish from the culture solution, purify on a BL agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), select a strain, culture and store.
(8) For each of the obtained strains, perform steps (1) and (2) to determine the survival rate in 100% Valencia orange juice.
Survival rate (%) = {(viable count after storage) / (viable count before storage)} × 100
The viable cell count was determined by measuring the number of colonies formed by culturing on a BL agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical).
(9) The strain with the highest survival rate is obtained as Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107).
[0007]
The mycological properties of the acid-resistant Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) of the present invention are shown below. (1) Bacterial form (when observed with an optical microscope when anaerobically cultured on BL agar medium at 37 ° C for 72 hours)
Size: 0.3-0.8 μm x 4-10 μm
Shape: Neisseria gonorrhoeae that shows polymorphism (stick shape, Y shape, etc.)
(2) Gram stainability: positive (3) colony morphology Shape: circular ridges: hemispherical bulge circumference: smooth size: 1-4 mm
Color tone: Yellowish brown surface: Smooth (4) Spore formation: Negative (5) Gas generation: None [0008]
(6) Motility: None (7) Catalase activity: Negative (8) Nonfat milk coagulation: Coagulation (9) Gelatin liquefaction: None (10) Nitrate reducibility: None (11) Indole production: None (12) Sulfurization Hydrogen production: None (13) Acetic acid / L (+) lactic acid molar ratio: 1.5 or more (14) Acetic acid production: Yes (15) Sugar fermentability
The method was carried out according to the method of Mitsuoka (Tomochika Mitsuoka, Clinical Laboratory, vol.18, pp.1163-1172, 1974). (+: Fermentable,-: no fermentable)
1. Arabinose +
2. Xylose +
3. Ribose +
4). Glucose +
5. Mannose +
6). Fructose +
7). Galactose +
8). Sucrose +
9. Maltose +
10. Cellobiose −
11. Lactose +
12 Trehalose −
13. Melibiose +
14 Raffinose +
15. Meletitos +
16. Starch −
17. Glycogen −
18. Inulin −
19. Mannit −
20. Sorbit −
21. Inosit −
22. Esculin −
23. Salicin −
24. Amygdalin −
[0010]
(16) Classification using DNA Classification by chromosome DNA hybridization Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703, Bifidobacterium breve ATCC 15700, Bifidobacterium abrescent Extract Bifidobacterium longum ATCC 15707 and Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 chromosomal DNA, respectively, Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) Hybridization with the chromosomal DNA extracted from was carried out. Further, hybridization with purified DNA of Escherichia coli (Pharmacia Biotech) was performed.
Chromosomal DNA extracted from Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) hybridized most strongly with chromosomal DNA extracted from Bifidobacterium longum ATCC 15707. When the intensity of hybridization to the chromosomal DNA of Escherichia coli is 0 and the intensity of hybridization to the chromosomal DNA of Bifidobacterium longum ATCC 15707 is 100, other bifidobacteria The intensity of hybridization to chromosomal DNA extracted from the bacteria was 50 or less.
[0011]
2. Classification by PCR (polymerase chain reaction)
A method is known in which probes for PCR are prepared based on the difference in the sequence of DNA encoding 16s ribosomal RNA, and bifidobacteria are classified at the species level by PCR (Denis Roy et al., International Journal of Food Microbiology). , vol.29, pp.11-29, 1996). Therefore, according to this method, a probe for Bifidobacterium longum was prepared, and PCR was performed using the chromosomal DNA of Bifidobacterium as a template. As a result, Bifidobacterium longum SBT 10519 When a chromosomal DNA was used as a temperate, an amplification of a DNA fragment (approximately 0.57 bp) of the same size as that when the chromosomal DNA of Bifidobacterium longum ATCC 15707 was used as a temperate was observed. . However, when other chromosomal DNAs of bifidobacteria were used as temperates, such amplification of DNA fragments was not observed.
Above, bi of the present invention Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum) SBT 10519 (FERM P-16107) is, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) vol.2, Bifidobacterium shown in classification criteria 1986 (Bifidobacterium) It was consistent with the nature and was identified as Bifidobacterium longum by classification using DNA.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Bifidobacterium longum having the acid resistance of the present invention (Bifidobacteriumlongum) holds standard properties of Bifidobacterium longum a (Bifidobacterium longum) strain in 100% Valencia orange juice (pH 3.9), select For example, Valencia orange fruit juice, grapefruit fruit juice, pineapple fruit juice and other natural fruit juices show high survival, so together with these natural fruit juices, blend into beverages, jellies, fresh confectionery, etc. Can do.
The following examples illustrate the present invention in more detail.
[0013]
[Example 1]
Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) was inoculated into 20 ml of Briggs liver broth, cultured at 37 ° C for 16 hours, and the cells were collected by centrifugation and washed with physiological saline. did. The cells were suspended in 20 ml of 100% Valencia orange juice drink (pH 3.9;
[0014]
[Test Example 1]
The resistance of each of the Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) obtained in Example 1 to each organic acid was examined. Further, as a comparative control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) as a parent strain and Bifidobacterium longum ATCC 15707 as a reference strain are similarly used. Resistance to each organic acid was examined.
After each strain of Bifidobacterium longum was cultured in Briggs liver broth, the cells were collected and washed. These cells are suspended in 0.3 M citrate buffer (pH 4.0), 0.3 M malate buffer (pH 4.0), 0.3 M lactate buffer (pH 4.0) or 0.3 M acetate buffer (pH 4.0). After turbidity, filled into a container and stored at 10 ° C. for 4 days, the number of viable bacteria of Bifidobacterium longum in each buffer solution was measured, and the survival rate was calculated. The results are shown in Table 1.
[0015]
[Table 1]
[0016]
[Example 2]
Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) was cultured in
As a control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were similarly analyzed. A Valencia orange juice drink containing Bifidobacterium longum was produced.
And the Valencia orange juice drink containing these produced Bifidobacterium longum was preserve | saved at 10 degreeC, and the change of the viable cell count during a preservation | save period was measured. The result is shown in FIG.
According to this, the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 died rapidly, and the viable cell count decreased to several per ml after 2 weeks of storage. The number of viable bacteria after 2 weeks of storage of the parent strain Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) was about 3.5 × 10 4 per ml. On the other hand, Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) of the present invention maintains a high viable cell count of 2.8 × 10 7 per ml (survival rate 2.0%) even after 2 weeks of storage. Was.
The Valencia orange juice drink containing Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) produced in this example is a normal 100% Valencia orange juice drink both in appearance, aroma and flavor. It was almost unchanged.
[0017]
[Example 3]
Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) was cultured in
As a control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were similarly analyzed. A grapefruit juice drink containing Bifidobacterium longum was produced.
And the grapefruit juice drink containing these produced Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum ) was preserve | saved at 10 degreeC, and the change of the viable cell count during a preservation | save period was measured. The result is shown in FIG.
According to this, the reference strain Bifidobacterium longum (Bifidobacteriumlongum) ATCC 15707 and Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum) SBT 2928 (FERM P-10657) has been rapidly killed, Bifidobakuteri of the present invention Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) maintained a high viable count even after 2 weeks of storage.
The grapefruit juice drink containing Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) produced in this example is almost the same as a normal 100% grapefruit juice drink in both appearance, aroma and flavor. It was not changed.
[0018]
[Example 4]
Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) was cultured in
As a control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were similarly analyzed. A pineapple juice drink containing Bifidobacterium longum was produced.
And the pineapple fruit juice drink containing these produced Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum ) was preserve | saved at 10 degreeC, and the change of the viable cell count during a preservation | save period was measured. The result is shown in FIG.
According to this report, the parent strain Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were rapidly killed. Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) maintained a high viable count even after 2 weeks of storage.
The pineapple juice drink containing Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) produced in this example is almost the same as a normal 100% pineapple juice drink in terms of appearance, aroma and flavor. It was not changed.
[0019]
[Example 5]
Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) was cultured in
As a control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were similarly analyzed. Valencia orange juice jelly containing Bifidobacterium longum was produced.
Then, these produced Valencia orange juice jelly containing Bifidobacterium longum was stored at 10 ° C., and the change in the number of viable bacteria during the storage period was measured. The result is shown in FIG.
According to this, the parent strain of Bifidobacterium longum (Bifidobacterium lo ngum) SBT 2928 ( FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum) ATCC 15707 has been rapidly killed, the present invention Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) maintained a high viable count even after 2 weeks of storage.
In addition, Valencia orange juice jelly containing Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) produced in this example is almost the same as normal Valencia orange juice jelly in both appearance, aroma and flavor. It was not changed.
[0020]
[Example 6]
Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) was cultured in
As a control, Bifidobacterium longum SBT 2928 (FERM P-10657) and the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 were similarly analyzed. A rare cheesecake with lemon juice containing Bifidobacterium longum was produced.
And the rare cheese cake containing lemon juice containing these produced Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum ) was preserve | saved at 10 degreeC, and the change of the viable cell count during a preservation | save period was measured. The result is shown in FIG.
According to this, the reference strain Bifidobacterium longum ATCC 15707 died rapidly, and the viable count decreased to about 3 × 10 2 per gram after 1 week of storage. The viable cell number after one week storage of the parent strain of Bifidobacterium longum (Bifid obacterium longum) SBT 2928 ( FERM P-10657) was 4 × 10 5 or so per 1g. On the other hand, Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) of the present invention maintains a high viable count of 9 × 10 7 per 1 g (survival rate 3.6%) even after 1 week of storage. Was.
In addition, the lemon cheese cake containing lemon juice containing Bifidobacterium longum SBT 10519 (FERM P-16107) produced in this example is a rare cheese cake containing lemon juice in terms of appearance, aroma and flavor. It was almost unchanged.
[0021]
【The invention's effect】
The Bifidobacterium longum of the present invention has high acid resistance that exhibits survival even in natural juice. Therefore, the cells of Bifidobacterium longum can be added to beverages, jelly, and fresh confectionery containing natural fruit juice, contributing to a variety of foods and beverages containing live Bifidobacterium. be able to.
[Brief description of the drawings]
Fig. 1 shows changes in the viable count of bifidobacteria in orange juice at 10 ° C.
Fig. 2 shows changes in the viable count of bifidobacteria in grape fluid juice at 10 ° C.
Fig. 3 shows changes in the viable count of bifidobacteria in pineapple juice at 10 ° C.
Fig. 4 shows changes in the viable count of bifidobacteria in orange jelly at 10 ° C.
Fig. 5 shows changes in the viable count of bifidobacteria in a rare cake with lemon juice stored at 10 ° C.
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